DE60107538T2

DE60107538T2 - Vorrichtung zum trennen und nachweis von bewegungsfähigen spermatozoen

Info

Publication number: DE60107538T2
Application number: DE60107538T
Authority: DE
Inventors: David Brickwood
Original assignee: Genosis Ltd
Current assignee: Genosis Ltd
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2021-02-17
Also published as: CA2399993A1; US20030096395A1; ATE283913T1; US7179641B2; AU2001233872B2; GB0003596D0; US20060110821A1; WO2001060968A1; EP1255810B1; EP1255810A1; JP4091767B2; ES2234809T3; JP2003523194A; AU3387201A; DE60107538D1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Fertilitätstests für Männer, genauer gesagt, das Gebiet der Tests zur Abtrennung und Detektion motiler Spermien in einer Samenprobe.
HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK
Ca. 15% der Paare, die beabsichtigen, ein Kind zu zeugen, misslingt dieses Vorhaben innerhalb eines Zeitraumes von einem Jahr, während dessen ungeschützter Sexualverkehr betrieben wird. Fertilitätsspezialisten definieren diese Paare als infertil. 40% dieser Fälle beruhen auf männlichen Faktoren. Für einen erheblichen Anteil dieser Fälle existiert eine Behandlungsmöglichkeit zur Verbesserung oder zum Beheben des Umstandes, der zur Infertilität führt.
Ferner gibt es Umstände, in denen es wünschenswert ist, einen Test auf das Vorhandensein von lebensfähigen Spermien in einer Probe durchzuführen. Bspw. werden heutzutage häufig Vasektomien als Methode zur Empfängnisverhütung durchgeführt, wobei jedoch eine Bestätigung erforderlich ist, dass nach der Operation das Ejakulat frei von lebensfähigen Spermien ist.
Es existiert eine Anzahl von Verfahren, um die Motilität und Zahl von Spermien in einer Probe festzustellen. Eines dieser Verfahren ist die mikroskopische Analyse, die typischerweise in einem Krankenhaus oder kommerziellen Labor durchgeführt wird. Kürzlich wurden jedoch eine Reihe von Vorschlägen bezüglich Testkits gemacht, die dazu vorgesehen sind, die Detektion von Spermien zu vereinfachen.
Die WO 97/40386 offenbart ein Kit, das auf der Immundetektion des 34 kDa großen humanen epididymalen Spermienproteins basiert. Die in einer Probe vorhandenen Spermien werden dreimal durch Zentrifugation in Dulbecco-phosphatgepufferter Saline gewaschen. Die Proben werden dann bei 95°C hitzedenaturiert, bei 14.000 g zentrifugiert und die Überstände werden anschließend zur Analyse verwendet.
Die WO 95/29188 beschreibt einen Test basierend auf Antikörpern gegen das SP-10-Antigen von humanen Spermien.
Die EP-A-0387873 offenbart ein Kit, das feste Kugeln verwendet, an die solche Antikörper gebunden sind, die spezifisch für humanes Spermatozoon-Acrosom sind. Die Kugeln werden mit einer Probe gemischt, inkubiert, abgetrennt, gewaschen und die Anzahl von Spermien, die an die Kugeln gebunden sind, wird gemessen, vorzugsweise durch Untersuchung mittels eines Mikroskops.
Ein Nachteil dieser Testkits liegt darin, dass diese nicht zwischen motilen und nicht-motilen Spermien unterscheiden. Diese Unterscheidung ist der am meisten prädiktive Indikator für männliche Infertilität. Des Weiteren beinhalten diese Kits Maßnahmen, die keine Verwendung zu Hause erlauben, z. B. Zentri fugation, Mikroskopie, so dass eine Durchführung durch einen erfahrenen Fachmann erforderlich ist.
Diesen Nachteilen wird mit der Vorrichtung aus der WO 00/09648 (Genosis Ltd.) begegnet, die einen Apparat zur Abtrennung motiler Spermien von nicht-motilen Spermien in einer flüssigen Probe offenbart, wobei der Apparat (i) einen Behälter mit einem Probenaufnahmeeinlass, einen Auslass für die gefilterte Probe und einen Probenabtrennfilter aufweist, der dazwischen befestigt ist, wobei der Probenabtrennfilter eine Proben aufnehmende Fläche und eine gegenüberliegende Fläche aufweist, und der Probenabtrennfilter dazu vorgesehen ist, um im Wesentlichen das Hindurchfließen der Probe zu verhindern, jedoch das Hindurchtreten der motilen Spermien ermöglicht, wenn die gegenüberliegende Fläche des Probenabtrennfilters in Kontakt mit einem flüssigen Medium steht, und der (ii) Mittel zur Zufuhr einer Flüssigkeit zu der gegenüberliegenden Fläche des Filters aufweist.
Das US-Patent 5,866,354 offenbart eine Vorrichtung zur Messung der Motilität von Spermien, die Folgendes aufweist: einen Behälter; einen Temperaturregler zur Aufrechterhaltung einer vorgewählten Temperatur des Behälters; ein Volumen eines flüssigen Trennmediums (Grenzmedium) in dem Behälter; ein Volumen eines flüssigen Testprobenmediums oben auf dem Trennmedium in dem Behälter, wobei das Testprobenmedium eine Spermienprobe und ein gepuffertes isotonisches Verdünnungsmittel aufweist. Die Dichte des Trennmediums ermöglicht es hochmobilen Spermien, darin schneller hineinzumigrieren als andere Spermien. Die Vorrichtung hat ferner eine Saugvorrichtung, um nach der Abtrennung das Medium aus dem Behälter zu entfernen.
Die FR-A-2539628 offenbart eine Vorrichtung mit einem Behälter, insbesondere von röhrenförmiger Gestalt, der in zwei Kompartimente unterteilt ist. Der Behälter ist mit einem wässrigen Puffermedium gefüllt, wobei die Spermien auf den Boden eines Zufuhrkompartimentes gegeben werden, und die Präparation wird stehen gelassen, um den motilen Spermien Zeit zu geben, um in das Puffermedium in Richtung des Probenkompartimentes zu migrieren.
Das US-Patent 5,908,380 offenbart eine aufschwimmende, in Kompartimente unterteilte Zavos-Säule zur Abtrennung von Spermien entsprechend ihrer Motilität.
Die SU-A-1486163 offenbart eine Vorrichtung zur Abtrennung motiler Spermien, in die die Spermien direkt in einen Teilbereich eingebracht werden, der aus porösem Material hergestellt ist und den inneren Teil der Vorrichtung in zwei getrennte Reservoire unterteilt.
Weitere Verbesserungen der Spermienabtrennung, Detektion und Analyse sind hierin offenbart.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung zur Abtrennung motiler Spermien aus einer flüssigen Probe bereit, wobei die Vorrichtung einen Probentrennbehälter aufweist, der Folgendes aufweist:

(a) eine Probeneinlassöffnung;
(b) eine Probenauslassöffnung, die in Ausgangsstellung geschlossen ist;
(c) ein Probentrennmedium, in das die motilen Spermien der Probe über die Probeneinlassöffnung hineinmigrieren können, und
(d) ein Bedienungselement, über das die Probenauslassöffnung geöffnet werden kann, so dass das Probentrennmedium durch die Probenauslassöffnung aus dem Behälter fließen kann.

In dieser Vorrichtung ist das Trennmedium in dem Behälter anfänglich gehindert, durch die Auslassöffnung zu fließen. Dies ermöglicht eine Inkubationsdauer, die den motilen Spermien ausreichend Zeit gibt, um von der Probe in das Probentrennmedium zu migrieren, bevor dieses aus dem Behälter austritt. Bei Betrieb des Bedienungselementes wird die Auslassöffnung geöffnet und das Trennmedium (einschließlich der motilen Spermien) kann durch die Auslassöffnung hindurchmigrieren und das Gefäß bspw. zur Analyse verlassen.
Damit die motilen Spermien in der Probe in das Trennmedium eintreten können, müssen die Einlassöffnung und das Trennmedium in Flüssigkeitsverbindung stehen. Vorzugsweise jedoch ist solch eine Verbindung anfänglich unterbunden, so dass eine Kontamination des Mediums über die Einlassöffnung vor der Verwendung der Vorrichtung verhindert wird. Dadurch kann auch verhindert werden, dass das Medium aus dem Behälter über die Einlassöffnung austritt, obwohl dies auch auf sonstige Art und Weise erreicht werden kann, bspw. über die Viskosität oder Oberflächenspannung des Mediums.
Deshalb weist in diesem Ausführungsbeispiel der Behälter ein zweites Bedienungselement (e) auf, über das das Trennmedium über die Einlassöffnung mit einer Probe in Kontakt gebracht werden kann. Dies kann durch entfernte Lagerung des Mediums von der Einlassöffnung erreicht werden, bis das zweite Bedienungselement bedient wird, oder, alternativ, durch Vorsehung einer Einlassöffnung, die anfänglich geschlossen oder abgedichtet ist, und durch Betätigung des Bedienungselementes geöffnet wird.
Deshalb wird während der Verwendung dieser Vorrichtung das zweite Bedienungselement betätigt, dadurch wird das Trennmedium mit der Einlassöffnung in Kontakt gebracht. Dies ermöglicht motilen Spermien in der Probe von der Probe in das Trennmedium zu migrieren. Nach einer Inkubationsdauer wird das (erste) Bedienungselement betätigt, wodurch es dem Trennmedium (nun enthaltend motile Spermien) ermöglicht wird, den Behälter zu verlassen. Es ist bevorzugt, dass das erste Bedienungselement nicht betätigt werden kann, bis das zweite Bedienungselement betätigt wurde.
Es versteht sich, dass das Merkmal (e) unabhängig von Merkmal (d) arbeiten kann.
Der Behälter kann einen kreisförmigen Querschnitt aufweisen, z. B. konisch oder zylindrisch sein.
Die Einlass- und Auslassöffnungen können eine Vielzahl von Formen annehmen. Die Einlassöffnung kann bspw. ein offenes Ende eines Zylinders oder Kegels sein. Dieses offene Ende kann in eine Probe gegeben werden und, wenn das Trennmedium und die Probe in Kontakt stehen, können die Spermien über das offene Ende in den Behälter eindringen. Es kann wünschenswert sein, das offene Ende mit einem Netz oder Gitter abzudecken, um das Zurückhalten des Probentrennmediums im Inneren des Gefäßes (über Oberflächenspannung) zu unterstützen, ohne dass das Eintreten der Spermien aus der Probe verhindert wird.
Die Auslassöffnung ist vorzugsweise eine Öffnung, ein Loch oder ein Schlitz in der Behälterwand, die weiter zu einem Rohr, Schlauch oder Kanal führen kann, der bzw. das von dem Behälter wegführt.
Die Einlass- und Auslassöffnungen sind vorzugsweise derart angeordnet, dass während der Verwendung die Auslassöffnung oberhalb der Einlassöffnung liegt. So müssen die Spermien entgegen die Schwerkraft schwimmen, um den Behälter zu verlassen, wodurch die bevorzugte Migration von motilen Spermien gegenüber nicht-motilen Spermien verstärkt wird.
In der Vorrichtung kann jegliches geeignete Bedienungselement verwendet werden, z. B. Tasten, Schalter etc. Wenn der Behälter einen kreisförmigen Querschnitt aufweist, ist das (erste) Bedienungselement vorzugsweise ein drehbarer Ring, der eine Öffnung aufweist. Eine Drehung des Ringes aus einer geschlossenen Position richtet Öffnungen in dem Ring und der Behälterwand zueinander aus, wodurch es dem Probentrennmedium ermöglicht wird, den Behälter über die Auslassöffnung zu verlassen.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung des (ersten) Bedienungselementes bewirkt dieses das Einziehen von Flüssigkeit in ein rundes Gehäuse oder eine Röhre, z. B. wird dabei der Kolben einer Spritze zurückgezogen. Der Kolben blockiert anfänglich die Auslassöffnung, wobei bei Zurückziehen des Kolbens das Probentrennmedium durch die Auslassöffnung und in den inneren Raum der Spritze fließen kann. Ein geeignetes Bedienungselement, um das Zurückziehen des Kolbens der Spritze zu bewirken, ist ein drehbarer Knopf, der an den Kolben angebracht ist, z. B. durch einen Zahnstangenmechanismus.
Wenn die Vorrichtung ein zweites Bedienungselement aufweist, ist dieses vorzugsweise eine Taste. Wenn diese gedrückt wird, wird das Probentrennmedium, das sich in der Vorrichtung befindet, freigegeben, so dass dieses (z. B. durch Schwerkraft) die Einlassöffnung erreichen kann. Dies lässt sich bspw. erreichen durch das Vorsehen eines Reservoirs von Medium innerhalb des Behälters, das durch eine Folienwand verschlossen ist, zusammen mit einem Folienschneider. Die Betätigung des zweiten Bedienungselementes bewirkt ein Durchstechen der Folie mit dem Schneider, wodurch das Medium freigesetzt wird.
Eine bevorzugte Anordnung des Reservoirs ist eine solche, wie diese in der WO 02/20713 offenbart ist, in der sich das Trennmedium im Inneren eines hermetisch verschlossenen Reservoirs befindet. Diese Vorrichtung weist eine Ventilationsnadel auf, um das Medium aus dem Reservoir austreten zu lassen, wobei die Ventilationsnadel ein Flüssigkeitszufuhrteil und ein Reservoirventilationsteil aufweist, wobei sich das Reservoirventilationsteil entlang der Nadel distal zu dem Zufuhrteil befindet, wobei das Zufuhrteil und das Ventilationsteil jeweils einen Kanal definieren, der sich von der jeweiligen Position durch die Seitenwand der Nadel erstreckt. Die Kanäle ermöglichen es dem Zufuhrteil, bei Gebrauch Flüssigkeit aus dem Reservoir zuzuführen, bspw. durch Ventilieren von Luft an einem Ende und Dispensieren von Flüssigkeit an dem anderen Ende. In dieser Anordnung ist die Ventilationsnadel vorzugsweise zumindest teilweise eine Kanüle mit einer hohlen Spitze an dem Zufuhrteil für eine kontrollierte pipettenähnliche Zufuhr. In einer Nadel mit einem proximalen Teil und einem distalen Teil kann der distale Teil sowohl den Ventilationsteil als auch den Zufuhrteil aufweisen. Die Nadel hat vorzugsweise einen C-förmigen Querschnitt an dem Ventilationsteil und dem Zufuhrteil. Die beiden Kanäle sind vorzugsweise eine Einheit, wobei sich der Kanal von dem Ventilationsteil zu dem Zufuhrteil erstreckt.
In einer Entlüftungsposition erstreckt sich die Ventilationsnadel vorzugsweise derart durch zwei Wandteile des Reservoirs, so dass das Ventilationsteil einen Durchlass durch das erste Wandteil ausbildet, um eine Ventilation mit Luft zu ermöglichen, und das Zufuhrteil einen Durchgang durch das zweite Wandteil ausbildet, um es der Flüssigkeit zu ermöglichen, aus dem Reservoir auszutreten.
Wenn diese Art von Anordnung verwendet wird, wird die Nadel durch das zweite Betätigungselement bedient (z. B. ist dieses an eine Taste oder einen Schraubenvorschubmechanismus angebracht).
Das Trennmedium ermöglicht es motilen Spermien in bevorzugter Weise gegenüber nicht-motilen Spermien durch dieses hindurchzumigrieren. Dies lässt sich durch Verwendung eines jeglichen geeigneten Puffers erreichen (z. B. HEPES, EBSS, etc.), da motile Spermien aktiv durch das Medium hindurchmigrieren können, während über den maßgeblichen Zeitraum nicht-motile Spermien bestenfalls passiv durch Diffusion eindringen können. Es ist jedoch bevorzugt, ein Medium zu verwenden, das die Migration von motilen Spermien aus der Probe verstärkt. Geeignete Medien umfassen Zervixschleim [e. g. Keel & Webster (1988) Fertil. Steril. 49: 138–143], Polyacrylamidgel [e. g. Lorton et al. (1981) Fertil. Steril. 35: 222–225], Hyaluronsäure [e. g. Aitken et al. (1992) J. Androl. 13: 44–54], oder ein Cellulosederivat [e. g. WO 01/12783 (Genosis Limited)], wie bspw. Methylcellulose.
Das Medium kann in Form einer Lösung oder eines Gels vorliegen.
Vorzugsweise dient das Trennmedium ebenfalls dazu, um die Probe zu ,waschen', um Komponenten wie Samenplasma zu entfernen.
Zusätzlich zur Trennung von motilen und nicht-motilen Spermien ist es bevorzugt, dass die Vorrichtung nach der Trennung motile Spermien detektieren kann. Dementsprechend weist die erfindungsgemäße Vorrichtung vorzugsweise Spermiendetektionsmittel auf, die in Verbindung mit der Auslassöffnung des Behälters stehen. Die Detektionsmittel können mit der Vorrichtung eine Einheit bilden oder können als separate Komponente zum Einführen in die Vorrichtung vor, während oder nach der Probentrennung bereitgestellt werden.
Dementsprechend stellt die Erfindung eine Vorrichtung zur Abtrennung und Detektion motiler Spermien in einer flüssigen Probe bereit, wobei die Vorrichtung Folgendes aufweist:

– einen Probentrennbehälter mit:
(a) einer Probeneinlassöffnung;
(b) einer Probenauslassöffnung, die in Ausgangsstellung geschlossen ist;
(c) einem Probentrennmedium, in das die motilen Spermien der Probe über die Probeneinlassöffnung hineinmigrieren können, und
(d) einem Bedienungselement, über das die Probenauslassöffnung geöffnet werden kann, so dass das Probentrennmedium durch die Probenauslassöffnung aus dem Behälter fließen kann,
– ein Spermiendetektionsmittel mit:
(i) einem mit der Auslassöffnung in Verbindung stehenden Einbringbereich;
(ii) einem Detektionsbereich, in dem das Vorhandensein von Spermien detektiert werden kann, und
(iii) einem Reagenzienbereich, der ein Reagenz enthält, das mit Spermien reagieren kann, um deren Detektion in dem Detektionsbereich zu erleichtern,

Der Detektionsbereich ist vorzugsweise ein Bereich, über den Spermien nicht hinausfließen können (ein ,Einfangbereich'). Während des Betriebes wird deshalb ein Fluss von Spermien jenseits des Einfangbereiches verhindert und die Spermien sind für die Detektion immobilisiert. Der Einfangbereich verwendet vorzugsweise die Prinzipien, die in der WO 00/20866 offenbart sind – der Bereich ist porös mit Poren von einer solchen Größe, in die Spermien nicht eindringen können. Während des Fließens in den Einfangbereich sind deshalb die Spermien am Einlass eingefangen; wenn die Spermienkonzentration ansteigt, steigt ebenfalls die zurückgehaltene Menge an.
Der Einfangbereich kann aus jeglichem geeignetem porösen Material bestehen (z. B. HDPR, Nitrocellulose), durch das Spermien nicht migrieren können. Dieses Erfordernis spiegelt sich in der Porengröße des Einfangbereiches wieder. Der Kopf eines humanen Spermatozoons hat typischerweise einen Durchmesser von 3 bis 5 μm, und die Schwanzlänge liegt bei ungefähr 50 bis 60 μm. Die Porengröße kann entsprechend gewählt werden (z. B. Nitrocellulose, mit einer nominalen Porengröße bei 5 bis 8 μm), und eine geeignete Porengröße kann empirisch durch einfaches Experimentieren bestimmt werden.
Es ist offensichtlich, dass jegliches poröse Material, das vor dem Einfangbereich angeordnet ist, im Gegensatz zum Einfangbereich eine Porengröße aufweisen muss, die groß genug ist, um es den Spermien zu ermöglichen, sich relativ frei zu bewegen.
Einem Fachmann ist wohlbekannt, dass die nominale Porengröße eines porösen Materials durch den Hartpartikelprobentest bestimmt werden kann, d. h. durch Bestimmung des maximalen Durchmessers von kugelförmigen Partikeln, die durch das Material hindurchtreten können. Alternativ kann die Porengröße eines Materials durch Messung ihres ,Bubble Points' bestimmt werden. Der Bubble Point ist der Druck, der erforderlich ist, um Luft durch eine (mit Wasser) befeuchtete Membran hindurchzudrücken, und korreliert mit der Porengröße, die über die Partikelzurückhaltung gemessen wurde (obwohl bei den Extrema von Druck und Porengröße die Korrelation geringer sein kann). Der Bubble Point ist generell einfacher zu messen als die Partikelzurückhaltung und ist deshalb der bevorzugte Test, wenn die Porengröße bestimmt wird.
Der Einlass in den Einfangbereich ist vorzugsweise eng, so dass die Spermien fokussiert werden, so dass sich ein schärferes Signal ergibt.
Für einen weniger bevorzugten Detektionsbereich können Anti-Spermien-Antikörper verwendet werden.
In einem Ausführungsbeispiel des Detektionsbereiches basiert die Detektion auf Acrosin. Der Detektionsbereich enthält ein Reagens zur Detektion von Acrosin (e. g. siehe Mortimer, Practical Laboratory Andrology (1994), Seite 90) und der Reagenzienbereich umfasst ein Reagens, wie Proteinase K oder dem Calciumionophor A23187 [Perry et al. (1997) J. Exp. Zool. 279: 284–290; Perry et al. (1997) J. Exp. Zool. 279: 291–300 (1997); Perry et al. (1996) Human Reprod. 11: 1055–1062; Perry et al. (1995) Fertil. Steril. 64: 150–159], das eine Öffnung des Acrosoms bewirkt. Ein bevorzugtes Reagens zur Lyse der Acrosomen ist ein Lysepuffer, der 2% SDS, 100 μg/ml Proteinase K in 10 mM Tris-HCl und 0,1 M EDTA aufweist. Während der Migration wird deshalb Acrosin aus den Spermien freigesetzt und stromabwärts in dem Detektionsbereich detektiert.
Üblicherweise enthält der Reagenzienbereich eher ein Reagens, das an intakte Spermien oder an eine oder mehrere Komponenten davon bindet, und diese Bindereaktion wird dazu verwendet, um ein visuelles Signal zu generieren. Deshalb ist der Reagenzienbereich vorzugsweise ein ,Markierungsbereich', der einen Marker enthält, der in der Lage ist, an Spermien zu binden. Dies wird vorzugsweise zusammen mit einem Einfangbereich verwendet. Der Marker innerhalb des Markierungsbereichs kann jegliches geeignete Reagens sein, das an Spermien binden kann, und vorzugswei se ein sichtbares Signal abgibt. Da nur motile Spermien die Auslassöffnung erreichen, muss der Marker nicht spezifisch für Spermien sein.
Der Marker ist typischerweise ein Antikörper, der an Spermien binden kann und der geeignet getaggt ist. Es ist bevorzugt, einen sichtbaren Tag zu verwenden, wie colloidales Gold (das als rosa Farbe sichtbar ist), obwohl ebenfalls fluoreszierende, lumineszierende oder radioaktive Tags verwendet werden können. Es versteht sich, dass der Begriff ,Antikörper' polyklonale und monoklonale Antikörper umfasst, sowie Antikörperfragmente (e. g. F(ab)₂, Fc etc.), vorausgesetzt, dass die Anti-Spermien-Reaktivität erhalten bleibt.
Bevorzugte Marker erkennen ein Oberflächenantigen, das auf dem Großteil einer Population von Spermien vorhanden ist, eher als auf einer Untergruppe. Während jedes Spermien-Antigen verwendet werden kann (e. g. P34H (WO 97/40836), SP-10 (WO 95/29188), siehe auch EP-A-0387873), können ebenso ,universelle' Antigene, wie CD59, verwendet werden. Alternativ kann ein Farbstoff, wie Eosin, verwendet werden.
Es ist bevorzugt, dass der Marker nicht aktiviert ist (e. g. Rehydrierung von dehydriertem Marker), bevor das Probentrennmedium den Behälter verlässt. Dies kann durch eine derartige Anordnung des Markierungsbereiches erreicht werden, bei der der Marker in diesem Bereich nicht aktiviert wird, bevor das (erste) Bedienungselement betätigt wurde. Deshalb bleibt der Marker ortsgebunden, bis motile Spermien die Probe verlassen haben und in das Probentrennmedium eingedrungen sind.
Der Markierungsbereich kann in jeder geeigneten Position derart angebracht werden, dass ihr Marker Spermien in dem Detektionsbereich kontaktieren kann (e. g. in dem Einfangbereich zurückgehaltene Spermien). Dies kann stromaufwärts oder stromabwärts des Einbringbereiches oder integral mit diesem sein. Wenn dieser stromaufwärts liegt, sollte das Probentrennmedium, das den Behälter verlässt, in der Lage sein, den Markierungsbereich zu kontaktieren, und dies separat von ihrem Kontakt zu dem Einbringbereich, um den Marker zu aktivieren; wenn dieser stromabwärts oder integral liegt, wird der Fluss automatisch den Marker aktivieren.
Wenn das Detektionsmittel sowohl einen ,Einfangbereich' als auch einen ,Markierungsbereich' umfasst, wird die Porengröße des Einfangbereiches so gewählt, dass freier Marker (nicht an Spermien gebunden) dort hindurchfließen kann, während dies Marker, der nicht an Spermien gebunden ist, nicht kann. Während des Flusses in den Einfangbereich wird deshalb gebundener Marker am Einlass eingefangen. Wenn die Spermienkonzentration ansteigt, steigt auch die Menge an eingefangenem Marker. Es ist offensichtlich, dass der Marker kleiner als die Spermien sein muss, so dass freier Marker nicht durch den Einfangbereich zurückgehalten wird.
Wenn das Detektionsmittel einen Marker verwendet, weist dieser vorzugsweise einen Bereich stromabwärts des Detektionsbereichs auf, der ungebundenen Marker zurückhält (der ,Markerkontrollbereich'). Dieser weist typischerweise einen Antikörper auf, der an ungebundenen Marker binden kann (z. B. wenn der Marker ein monoklonaler Maus-Antikörper ist, kann der Markerkontrollbereich einen Antimaus-Antikörper verwenden). Marker, der durch den Detektionsbereich hindurchtritt (z. B. ein solcher, der nicht am Einlass zu dem Einfangbereich eingefangen wird), wird so innerhalb des Markerkontrollbereiches zurückgehalten, wo dieser gemessen werden kann. Ein Vergleich der Menge an Marker in dem Detektionsbereich und dem Markerkontrollbereich ermöglicht eine semiquantitative Messung der Menge an Spermien in der Probe.
Der Einbringbereich befindet sich dort, wo das Probentrennmedium, das den Behälter verlässt, in Kontakt mit dem Spermiendetektionsmittel kommt. Dieser kann aus jeglichem Material gebildet sein, das geeignet ist, einen Kapillarfluss von Spermien dort hindurch zu ermöglichen, z. B. aus fibrösem Material, wie einem Bausch aus HPDE-Material, verbundenen Polyesterfasern, Glasfasern oder dergleichen.
Es wurde jedoch festgestellt, dass Spermien dazu geneigt sind, in fibrösem Material festgehalten zu werden, wodurch die Sensitivität verringert wird. Es ist deshalb bevorzugt, einen nicht-fibrösen Einbringbereich zu verwenden. Geeignete Beispiele umfassen Kapillarröhren, Raum zwischen zwei oder mehreren Materiallagen, die in nächster Nähe zueinander angeordnet sind, so dass zwischen diesen ein Kapillarfluss stattfinden kann, oder eine Reihe von parallelen Kapillarkanälen oder -rinnen. In solchen Anordnungen, bei denen der Markierungsbereich und der Einbringbereich integral sind, wird dieser vorzugsweise von mehr als einem Materialstück gebildet, so dass der Marker während des Zusammenbaus eingebracht werden kann. Wenn nebeneinander angeordnete Lagen verwendet werden, kann der Marker bspw. in eine oder mehrere Lagen eingebracht werden, und diese können dann in nächste Nähe zueinander gebracht werden, um einen Ka pillarfluss zu ermöglichen. Gleichermaßen, wenn parallele Kanäle oder Rinnen verwendet werden, kann der Marker in das zum Kanal ausgebildete Material eingebracht werden, und, optional, mit einer weiteren Lage bedeckt werden.
In einer entsprechenden Anordnung findet ein Kapillarfluss hinter einem fibrösen Material statt, eher als durch ein solches hindurch. Während des Flusses dahinter, kann Flüssigkeit in das fibröse Material eindringen (z. B. um einen Marker zu rehydrieren, der darin enthalten ist), wobei der Hauptkapillarfluss durch den Einbringbereich für die Spermien nicht innerhalb des fibrösen Materials stattfindet.
Der Einbringbereich und die Probenauslassöffnung können im Wesentlichen eine Einheit sein.
In bevorzugten Ausführungsbeispielen wird der Fluss einer Probe zum Detektionsbereich durch ein sich stromabwärts befindliches Geflecht unterstützt, um die Kapillarbewegung zu fördern.
Während der Verwendung der bevorzugten Vorrichtungen ist deshalb der Migrationsweg von motilen Spermien in der Probe Folgender: Eintritt in das Trennmedium über die Einlassöffnung des Behälters, Austritt aus dem Trennmedium über die Auslassöffnung des Behälters (nach der Betätigung des Bedienungselementes nach einer Inkubationszeit), Eintritt in den Einbringbereich, und Kapillarfluss zu dem Einfangbereich, in dem weitere Migration verhindert wird. Ein sichtbares Signal in dem Einfangbereich zeigt das Vorhandensein von motilen Spermien in der Probe an.
Das sichtbare Signal, das durch das Detektionsmittel bereitgestellt wird, ist vorzugsweise außen im Hinblick auf den Behäülter und weiter bevorzugt ein solches, das auch von außerhalb der Vorrichtung sichtbar ist.
Das Detektionsmittel hat vorzugsweise die Form eines Lateral-Flow-Teststreifens, der an der Außenseite des Behälters befestigt ist.
Es versteht sich, dass der Behälter mehr als eine Probenauslassöffnung aufweisen kann, wobei jede zu getrennten Detektionsmitteln führen kann. Dies ermöglicht unabhängige Tests an derselben Probe, z. B. ein Assay für motile Spermien auf einem Streifen und ein Assay für Acrosomenreaktion auf einem anderen Streifen. Dies kann auch durch die Verwendung einer einzelnen Auslassöffnung erreicht werden, die stromabwärts zu verschiedenen Detektionsmitteln führt.
Um die Trennung von motilen und nicht-motilen Spermien (z. B. EP-A-0437508) zu verstärken, ist es bevorzugt, dass die Vorrichtung bei einer im Wesentlichen feststehenden Temperatur betrieben wird. Diese liegt typischerweise bei 30°C bis 44°C, vorzugsweise bei 35°C bis 39°C, und weiter bevorzugt bei einer festgelegten Temperatur um 37°C. Deshalb weist die Vorrichtung vorzugsweise einen Temperatursensor auf.
Der Temperatursensor kann ein einfaches Signal abgeben, um anzuzeigen, wenn die Arbeitstemperatur erreicht wurde. Die Vorrichtung kann in der Hand des Anwenders gehalten werden, oder in ein beheiztes Wasserbad eingebracht werden, bis das Signal abgegeben wird.
Bevorzugter ist es jedoch, wenn die Vorrichtung auch ihre eigene Wärmequelle aufweist, die vorzugsweise reguliert sein kann, z. B. unter Verwendung thermostatischer Regelung. Die Wärmequelle sollte vorzugsweise Wärme zu dem Bereich des Behälters führen, der das Probentrennmedium enthält. Strom und Steuerungsschaltkreise für die Wärmequelle können zweckdienlich im Inneren einer Bedienungselementtaste oder innerhalb des Gehäuses der Vorrichtung untergebracht sein.
Es versteht sich, dass die umfasste Temperatursteuerung in der Vorrichtung unabhängig von den anderen Merkmalen der Vorrichtung arbeiten kann.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann mit jeder geeigneten flüssigen Probe betrieben werden, die vorzugsweise eine Samenprobe ist. Die Vorrichtung kann eine Aufnahme für die Probe aufweisen. Eine solche hat vorzugsweise die Form eines Bechers oder einer geneigten Oberfläche, auf die die Probe gegeben werden kann, anschließend sammelt sich diese auf dem Boden (z. B. in einer Vertiefung). Der Probeneinlass kann dann mit der gesammelten Probe in Kontakt gebracht werden. Die Aufnahme kann ebenfalls einen Überlauf in der Nähe ihres Bodens aufweisen. Die Aufnahme kann integral mit der Vorrichtung sein, oder sie kann als separate Komponente vorgesehen sein, an die die Vorrichtung vor, während oder nach der Probenablage und/oder -sammlung angebracht wird.
Vorzugsweise hat der Grenzbereich zwischen der Aufnahme und der Einlassöffnung des Behälters (z. B. dort, wo der Behälter an die Vertiefung angebracht ist) eine definierte Fläche, wodurch die Reproduzierbarkeit des Assays begünstigt wird.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann einfach und kostengünstig hergestellt werden. Ferner kann sie sehr einfach verwendet werden, bspw. durch den Benutzer zu Hause. Die Erfindung stellt deshalb eine Assayvorrichtung bereit, die zu Hause als Basistest für, bspw., männliche Fertilität, verwendet werden kann.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann in einem Verfahren zum Abtrennen von motilen Spermien von einer flüssigen Probe verwendet werden, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:

(a) Bereitstellung eines Behälters mit einer Probeneinlassöffnung, einer geschlossenen Probenauslassöffnung und einem Probentrennmedium;
(b) Ermöglichen der Spermien in der Probe über eine Dauer von 5 bis 60 Minuten (vorzugsweise von etwa 30 Minuten) in das Probentrennmedium zu migrieren, und
(c) Ermöglichen des Probentrennmediums, den Behälter zu verlassen durch Öffnen der Probenauslassöffnung.

Das Verfahren kann anfänglich den Schritt des Öffnens der Einlassöffnung umfassen.
Das Verfahren umfasst vorzugsweise Schritte zur Detektion von Spermien in dem Medium, nachdem dieses den Behälter verlassen hat, und kann deshalb folgende Schritte umfassen:

(i) Ermöglichen des Probentrennmediums, das die Auslassöffnung verlässt, durch Kapillarwirkung in ein Material hineinzufließen, das in der Lage ist, Spermien zu immobilisieren;
(ii) In-Kontakt-Bringen der Spermien mit einem Marker, und
(iii) Detektieren des Markers, der am Einlass zu diesem Material zurückgehalten wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung.
2 zeigt diese Vorrichtung nach dem Einsetzen in eine Aufnahme.
Die 3 bis 6 zeigen die Arbeitsweise dieser Vorrichtung.
7 zeigt eine Übersicht über die Verwendung dieser Vorrichtung.
8 zeigt eine zweite erfindungsgemäße Vorrichtung, vor dem Einsatz.
9 zeigt die gleiche Vorrichtung unterteilt in ihre beiden Bestandteile, wobei
10 eine Explosionsdarstellung des oberen Teiles zeigt.
11 zeigt die Herstellung des Teststreifenzusammenbaus, der in der Vorrichtung verwendet wird.
12 bis 16 zeigen einen Überblick über die Verwendung dieser Vorrichtung.
AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Die in 1 gezeigte Vorrichtung (10) weist Folgendes auf Einen zylindrischen Kunststoffbehälter (15); eine Probeneinlassöffnung (20), bedeckt von einem Nylonnetz (21), gebildet aus 0,15 mm Fasern, die einen Abstand von 0,25 mm haben; ein seitliches Loch (30), dargestellt in geöffneter Position; eine Lösung (40) von EBSS, versetzt mit 0,88 mg/ml Hyaluronsäure und 0,45% BSA; einen drehbaren Ring (50) aus Kunststoff, der ein Loch (51) aufweist, das zu dem Loch (30) ausgerichtet ist, um eine Auslassöffnung (35) auszubilden; eine Taste (60, gedrückt gezeigt), die eine Batterie und ein Schaltsystem zum Antreiben einer umlaufenden Wärmequelle (70) enthält, und an die ein Reservoir für eine Lösung (65, leer dargestellt), ein Folienverschluss (66, durchbrochen dargestellt) und ein hohler Fo lienschneider (68) angebracht ist; und einen außen befestigten Teststreifen (80).
2 zeigt die Vorrichtung (10) aus 1, befestigt an eine Samenaufnahme (90) mit geneigten Wänden. Eine Samenprobe (100) wurde in der Vertiefung (99) auf dem Boden der Aufnahme (90) gesammelt, wobei einiges hiervon in den Aufnahmenüberlauf (95) übergelaufen ist.
3 zeigt die Vorrichtung (10) unmittelbar vor der Verwendung. Eine Samenprobe (100) wurde in der Vertiefung (99) gesammelt und steht in Kontakt mit der Einlassöffnung (20). Die Auslassöffnung (35) ist geschlossen, denn das Loch (51) in dem Ring (50) ist nicht zu dem Ring (30) in der Behälterwand ausgerichtet. Die Lösung (40) wird in dem Reservoir (65) durch einen Folienverschluss (66) gehalten, beabstandet zu der Einlassöffnung (20).
Um den Test zu beginnen, wird die Taste (60) gedrückt, wie in 4a gezeigt. Der Folienschneider (68) durchbohrt den Verschluss (66) und setzt die Lösung (40) frei. Die motilen Spermien in der Probe (100) sind nun in Flüssigkeitsverbindung mit der Lösung (40) und sind in der Lage, über den Einlass (20) in diese hineinzumigrieren, wie in 4b gezeigt, wohingegen nicht-motile Spermien und Samenplasma in der Probe (100) zurückbleiben. Die Taste (60) aktiviert ebenfalls die Wärmequelle (70), wodurch die Temperatur der Lösung (40) auf 37°C gebracht wird.
Nach einer Dauer von etwa 30 Minuten, während der die motilen Spermien in die Lösung (40) migriert sind, wird der Ring (50) gedreht, wie in 5 gezeigt, so dass dessen Loch (51) zu dem Loch (30) ausgerichtet ist, wodurch die Auslassöffnung (35) geöffnet wird. Die Lösung (40), die nun motile Spermien enthält, kann den Behälter verlassen und mit dem außen befestigten Teststreifen (80) in Kontakt treten.
Wie in 6 gezeigt, fließt die Lösung durch Kapillarwirkung durch die eng angrenzende Kunststoffstreifen (81a & b) und den Boden des Teststreifens (80). Zwischen den Streifen (81a & b) liegt ein Bereich (82) von dehydriertem goldmarkiertem Maus-Anti-CD59. Wenn die Lösung den Bereich (82) zwischen den Streifen (81a & b) passiert, wird der Antikörper rehydriert und ist in der Lage, an Spermien in der Lösung zu binden. Weiter stromabwärts erreicht die Lösung den Nitrocellulosestreifen (83). Die Porengröße des Streifens (83) ist zu klein, um die Spermien eintreten zu lassen, so dass diese an seinem Einlass (84) eingefangen werden. Freier Marker fließt weiter, bis dieser stromabwärts an einer Linie (85) von immobilisiertem Anti-Maus-Antikörper eingefangen wird.
Wie in 7 gezeigt, sind der Einlass (84) und die Linie (85) durch das Fenster sichtbar. In 7E sind zwei Linien sichtbar, die das Vorhandensein von motilen Spermien in der Ausgangsprobe anzeigen. Hierzu im Gegensatz ist in 7F nur die Kontrolllinie (85) sichtbar, wodurch die Abwesenheit von motilen Spermien in der Ausgangsprobe angezeigt wird.
Die Vorrichtung (110), die in den 8 und 9 dargestellt ist, weist ein oberes Teil (191) und ein unteres Teil (190) auf, die zusammenpassen. Der Boden des unteren Teiles (190) enthält eine Vertiefung (199), in die eine Samenprobe (200) gegeben wird. Das obere Teil (191) weist ein vertieftes Fenster (113), eine Taste (160) und einen Knopf (150) auf. Der Knopf (150) und Taste (160) sind derart geformt, so dass der Knopf (150) nicht gedreht werden kann, bis die Taste (160) gedrückt worden ist.
In 10 sind die inneren Bestandteile des oberen Teiles (191) in einer Explosionsdarstellung gezeigt. Das obere Teil (191) ist aus einem Oberteil (192) gebildet, das in eine Aufnahme (193) eingreift. Auf dem Boden der Taste (160) befindet sich eine Nadel (168) und, wenn die Taste (160) betätigt wird, durchsticht die Nadel (168) das Reservoir (165), welches, vor der Betätigung, eine Lösung (140) von EBSS enthält, die mit 0,88 mg/ml Hyaluronsäure und 0,45% BSA versetzt ist. Das Reservoir (165) befindet sich in einem Kunststoffgehäuse (166), das einen Halsbereich (115) und einen Kopfbereich (120) aufweist. Die Seite des Halses (115) enthält ein Loch (130), in das das rohrförmige Teil (186) der Teststreifenanordnung (180) eingreift. Der Boden des Kopfbereiches (120) ist mit einem kreisförmigen Nylonnetz (121) bedeckt, das aus 0,15 mm Fasern gebildet ist, die einen Abstand von 0,25 mm haben. In der zusammengebauten Vorrichtung (110) steht das Netz (121) in Kontakt mit der Probe (200) innerhalb der Vertiefung (199). Der Knopf (150) ist über einen Zahnstangenmechanismus an einem Bolzen (155) befestigt, der vor der Verwendung durch das rohrförmige Teil (186) in Richtung des Loches (130) hindurchgeht. Die Aufnahme (193) enthält eine Batterie (194), die die Wärmequelle (170) versorgt. Nach dem Zusammenbau umgibt die Wärmequelle (170) den Hals (115) umlaufend, mit Ausnahme des Bereiches des Loches (130).
Explosionsdarstellungen und Darstellungen des zusammengebauten Teststreifenzusammenbaus (180) sind in 11 gezeigt. In der zusammengebauten Vorrichtung (110) steht das rohrförmige Teil (186) in direkter Verbindung mit dem Loch (130) und vor der Verwendung greift der Bolzen (155) in das rohrförmige Teil (186) ein und füllt dieses aus, wodurch verhindert wird, dass Flüssigkeit hindurchfließen kann. Wenn der Bolzen (155) durch Betätigung des Knopfes (150) in Richtung des in 11 gezeigten Pfeiles zurückgezogen wird, öffnet sich das rohrförmige Teil (186), um zusammen mit dem Loch (130) eine Auslassöffnung (135) zu bilden, durch die Flüssigkeit fließen kann. Das rohrförmige Teil (186) und der Bolzen (155) funktionieren deshalb in der Art einer Spritze. Flüssigkeit fließt durch das rohrförmige Teil (186) in den Kapillarraum zwischen durchsichtige Plastikgehäuse (181a; 181b) und tritt unter einem Kissen (182) hindurch, das dehydrierte goldgetaggte Maus-Anti-CD59 enthält. Wenn die Flüssigkeit das Kissen (182) passiert, wird der Antikörper re-hydriert und kann in die Flüssigkeit übertreten, wo dieser in der Lage ist, an Spermien zu binden. Die Flüssigkeit fließt weiter in Richtung und in den Nitrocellulosestreifen (183), unterstützt durch ein Geflecht (188). Die Porengröße des Streifens (183) ist zu klein, als dass Spermien eindringen könnten, so dass diese an dessen Einlass (184) eingefangen werden. Die Antikörper können die am Einlass (184) eingefangenen Spermien binden und einen rosa Streifen ausbilden. Jeder freie Antikörper fließt weiter, bis dieser stromabwärts an einer Linie (185) von immobilisiertem Antimaus-Antikörper eingefangen wird.
Die Vorrichtung wird verwendet, wie in den 12 bis 16 illustriert:

– In 12 wird eine Samenprobe (200; z. B. erhalten durch Masturbation) in ein unteres Teil (190) gegeben und sammelt sich in einer Vertiefung (199), während das untere Teil (190) auf einer flachen Oberfläche liegt.
– Nach 30 Minuten wird das obere Teil (199) mit dem unteren Teil (190) zusammengefügt, wie in 13 gezeigt, um die Vorrichtung (110) auszubilden.
– Dann wird die Taste (160) gedrückt, wie in 14 gezeigt. Dadurch wird die Lösung (140) freigesetzt und aktiviert ebenfalls die Wärmequelle (170), die die Temperatur der Lösung (140) auf 37°C bringt.
– Nach etwa 30 Minuten, während der die Spermien in die Lösung (140) eindringen können und eine Temperaturäquilibrierung stattfindet, zeigt das LED (116) an, dass der Knopf (150) gedreht werden soll, wie in 15.
– Dadurch wird der Bolzen (155) zurückgezogen und motile Spermien aus der Probe (200), die in das Medium (140) geschwommen sind, können in das rohrförmige Teil (186) des Teststreifens (180) eintreten. Die Lösung (140) fließt durch den Teststreifen (180) durch Kapillarwirkung in Richtung des Geflechts (188). In Lösung befindliche Spermien werden am Einlass (184) des Nitrocellulosestreifens (183) zurückgehalten. Freie goldgetaggte Antikörper fließen weiter, bis diese stromabwärts an einer Linie (185) von immobilisierten Anti-Maus-Antikörpern eingefangen werden. Die Linie bei (184) in 16 zeigt ein positives Ergebnis an. Die Linie bei (185) zeigt an, dass der Test korrekt funktioniert hat.

Es versteht sich, dass die Erfindung lediglich beispielhaft beschrieben wurde und Modifizierungen vorgenommen werden können, solange diese im Umfang der Ansprüche bleiben.

Claims

Vorrichtung zur Abtrennung und Detektion motiler Spermien in einer flüssigen Probe, wobei die Vorrichtung Folgendes aufweist: – einen Probentrennbehälter mit: (a) einer Probeneinlassöffnung; (b) einer Probenauslassöffnung, die in Ausgangsstellung geschlossen ist; (c) einem Probentrennmedium, in das die motilen Spermien der Probe über die Probeneinlassöffnung hineinfließen können, und (d) einem Bedienungselement, über das die Probenauslassöffnung geöffnet werden kann, so dass das Probentrennmedium durch die Probenauslassöffnung aus dem Behälter fließen kann – ein Spermiendetektionsmittel mit: (i) einem mit der Auslassöffnung in Verbindung stehenden Einbringbereich; (ii) einem Detektionsbereich, in dem das Vorhandensein von Spermien detektiert werden kann, und (iii) einem Reagenzienbereich, der ein Reagenz enthält, das mit Spermien reagieren kann, um deren Detektion in dem Detektionsbereich zu erleichtern, wobei diese Bereiche derart angeordnet sind, so dass ein Kapillarfluss der Spermien von dem Einbringbereich zu dem Detektionsbereich ermöglicht wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Bereiche derart angeordnet sind, so dass ein Kapillarfluss der Spermien von dem Einbringbereich über den Reagenzienbereich zu dem Detektionsbereich ermöglicht wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Detektionsbereich ein Spermieneinfangbereich ist, der in der Lage ist, Spermien zu immobilisieren, und der Reagenzienbereich ein Markierungsbereich ist, der einen Marker enthält, der an Spermien binden kann.
Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Behälter zusätzlich ein zweites Bedienungselement (e) aufweist, über das es ermöglicht wird, dass das Trennmedium über die Einlassöffnung mit einer Probe in Kontakt treten kann.
Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, wobei der Einfangbereich porös ist und eine solche Porengröße aufweist, dass freier Marker hindurchtreten kann, wohingegen an Spermien gebundener Marker nicht hindurchtreten kann.
Vorrichtung nach Anspruch 3, Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei die Detektionsmittel einen stromabwärts des Detektionsbereichs angeordneten Bereich beinhalten, der Marker zurückhält, der nicht an Spermien gebunden ist.
Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Einbringbereich nicht-faserig ist.
Vorrichtung nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Vorrichtung einen Temperatursensor beinhaltet.
Vorrichtung nach Anspruch 8, die eine eigene Wärmequelle und ggf. ein Temperaturregelungsmittel beinhaltet.