BR102014028937A2

BR102014028937A2 - aparelho e métodos para separação de espermatozoides

Info

Publication number: BR102014028937A2
Application number: BR102014028937A
Authority: BR
Inventors: Armand Zini; David Allan Sinton; Lise Marie Eamer; Marion Vollmer; Reza Nosrati
Original assignee: Univ Toronto; Univ Mcgill
Priority date: 2013-11-19
Filing date: 2014-11-19
Publication date: 2015-10-13
Also published as: US9663755B2; US20150140655A1

Abstract

aparelho e métodos para separação de espermatozoides. a presente invenção refere-se a várias concretizações de métodos e aparelhos para a separação de espermatozoide, incluindo um aparelho tendo um reservatório de entrada e de descarga, e ainda: i) uma matriz radial de microcanais dispostas entre os reservatórios de entrada e de descarga para proporcionar a comunicação fluida entre os mesmos e para dirigir o espermatozoide móvel para dentro a partir do reservatório de entrada para o reservatório de descarga; ou ii) pelo menos um caminho de microcanais disposto entre os reservatórios de entrada e de descarga para proporcionar a comunicação fluida entre os mesmos, o pelo menos um caminho de microcanais tendo uma entrada de caminho adjacente ao reservatório de entrada, uma saída de caminho adjacente ao reservatório de descarga, e uma junção situada entre a entrada de caminho e a saída de caminho para dirigir uma parte do espermatozoide que entra na entrada de caminho em direção ao reservatório de descarga com base no comportamento de parede de natação do esperma. os métodos incluem encher um aparelho com líquido tampão, introduzindo o sêmen em um reservatório de entrada e recuperando o espermatozoide separado do sêmen do reservatório de descarga.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "APARELHO E MÉTODOS PARA SEPARAÇÃO DE ESPERMATOZÓIDES". CAMPO [001] As modalidades descritas referem-se a aparelho e a métodos para separação de espermatozóides, e mais particularmente a a-parelho e métodos pelo menos para uma de separação de espermatozóides de alto rendimento e separação de espermatozóides baseada no comportamento de nado até a parede.

ANTECEDENTES [002] A infertilidade foi uma condição crescente ao longo das décadas passadas (Bushnik et al2012). Estudos revelaram que 5,4% e 8,5% dos casais canadenses experimentaram problemas de fertilidade em 1984 e 1992, respectivamente (Balakrishnan e Fernando, 1993; Dulberg e Stephens, 1993). Em 2009-2010, a porcentagem de casais afetados pela infertilidade aumentou para 11-15%, que é similar à prevalência de infertilidade em outros países industrializados (Bushnik et al., 2012; Boivin et al., 2007; Boivin et al., 2009). Uma vez que o tratamento in vivo da infertilidade raramente é possível, a maior parte dos casais estéreis têm que depender de Tecnologias de Reprodução Assistida (ARTs) (Burger e Baker, 1987). Correspondendo ao crescimento na infertilidade, os números de tratamentos de Fertilização In Vitro (IVF) no Canadá aumentaram de -25.000 ciclos de IVF com uma taxa de nascimento de vivos de 20% (=5.000 nascimentos), para -35.000 ciclos de IVF com uma taxa de nascimento de vivos de 30% (=10.500 nascimentos) na década passada (Yuzpe et al., 2002; Pierson et al., 2011). Para cada ciclo de IVF um casal pode esperar custos na média de US$ 5.660, limitando os serviços canadenses de infertilidade a famílias de renda média e alta (OVO Consulting, 2009). [003] A seleção de espermatozóides é requerida para ART, e a seleção pode influenciar tanto na taxa de êxito de tratamento como na saúde da descendência (Schultz e Williams, 2002; Said e Land, 2011). Em IVF, um oócito é incubado com uma alíquota de 50.000 espermatozóides de uma amostra inicial na ordem de 100 milhões de espermatozóides (Coughlan e Ledger, 2008). Na Injeção de Espermatozóides Intracitoplasmática (ICSI), um espermatozóide único é selecionado e diretamente injetado em um oócito (Palermo et al., 1992). [004] Somente no Canadá, estimou-se que os tratamentos de IVF envolvam custos totais de US$ 437 milhões em 2002. Isto constitui -0,42% da quantia dispendida na saúde no Canadá naquele ano (Col-lins, 2002).

SUMÁRIO [005] A introdução seguinte é fornecida para introduzir o leitor à discussão mais detalhada a seguir. A introdução não é destinada a limitar ou definir alguma matéria reivindicada ou objeto até o momento não reivindicado. Uma ou mais modalidades podem residir em qualquer combinação ou subcombinação dos elementos ou etapas de processo descritas em qualquer parte deste documento incluindo suas reivindicações e figuras que podem servir como base da matéria objeto reivindicada. [006] Em um amplo aspecto, em pelo menos uma modalidade descrita neste pedido, é fornecido um aparelho para separação de espermatozóides, o aparelho compreendendo: um reservatório de entrada para receber uma amostra de esperma; um reservatório de saída para coletar os espermatozóides separados da amostra; e um arranjo radial de microcanais dispostos entre o reservatório de entrada e o reservatório de saída para fornecer comunicação de fluidos entre eles, o arranjo radial de microcanais que são configurados para controlar os espermatozóides dotados de motilidade internamente do reservatório de entrada ao reservatório de saída. [007] Em algumas modalidades, o arranjo radial de microcanais compreende uma pluralidade de percursos de microcanais entre o reservatório de entrada e o reservatório de saída, cada percurso de mi-crocanal compreendendo uma via de saída adjacente ao reservatório de saída, e pelo menos uma via de entrada adjacente ao reservatório de entrada. [008] Em algumas modalidades, uma largura de cada percurso de microcanal está entre 50 pm e 300 pm, e em que uma altura de cada percurso de microcanal está entre 25 pm e 100 pm. [009] Em algumas modalidades, a largura de cada percurso de microcanal está entre 100 pm e 200 pm, e em que a altura de cada percurso de microcanal está entre 50 pm e 75 pm. [0010] Em algumas modalidades, um comprimento de cada percurso de microcanal está entre 6 mm e 9 mm. [0011] Em algumas modalidades, a pluralidade de percursos de microcanais compreende pelo menos 200 percursos de microcanais entre o reservatório de entrada e o reservatório de saída. [0012] Em algumas modalidades, pelo menos uma via de entrada de cada percurso de microcanal compreende duas vias de entrada separadas por um componente de parede divisora. [0013] Em algumas modalidades, o aparelho compreende ainda uma pluralidade de componentes antirretorno localizados dentro do reservatório de saída e configurados para restringir os espermatozóides dotados de motilidade de reentrada no arranjo radial de microcanais após a saída do arranjo radial de microcanais. [0014] Em algumas modalidades, há uma pluralidade de arranjos radiais cada um tendo uma pluralidade de microcanais que são acoplados ao reservatório de entrada e o reservatório de saída e os arranjos radiais são empilhados para aumentar o número de percursos de microcanais entre o reservatório de entrada e o reservatório de saída. [0015] Em algumas modalidades, pode haver entre 2 e 16 arranjos radiais empilhados. Em algumas outras modalidades, pode haver mais de 16 arranjos radiais empilhados. Por exemplo, se cada camada de arranjo radial é fabricada bastante fina, então mais camadas de arranjos radiais podem ser empilhadas uma em cima da outra. [0016] Em algumas modalidades, o aparelho pode compreender ainda guias semicirculares dispostas ao longo de uma parede da entrada que se estende de ambos os lados do canal de entrada para redirecionar os espermatozóides para longe da parede de entrada. [0017] Em algumas modalidades, as guias semicirculares podem ter raios de menos de aproximadamente 150 pm. [0018] Em algumas modalidades, o aparelho pode compreender ainda pelo menos um arranjo radial adicional de microcanais em camadas acima de outro arranjo radial de microcanais. [0019] Em outro amplo aspecto, em pelo menos uma modalidade descrita neste pedido, é fornecido um aparelho para separação de espermatozóides, o aparelho compreendendo: um reservatório de entrada para receber uma amostra de esperma; um reservatório de saída para coletar os espermatozóides separados da amostra; e pelo menos um percurso de microcanal disposto entre o reservatório de entrada e o reservatório de saída para fornecer comunicação de fluidos entre eles, pelo menos um percurso de microcanal que compreende uma via de entrada adjacente ao reservatório de entrada, uma via de saída adjacente ao reservatório de saída e uma junção localizada entre a via de entrada e a via de saída para controlar uma porção de espermatozóides dotados de motilidade que entra na via de entrada em direção ao reservatório de saída baseado no comportamento de nado até a parede do esperma. [0020] Em algumas modalidades, uma largura de pelo menos um percurso de microcanal está entre 50 pm e 300 pm, e em que uma altura de pelo menos um percurso de microcanal está entre 25 pm e 100 μιη. [0021] Em algumas modalidades, a largura de pelo menos um percurso de microcanal está entre 100 pm e 200 pm, e em que a altura de pelo menos um percurso de microcanal está entre 50 pm e 75 pm. [0022] Em algumas modalidades, um comprimento de pelo menos um percurso de microcanal está entre 6 mm e 9 mm. [0023] Em algumas modalidades, a junção compreende um percurso esquerdo e um percurso direito de espermatozóides dotados de motilidade que nadam através de pelo menos um percurso de microcanal da via de entrada e em direção ao reservatório de saída. [0024] Em algumas modalidades, a junção compreende ainda um percurso central disposto entre o percurso esquerdo e o percurso direito. [0025] Em algumas modalidades, o percurso esquerdo leva à via de saída, e o percurso direito leva a uma câmara de coleta. [0026] Em algumas modalidades, o percurso direito leva à via de saída, e o percurso esquerdo leva a uma câmara de coleta. [0027] Em algumas modalidades, um ângulo do canal lateral entre uma parede lateral de pelo menos um percurso de microcanal localizado entre a via de entrada e a junção e uma parede lateral mútua do percurso esquerdo ou do percurso direito é menos de aproximadamente 105°. [0028] Em algumas modalidades, o ângulo do canal lateral é aproximadamente 45°. [0029] Em algumas modalidades, tanto o percurso esquerdo como o percurso direito levam à via de saída, e o percurso central leva a uma câmara de coleta. [0030] Em algumas modalidades, o percurso esquerdo leva à via de saída, e o percurso central e o percurso direito cada um leva a uma câmara de coleta. [0031] Em algumas modalidades, o percurso direito leva à via de saída, e o percurso central e o percurso esquerdo cada um leva a uma câmara de coleta. [0032] Em algumas modalidades, o percurso central leva à via de saída, e o percurso esquerdo e o percurso direito cada um leva a uma câmara de coleta. [0033] Em algumas modalidades, o aparelho compreende um arranjo radial de percursos de microcanais dispostos entre o reservatório de entrada e o reservatório de saída, o arranjo radial de percursos de microcanais compreendendo pelo menos um percurso de microcanal. [0034] Em algumas modalidades, há uma pluralidade de arranjos radiais cada um tendo uma pluralidade de microcanais que são acoplados ao reservatório de entrada e ao reservatório de saída e os arranjos radiais são empilhados para aumentar o número de percursos de microcanais entre o reservatório de entrada e o reservatório de saída. [0035] Em algumas modalidades, pode haver entre 2 e 16 arranjos radiais empilhados. Em algumas outras modalidades, pode haver mais de 16 arranjos radiais empilhados. Por exemplo, se cada camada de arranjo radial é fabricada bastante fina, então mais camadas de arranjos radiais podem ser empilhadas uma em cima da outra. [0036] Em algumas modalidades, o aparelho pode compreender ainda guias semicirculares dispostas ao longo de uma parede de entrada que se estende de ambos os lados do canal de entrada para redirecionar o esperma para longe da parede de entrada. [0037] Em algumas modalidades, guias semicirculares podem ter raios menores que aproximadamente 150 pm. [0038] Em algumas modalidades, o aparelho compreende ainda pelo menos um componente antirretorno localizado dentro do reservatório de saída e configurado para restringir os espermatozóides dota- dos de motilidade de reentrada em pelo menos um percurso de micro-canal após saída da via de saída. [0039] Em algumas modalidades, o reservatório de entrada é dimensionado para receber aproximadamente 1 mL de sêmen. [0040] Em algumas modalidades, o aparelho é fabricado de pelo menos um de Polidimetilsiloxano (PDMS), policarbonato, poliestireno e vidro. [0041] Em outro amplo aspecto, em pelo menos uma modalidade descrita neste pedido, é fornecido um método para separação de espermatozóides, o método compreendendo: fornecimento de um aparelho compreendendo: um reservatório de entrada para receber uma amostra de esperma; um reservatório de saída para coletar os espermatozóides separados da amostra; e um arranjo radial de microcanais dispostos entre o reservatório de entrada e o reservatório de saída para fornecer comunicação de fluidos entre eles, o arranjo radial de microcanais que são configurados para controlar espermatozóides dotados de motilidade internamente do reservatório de entrada ao reservatório de saída; preenchimento do reservatório de entrada, do reservatório de saída e do arranjo radial de microcanais com um fluido tampão; introdução de uma amostra de sêmen no reservatório de entrada; e recuperação dos espermatozóides separados da amostra do reservatório de saída. [0042] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a cobertura do reservatório de saída com um componente de fechamento de saída antes do ato de introdução e descobrimento do reservatório de saída antes do ato de recuperação. [0043] Em algumas modalidades, o componente de fechamento de saída compreende uma camada de uma fita isolante. [0044] Em algumas modalidades, portas de seringa são usadas como componentes de fechamentos de entrada e de saída. [0045] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a cobertura do reservatório de entrada com um componente de fechamento de entrada após o ato de introdução. [0046] Em algumas modalidades, o ato de recuperação é executado entre aproximadamente 10 e 60 minutos após ato de introdução. [0047] Em algumas modalidades, o ato de recuperação é executado entre aproximadamente 12 e 17 minutos após ato de introdução. [0048] Em algumas modalidades, o fluido tampão compreende um tampão salino tamponado HEPES compreendendo álcool polivinílico aproximadamente 1% e metilcelulose aproximadamente 0,5%. [0049] Em algumas modalidades, o fluido tampão compreende um tampão de baixa ou alta viscosidade. [0050] Em algumas modalidades, o ato de preenchimento compreende submersão do aparelho em um vaso contendo o fluido tampão e aplicação de um vácuo para remover as bolhas de ar do arranjo radial de microcanais. [0051] Em algumas modalidades, o método compreende ainda, antes do ato de introdução, equilíbrio de uma temperatura do aparelho preenchido com o tampão a aproximadamente 37Ό, e m anter a temperatura do aparelho preenchido com o tampão em aproximadamente 37Ό até o ato de recuperação. [0052] Em algumas modalidades, o aparelho pode compreender ainda pelo menos um arranjo radial adicional de percursos de microcanais em camadas acima de um arranjo adjacente de percursos de microcanais. [0053] Em outro amplo aspecto, em pelo menos uma modalidade descrita neste pedido, é fornecido um método para separação de espermatozóides, o método compreendendo: fornecimento de um aparelho compreendendo: um reservatório de entrada para receber uma amostra de esperma; um reservatório de saída para coletar os esper- matozoides separados da amostra; e pelo menos um percurso de mi-crocanal disposto entre o reservatório de entrada e o reservatório de saída para fornecer comunicação de fluidos entre eles, pelo menos um percurso de microcanal compreendendo uma via de entrada adjacente ao reservatório de entrada, uma via de saída adjacente ao reservatório de saída e uma junção localizada entre a via de entrada e a via de saída para controlar uma porção do espermatozóide que entra na via de entrada em direção ao reservatório de saída baseado no comportamento de nado até a parede do esperma; preenchimento do reservatório de entrada, o reservatório de saída e peto menos um percurso de microcanal com um fluido tampão; introdução de uma amostra de sêmen no reservatório de entrada; e recuperação dos espermatozóides separados da amostra do reservatório de saída. [0054] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a cobertura do reservatório de saída com um componente de fechamento de saída antes do ato de introdução e descobrimento do reservatório de saída antes do ato de recuperação. [0055] Em algumas modalidades, o componente de fechamento de saída compreende uma camada de uma fita isolante. [0056] Em algumas modalidades, o método compreende ainda a cobertura do reservatório de entrada com um componente de fechamento de entrada após ato de introdução. [0057] Em algumas modalidades, o ato de recuperação é executado entre aproximadamente 10 e 60 minutos após ato de introdução. [0058] Em algumas modalidades, a recuperação é realizada entre aproximadamente 12 e 17 minutos após ato de introdução. [0059] Em algumas modalidades, o fluido tampão compreende um tampão salino tamponado HEPES compreendendo álcool polivinílico aproximadamente 1% e metilcelulose aproximadamente 0,5%. [0060] Em algumas modalidades, o fluido tampão compreende um tampão de baixa ou alta viscosidade. [0061] Em algumas modalidades, o ato de preenchimento compreende submersão do aparelho em um vaso contendo o fluido tampão e aplicação de um vácuo para remover as bolhas de ar de pelo menos um percurso de microcanal. [0062] Em algumas modalidades, o método compreende ainda, antes do ato de introdução, equilíbrio de uma temperatura do aparelho preenchido com o tampão a aproximadamente 37Ό, e m anter a temperatura do aparelho preenchido com o tampão em aproximadamente 37Ό até o ato de recuperação. [0063] Será apreciado por um especialista na técnica que um método ou o aparelho descrito neste pedido podem personificar um ou mais dos atributos contidos neste pedido e que os atributos possam ser usados em qualquer particular combinação ou subcombinação. [0064] Outros atributos e vantagens do presente pedido de patente ficarão evidentes da seguinte descrição detalhada tomada em conjunto com os desenhos acompanhantes. Deve ser entendido, entretanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, ao indicar as modalidades preferenciais do pedido de patente, são dados por meio de ilustração somente, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e do escopo do pedido de patente ficarão evidentes para os especialistas na técnica desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0065] Para uma melhor compreensão de várias modalidades descritas neste pedido, e mostrar mais claramente como estas várias modalidades podem ser levadas a efeito, referência será feita, por meio de exemplo, aos desenhos acompanhantes que mostram pelo menos uma modalidade exemplo e as figuras serão resumidamente descritas agora. [0066] A FIG. 1 é uma vista em perspectiva explodida de um apa- relho para separação de espermatozóides conforme uma modalidade exemplo; [0067] a FIG. 2A é uma vista superior do aparelho da FIG. 1; [0068] a FIG. 2B é uma vista de corte, parcialmente alargada, ao longo da linha 2B - 2B na FIG. 2A do aparelho da FIG. 1; [0069] a FIG. 2C é uma vista superior de um exemplo de uma modalidade alternativa de um aparelho para separação de espermatozóides; [0070] a FIG. 3A é uma vista em perspectiva, parcialmente alargada, do aparelho da FIG. 1; [0071] a FIG. 3B é uma vista superior, parcialmente alargada, do arranjo de microcanais do aparelho da FIG. 3A; [0072] a FIG. 4 é uma vista superior, parcialmente alargada, de um arranjo alternativo de microcanais conforme outra modalidade exemplo; [0073] a FIG. 5 é uma vista superior, parcialmente alargada, do arranjo de microcanais da FIG. 4 com uma pluralidade de componentes antirretorno; [0074] as FIGS. 6A-6C são diagramas esquemáticos de fabricação, ligação e recheio do aparelho da FIG. 1 conforme uma modalidade; [0075] as FIGS. 7A-7C são diagramas esquemáticos de um método de separação de espermatozóides conforme pelo menos uma modalidade exemplo; [0076] as FIGS. 8A-8D são diagramas mostrando a concentração de espermatozóides e a vitalidade por experimento de 15 min com o espermatozóide de touros: A FIG. 8A é um diagrama de concentrações e contagens (entrada) de espermatozóides para experimentos com amostras marcadas antes da injeção (n=5), a FIG. 8B é um diagrama de vitalidade da porcentagem correspondente do espermato- zoide selecionado diretamente após coleta da amostra (n=5), a FIG. 8C é um diagrama de concentrações e contagens de espermatozóides (mostrado a entrada) para experimentos com marcação após o processo de seleção (n>4), e a FIG. 8D é um diagrama de vitalidade da porcentagem correspondente dos espermatozóides selecionados 30 minutos (requeridos para o procedimento de marcação) após a coleta da amostra, em comparação com a vitalidade de espermatozóides bruta inicial (n>4); [0077] a FIG. 9 é um diagrama mostrando o efeito do tempo e do comprimento de microcanal na vitalidade dos espermatozóides de touros selecionados; [0078] as FIGS. 10A-10D são diagramas mostrando ensaios de estrutura de cromatina de espermatozóides representativos (SCSAs) de experimento de 10 min de espermatozóides humanos com dispositivo de 7,5 mm: a FIG. 10A mostra um histograma de ensaio de estrutura de cromatina de espermatozóides humanos que indica a população de espermatozóides com fragmentação de DNA (%DFI) para o sêmen bruto, a FIG. 10B mostra um citograma de análise de estrutura de cromatina de espermatozóides humanos indicando a população de espermatozóides com alta marcabilidade de DNA (%HDS) para o sêmen bruto e as FIGS. 10C-D mostram os resultados de ensaio análogos de espermatozóides selecionados coletados do dispositivo. [0079] as FIGS. 11A-11C são diagramas mostrando contagem de espermatozóides humanos selecionados e resultados de integridade de DNA com comprimentos de microcanal de 6 mm, 7,5 mm e 9 mm (n=4). A FIG. 11A é um diagrama do sêmen bruto inicial e concentrações de espermatozóides selecionadas com as contagens de espermatozóides correspondentes à inserção mostrada, a FIG. 11B é um diagrama da porcentagem do índice de fragmentação de DNA (%DFI), e a FIG. 11C é um diagrama da porcentagem de alta marcabilidade do DNA (%HDS); [0080] as FIGS. 12A-12B são diagramas mostrando a proporção de porcentagem da concentração de entrada para a de saída tanto de espermatozóides de touro (FIG. 12A) quanto espermatozóides humanos (FIG. 12B) (n>4) para corridas de dispositivo de 6 mm, 7,5 mm e 9 mm; [0081] as FIGS. 13A-13C são diagramas mostrando contagem de espermatozóides humanos selecionados e resultados de integridade de DNA para experimentos de 10, 15, e 20 minutos usando dispositivos de 7,5 mm (n=4): FIG. 13A é um diagrama do sêmen bruto inicial e a concentração de espermatozóides selecionados com as contagens de espermatozóides a inserção mostrada, a FIG. 13B é um diagrama da porcentagem do índice de fragmentação de DNA (%DFI), e a FIG. 13C é um diagrama da porcentagem de alta marcabilidade do DNA (%HDS); [0082] a FIG. 14A é uma vista esquemática superior de um dispositivo microfluídico com três desenhos de junção diferentes; [0083] a FIG. 14B é um diagrama de uma distribuição de nadadores diretos (SS) e nadadores de parede (WS) de três desenhos de junção diferentes da FIG. 14A; [0084] aA FIG. 14C é uma vista esquemática superior mostrando a partida dos espermatozóides dos cantos do canal; [0085] a FIG. 15A é um diagrama de porcentagens de espermatozóides identificados como nadadores à esquerda (LS) e nadadores à direita (RS) em dispositivos fabricados de materiais diferentes e contendo desenhos diferentes; [0086] a FIG. 15B é uma comparação de espermatozóides que nadam à esquerda ou à direita dependendo de uma superfície de vidro de fundo ou topo; [0087] a FIG. 16A é um diagrama esquemático de um dispositivo microfluídico de alto rendimento mostrando vistas superiores das configurações de canal para selecionar espermatozóides baseados no comportamento de nado à esquerda, diretamente, ou à direita até a parede; [0088] a FIG. 16B é um diagrama da concentração de espermatozóides de touros coletada de cada uma das passagens dos nadadores à esquerda (LS), nadadores diretos (SS) e nadadores à direita (RS); [0089] a FIG. 16C é um diagrama da vitalidade de porcentagem dos espermatozóides de touros coletados de cada uma das saídas de espermatozóides LS, SS e RS; [0090] as FIGS. 17A-17D são diagramas mostrando a concentração, a vitalidade e a avaliação de DNA de espermatozóides humanos classificados pelo comportamento de nado até a parede: a FIG. 17A é um diagrama da concentração de espermatozóides coletados de cada uma das passagens do espermatozóides nadadores à esquerda (LS), nadadores diretos (SS) e nadadores à direita (RS) comparando com a amostra de sêmen bruto; a FIG. 17B é um diagrama de vitalidade das porcentagem dos espermatozóides coletados de cada uma das passagens de LS, SS e RS comparando com a amostra de sêmen bruto; a FIG. 17C é um diagrama do índice de Fragmentação de DNA (DFI) de porcentagem dos espermatozóides coletados das passagens comparando com a amostra de sêmen bruto; e a FIG. 17D é um diagrama da porcentagem de alta marcabilidade do DNA (%HDS) dos espermatozóides coletados das saídas quando comparados com a amostra de sêmen bruto; [0091] as FIGS. 18A-18B são diagramas mostrando uma porcentagem de índice de Fragmentação de DNA (DFI) e de Alta Marcabilidade do DNA (%HDS) dos espermatozóides coletados das saídas quando comparados com a amostra de sêmen bruto em relação a um Resultado Percoll; [0092] a FIG. 19 é uma vista superior, parcialmente alargada, de um arranjo alternativo de microcanais conforme outra modalidade e-xemplo; [0093] a FIG. 20 é uma vista superior, parcialmente alargada, de um arranjo alternativo de microcanais conforme outra modalidade e-xemplo; [0094] aA FIG. 21 é uma vista superior, parcialmente alargada, de um arranjo alternativo de microcanais conforme outra modalidade e-xemplo; [0095] a FIG. 22A é uma vista em perspectiva explodida de um aparelho alternativo para separação de espermatozóides conforme outra modalidade; [0096] a FIG. 22B é uma vista superior do aparelho da FIG. 22A; [0097] a FIG. 23 é uma vista em perspectiva explodida de um e-xemplo de uma modalidade alternativa de um aparelho para separação de espermatozóides; e [0098] a FIG. 24 é uma modalidade exemplo de uma organização para injetar e extrair espermatozóide de um aparelho para separação de espermatozóides que tem arranjos radiais de microcanais empilhados. [0099] Os aspectos e atributos adicionais das modalidades descritas neste pedido aparecerão da seguinte descrição tomada em conjunto com os desenhos acompanhantes.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES EXEMPLARES [00100] Vários aparelhos ou os processos serão descritos abaixo para fornecer um exemplo de pelo menos uma modalidade da matéria objeto reivindicada. Nenhuma modalidade descrita abaixo limita qualquer matéria objeto reivindicada e qualquer matéria objeto reivindicada pode cobrir processos, aparelhos, dispositivos ou sistemas que se diferenciam dos descritos abaixo. A matéria objeto reivindicada não é limitada a aparelhos, dispositivos, sistemas ou processos que têm todos os atributos de qualquer aparelho, dispositivo, sistema ou processo descrito abaixo ou a atributos comuns a múltiplos ou todos os aparelhos, dispositivos, sistemas, ou processos descritos abaixo. É possível que um aparelho, dispositivo, sistema ou processo descritos abaixo não sejam uma modalidade de qualquer matéria objeto reivindicada. Qualquer matéria objeto que é descrita em um aparelho, dispositivo, sistema ou processo descrito abaixo deste não é reivindicada neste documento pode ser a matéria objeto de outro instrumento protetor, por exemplo, pedido de patente continuado, e os requerentes, inventores, ou proprietários não pretendem abandonar, negar, ou dedicar ao público qualquer tal matéria objeto pela sua revelação neste documento. [00101] O aparelho e os métodos descritos neste pedido podem ser usados para a variedade de alvos, tais como (mas não limitados a) as combinações das seguintes aplicações: seleção de espermatozóides, purificação de esperma, alta seleção de viabilidade, seleção de alta concentração, alta seleção de integridade de DNA, alta seleção de maturidade ou melhora em população selecionada a partir de células com motilidade quanto a: viabilidade, concentração, integridade de DNA e/ou maturidade. O aparelho e os métodos podem ser usados para a purificação de espermatozóide clínica ou caseira para aplicação na fertilização in vitro (IVF) e inseminação intrauterina (IUI). [00102] Além disso, será apreciado que para simplicidade e clareza de ilustração, onde considerado apropriado, os numerais de referência podem ser repetidos entre as figuras para indicar elementos correspondentes ou análogos. Além disso, numerosos detalhes específicos são apresentados a fim de fornecer uma compreensão completa das modalidades exemplo descritas neste pedido. Entretanto, será entendido por aqueles especialistas ordinários na técnica que as modalida- des exemplo descritas neste pedido podem ser praticadas sem estes detalhes específicos. Em outros exemplos, métodos, procedimentos e componentes bem conhecidos não foram descritos detalhadamente para não obscurecer as modalidades exemplo descritas neste pedido. Também, a descrição não deve ser considerada como limitação do escopo das modalidades exemplo descritas neste pedido. [00103] Deve ser observado que os termos de grau tais como "substancialmente", "a cerca de" e "aproximadamente", como usados neste pedido, significam uma quantidade razoável do desvio do termo modificado tal que o resultado final não seja significativamente modificado. Estes termos de grau devem ser interpretados como incluindo um desvio do termo modificado se este desvio não negar o significado da palavra modificada. [00104] Adicionalmente, deve ser observado que o termo separação de espermatozóides usado neste pedido pode ser definido como (mas não limitada a) qualquer um destes termos: seleção, purificação, seleção rápida e seleção de alto rendimento de células com motilida-de. [00105] Além disso, a citação de qualquer faixa numérica por parâmetros neste pedido inclui todos os números e frações subsumidas dentro daquela faixa (por exemplo, 1 a 5 inclui 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,90, 4, e 5). Também deve ser entendido que se supõe que todos os números e frações destes são modificados pelo termo "aproximadamente" que significa uma variação até certa quantidade do número ao qual a referência está sendo feita se o resultado final não for significativamente modificado. [00106] Como usado neste pedido, o fraseado "e/ou" é destinado a representar um ou inclusivo. Isto é, "X e/ou Y" é destinado a significar X ou Y ou ambos, por exemplo. Como um exemplo adicional, "X, Y, e/ou Z" é destinado a significar X ou Y ou Z ou qualquer combinação destes. [00107] Como observado acima, a infertilidade masculina está crescendo no mundo inteiro (Bushnik et al., 2012; Boivin et al., 2007), Tecnologias De Reprodução Assistida (ARTs) somente são prósperas em 30% dos casos (Pierson et al., 2011). Uma vez que 40-50% de problemas de fertilidade são devido à infertilidade masculina, a seleção do espermatozóide mais fértil é absolutamente crucial para as taxas de êxito de ARTs (Norris, 2001). [00108] A seleção de espermatozóides é uma parte importante de ART e pode influenciar tanto em taxas de êxito como na saúde da descendência. A importância do espermatozóide e abordagens de separação foi subestimada e a pesquisa prévia na maioria foi concentrada em recuperação e cultivo do óvulo. Descobertas recentes indicam um papel muito maior do espermatozóide do que entregar somente um segundo conjunto de cromossomos (Ainsworth, 2005). Infelizmente, o processamento de espermatozóide atual e as técnicas de seleção de espermatozóides, como centrifugação e nado, apenas modificaram-se desde 1978 (Han et al., 2010). Um assunto é que as técnicas de separação atuais se diferenciam muito do processo in vivo e podem até causar dano ao espermatozóide (Han et al., 2010; Mortimer, 2000). Ainda, técnicas de seleção conhecidas muitas vezes dependem da experiência de técnico na seleção de espermatozóides, que torna o processo propenso a erros (Suh et al., 2005; Niederberger, 2004). [00109] Melhoras de processamento de espermatozóide e separação de espermatozóides são necessárias. O aparelho e os métodos descritos neste pedido podem ser implementados em clínicas de fertilidade, mas também podem ser aplicados em laboratórios de pesquisa de fertilidade, por exemplo, para investigar causas e tratamentos da infertilidade masculina, ou para a purificação de espermatozóide caseira para a aplicação em IVF e inseminação intrauterina (IUI). O apare- Iho e os métodos descritos neste pedido podem ser usados para separação de espermatozóides para IVF, ICSI, IUI e/ou outras ARTs. O a-parelho e os métodos descritos neste pedido também podem ser usados para aplicações não humanas, por exemplo, seleção de espermatozóides bovino (ou outro animal) para IVF ou outros métodos de melhoramento. [00110] O processamento de espermatozóide e a separação de espermatozóides realizada por várias modalidades de aparelhos e métodos descritos neste pedido podem ser usados para variedade de alvos, tais como (mas não limitados a) as combinações de duas ou mais das seguintes aplicações: seleção de espermatozóides, purificação de esperma, seleção de alta viabilidade, seleção de alta concentração, seleção de alta integridade de DNA, seleção de alta maturidade ou melhora na população selecionada a partir de células com motilidade em termo de: viabilidade, concentração, integridade de DNA e/ou maturidade. [00111] Um desafio da seleção de espermatozóides é ditado pela biologia: volume de amostra, concentração do espermatozóide e tempos de vida in vitro. Os valores de ordem de magnitude dados do volume de amostra (tipicamente ~1 ml_), concentração do espermatozóide (tipicamente ~100M/ml_), e tempo admissível para um processo de seleção (tipicamente 10-20 min), a taxa de sorteamento fundamental ditada pela biologia pode ser estimada como -100 kHz, que é significativamente mais alta do que tecnologias de sorteamento de célula disponíveis (Mazutis et al., 2013; Aharoni et al., 2006). [00112] Por exemplo, olhando para números típicos: de aproximadamente 196.000.000 de espermatozóides em uma amostra masculina média, -25.000 a 50.000 espermatozóides são tipicamente requeridos para a gotícula base de IVF, onde as células do óvulo são circundadas por um número específico de células espermáticas que possivelmente fertilizam o óvulo (Cooper et al., 2010; Wolf et al1984). Para ICSI, um espermatozóide único é selecionado para a injeção no oócito. Para IUI humano, -5-50 x 106 espermatozóides são tipicamente usados. Para IVF bovino, tipicamente aproximadamente 50.000 espermatozóides é usado. [00113] Em algumas técnicas atuais, devido a limitações de tempo, nenhuma separação de espermatozóides real, ao invés disso somente um processo de purificação do espermatozóide é realizado. O processo de purificação do espermatozóide tipicamente somente separa o fluido seminal do espermatozóide (Organização Mundial de Saúde, 2010). Isto significa que os métodos de preparação de espermatozóide atuais podem não classificar o espermatozóide mais fértil de uma a-mostra. [00114] Duas técnicas atuais comuns aplicadas à seleção de espermatozóides na preparação para ART são a centrifugação por gradiente de densidade (Le Lannou e Blanchard, 1988) e o ensaio de nado (Sakkas et al., 2000; Âkerlõf et al., 1987), baseado em sedimentação e migração, respectivamente. Em termos de números de espermatozóides e tempo, a centrifugação por gradiente de densidade tipicamente seleciona -36% da população de espermatozóides de 0,5 mL do sêmen bruto em 30 min, e o ensaio de nado tipicamente seleciona -12% da população de espermatozóides de 1 mL em 1 hora; resultando em melhora de 18-19% e de 5% em motilidade do espermatozóide respectivamente (WHO Press, 2010; Ng et al., 1992). A população do espermatozóide selecionada pode ser usada diretamente para IVF ou ICSI mas em algumas clínicas uma centrifugação adicional (10-15 min) e ressuspensão subsequente de espermatozóides dotados de motilidade em uma solução de tampões é empreendida. Em caso de ICSI, um espermatozóide único é selecionado a partir da amostra preparada por um embriologista (um processo que envolve inspeção visual de fração muito pequena dos espermatozóides (por exemplo, -100)). [00115] Estas técnicas de processamento de espermatozóide atuais podem sofrer de várias limitações: os métodos não se parecem com o processo natural in vivo (Sakkas, 2013); a população de espermatozóides selecionada muitas vezes é contaminada com espermatozóides fracamente dotados de motilidade e células somáticas (por exemplo, leucócitos) (Said e Land, 2011; Sakkas, 2013); a população de espermatozóides selecionada pode sofrer injúria iatrogênica (por exemplo, injúria oxidativa) devido à centrifugação (Aitken e Clarkson, 1988), e processamento prolongado ou de múltiplas etapas (Said e Land, 2011); e a inspeção visual manual adicional muitas vezes é requerida e esta etapa específica do embriologista pode ser em parte responsável por variações da taxa do êxito entre as clínicas (Sakkas, 2013). [00116] Uma métrica estabelecida para a qualidade do espermatozóide é a integridade do DNA de espermatozóides, isto é medida da organização/arquitetura de cromatina dos espermatozóides, compactação da cromatina e integridade da fita de DNA (Erenpreiss et al., 2006). A alta integridade do DNA é ligada tanto a taxas de fertilização melhoradas como ao desenvolvimento de embrião em IVF e ICSI (Ahmadi e Ng, 1999; Agarwal e Said, 2003). Foi descoberto que tanto a centrifugação por gradiente de densidade como o nado geralmente selecionam populações de espermatozóides com a integridade de DNA aumentada (comparando com a amostra bruta) (Matsuura et al., 2010; Enciso et al., 2011; Jackson et al., 2010). Entretanto, também foi mostrado que a centrifugação por gradiente de densidade induz potencialmente dano de DNA de espermatozóides (Said e Land, 2011; Sakkas, 2013; Zini et al., 1999). [00117] Abordagens alternativas para seleção do espermatozóide incluem eletroforese (Fleming et al., 2008; Aitken et al., 2011; Zhang et al., 2011), ligação de ácido hialurônico (Huszar et al., 2007; Parmegia- ni et al., 2010; Worrilow et ai2013), e avaliação morfológica do espermatozóide sob ampliação elevada (Balaban et al., 2011; Antinori et al., 2008; Souza Setti et al., 2010), com os últimos dois métodos sendo somente aplicáveis para seleção de espermatozóides individual. Estas abordagens tiveram aplicação clínica limitada devido a equipamento e exigências de tempo, impactos negativos na motilidade do espermatozóide e/ou dependência da experiência de um embriologista (Balaban et al., 2011; Antinori et al., 2008; Souza Setti et al., 2010; Ainsworth et al., 2005). [00118] Um grande avanço na tecnologia de seleção de espermatozóides pode melhorar muito a taxa de êxito e praticabilidade das ARTs. Entretanto, as técnicas clínicas de preparação de espermatozóides não melhoraram significativamente durante os últimos 20 anos (Han et al., 2010). Para visar esta falta de melhora, os dispositivos mi-crofluídicos emergiram como um método alternativo para a preparação de espermatozóides (Suh et al., 2005; Kricka et al., 1993). [00119] As abordagens microfluídicas são bem ajustadas à manipulação celular (Whitesides, 2006; Yeo et al., 2011; Mu et al., 2013), e foram desenvolvidas para selecionar ou manipular o espermatozóide baseado na motilidade (Cho et al., 2003; Xie e al, 2010; Schuster et al., 2003; Seo et al., 2007; Tasoglu et al., 2013), quimiotaxia (Xie et al, 2010; Ko et al., 2012), forças óticas (Zhang et al., 2011; Ohta et al., 2010), e eletroforese (Ainsworth et al., 2005). Entretanto, na maioria dos casos, a complexidade de usar dispositivos microfluídicos e a necessidade de suportar infraestruturas foi barreiras à implementação clínica. Além disso, a característica de baixo volume de amostra de microfluídicos resulta ser uma desvantagem no contexto da seleção de espermatozóides devido ao tamanho de escala em mililitros inerente de amostras humanas. [00120] Também, embora as técnicas estejam avançando, nem to- dos os parâmetros de fertilidade cruciais para resultados positivos são rotineiramente testados (Tomlinson et al., 1999). A integridade de DNA é de importância particular como a baixa integridade de DNA pode aumentar a taxa de erro (Aitken et al., 2009; Zini et al., 2008). [00121] Estas restrições de desenho biológicas e clínicas apontam para uma oportunidade para uma abordagem microfluídica simples, passiva (isto é, sem fluxo de fluido no aparelho), e altamente paraleli-zada para seleção de espermatozóides baseada na motilidade do es-perma. [00122] As várias modalidades descritas neste pedido geralmente referem-se a aparelhos e métodos de uma seleção de espermatozóides microfluídica, e mais particularmente à separação de espermatozóides usando variações de um dispositivo radial para separação de espermatozóides baseado na motilidade e/ou baseado na preferência do espermatozóide para nadar perto das paredes do canal. Em algumas modalidades, o desempenho de tal dispositivo radial pode ser dependente do desenho de rede de microcanais.

SEPARAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO BASEADA EM MOTILIDADE [00123] Em um amplo aspecto, as modalidades descritas neste pedido referem-se em geral a um aparelho de seleção de espermatozóides microfluídico para rendimento rápido em comparação com outros dispositivos microfluídicos de sorteamento de esperma. Por exemplo, algumas modalidades podem fornecer a seleção de espermatozóide único bem como a seleção de até 50.000 espermatozóides (que pode ser requerida para tipos específicos de ARTs) de até 1 ml de uma a-mostra de espermatozóide pura (~ 100.000.000 de espermatozóides), e pode ser caracterizado como fornecimento de uma frequência de separação mais alta do que 40 kHz. [00124] Alternativamente ou adicionalmente, algumas modalidades podem fornecer o processamento de espermatozóide e a separação de espermatozóides em um procedimento de uma etapa que é relativamente rápido (por exemplo, a seleção de espermatozóides pode ser realizada em 1 hora após a doação do esperma). [00125] Alternativamente ou adicionalmente, algumas modalidades podem não usar produtos químicos nem incluir etapas que poderíam ser perigosas para o espermatozóide (por exemplo, centrifugação que pode causar dano de DNA). [00126] Alternativamente ou adicionalmente, algumas modalidades podem simular as condições naturais do corpo feminino, por exemplo, usando um tampão fisiológico de alta viscosidade, em uma microrede. [00127] Alternativamente ou adicionalmente, algumas modalidades são baseadas em uma abordagem científica automatizada e podem não depender significativamente da experiência do técnico ou outros fatores ambientais incontrolados. Devido à simplicidade de algumas modalidades, a implementação, por exemplo, em clínicas de fertilidade pode ajudar a reduzir a variação entre centros de fertilidade diferentes. [00128] Alternativamente ou adicionalmente, algumas modalidades podem ser menos caras do que técnicas de separação de espermatozóides atuais, baseadas, por exemplo, no uso de menos produtos químicos e equipamentos, e/ou menos horas de trabalho do técnico. [00129] Como observado acima, um desafio da seleção de espermatozóides é ditado pela biologia: uma população heterogênea de ~108 espermatozóides por mililitro com uma vida curta in vitro. Entretanto, as abordagens de seleção de espermatozóides convencionais resultam na melhora de menos de 50% na integridade do DNA. Neste pedido, pelo menos uma modalidade de um dispositivo microfluídico clinicamente aplicável é apresentada que seleciona o espermatozóide baseado na motilidade progressiva em um grande número (por exemplo, 500) de microcanais paralelos. Estes dispositivos, de acordo com os ensinamentos neste pedido, alavancam o comportamento de acú- mulo superficial e o limite após navegação do espermatozóide em geometria de microescala. O resultado é um procedimento de uma etapa para purificação de espermatozóide e seleção de espermatozóides com alta integridade de DNA de 1 mL do sêmen bruto em menos de 20 minutos. Experimentos com o espermatozóide de touros indicam melhora de mais de 89% em comparação com a amostra de sêmen bruto na vitalidade do espermatozóide selecionada. Os testes clínicos com o espermatozóide humano mostram melhora de mais de 80% na integridade do DNA humano, significativamente superando as melhores práticas atuais. Estes resultados demonstram a presença de uma subpopulação de espermatozóides com cromatina e integridade de DNA quase intactos e um método clinicamente aplicável simples de acordo com os ensinamentos neste pedido para selecionar esta população. [00130] A funcionalidade de pelo menos algumas modalidades descritas neste pedido é alcançada pelo espermatozóide autopropulsiona-do que nada por um fluido efetivamente estagnado (que pode ser um fluido relativamente de alta viscosidade) em um arranjo radial de canais paralelos e alavanca as características nadadoras naturais do espermatozóide em geometrias confinadas, por exemplo, comportamento de acúmulo superficial e/ou navegação que segue a borda. A rede de microcanais controla os espermatozóides dotados de motilidade do anel de injeção radialmente interno em direção à saída de onde o espermatozóide selecionado é extraído. Uma vez que não há nenhum fluxo (ou efetivamente nenhum fluxo) nos microcanais, somente espermatozóides dotados de motilidade que nadam pelo fluido são direcionados à saída. O resultado é um aparelho simples clinicamente a-plicável e/ou método de purificação de espermatozóide e seleção de espermatozóides de alta integridade de DNA. [00131] O desempenho de seleção desta abordagem foi estabelecí- do, inter alia, por experimentos com espermatozóide de touros para quantificar a concentração e a vitalidade do espermatozóide selecionado. Pelo menos algumas modalidades descritas neste pedido também foram testadas com espermatozóide humano incluindo a avaliação da integridade de DNA usando o ensaio de estrutura de cromatina do espermatozóide (SCSA). Foi observado que o espermatozóide selecionado do dispositivo parece ser geralmente superior quantificavel-mente em termos de integridade de DNA do que aqueles selecionados usando métodos de seleção de espermatozóides clínicos correntes. [00132] Referência é feita agora às FIGS. 1 a 3B, que ilustram uma modalidade exemplo de um aparelho 100 para separação de espermatozóides. Em algumas modalidades, o aparelho 100 pode ser fabricado de Polidimetilsiloxano (PDMS) e será descrito como tal neste pedido. Será apreciado que outros materiais adequados (por exemplo, Po-li(metil metacrilato) (PMMA) ou outras substâncias termoplásticas adequadas (tal como policarbonato, poliestireno, vidro, etc.) podem ser usados. [00133] Considerando sua aplicação desejada, é idealizado que o aparelho 100 seja tipicamente um dispositivo de uso único, particularmente quando usado processar o espermatozóide humano. Entretanto, será apreciado que para algumas aplicações (por exemplo, quando usado classificar o espermatozóide de animais, como espermatozóide bovino), o aparelho 100 pode ser reutilizado para classificar múltiplas amostras. [00134] O aparelho 100 compreende uma camada superior 110 e uma camada inferior 120. A camada superior 110 compreende uma porção de entrada de recesso 114 (configurado para formar o reservatório de entrada 115 quando a camada superior 110 é ligada com a camada inferior 120) e uma porção de recesso 116 (configurada para formar o reservatório de saída 117 quando a camada superior 110 é ligada com a camada inferior 120) fornecidas na superfície de fundo da camada superior 110. Em algumas modalidades, a fim de gerar um molde mestre para fabricar o aparelho de PDMS, os atributos podem ser cortados de PMMA ou outro material adequado e ligados a uma superfície planar (por exemplo, uma placa de petri). [00135] A porção de entrada de recesso 114 é configurada para cooperar com a camada inferior 120 para formar um reservatório de entrada (preferencialmente) anelar 115 com entradas nos microcanais 122 dentro do anel. Em geral, esta abordagem permite processamento no chip de mais do que espermatozóide 50M introduzido no chip em experimentos de 10-20 min que levam a uma seleção de espermatozóides de alta frequência na ordem de 105 Hz. Será apreciado que outras geometrias (por exemplo, semicircular) podem ser usadas para o reservatório de entrada, em modalidades variantes. [00136] A porção de entrada de recesso 114 e/ou camada inferior 120 podem ser dimensionadas de forma que reservatório de entrada 115 seja dimensionado para acomodar um tamanho de amostra esperado, que pode variar dependendo da aplicação esperada do aparelho 100. Por exemplo, o reservatório de entrada 115 pode ser dimensionado para acomodar aproximadamente 1 ml_ de sêmen bruto (por e-xemplo, para acomodar amostras humanas típicas), aproximadamente 3 ml_ de sêmen bruto (por exemplo, para acomodar amostras bovinas típicas) ou acomodar amostras maiores (ou menores) de esperma. [00137] A camada inferior 120 compreende um arranjo radial de microcanais 122 para controlar espermatozóides dotados de motilidade internamente do reservatório de entrada 115 em direção ao reservatório de saída 117 em uma situação de fluxo estática. O reservatório de entrada 115 é preferencialmente disposto ao longo de uma porção exterior do arranjo radial de microcanais 122 e o reservatório de saída é preferencialmente disposto ao longo de uma porção interior do arranjo radial de microcanais 122. Um molde mestre da camada inferior 120 pode ser fabricado usando técnicas de litografia suave padrão, permitindo múltiplas camadas de fundo 120 serem feitas por exemplo, de PDMS usando tal molde mestre. [00138] A geometria do aparelho 100, e particularmente a rede de microcanais 122, é preferencialmente informada pelas exigências da amostra biológica e a geometria do tubo de Falópio, por exemplo, para mimetizar um ambiente in vivo. Por exemplo, em algumas modalidades, a largura e a altura de cada microcanal (por exemplo, 100 pm χ 75 pm) podem corresponder geralmente à distância entre o epitélio ciliado do tubo de Falópio (Suarez e Pacey, 2006) e o comprimento do espermatozóide humano médio (Gaffney et al., 2011). O espermatozóide é dessa forma confinado pela geometria de microcanal que se assemelha com elementos do tubo de Falópio, provocando sua navegação natural que segue a borda (Denissenko et al., 2012). [00139] Exemplos de arranjos alternativos de microcanais são mostrados nas FIGS. 3A-5. Como mostrado na FIG. 4, o arranjo de microcanais 122b compreende uma pluralidade de percursos de microcanais 405 que fornece comunicação de fluidos entre o reservatório de entrada 115 e o reservatório de saída 117. Cada percurso 405 compreende uma via de saída 410 adjacente ao reservatório de saída 117, e pelo menos uma via de entrada 420 adjacente ao reservatório de entrada 115. [00140] Será apreciado que o número de percursos de microcanais no arranjo de microcanais pode variar. Embora tenha sido descoberto que os arranjos de microcanais com aproximadamente 200 a aproximadamente 500 percursos de microcanais geralmente fornecem o desempenho de sorteamento aceitável, dependendo do volume de amostra esperado, as dimensões de cada microcanal, e/ou o número aproximado desejado do espermatozóide desejado a ser coletado, mais ou menos microcanais podem ser fornecidos em modalidades variantes. [00141] Devido à natureza radial do arranjo de microcanais 122, pelo menos um divisor 126 pode ser fornecido adjacente ao reservatório de entrada, de forma que dois ou mais percursos 405 que se originam em percursos de entrada separados 420 (ver por exemplo, percursos de entrada 420a e 420b na FIG. 4) podem se combinar antes do reservatório de saída (por exemplo, 5 mm antes do reservatório de saída) para manter uma geometria de seção transversal do percurso de microcanal relativamente uniforme, apesar da natureza radial do arranjo de microcanais 122. [00142] Em algumas modalidades, as paredes dos microcanais podem estreitar-se geralmente internamente ao longo de um caminho 405 entre uma via de entrada 420 e uma via de saída 410. Alternativamente ou adicionalmente, uma ou mais regiões cônicas distintas (ver, por exemplo, as regiões 430 e 435 na FIG. 4) podem ser fornecidas pelas paredes dos microcanais, para auxiliar na direção de espermatozóides dotados de motilidade em direção ao reservatório de saída 117 e/ou auxiliar na manutenção de uma largura de microcanal relativamente uniforme apesar da natureza radial do arranjo de microcanais 122. Para fornecer tais regiões cônicas, a espessura dos componentes de parede que definem os percursos de microcanais pode variar (gradualmente ou abruptamente) ao longo do seu comprimento. [00143] O comprimento 310 para cada percurso de microcanal pode estar ser de até 10 mm a fim de acomodar a velocidade de nado progressiva média do espermatozóide humano (isto é, ~45 pm/s) em um fluido tampão e um prazo de seleção de aproximadamente 10-20 minutos. Como ainda será discutido abaixo, os dispositivos foram fabricados e testados com comprimentos de microcanal de 6 mm, 7,5 mm, e 9 mm, para quantificar a influência do comprimento de canal no desempenho de seleção. [00144] Em algumas modalidades, mais de 100-500 microcanais podem ser requeridos. Devido a restrições na entrada e volumes de passagem não é possível modificar o número de microcanais na camada, como tal a pluralidade dos microcanais que pode ser empilhada várias vezes, tal como 2-16 vezes, por exemplo, a fim de aumentar o número de percursos de microcanais entre o reservatório de entrada e 0 reservatório de saída. Um exemplo disto é mostrado na FIG. 23. Em algumas outras modalidades, pode haver mais de 16 arranjos radiais empilhados. Por exemplo, se cada camada de arranjo radial é fabricada bastante fina, então mais camadas de arranjos radiais podem ser empilhadas uma em cima da outra. [00145] Dimensões exemplares dos arranjos de microcanais mostradas nas FIGS. 3A-5 são mostradas na Tabela 1. TABELA 1: DIMENSÕES DE MICROCANAIS PARA SEPARAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO BASEADA EM MOTILIDADE. [00146] Preferencialmente, a geometria anelar do reservatório de entrada 115 (por exemplo, como mostrado nas FIGS. 1-5) distribui i-gualmente uma amostra de espermatozóide injetada através das entradas dos microcanais paralelos (por exemplo, onde uma amostra de 1 ml é injetada em um aparelho 100 com -500 microcanais no arranjo de microcanais 122, aproximadamente 2 pL do espermatozóide serão adjacentes em cada entrada de microcanal). [00147] Referindo-se agora à FIG. 2C, é mostrada nesta uma vista superior de um exemplo de uma modalidade alternativa de um apare- Iho 100' para separação de espermatozóides. Nesta modalidade e-xemplo, o reservatório de entrada anelar 115' compreende guias semicirculares que têm paredes de guias semicirculares 115Ί entre entalhes 115n' que são dispostos ao longo da parede exterior do reservatório de entrada 115'. Esta parede estende-se de ambos os lados da a-bertura de entrada 114. Em algumas modalidades, as guias semicirculares 115w' podem ter raios menores que 150 pm. Guias semicirculares 115w' servem para redirecionar o limite seguinte aos espermatozóides que estão nadando ao longo do exterior da parede de entrada em direção aos microcanais 122 levar ao reservatório de saída 117. A região mais escura dos microcanais 122 é devido a microcanais que são mais estreitos em tamanho. As guias semicirculares 115'w podem ser usadas em outras modalidades exemplo do aparelho de separação de espermatozóides descrito conforme os ensinamentos neste pedido. [00148] Em algumas modalidades, projeções em forma de funil 124 podem ser fornecidas na camada inferior 120 dentro do reservatório de saída 117 e adjacentes à rede de microcanais, para impedir o espermatozóide de nadar de volta nos microcanais (ver, por exemplo, a ampliação na FIG. 3A, FIG. 3B e FIG. 5 bem como algumas outras figuras) uma vez que alcançaram o reservatório de saída (Galajda et al., 2007). Por exemplo, o espermatozóide que nadou pelo arranjo de microcanais e para além das projeções 124 pode ser pego no vértice em forma de funil, e dessa forma impedido de reentrada nas vias de saída. [00149] Retornando às FIGS. 6A-6C, após fabricação das camadas de topo e de fundo 110, 120 de PDMS (FIG. 6A), os orifícios 112a, 112b para o reservatório de entrada e/ou orifício 118 para o reservatório de saída podem ser puncionados usando um puncionador de bióp-sia padrão. A ligação das camadas 110, 120 pode ser realizada usando tratamento com corona ou plasma (FIG. 6B). [00150] Embora o aparelho 100 tenha sido descrito como fabricado de uma camada superior 110 e uma camada inferior 120, será apreciado que outros métodos da fabricação possam ser usados a fim de construir o aparelho 100, incluindo métodos nos quais mais (ou menos) camadas são formadas durante o processo de fabricação. [00151] Como será discutido ainda abaixo, a fim de preparar o aparelho 100 para o uso, reservatório de entrada 115, reservatório de saída 117, e o arranjo de microcanais 122 são preenchidos de um fluido tampão adequado. Aplicar um vácuo enquanto o aparelho 100 é submerso no fluido tampão auxilia na remoção de bolhas de ar dos canais e pode permitir o preenchimento completo (FIG. 6C). [00152] Por exemplo, o aparelho 100 pode ser submerso em um prato com o tampão de salina tamponada HEPES (HBS) contendo álcool polivinílico 1% (PVA) e metilcelulose (MC) 0,5%. Este tampão é um meio viscoelástico não newtoniano de alta viscosidade que simula o muco viscoso natural dentro do trato feminino (Kirkman-Brown e Smith, 2011) e também serve para assegurar a alta resistência de fluxo e dessa forma o fluxo insignificante na rede de microcanais. [00153] Um exemplo de um fluido de baixa viscosidade que pode ser usado são soluções de lavagem de espermatozóide comercialmente disponível bem como tampão salino tamponado HEPES compreendendo álcool polivinílico 1% uma vez que também tem baixa viscosidade. [00154] Quando os microcanais são preenchidos com um tampão (por exemplo, um tampão de alta viscosidade), pode haver fluxo mínimo dentro dos microcanais, mimetizando o ambiente altamente viscoso in vivo. A resistência do fluxo no anel de injeção 115 pode ser de 105 vezes aquela dos microcanais paralelos, efetivamente eliminando o fluxo dentro do arranjo de microcanais 122 durante a introdução de uma amostra de sêmen no reservatório de entrada 115. [00155] Opcionalmente, um componente de fechamento de saída 130 (por exemplo, uma camada adesiva temporária, como uma fita isolante) pode ser usado para cobrir o orifício de reservatório de saída 118 antes da injeção de uma amostra de espermatozóide no aparelho. O objetivo da camada 130 é gerar um dispositivo sem saída sem fluxo de fluido nos canais durante a injeção de espermatozóide e a separação para ainda assegurar um ambiente sem fluxos. [00156] Opcionalmente, um ou mais componentes de fechamento de entrada (não mostrados) podem ser usados para cobrir os orifícios de reservatório de entrada 112a, 112b após uma amostra ser introduzida no reservatório de entrada 115. Por exemplo, uma camada adesiva temporária, (como uma fita isolante) pode ser usada. [00157] Alternativamente, outras modalidades podem usar portas de seringa com tampas para o componente de fechamento de entrada e o componente de fechamento de saída 130 (por exemplo, ver a FIG. 24). Tais modalidades permitem o uso da seringa para introduzir a amostra na entrada e extrair a amostra da saída. [00158] Será apreciado que podem ser usadas outras soluções de tampões adequadas (por exemplo, tampões aquosos menos viscosos). Por exemplo, a fim de assegurar nenhum fluxo, um tampão de alta viscosidade contendo metilcelulose (MC) foi inicialmente usado em pelo menos alguns experimentos discutidos abaixo. Entretanto, como muitas clínicas de fertilidade tipicamente não usam tampões de alta viscosidade, testes subsequentes foram conduzidos no aparelho 100. Os experimentos de fluxo com um tampão aquoso (por exemplo, um tampão com uma viscosidade aproximadamente igual àquela da água) mostraram que pela natureza do desenho de aparelho, nenhum fluxo (ou efetivamente nenhum fluxo) está presente, e resultados adequados foram obtidos com o uso de componentes de fechamento de saída e/ou entrada (discutidos abaixo). Além disso, o rendimento de espermatozóide foi mais alto com um tampão aquoso do que com um tampão de alta viscosidade, e a viabilidade foi geralmente similar aos resultados obtidos com um tampão de alta viscosidade. [00159] Em pelo menos algumas modalidades, antes que a amostra de espermatozóide seja aplicada, o aparelho preenchido do tampão 100 pode ser equilibrado a 37Ό. [00160] Um método de exemplo para separação de espermatozóides usando o aparelho 100 será descrito agora com referência às FIGS. 7A-7C. [00161] Como mostrado na FIG. 7A, uma amostra de sêmen bruto, liquefeito, mas não tratado (por exemplo, uma amostra sem qualquer pré-tratamento de sêmen como centrifugação por gradiente de densidade ou lavagem) é introduzida no reservatório de entrada 115. Por exemplo, uma amostra pode ser injetada por exemplo, usando uma seringa 510 através do orifício de entrada 112a (e/ou orifício de entrada 112b). Tal abordagem fornece injeção de amostra segura, rápida (por exemplo, em 30 segundos ou menos), robusta, e clinicamente a-plicável. [00162] Uma vez que a amostra foi introduzida no reservatório de entrada, espermatozóides dotados de motilidade navegam do reservatório de entrada 115, através do arranjo de microcanais 122, e no reservatório de saída 117 enquanto espermatozóides não dotados de motilidade e fragmentos permanecem geralmente no reservatório de entrada 115 devido à situação de fluxo estático dentro do dispositivo (ver, por exemplo, FIG. 7B). A navegação em uma geometria confinada, como rede de microcanais 122, ocorre devido à característica natural do espermatozóide de seguir limites. [00163] Como mostrado na FIG. 7C, após um período de tempo adequado passou a permitir os espermatozóides dotados de motilidade de navegarem no arranjo de microcanais 122 (por exemplo, 15-20 minutos), o componente de fechamento 130 (onde fornecido) pode ser removido e o espermatozóide separado pode ser coletado do reservatório de saída 117 no centro do aparelho 100 (por exemplo, usando uma micropipeta padrão 520). [00164] A produção deste aparelho (isto é, o sêmen separado coletado do reservatório de saída 117) pode ser usada diretamente para a base de gotícula de IVF, ou para a seleção de espermatozóide antes de ICSI. [00165] Alternativamente, em vez de introduzir uma amostra de sêmen no reservatório da entrada anelar exterior e coletar os espermatozóides do reservatório de saída, será apreciado que cada um pode introduzir de modo conceptível uma amostra de espermatozóide no reservatório interior, e coletar os espermatozóides que navegam em um arranjo de microcanais (por exemplo, arranjo de microcanais como mostrado na FIG. 4) do reservatório anelar exterior. Isto pode ser útil, por exemplo, para coletar uma solução de esperma/tampão relativamente diluída - com espermatozóide de alta integridade de DNA - do reservatório anelar exterior. [00166] Em uma ou mais modalidades alternativas, mais de um arranjo radial de microcanais pode ser fornecido no aparelho, fornecendo percursos de microcanais adicionais entre um reservatório de entrada e um reservatório de saída. Tal aparelho pode fornecer o rendimento adicional comparando com o aparelho que tem somente um arranjo radial de microcanais de dimensões similares. Um aparelho de rendimento mais alto pode ser útil para processar grandes volumes de espermatozóide (por exemplo, para aplicações bovinas (ou outro animal)), e/ou para processar amostras de espermatozóide de homens com amostras de espermatozóide normais (por exemplo, onde boa motilidade de espermatozóide e volume de espermatozóide são esperados, o rendimento mais alto pode ser usado a fim de alcançar números de espermatozóides suficientes para IUI). [00167] Por exemplo, as FIGS. 22A-22B ilustram uma modalidade exemplo de um aparelho 2200 para separação de espermatozóides. Similar ao aparelho 100, o aparelho 2200 inclui uma camada superior 2210 e uma camada inferior 2.220 tendo um arranjo radial de microca-nais 2222. Os componentes similares àqueles no aparelho 100 foram similarmente numerados e não serão descritos adicionalmente. [00168] O aparelho 2200 também compreende quatro arranjos radiais adicionais de microcanais 2222a-d. Estes arranjos radiais adicionais podem ser fabricados de uma maneira similar como o arranjo radial 2220 e empilhados acima do arranjo radial 2220 para fornecer cinco camadas de arranjos radiais de microcanais. Para acomodar a espessura aumentada, um ou mais anéis espaçadores 2250 podem ser fornecidos entre a camada superior 2210 e a camada inferior 2220. A porção de entrada de recesso 2214 é configurada para cooperar com a camada inferior 2220 e/ou o anel espaçador 2250 para formar um reservatório de entrada (preferencialmente) anelar 2215 com entradas nos microcanais em cada arranjo radial 2200, 2200a-d dentro do anel. Será apreciado que não necessariamente é mostrado que os arranjos radiais adicionais e os anéis espaçadores escalam, como os componentes definidores do canal dos arranjos radiais adicionais serão tipicamente bastante finos (por exemplo, 50-75pm). [00169] Embora quatro arranjos radiais adicionais de microcanais 2222a-d sejam mostrados, será apreciado que mais (ou menos) camadas adicionais cada uma tendo um arranjo radial de microcanais pode ser usada em modalidades variantes. Similarmente, embora quatro anéis espaçadores 2250a-d sejam mostrados, mais (ou menos) anéis espaçadores podem ser usados (por exemplo, baseado no número de arranjos radiais adicionais que são usados). Será apreciado que a espessura dos anéis espaçadores pode variar, e que o número de anéis espaçadores não necessariamente pode se igualar ao núme- ro de arranjos radiais adicionais. Por exemplo, a espessura de um anel espaçador pode ser baseada na espessura total dos arranjos radiais adicionais, para que somente um anel espaçador possa ser requerido. Alternativamente, a porção exterior da camada superior 2210 e/ou camada inferior 2220 pode ser tornada mais espessa para acomodar a espessura adicionada de arranjos radiais adicionais, eliminando a necessidade de anéis espaçadores separados. [00170] Referindo-se agora à FIG. 23, é mostrada nesta uma vista em perspectiva explodida de um exemplo de uma modalidade alternativa de um aparelho 2300 para separação de espermatozóides. O aparelho 2300 compreende uma camada superior 2310, uma camada intermediária 2320, uma camada inferior 2325 e uma pilha de microca-nais 2.350 compreendendo múltiplos arranjos radiais de microcanais. A camada superior 2310 compreende as primeiras e segundas aberturas de entrada 2312a e 2312b e uma abertura de saída 2330. A camada intermediária 2320 compreende as entradas 2312a e 2314a que se alinham com as aberturas 2312a e 2312b, respectivamente quando a camada superior 2310 é colocada na camada intermediária 2320. A camada intermediária 2320 também contornou as paredes laterais 2315w que formam um anel de entrada quando a pilha de arranjos radiais de microcanais 2350 é colocada no centro da camada intermediária 2320. A pilha de arranjos radiais de microcanais 2350 é disposta tal que a passagem 2350o da pilha de arranjos radiais de microcanais 2350 esteja alinhada com a abertura de passagem 2330 quando a camada superior 2310 é colocada na camada intermediária 2320. As paredes laterais contornadas 2315w ajudam na direção do espermatozóide à pilha de arranjos radiais de microcanais 2350 durante o uso. Neste sentido, as paredes laterais contornadas 2315w podem ter uma forma semicircular que se repete, como é mostrado na FIG. 23, ou podem ter outra forma adequada que realiza esta função. [00171] Na modalidade da FIG. 23, a pilha de arranjos radiais de microcanais 2350 auxilia o espermatozóide a encontrar um canal que leva à saída 2350o durante o uso. Em outras palavras, há uma pluralidade de arranjos radiais 2350 cada um tendo uma pluralidade de microcanais que são acoplados ao reservatório de entrada 2314a, 2314b e ao reservatório de saída 2350o e os arranjos radiais são empilhados para aumentar o número de percursos de microcanais entre o reservatório de entrada 2314a, 2314b e o reservatório de saída 2350o por meio disso aumentando o número de canais possíveis que existem conectando a entrada à saída e aumentando a facilidade com a qual os espermatozóides encontram um microcanal. Em algumas modalidades, pode haver entre 2 a 16 arranjos radiais empilhados enquanto em outras modalidades pode haver mais de 16 arranjos radiais empilhados. [00172] Referindo-se agora à FIG. 24, é mostrada nesta uma modalidade exemplo de uma organização 2400 para injetar e extrair o espermatozóide do aparelho 2300' para separação de espermatozóides que empilhou arranjos radiais de microcanais. Neste caso, o aparelho 2300' compreende uma porta de entrada 2312ap acoplado à abertura de entrada 2312a. Uma seringa 2312 então pode ser usada para introduzir a amostra de espermatozóide na abertura de entrada 2312a pelo acoplamento da extremidade atuante da seringa 2312s com a porta de entrada 2312ap. O aparelho 2300' compreende ainda uma porta de entrada 2312bp para o acoplamento com a abertura de entrada 2312b. Um reservatório de coleta então pode ser acoplado à porta de entrada 2312bp para coletar qualquer solução de tampões deslocada durante o uso. O aparelho 2300' compreende ainda uma porta de saída 2.350p para o acoplamento com a abertura de saída 2350. A seringa de extração 2350s pode ser acoplada à porta de saída 2.350p através de um canal 2350c como um cateter para coletar os espermatozóides da abertura de passagem 2350 durante o uso. Consequentemente, nesta modalidade exemplo, as portas de entrada 2312ap, 2312bp e a porta de saída 2.350 pontos são portas de seringa. RESULTADOS EXPERIMENTAIS: [00173] A fim de avaliar o impacto de variar o comprimento do canal 310 (ver, por exemplo, as FIGS. 3A e 3B), três dispositivos diferentes foram projetados com um comprimento de canal 310 de 6 mm, 7,5 mm e 9 mm. Diversos experimentos foram realizados, onde o espermatozóide selecionado coletado do reservatório de saída sob várias condições foi examinado para quantificar o desempenho de dispositivo em termos de vitalidade e integridade de DNA do espermatozóide selecionado. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL - GERAL: [00174] O dispositivo de seleção de espermatozóides microfluídico foi preenchido submergindo o dispositivo no tampão e aplicando vácuo (por exemplo, -30 psi) durante pelo menos 90 minutos. Após esta etapa, o dispositivo foi colocado dentro de uma incubadora (37°C) durante 1 hora para alcançar a temperatura fisiológica. Para deixar o fluxo estabilizar dentro do dispositivo, pelo menos 10 minutos antes do experimento, o dispositivo foi transferido da incubadora para uma placa aquecida (37Ό). Uma seringa plástica BD de 1 mL fo i usada para injetar 1 mL da amostra de sêmen bruto no dispositivo (Ver por exemplo, a FIG. 7A). Os experimentos foram conduzidos por 10, 15, e 20 minutos para investigar o efeito do tempo na concentração de espermatozóide selecionada, contagem, vitalidade e integridade de DNA. No fim da duração de experimento (isto é, o tempo permitido ao espermatozóide para nadar dentro do dispositivo), a camada temporária foi removida da saída e 100 pL do tampão contendo espermatozóide selecionado foram isolados da saída usando uma pipeta Eppendorf de 100 pL (Ver, por exemplo, a FIG. 7C). [00175] A concentração, a contagem e a vitalidade de espermatozóide de touros foram avaliadas com o kit de viabilidade de espermatozóide LIVE/DEAD fluorescente (L-7011; Invitrogen, NY, EUA). O espermatozóide foi marcado antes da injeção de espermatozóide ou 10 minutos após coleta da amostra. Os espécimes marcados foram carregados em um hemocitômetro e um microscópio fluorescente reverso (DMI 6000B, Leica) com uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) foi usado para capturar imagens em ampliação de 100 vezes em campo brilhante (número total de espermatozóides), fluorescência verde (células vivas) e fluorescência vermelha (células mortas). O plug-in do programa de processamento de contagem celular de imagem ImageJ disponível gratuitamente foi usado para processar as i-magens. Os espermatozóides que foram marcados tanto como 'vivos' como 'mortos' foram considerados 'vivos' durante a contagem. No caso dos experimentos de espermatozóide humano, a concentração de espermatozóide foi medida usando um hemocitômetro (Hausser Scienti-fic, PA, EUA) seguido de SCSA para analisar a integridade do DNA. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL - FABRICAÇÃO DO DISPOSITIVO: [00176] Ao fabricar o aparelho de separação de espermatozóides 100 para os experimentos discutidos mais abaixo, o arranjo de micro-canais paralelos na camada inferior foi projetado em AutoCAD e impresso em uma fotomáscara (Pacific Arts & Designs Inc., Markham, Canadá). O molde mestre foi fabricado com o fotorresistor negativo 2075 SU-8 (MicroChem, Newton, MA, EUA) usando técnicas litográfi-cas suaves padrão (Unger et al., 2000). Os microcanais têm uma profundidade de 75 pm. Para fabricar o molde mestre da camada superior, os atributos foram projetados em AutoCAD e corte de PMMA de espessura de 1,45 mm e 0,8 mm (Plastic Word, Toronto, Canadá) u-sando um laser de ablação de C02 M-360 (Universal Laser Systems Inc., Scottsdale, AZ, EUA). O PMMA então foi ligado a uma placa de petri a fim de completar o molde mestre e manter o PDMS na camada superior. Tanto as camadas superiores como as inferiores foram fabricadas usando substrato de PDMS (Silgards 184: Dow Corning, Ml, EUA) com proporção de mistura 1:10, e ligadas a um tratador de coro-na portátil (BD-20AC, Electro-Technic Products Inc., IL, EUA) (Haubert et al2006). Duas portas de entrada de 4 mm de diâmetro em cada extremidade do anel de injeção e uma porta de saída de 5 mm de diâmetro no centro da saída foram puncionados na camada superior u-sando o Miltex Punch Dermal Biopsy. Finalmente, fita transparente foi usada como um selo superior removível para fechar a saída durante a injeção de amostra e a duração dos experimentos. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL - PREPARAÇÃO DA AMOSTRA DE ESPERMA: [00177] Para o espermatozóide de touros, as palhetas contendo 500 pL do espermatozóide de touros (ABS Global Inc., Canadá) foram armazenadas em nitrogênio líquido. Antes do uso, o espécime de touros foi descongelado em um banho de água a 37Ό e removido da palheta usando uma seringa de inseminação artificial. O espermatozóide de touros foi mantido sempre a 37Ό, e os experimen tos foram conduzidos em 10 min da transferência de espermatozóide na incubadora. [00178] Para o espermatozóide humano, o espermatozóide humano ejaculado fresco foi obtido de doadores saudáveis (n=8) por masturba-ção após 2 a 4 dias de abstinência sexual e incubado por 30 min a 37Ό para permitir a liquefação. Os experimentos fo ram conduzidos dentro de 10 minutos da liquefação. Os parâmetros de espermatozóide padrão foram obtidos no acordo com as referências da OMS (WHO Press, 2010) usando análise de espermatozóide assistida por computador (CASA). Todos os doadores assinaram um consentimento informado, e a informação deste estudo permaneceu confidencial e dentro da instituição. Este estudo foi aprovado pelo conselho de revisão de ética na Universidade McGill.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL - PREPARAÇÃO DE TAMPÃO [00179] Salina tamponada com HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazino-etanossulfônico) (HBS) com NaCI (135 mm), KCI (5 mM), D-glicose (12 mM), HEPES (25 mM) (Bioshop Canada Inc., Burlington, Canadá), e Na2HP04.2H20 (0,75 mM, Sigma-Aldrich Corp., MO) foi usado como a solução base para preparar o tampão experimental. Para impedir o espermatozóide de aderir na superfície, PVA (Sigma-Aldrich Corp., o Missouri) foi adicionado a uma concentração final de 1 mg/ml_. Metilcelulose (MC) (M0512; Sigma-Aldrich Corp., MO) foi dissolvida em HBS/PVA para preparar uma solução de MC 0,5%, que resultou em uma solução viscoelástica não newtoniana com uma viscosidade aproximada de 25 cp a 20Ό. Finalmente, uma solução 1 M de NaOH (VWR, West Chester, PA) foi usada para ajustar o tampão ao pH 7,4 à temperatura ambiente. O tampão foi armazenado a 4Ό e todos os dispositivos foram carregados e não testados após 7 dias após a preparação do tampão PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL - ENSAIO DE ESTRUTURA DE CROMATINA DE ESPERMATOZÓIDES (SCSA) [00180] A integridade do DNA de espermatozóides foi avaliada u-sando o ensaio de estrutura de cromatina de espermatozóides (SCSA) e os resultados foram expressos como DFI percentual de espermatozóide (um índice de dano de DNA) e HDS percentual de espermatozóide (uma medida de compactação da cromatina nuclear) como anteriormente descrito (Evenson et al., 2002; Zini et al., 2001). As amostras armazenadas congeladas foram descongeladas em gelo, diluídas com o tampão TNE (tampão Tris 0,1 M, NaCI 0,15 M, ácido etilenodiamino-tetracético 1 mM (EDTA), pH 7,4) e em seguida tratadas com 0,40 ml da solução de detergente ácido (HCI 0,08 M, NaCI 0,15 M, Triton X- 100 0,1%, ρΗ 1,2). Após 30 segundos, as amostras foram marcadas adicionando 1,2 ml de solução marcadora de laranja de acridina (AO) contendo 6 pg de AO (purificado cromatografi ca mente; Cat. # 04539, Polysciences Inc., Warrington, PA, EUA) por ml de tampão (ácido cítrico 0,037 M, Na2HP04 0,126 M, EDTA 0,0011 M (dissódico), NaCI 0,15 M, pH 6,0). Após 3 min, a fluorescência foi medida para um mínimo de 5.000 células usando um Analisador MACSQuant (Miltenyi Biotech GmbH, Teterow, Alemanha) equipado com um laser de argônio. A excitação ocorreu em 488 nm, e DNA de fita dupla e DNA de fita simples podem ser detectados como fluorescência verde e vermelha, respectivamente. O programa WinList (Verity Softwarehouse Inc., Topsham, ME, EUA) foi usado para gerar gráficos de citograma (fluorescência vermelha vs. verde) e histograma (células totais vs. DFI), bem como, leituras de %DFI e %HDS (ver por exemplo, as FIGS. 10B, 10D). COMPRIMENTO DE CANAL - ESPERMATOZÓIDE DE TOUROS [00181] A marcação da viabilidade de vivos/mortos do espermatozóide de touro foi aplicada para avaliar a função de dispositivo, a concentração do espermatozóide selecionada e a vitalidade do espermatozóide selecionada. As FIGS. 8A-8B mostram resultados dos casos onde a marcação de vivos/mortos foi realizada antes da injeção da amostra (n = 5). As concentrações de espermatozóide totais coletadas nas saídas dos três dispositivos são traçadas com a concentração da amostra bruta na FIG. 8A, com as contagens de espermatozóide da saída correspondendo à inserção mostrada. Com um espermatozóide médio de 40M em amostra de 1 ml_ introduzida na entrada, concentrações na ordem de 1 M/mL e contagens de espermatozóide correspondentes na ordem de 100.000 são coletadas nas saídas. Resultados para os três dispositivos indicam que a concentração de espermatozóide isolada diminui linearmente com o comprimento do microcanal (R2=0,99), com concentrações mais baixas de espermatozóides mais rápidos selecionados em microcanais mais longos. [00182] Como ilustrado na FIG. 8B, a pré-marcação do espermatozóide revelou que a vitalidade de porcentagem do espermatozóide selecionado sempre foi 100% apesar dos comprimentos de microcanal e a vitalidade percentual do espermatozóide no sêmen bruto. A ausência do fluxo dentro do dispositivo, todo o espermatozóide inicialmente morto e fragmentos permaneceram na entrada, e somente os espermatozóides vivos e dotados de motilidade foram capazes de alcançar a saída. Esta característica permite a purificação de espermatozóide simultânea e a seleção de espermatozóides no chip sem qualquer tratamento prévio do esperma. [00183] As FIGS. 8C e 8D mostram resultados dos casos onde a marcação de vivos/mortos foi realizada após processo de seleção (n > 4). O espermatozóide foi marcado 30 min após a coleta como requerido para o procedimento de marcação (marcação iniciada 10 min após coleta da amostra e leva 20 min para ocorrer). Similar aos experimentos de pré-marcação (FIG. 8A), concentrações de espermatozóide selecionado e contagens reduzidas linearmente (R2=0,93) com comprimento de microcanal (FIG. 8C). Também foi observado que reduzindo a concentração de sêmen bruto na entrada, a concentração do espermatozóide coletado reduzido com aproximadamente a mesma ordem de magnitude (0,5 neste caso) sugere que a eficiência de seleção é relativamente constante com uma concentração inicial na faixa de 20M/ml a 40M/ml. [00184] A FIG. 8D mostra a vitalidade de porcentagem do espermatozóide selecionado a partir após a coleta de amostra em comparação com o sêmen bruto introduzido no chip. Os resultados indicam que o dispositivo de 9 mm produz vitalidade de espermatozóide de mais de 97% 30 min após os experimentos e este número se reduz a 92% e 89% para dispositivos de 7,5 mm e 6 mm, respectivamente. Usando o dispositivo de 9 mm como um exemplo, os dados indicam que a população de espermatozóides selecionada demonstra uma vitalidade percentual 106% maior (quando comparada com a vitalidade de 47% no sêmen bruto). A tendência linear (R2=0,98) indica que os dispositivos com comprimentos de canal mais longos selecionados de espermatozóides dotados de motilidade com melhor vitalidade do que dispositivos com comprimentos de canal mais curtos. Tomados em conjunto, os dados sugerem que em dispositivos com canais mais curtos, um maior número de espermatozóides dotados de motilidade é capaz de alcançar a saída, mas estes espermatozóides morrerão mais rapidamente do que os espermatozóides que foram selecionados com comprimentos de canal mais longos.

DURAÇÃO - ESPERMATOZÓIDE DE TOURO [00185] A fim de avaliar o efeito da duração do experimento na vitalidade do esperma, espermatozóides de touro foram processados por 10, 15, e 20 minutos no aparelho com comprimentos de microcanais de 6 mm, 7,5 mm e 9 mm (n>4). A FIG. 9 mostra a vitalidade do espermatozóide selecionado 30 min após a coleta da amostra que indica que para os mesmos comprimentos de microcanais, reduz a vitalidade do espermatozóide selecionado ao aumentar o tempo experimental. Aumentar a duração de experimento de 10 min para 20 min no dispositivo de 6 mm reduz substancialmente a vitalidade de porcentagem de 93% a 84%. Ao contrário, os microcanais mais longos aumentam a vitalidade do espermatozóide selecionado e reduzem a variação causada por modificações no tempo experimental. Por exemplo, em um dispositivo de 9 mm, a vitalidade percentual diminui somente em 5% (de 99% para 94%) ao modificar a duração de experimento de 10 min para 20 min. Estas descobertas parecem indicar uma correlação forte entre a motilidade do espermatozóide progressiva rápida e vitalidade uma vez que o espermatozóide com motilidade altamente progressiva é capaz de nadar maiores distâncias em um período de tempo mais curto e exibirá posteriormente uma vitalidade mais alta do que o espermatozóide com motilidade progressiva menos rápida. A tendência também indica que o ato de nadar mais peto dispositivo não teve um impacto negativo na vitalidade de esperma, ou, no mínimo, qualquer efeito negativo potencial foi mais do que compensado pela vitalidade mais alta da população nadadora mais rápida.

COMPRIMENTO DE CANAL - ESPERMATOZÓIDE HUMANO [00186] A integridade do DNA é uma métrica para qualidade de espermatozóides e capacidade de fertilização. A integridade do DNA de espermatozóides ruim é ligada a taxas inferiores de gravidez natural e assistida e a um maior risco de perda da gravidez tanto em IVF como em ICSI (Coughlan e Ledger, 2008; Zini et al., 2008; Zini e Sigman, 2009). Os três dispositivos foram clinicamente testados com espermatozóides humanos frescos para quantificar a integridade do DNA dos espermatozóides selecionados e o papel do comprimento de canal e duração do teste. O ensaio de estrutura de cromatina de espermatozóides (SCSA) foi usado para avaliar a integridade do DNA como é conhecido por produzir resultados confiáveis e reprodutíveis ao avaliar o nível do dano de DNA (Evenson, 2013; Bungum et al., 2011; Even-son et al., 2002). O SCSA foi usado para medir dois marcadores de cromatina de espermatozóides e dano de DNA: o índice de fragmentação de DNA percentual (%DFI - uma medida de quebra de fitas de DNA); e percentual de alta marcabilidade de DNA (%HDS - uma medida da compactação de cromatina) (ver os resultados de ensaio representativo nas FIGS. 10A-10D, onde a fluorescência verde indica níveis muito baixos de fragmentação de DNA e fluorescência vermelha indica altos níveis de fragmentação de DNA.) (Evenson et al., 2002). Um alto %DFI indica uma grande percentagem do espermatozóide com quebras de fita de DNA e um alto %HDS indica uma alta proporção do es- permatozoide com compactação de cromatina ruim. [00187] As FIGS. 11A-11C mostram a concentração de espermatozóide humano selecionado, contagem, %DFI, e %HDS em comparação com a amostra de sêmen bruto inicial (n=4). Os resultados indicam que com um espermatozóide média 120M em amostra de 1 ml_ introduzida na entrada, amostras de 100 pL com mais de 630.000, 410.000, e 120.000 espermatozóides foram coletadas de dispositivos de 6 mm, 7,5 mm e 9 mm, respectivamente (com concentrações correspondentes de 6,32M/ml_, 4,12M/ml_, e 1,29M/mL) (FIG. 11 A). O tempo do experimento foi 10 min em cada caso. [00188] Análogo aos resultados de espermatozóide de touro (FIG. 8C), a concentração e as contagens do espermatozóide humano selecionado linearmente diminuem com o comprimento do microcanal (R2=0,99). Embora as contagens de espermatozóide selecionado fossem similares para testes de touros e de seres humanos, as amostras de teste humanas tiveram contagens iniciais mais altas e os testes foram mais curtos em duração (10 min vs. 15 min). As contagens de espermatozóide humano coletado estão na ordem de 103 vezes aquela das contagens de entrada, que é indicativo de um processo de seleção eficaz. É notável, entretanto, que as contagens de saída e as concentrações permaneçam suficientes para a aplicação clínica. Além disso, a proporção de concentrações de espermatozóide da entrada para a de saída é muito similar através de dispositivos tanto em espermatozóide de touro como em espermatozóide humano (ver uma comparação dos gráficos nas FIGS. 12A-12B). Também é notável que as concentrações mostram uma tendência consistente tanto em testes de espermatozóide humano como de touro. Entretanto, devido à diferença de 10 vezes no volume de amostra da entrada e da saída, é importante não confundir a proporção de concentração traçada com a taxa de seleção (isto é, a contagem do espermatozóide selecionado contra a contagem do espermatozóide injetado). [00189] DNA de espermatozóides humanos e os parâmetros de integridade de cromatina, %DFI e %HDS, para o espermatozóide selecionado e sêmen bruto como uma função do comprimento do dispositivo são traçados nas FIGS. 11B-11C. %DFI foi 10,9 para o sêmen bruto e 4,32, 3,37 e 2,40 para o espermatozóide selecionado nos dispositivos de 6 mm, 7,5 mm e 9 mm, respectivamente. Resultados mostram uma correlação linear negativa forte entre %DFI e comprimento do microcanal (R2=0,99), indicando a fragmentação de DNA reduzida com o comprimento de microcanal aumentado. Especificamente, %DFI no espermatozóide selecionado de dispositivos de 6 mm, 7,5 mm e 9 mm foi mais baixo em 60%, 70% e 78%, respectivamente, quando comparado com a amostra de sêmen bruto. Resultados para %HDS indicam tendências similares com uma correlação mais fraca (R2=0,76) do que os observados para %DFI (FIG. 11C). %HDS foi 4,21 para o sêmen bruto e melhorou em 46%, 79% e 80% nos dispositivos de 6 mm, 7,5 mm e 9 mm, respectivamente (com %HDS correspondente de 2,25, 0,86 e 0,84). Estes valores comparam-se favoravelmente com os métodos atuais mais comuns de preparação de esperma, nado e cen-trifugação por gradiente de densidade, com melhoras relatadas máximas de 50% (de Lamirande et al., 2012; Zini et al., 2002). [00190] Além de tudo, as análises com o espermatozóide humano revelaram que a concentração mais alta pode ser isolada do dispositivo de 6 mm e diminui linearmente com o comprimento do canal (FIG. 11 A). A comparação dos parâmetros DFI e HDS de qualidade de DNA da amostra de sêmen bruto e amostras separadas mostram que a fragmentação é significativamente reduzida após separação com o dispositivo microfluídico. Além disso, as porcentagens de DFI e HDS são mais baixas nos dispositivos de 7,5 mm e de 9 mm do que no dispositivo de 6 mm (FIGS. 11B-11C). Isto significa que o dispositivo com um comprimento de canal de 7,5 mm produz os melhores resultados com relação à qualidade e concentração do DNA.

DURAÇÃO - ESPERMATOZÓIDE HUMANO [00191] A influência da duração do teste na concentração, contagem e integridade de DNA do espermatozóide selecionado foi avaliada para o dispositivo de 7,5 mm com resultados traçados nas FIGS. 13A-13C. Os resultados indicam que com um espermatozóide médio 113 M em amostra de 1 ml_ introduzida na entrada, mais de 410.000 foram selecionados em amostras de 100 pL dos experimentos de 10 min. O número de espermatozóides selecionados aumenta linearmente para mais de 490.000 e 600.000 espermatozóides para experimentos de 15 min e 20 min (R2=0,98), respectivamente (com concentrações coletadas correspondentes de 4,91 M/mL e 6,03 M/mL). Estas contagens de espermatozóide selecionado são mais do que suficientes para o desempenho de IVF (~ 50.000) e certamente suficientes para protocolos de ICSI. [00192] É notável, entretanto, que o número de espermatozóides coletados também é uma função da qualidade de amostra tal que para casos de infertilidade por má-formação (isto é, oligozoospermia e as-tenozoospermia) se espera que a proporção de espermatozóides coletados na saída seja mais baixa do que de homens férteis. Como demonstrado neste pedido, tanto o comprimento do dispositivo (FIG. 11 A) e/ou tempo de corrida (FIG. 13A) podem ser ajustados para aumentar contagens de espermatozóides selecionados de acordo com a necessidade. Por exemplo, fornecer um dispositivo com comprimentos de microcanais mais curtos e/ou aumentar a duração entre introdução da amostra no reservatório de entrada e coleta de espermatozóide do reservatório de saída tenderão a aumentar o número de espermatozóides coletados, enquanto fornecer um dispositivo com comprimentos de microcanal mais longos e/ou reduzir a duração entre introdução da amostra no reservatório de entrada e coleta de espermatozóides do reservatório de saída tenderão a diminuir o número de espermatozóides coletados. [00193] Os valores de integridade de DNA de espermatozóides humanos selecionados como quantificado pelo índice de fragmentação de DNA (%DFI) são mostrados na FIG. 13B. As respectivas populações de espermatozóides selecionadas a partir de experimentos de 10, 15, e 20 min foram mais baixas do que o sêmen bruto em 69% (10,9 para 3,37), 83% (7,29 para 1,26) e 81% (9,41 para 1,78), respectivamente (ver a Tabela 2 para detalhes). TABELA 2: RESULTADOS DE DFI E HDS (n=4) [00194] Estes dados indicam que o dispositivo seleciona o espermatozóide com uma integridade de DNA significativamente mais alta do que o sêmen bruto e sugere que 15 min é a duração preferencial da seleção do espermatozóide com a alta integridade de DNA. Como mostrado na FIG. 13C, encontrou-se que %HDS nas respectivas populações de espermatozóides selecionadas a partir dos experimentos de 10, 15, e 20 min foi mais baixo do que o sêmen bruto em 80% (4,21 a 0,86), 88% (5,22 a 0,62) e 91% (3,58 a 0,34), respectivamente (ver a Tabela 2 para detalhes). Estes dados parecem indicar que o dispositivo de 7,5 mm pode ser capaz de selecionar o espermatozóide com uma compactação de cromatina significativamente mais alta do que no sêmen bruto e sugerir que o tempo de 20 min é preferencial. [00195] Além disso, ambas as medidas da integridade de DNA, %DFI e %HDS, parecem indicar que o dispositivo pode ser capaz de selecionar populações de espermatozóides com a integridade de DNA significativamente mais alta. No contexto da aplicação clínica, o método ainda fornece (1) números de espermatozóides selecionados suficientes de IVF e ICSI (por exemplo, > 50.000); (2) processamento rápido (<20 min); e (3) uma simplificação considerável sobre práticas a-tuais que requerem a purificação de esperma. [00196] Ainda, as análises com o espermatozóide humano quanto à duração sugerem que a concentração de espermatozóide isolada foi a mais alta após 25 minutos (FIG. 13A); os parâmetros de qualidade de DNA foram similares após 15 e 20 minutos (FIGS. 13B-13C). Entretanto, desde a vitalidade de reduções de espermatozóide com o tempo (dados não mostrados), uma duração de 15 minutos foi determinada a usar para futuros experimentos. [00197] Além de tudo, uma abordagem de seleção de espermatozóides microfluídica simples foi desenvolvida baseada nos ensinamentos neste pedido. Esta abordagem de seleção de espermatozóides é capaz de selecionar espermatozóide de alta integridade de DNA de um mililitro do sêmen bruto. O método alavanca a navegação que segue a borda de espermatozóides dotados de motilidade em um arranjo de 500 canais paralelos preenchidos com meio viscoelástico que se parece com aquele do trato reprodutivo feminino. O dispositivo realiza purificação de espermatozóide e seleção de espermatozóides de alta integridade de DNA simultaneamente, fornecendo números de espermatozóides selecionados clinicamente relevantes em 20 min. O nível de DNA de espermatozóides e a integridade de cromatina obtida por seleção microfluídica (faixa de %DFI: 1-3% e faixa de %HDS: 0,3-0,9%) não foi alcançado com nenhuma outra técnica (Ng et al., 1992; Zini e al, 2000). Os dados também fornecem forte evidência que a cromatina de espermatozóide e a integridade do DNA são estritamente relacionadas à motilidade de espermatozóides progressiva rápida (o atributo característico do espermatozóide da saída). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram a presença de uma subpopulação de espermatozóides com cromatina quase intacta e integridade do DNA e a capacidade de selecionar não invasivamente esta população para o uso em ART. [00198] No contexto da aplicação clínica, a simplicidade e a curta duração deste processo de seleção também são atributos muito úteis. Especificamente, o processo de uma etapa substitui o processo de várias etapas prévias que envolvem forças potencialmente prejudiciais (por exemplo, centrifugação) e o risco associado de injúria de espermatozóide iatrogênica. A curta duração minimiza o estresse oxidativo. Embora não verificado, suspeita-se que prolongar os experimentos (além de 20 min) pode selecionar o espermatozóide com a maturidade aumentada (compactação de cromatina mais alta) à custa de dano do DNA em consequência do estresse oxidativo. [00199] Os doadores de espermatozóide com parâmetros de espermatozóides normais (por exemplo, cromatina de espermatozóides e integridade do DNA normais) foram usados. Experimentos adicionais com amostras de espermatozóide de homens estéreis, muitos dos quais terão parâmetros de espermatozóides anormais (por exemplo, baixa concentração e motilidade ruim) podem ser necessários para definir os melhores parâmetros de dispositivo destes subgrupos de homens estéreis (defeito de concentração primário ou defeito de motilidade primário). Espera-se que a motilidade de espermatozóides pior de amostras de homens estéreis pode requerer comprimentos de dispositivo menores e/ou os tempos de execução maiores a fim de alcançar números de espermatozóides suficientes para IVF. É notável, entretanto, que muitos destes homens podem ser candidatos para ICSI (requerendo somente 10-30 espermatozóides), portanto a recuperação de espermatozóides de porcentagem mais baixa não será um fator adverso importante em tais casos. Os resultados aqui demonstram que a geometria de dispositivo simples e/ou o protocolo podem ser sintonizados para adaptação específica para o paciente.

QUALIDADE DE ESPERMATOZÓIDE - ESPERMATOZÓIDE HUMANO DE HOMENS COM INFERTILIDADE [00200] As análises preliminares do espermatozóide classificado em um período de tempo de 2 horas usando o aparelho e o espermatozóide humano obtido de homens com infertilidade mostraram uma melhora de 40% na morfologia, uma melhora de 74% na motilidade e uma melhora de 58,4% em %DFI comparando com as amostras de sêmen bruto.

SEPARAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO BASEADA EM MOTILIDADE E COMPORTAMENTO DE NADO ATÉ A PAREDE [00201] Em outro amplo aspecto, as modalidades descritas neste pedido referem-se em geral a um aparelho de seleção de espermatozóides microfluídico capaz de separar o espermatozóide baseado no comportamento de nado até a parede. [00202] Uma purificação de uma etapa de espermatozóide de alto rendimento e o dispositivo de seleção de espermatozóides foram usados para selecionar espermatozóides, mostrando que os espermato- zoides que nadam até a parede têm uma integridade de DNA mais alta. Esta abordagem fornece uma melhora para as práticas clínicas, evitando as técnicas perigosas usadas atualmente (Mortimer, 2000), e a inclusão de um parâmetro de fertilidade adicional, ou seja, comportamento de nado até a parede. Espera-se que esta seleção de espermatozóides leve a uma taxa mais alta de gravidezes com resultados positivos. A análise fornece discernimentos adicionais do comportamento de nado até a parede de espermatozóides que é de alto interesse para biólogos reprodutivos, pesquisadores microfluídicos e pesquisadores básicos que estudam o fenômeno de nado da célula. RESULTADOS EXPERIMENTAIS: [00203] Para avaliar o potencial de seleção de espermatozóides baseado no comportamento de nado até a parede, como mostrado na FIG. 14A, um dispositivo microfluídico 1400 foi fabricado de PDMS com um fundo de vidro. Neste dispositivo, um reservatório de entrada 1415 estava em comunicação de fluidos com uma passagem 1417 a-través de uma pluralidade de percursos de microcanais 1422, cada percurso compreendendo uma junção 1440. Para selecionar espermatozóides baseados somente na motilidade dos espermatozóides, o fluxo de fluido é evitado no dispositivo implementando câmaras sem saída no fim dos microcanais. Os espermatozóides nadaram do reservatório de entrada 1415 no canal principal até que alcançassem uma junção 1440. Os espermatozóides foram identificados como nadadores diretos (SS) se passaram diretamente pela junção ou nadadores de parede (WS) se seguiram a parede de canal e nadaram no canal lateral esquerdo ou direito. Três desenhos diferentes com ângulos variáveis na junção (45°, 90°, 135°, mostrados ampliados como 1440a, 1440b, e 1440c) foram usados a fim de determinar o efeito do ângulo de junção na eficiência de seleção (FIG. 14A). Os números de espermatozóides SS e WS foram avaliados por contagem manual. [00204] Os resultados na FIG. 14B demonstram que 70,1 ± 1,6% e 64,6 ± 2,8% de espermatozóides bovinos podem ser identificados como WS em comparação com 29,9 ± 1,6% e 35,4 ± 2,8% de SS nos desenhos com ângulos de 45° e 90°, respectivamente. Menos WS foram selecionados quando um ângulo de 135° foi incluído na junção uma vez que os números de WS significativamente reduziram a 22,7 ± 2,1% e os números de SS aumentaram a 77,3 ± 2,1%. (n = 12 experimentos independentes, média ± s.e.m., valores P foram determinados pelo teste t de Student de dois lados não pareados com variações desiguais mostrando diferenças significantes entre SS e WS; *** P <0,0005, ** P <0,005, *P <0,05). [00205] Foi visto que os espermatozóides nadaram contra a parede do canal lateral oposto de onde se espera que se virem em direção ao lado com o ângulo obtuso, como mostrado na FIG. 14C (as flechas indicam a direção de nado após deflexão da parede de canal oposto). Por isso, ângulos de canal laterais <105° (=15°+ 9 0°), como no caso dos desenhos de 45° e 90°, resultarão nos espermato zoides que nadam no canal lateral, enquanto os ângulos >105°, neste pedido representados pelo desenho de 135°, redirecionam os espermatozóides no canal principal. Estes resultados sugerem que ângulos <105° podem ser usados a fim de selecionar os espermatozóides que nadam até à parede. Ainda, este experimento de prova de conceito demonstra que a seleção de espermatozóides bovinos baseados no comportamento de nado até a parede pode ser um modo adequado de dividir espermatozóides de uma amostra de espermatozóide em subpopulações diferentes. [00206] A fim de testar se espermatozóides se orientam ao longo da superfície do dispositivo dependendo do material, dispositivos microflu-ídicos foram fabricados (1) com um fundo de vidro e topo de PDMS, (2) inteiramente de PDMS, e (3) com um fundo de PDMS e topo de vidro. A atração de espermatozóides bovinos em direção a uma superfície de vidro foi discutida há meio século (Rothschild, 1963). O estudo de Rothschild, entretanto, analisou espermatozóides em uma gota em uma superfície de vidro, não oferecendo aos espermatozóides uma superfície sólida alternativa. A limitação de espermatozóides entre duas superfícies sólidas, por isso, é uma nova abordagem para análise do comportamento de nado de espermatozóides de acordo com os ensinamentos neste pedido. Para determinar a proporção de nadadores à esquerda (LS) e nadadores à direita (RS), três dispositivos foram testados para espermatozóides que nadam à esquerda e à direita. SS não foram incluídos na análise a fim de determinar se uma diferença significante entre LS e RS existe. [00207] Os experimentos com o ângulo de 45° e fundo de vidro revelaram uma preferência significante de espermatozóides bovinos WS para nadar nos canais direitos (66,2 ± 3,9% de RS vs. 33,8 ± 3,9% de LS), ilustrado na FIG. 15A (a linha tracejada indica a marca de 50%). Valores P determinados por ANOVA de dois fatores mostram se diferenças significantes existem entre LS e RS (em baixo de barras) e entre materiais diferentes (abaixo dos marcadores do eixo). [00208] A preferência para nadar à direita diminui no dispositivo de PDMS completo, indicado por uma porcentagem levemente mais alta de espermatozóides RS do que LS (55,4% ± 4,2% de RS vs. 44,6 ± 4,2% de LS). Ao usar o dispositivo com vidro superior, entretanto, a proporção deslocada em direção a mais LS (51,4 ± 1,9%) do que RS (48,6 ± 1,9%), mas com um desequilíbrio mais baixo do que no dispositivo de fundo de vidro. A mesma distribuição também foi observada no desenho de 90°, confirmando as antigas descobertas que ângulos entre 45°e 90°resultam em seleção de espermatozoi des comparável. Embora uma tendência similar também possa ser observada no desenho de 135°, diferenças entre RS e LS não foram sig nificantes. Estes achados sugerem que uma grande percentagem de espermatozóides prefere nadar ao longo da superfície de vidro e em seguida à direita. Nos casos onde a superfície de vidro forma o fundo de dispositivo, mais espermatozóides são RS do que LS. A inversão da configuração do caso com a superfície de vidro no topo leva a mais LS do que RS, indicando que este efeito é dependente da posição da superfície de vidro. Os resultados mostram que a atração de espermatozóides para superfícies sólidas não é igual para cada material, por meio disso fornecendo nova informação sobre comportamento de nado de espermatozóides que pode ser empregada para a seleção de espermatozóides. Ainda, as descobertas da assimetria de nado à esquerda e direita com uma preferência de nado à direita de espermatozóides são um fenômeno não investigado e este estudo fornece discernimentos de um papel potencial do eixo esquerdo e direito na biologia reprodutiva. Futuros estudos podem revelar se a assimetria esquerda e direita tem um impacto similar na reprodução como tem no desenvolvimento embrionário (Raya e Izpisúa Belmonte; 2006). [00209] A possível influência da gravidade no comportamento de nado de espermatozóides foi examinada. Considerações teóricas foram publicadas na influência da gravidade (Katz e Pedrotti, 1997) e dados experimentais são o suporte disponível da hipótese de gravita-xia em espermatozóides bovinos e humanos (Roberts, 1972; Makler et al., 1993). Contradizendo dados que indicam que a gravidade não tem efeito sobre o nado de espermatozóides também foi publicado (Winet et al., 1984). A fim de adquirir novos discernimentos de gravitaxia de espermatozóides, as proporções de espermatozóides que nadam ao longo da superfície de vidro nos canais direitos foram comparadas. Como demonstrado na FIG. 15B, estes foram os espermatozóides i-dentificados como RS no dispositivo de fundo de vidro e os espermatozóides identificados como LS no dispositivo de topo de vidro. A com- paração destas duas populações no desenho de 45° mostra significativamente que mais RS (66,2 ± 43,9%) pode ser detectado no dispositivo de fundo de vidro do que LS (51,4 ± 1,9%) no dispositivo de topo de vidro. Um efeito similar, mas mais baixo foi observado no desenho de 90° com 64,6 ± 3,2% de RS e 56,4 ± 3,0% de LS , mas nenhuma diferença significante pode ser detectada no desenho de 135°(n = 12 experimentos independentes, média ± s.e.m., valores P foram determinados pelo teste t de Student não pareado de dois lados com variações desiguais; ***P <0,0005, **P <0,005, *P <0,05). Estes resultados demonstram que sob o efeito da gravidade, os espermatozóides tendem a nadar perto do fundo do dispositivo. Isto fortalece a hipótese que os espermatozóides exercem gravitaxia. [00210] Os efeitos do comportamento de nado até a parede na vitalidade e na integridade de DNA de espermatozóides selecionados também foram investigados. Uma pluralidade de aparelhos de purificação de sêmen de uma etapa, de alto rendimento e de seleção de espermatozóides sem fluxo foi fabricada inteiramente de PDMS, com cada aparelho tendo um de três desenhos de percurso de microcanal (por exemplo, 200a, 200b, e 200c como mostrado na FIG. 16A). Em cada um destes desenhos de percurso de microcanal, um percurso central conduz de uma via de entrada adjacente a um reservatório de entrada, e seis ligações foram fornecidas ao longo do percurso central, cada junção tendo um percurso central e dois canais laterais aproximadamente perpendiculares levando a câmaras laterais esquerdas e direitas alongadas substancialmente paralelas ao percurso central. No desenho de caminho mostrado em 200b, o percurso central leva ao reservatório de saída, e as câmaras laterais foram efetivamente câmaras sem saída. No desenho mostrado em 200a, a câmara lateral esquerda levou ao reservatório de saída, enquanto o percurso central e a câmara lateral direita eram efetivamente sem saída. No desenho mos- trado em 200c, a câmara lateral direita levou ao reservatório de saída, enquanto o percurso central e a câmara lateral esquerda eram efetivamente sem saída. [00211] Um ângulo de 90° foi usado para os canais laterais uma vez que experimentos preliminares indicaram tal ângulo sendo adequado para empregar a deflexão do esperma. Além disso, uma curvatura de 200 pm foi usada para auxiliar o espermatozóide a seguir continuamente a parede (Denissenko et al., 2012). O dispositivo selecionou espermatozóides de 200 pL do sêmen bruto baseado na sua preferência sendo LS, SS ou RS, enquanto os espermatozóides mortos e fragmentos permaneceram na entrada. Os resultados de concentração de espermatozóides bovinos na saída, como mostrados na FIG. 16B, indicam que as concentrações de espermatozóides coletados das saídas LS (1,96 ± 0,45 x106/mL) e RS (1,94 ± 0,56 x106/mL) foram mais altas do que a concentração de espermatozóides coletados da saída SS (0,77 ± 0,78 x106/mL) (n = 14 experimentos independentes, média ± s.e.m., valores P foram determinados por uma análise de dispersão única; ***P <0,0005, **P <0,005, *P <0,05). Estas diferenças na concentração originam a pergunta de se a vitalidade se diferencia entre os espermatozóides que exibem comportamento de nado até a parede e aqueles que não exibem tal comportamento. Os resultados de vitalidade bovina, como mostrado na FIG. 16C, mostram que não há nenhuma diferença estatisticamente significante na vitalidade dos espermatozóides selecionados usando o comportamento de nado até a parede (83,64 ± 2,72% de LS, 77,62 ± 3,38% de SS, 87,86 ± 4,76% de RS) (n = 14 experimentos independentes, média ± s.e.m., valores P foram determinados por uma análise da dispersão única; ***P <0,0005, **P <0,005, *P <0,05). Estes experimentos produziram uma proporção de espermatozóides que exibem assimetria de nado à esquerda compatível com os experimentos preliminares anteriormente discutidos, o comportamento de nado até a parede como um instrumento potente para seleção de espermatozóides microfluídica. [00212] A concentração e resultados de vitalidade dos espermatozóides humanos selecionados usando comportamento de nado até a parede (FIGS. 17A e 17B) exibem as mesmas tendências que os resultados bovinos (FIGS. 16B e 16C). Ao comparar a concentração e vitalidade do LS, os resultados bovinos são 1,96 ± 0,45 x106/mL e 83,6 ± 2,72%, que é similar aos resultados humanos de 1,55 ± 0,43 x106/mL e 88,81 ± 4,26%. Isto fornece uma forte fundação para usar espermatozóides bovinos como um modelo do comportamento de nado de espermatozóides humanos. A comparação da vitalidade dos espermatozóides selecionados pelo dispositivo microfluídico mostra que não há nenhum compromisso significante na vitalidade dos espermatozóides selecionados usando o comportamento de nado até a parede uma vez que então 88,81 ± 4,26% de LS, 81,87 ± 10,48% de SS, e 93,58 ± 1,63% de RS estavam vivos, em comparação com 85,20 ± 1,18% de vivos na amostra de sêmen bruto (FIG. 17B). [00213] Os resultados do ensaio de estrutura de cromatina de espermatozóide (SCSA) dos espermatozóides humanos selecionados usando a assimetria de nado à esquerda e as amostras de sêmen brutos são fornecidos nas FIGS. 17C e 17D (n = 5 experimentos independentes, média ± s.e.m, valores P foram determinados usando um teste t de dois lados comparando com a amostra bruta (controle); ***P <0,0005, **P <0,005, *P <0,05). O índice de fragmentação de DNA (DFI) mostra a porcentagem de células que têm o dano de DNA e alta marcabilidade do DNA (HDS) mostra a porcentagem de células que são imaturas. Os resultados do DFI e HDS mostram que os espermatozóides selecionados pelo dispositivo microfluídico têm %DFI (LS 1,16 ± 0,39%, SS 3,30 ± 0,86%, RS 1,63 ± 0,79%) e %HDS (LS 0,62 ± 0,22%, SS 2,54 ± 0,76%, RS 1,32 ± 0,57%) mais baixos do que o sê- men bruto (%DFI: 5,04 ± 0,70%,%HDS: 4,21 ± 0,63). Olhando exclusivamente para os resultados a partir dos espermatozóides selecionados usando o comportamento de nado até a parede, primeiro parece que o dispositivo LS tem rendimento melhor de %DFI e %HDS do que o RS e SS. Estes resultados, entretanto, precisariam ser mais explorados a fim de melhor entender se as diferenças entre o LS e RS existem. Um resultado que é notável é a melhora da integridade do DNA dos espermatozóides selecionados usando microfluídicos e assimetria de nado à esquerda em comparação com a técnica tradicional da cen-trifugação por gradiente de Percoll. Pesquisa prévia mostrou que a preparação de Percoll é capaz de selecionar espermatozóides com a metade do DFI do DFI da amostra de sêmen bruto (De Lamirande et al., 2012). Para comparar com tais resultados, %DFI do sêmen bruto usada neste estudo precisaria cair de aproximadamente 5% para 2,5%. %DFI de LS (1,16 ± 0,39%) e RS (1,63 ± 0,79%) estão visivelmente abaixo de 2,5%, indicando que a seleção de espermatozóides LS e RS pode fornecer melhores resultados do que a centrifugação por gradiente de Percoll tradicional (por exemplo, ver a FIG. 18). [00214] Completamente, a assimetria de nado à esquerda de espermatozóides está sob o efeito de uma interação complexa de vários fatores físicos, como gravidade, material superficial e geometria do canal. A variação destes fatores permite a separação de espermatozóides em subpopulações diferentes. A vitalidade e os resultados de integridade do DNA dos espermatozóides selecionados parecem ter três implicações: (1) o dispositivo microfluídico não causa o dano de DNA aos espermatozóides, (2) os espermatozóides selecionados pelo dispositivo microfluídico têm uma incidência significativamente mais baixa do dano de DNA do que o sêmen bruto, e (3) a assimetria de nado à esquerda pode ser utilizada como um instrumento da seleção de espermatozóides com a alta integridade de DNA comparável ou melhor do que usar a preparação de centrifugação por gradiente de Percoll. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL [00215] Os dispositivos da primeira parte do estudo foram feitos (1) de PDMS com um fundo de vidro, (2) inteiramente de PDMS, ou (3) de PDMS com um topo de vidro. Técnicas de litografia suave padrão foram usadas para a fabricação. Antes do uso, os dispositivos foram preenchidos de tampão de alta viscosidade contendo Ácido hialurônico 1 mg/mL. Uma temperatura de 37°C foi mantida durante o experimento. Imediatamente antes da injeção no dispositivo microfluídico, os espermatozóides bovinos congelados foram descongelados a 37Ό e marcados com SYBR14 (Kit de Viabilidade de Espermatozóide Ll-VE/DEAD, Molecular Devices, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Então 2 pL da amostra marcada foram injetados no dispositivo. Foram feitos vídeos de 5 minutos de duração mostrando espermatozóides fluorescentes que nadam nas junções do dispositivo. O desenho de dispositivo permitiu capturar dois vídeos simultaneamente. Contagem de espermatozóides foi realizada manualmente após o experimento. [00216] O dispositivo de alto rendimento da segunda parte do estudo foi fabricado usando técnicas de litografia suave e preenchido com tampão de alta viscosidade contendo metilcelulose 5 mg/mL. Uma temperatura de 37°C foi mantida durante o experimento. Espermatozóide bovino congelado foi descongelado e espermatozóide humano foi obtido e tratado como anteriormente publicado (Nosrati et al., submetido em 2013). Uma alíquota de 0,20 mL do espermatozóide foi injetada no anel de entrada usando uma seringa plástica. Os dispositivos foram deixados imperturbados durante 15 minutos, a cobertura de saída então foi removida, e os espermatozóides extraídos da passagem usando uma pipeta (Nosrati et al., submetido em 2013). A concentração de espermatozóides foi determinada contando manualmente as células em um hemocitômetro. Para os experimentos bovinos usados para validar o desenho microfluídico, a vitalidade foi avaliada contando as células vivas e mortas marcadas usando o Kit de Viabilidade de Espermatozóide LIVE/DEAD. Os novos dispositivos foram usados para cada experimento. A vitalidade do espermatozóide humano foi determinada usando protocolos de marcação estabelecidos (De Lamirande et al2012), e a integridade do DNAfoi avaliada usando protocolos de SCSA existentes (Zini et al., 2002). APLICAÇÃO: [00217] Além de tudo, as análises discutidas acima sugerem que o comportamento de nado até a parede de espermatozóides pode ser usado como um parâmetro de fertilidade potencial e prognosticador da integridade de DNA. Mostra que os espermatozóides podem ser selecionados usando geometrias microfluídicas com ângulos menores que 105° e que dependendo do material superficial, os espermatozóides mostram uma assimetria de nado à esquerda com uma preferência para nadar à direita. [00218] Também, experimentos no espermatozóide humano revelaram uma preferência levemente mais alta do espermatozóide para nadar ao lado direito do que ao lado esquerdo, como visto em experimentos mais precoces com o espermatozóide de touro em um dispositivo de PDMS completo (FIG. 15A, FIG. 17A). Concentrações mais baixas parecem ter sido reveladas para os canais diretos. Resultados similares podem ser vistos para a análise da vitalidade (FIG. 17B). O espermatozóide que nada ao lado direito mostra porcentagem mais alta de espermatozóides vivos, seguido da população que nada ao lado esquerdo. O espermatozóide que nada diretamente, entretanto, mostra uma porcentagem mais baixa de espermatozóides vivos do que a amostra de sêmen bruto. Os parâmetros DFI e HDS são significativamente reduzidos após separação baseada no comportamento de nado até a parede com o espermatozóide que nada ao lado esquerdo mostrando melhora mais alta na integridade do DNA do espermatozóide separado. Os nadadores à direita mostram a integridade de DNA levemente menor melhorada do que nadadores à esquerda. Entretanto, a melhora na integridade do DNA do espermatozóide que nada diretamente é a mais baixa em comparação com duas outras subpopu-lações (FIGS. 17C-17D). Isto faz com que a separação de espermatozóides que nada à esquerda uma abordagem promissora. [00219] Como observado acima, exemplos do aparelho de seleção de espermatozóides microfluídico (por exemplo, 200a, 200b, e 200c) capazes de separar o espermatozóide baseado no comportamento de nado até a parede são mostrados na FIG. 16A. Embora geralmente similar ao aparelho 100 descrito acima, no aparelho 200, uma rede de microcanais 222 é projetada a fim de classificar o espermatozóide u-sando o comportamento de nado até a parede: cada unidade de separação ilustrada na FIG. 16A contém três microcanais principais que são interligados por seis canais perpendiculares. Será apreciado que outras configurações de microcanais e canais cruzados podem ser fornecidas. [00220] Os cantos nesta rede de canais podem ser arredondados para que o espermatozóide seja capaz de seguir continuamente a parede em torno do canto. Por exemplo, uma curvatura de 200 pm pode ser aplicada aos cantos. Um dos canais principais leva ao reservatório de saída; outros dois canais controlam os espermatozóides dotados de motilidade direta em uma câmara sem saída (por exemplo, uma câmara de coleta ou armadilha). Isto significa que suas preferências de nado para um lado específico guiarão os espermatozóides no reservatório de saída (se for o lado preferencial) ou câmara sem saí-da/armadilha (se não for o lado preferencial). [00221] Outras modalidades exemplo de microcanais projetados a fim de classificar o espermatozóide usando o comportamento de nado até a parede são mostradas nas FIGS. 19-21. [00222] No exemplo mostrado na FIG. 19, que é projetado para selecionar nadadores à esquerda, percurso de microcanal 1905 compreende uma via de entrada 1920 adjacente ao reservatório de entrada 115, uma via de saída 1910 adjacente ao reservatório de saída 117, e uma junção 1940 localizado entre a via de entrada e a via de saída para controlar uma porção do espermatozóide que entra na via de entrada em direção ao reservatório de saída. Neste exemplo, os espermatozóides que tendem a nadar ao longo de uma parede esquerda serão guiados ao longo do caminho 1905a em direção ao reservatório de saída 117, enquanto os espermatozóides que tendem a nadar diretamente ou ao longo de uma parede direita serão guiados ao longo do caminho 1905b e 1905c, respectivamente, cada um destes caminhos conduzindo para uma câmara de coleta 1930 (ou outra extremidade sem saída eficaz). Consequentemente, os espermatozóides que entram no caminho reto ou à direita são direcionados para longe do reservatório de saída 117, e dessa forma não estarão entre os espermatozóides coletados do reservatório de saída 117. [00223] No exemplo mostrado na FIG. 20, que é projetado para selecionar nadadores à direita, ao encontrar a junção 1940, os espermatozóides que tendem a nadar ao longo de uma parede direita serão guiados ao longo do percurso 1905c em direção ao reservatório de saída 117, enquanto os espermatozóides que tendem a nadar diretamente ou ao longo de uma parede esquerda serão guiados ao longo dos percursos 1905b e 1905c, respectivamente, em direção à câmara de coleta 1930. No exemplo mostrado na FIG. 21, que é projetado para selecionar nadadores diretos, os espermatozóides que tendem a nadar diretamente serão guiados em direção a uma câmara de coleta, enquanto os espermatozóides que tendem a nadar ao longo de uma parede direita ou ao longo de uma parede esquerda serão guiados em direção ao reservatório de saída 117. [00224] Será apreciado que em modalidades alternativas, variações podem ser feitas aos percursos de microcanais do exemplo 222 e/ou 222a-c. Por exemplo, os desenhos variantes podem incorporar um ou mais componentes de parede de divisão (similares aos divisores 126 mostrados na FIG. 4), um ou mais regiões cônicas graduais (e/ou distinto) entre a via de entrada e a via de saída e/ou mais de uma câmara de coleta (ou outra extremidade sem saída eficaz) por via de entrada. [00225] As dimensões do exemplo para os percursos de microcanais no arranjo de microcanais 222 (e/ou no arranjo de microcanais 222a-c) são mostrados na Tabela 3. TABELA 3: DIMENSÕES DO APARELHO 200 PARA SEPARAÇÃO DE ALTO RENDIMENTO BASEADA EM MOTILIDADE E COMPORTAMENTO DE NADO ATÉ A PAREDE. [00226] Quando os aparelhos e os métodos descritos neste pedido são aplicados à injeção de espermatozóide intracitoplasmática (ICSI), um comprimento de microcanal mais longo na rede radial pode ser u-sado. O dispositivo então pode ser direcionado para uma duração menor a fim de ter uma qualidade altamente seletiva do espermatozóide na saída do dispositivo que então seria manualmente selecionada por embriologistas de ICSI. Se desejado, a saída pode ser monitorada sob um microscópio a fim de selecionar manualmente o primeiro esperma- tozoide na saída do microcanal observado. [00227] Várias modalidades de sistemas, aparelhos e métodos que podem ser usados para separação de espermatozóides foram descritas neste pedido por meio do exemplo somente. Por exemplo, os aparelhos e os métodos descritos neste pedido podem ser usados para a separação de outros tipos celulares, tais como (mas não limitados a) procariotos autopropulsionados após modificações de desenho menores, mas também eucariotos que migram devido a sinais internos ou externos ou tipos celulares com propriedades de superfície específicas (será apreciado que a funcionalização do dispositivo microfluídico teria que ser feita consequentemente). Por exemplo, redes de microcanais alternativas podem ser fornecidas a fim de: i) guiar as células (quimio-taxia); ii) se ligar às células para uma ou mais superfícies do aparelho (por exemplo, superfícies no reservatório de entrada, no reservatório de saída e/ou na rede de microcanais); e/ou iii) modificar a capacidade de migração de células induzindo uma transição fenotípica (por exemplo, transição mesenquimal epitelial). Várias modificações e variações podem ser feitas a todas as modalidades exemplo descritas conforme os ensinamentos neste pedido sem se afastar do espírito e do escopo das modalidades, que são somente limitadas pelas reivindicações a-crescentadas que devem ser dadas a interpretação mais ampla compatível com a descrição no conjunto.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [00228] A. Agarwal, T. M. Said, Hum. Reprod. Update 2003, 9, 331-345. [00229] A. Aharoni, K. Thieme, C. P. C. Chiu, S. Buchini, L. L. Lair-son, H. Chen, N. C. J. Strynadka, W. W. Wakarchuk, S. G. Withers, Nat. Methods 2006, 3, 609-614. [00230] A. Ahmadi, S-C. Ng, J. Exp. Zool. 1999, 284, 696-704. [00231] A. Souza Setti, R. C. Ferreira, D. Paes de Almeida Ferreira Braga, R. de Cássia Sávio Figueira, A. laconelli, E. Borges, Reprod. BioMed. Online 2010, 21, 450-455. [00232] A. T. Ohta, M. Garcia, J. K. Valley, L. Banie, H.-Y. Hsu, A. Jamshidi, S. L. Neaie, T. Lue, M. C. Wu, Lab Chip 2010, 10, 3213-3217. [00233] A. Zini, A. Finelli, D. Phang, K. Jarvi, Urology 2000, 56, 1081-1084. [00234] A. Zini, M. Sigman, J. Androl. 2009, 30, 219-229. [00235] A. Zini, R. Bielecki, D. Phang, Μ. T. Zenzes, Fértil. Steril. 2001, 75, 674-677. [00236] A. Zini, V. Mak, D. Phang, K. Jarvi, Fértil. Steril. 1999, 72, 496-499. [00237] Ainsworth C (2005). The secret life of sperm. Nature 436:770-771. [00238] Aitken, R.J., De luliis, G.N., McLachian, R.l. Biological and clinicai significance of DNA damage in the male germ line. J. Androl. 32, 46-56 (2009). [00239] B. Balaban, K. Yakin, C. Alatas, O. Oktem, A. Isiklar, B. Ur-man, Reprod. BioMed. Online 2011, 22, 472-476. [00240] B. S. Cho, T. G. Schuster, X. Zhu, D. Chang, G. D. Smith, S. Takayama, Anal. Chem. 2003, 75, 1671-1675. [00241] Balakrishnan TR, Fernando R (1993). Infertility among Canadians: an analysis of data from the Canadian Fertility Survey (1984) and General Social Survey (1990). Em: The Prevalence of Infer-tility in Canada: Research Studies of the Royal Commission on New Reproductive Technologies. Ottawa: Minister of Supply and Services Canada, 107-162. [00242] Boivin J, Bunting L, Collins JA, Nygren KG (2007). International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: po-tential need and demand for infertility medicai care. Hum Reprod 22:1506-1512. [00243] Boivin J, Bunting L, Collins JA, Nygren KG (2009). Re- ply: International estimates on infertility prevalence and treatment see-king: potential need and demand for medicai care. Hum Reprod 24:2380-2383. [00244] Boivin, J., Bunting, L., Collins, J.A., Nygren, K.G. International estimates of infertility prevalence and treatment-seeking: Potential need and demand for infertility medicai care. Hum Reprod. 22, 2800-2800 (2007). [00245] Burger HG, Baker HWG (1987). The treatment of infertility. Ann Rev Med 38: 29-40. [00246] Bushnik T, Cook JL, Yuzpe AA, Tough S, Collins J (2012). Estimating the prevalence of infertility in Canada. Hum Reprod 27(3):738-46. [00247] C. Ainsworth, B. Nixon, R. J. Aitken, Hum. Reprod. 2005, 20, 2261-2270. [00248] C. Coughlan, W. L. Ledger, Obstet. Gynaecol. Reprod. Med. 2008, 18, 300-306. [00249] Collins JA (2002). An International survey of the health e-conomics of IVF and ICSI. Human Reproduction Update 8(3):265-277. [00250] Cooper TG, Noonan E, von Eckardstein S et al. (2010).

World Health Organization reference values for human semen charac-teristics. Hum Reprod Update 16(3):231-45. [00251] D. Le Lannou, Y. Blanchard, J. Reprod. Fértil. 1988, 84, 551-556. [00252] D. P. Evenson, in Spermatogenesis: Methods and Protocols (Eds.: D.T. Carrell, K.l. Aston), Humana Press, New York, 2013, pp. 147-164. [00253] D. P. Evenson, K. L. Larson, L. K. Jost, J. Androl. 2002, 23, 25-43. [00254] D. Sakkas, Fértil. Steril. 2013, 99, 1023-1029. [00255] D. Sakkas, G. C. Manicardi, M. Tomlinson, M. Mandrioli, D. Bizzaro, P. G. Bianchi, U. Bianchi, Hum. Reprod. 2000, 15, 1112— 1116. [00256] D. Seo, Y. Agca, Z. C. Feng, J. K. Critser, Microfluid. Nano-fluid. 2007, 3, 561-570. [00257] De Lamirande, E., San Gabriel, M., Zini, A. Human sperm chromatic undergoes physiological remodeling during in vitro capacita-tion and acrosome reaction. J. Androl. 33, 1025-1035 (2012). [00258] DiLuzio, W.R. et al. Escherichia coli swim on the right-hand side. Nature 435, 1271-4 (2005). [00259] Dulberg CS, Stephens T (1993). The prevalence of inferti-lity in Canada, 1991- 1992: analysis of three national surveys. In: The Prevalence of In fértility in Canada: Research Studies of the Royal Commission on New Reproductive Technologies. Ottawa: Minister of Supply and Services Canada, 61-106. [00260] E. A. Gaffney, H. Gadêlha, D. J. Smith, J. R. Blake, J. C. Kirkman-Brown, Annu. Rev. Fluid Mech. 2011, 43, 501-528. [00261] E. V. A. Akerlõf, B. Fredricson, O. Gustafsson, A. Lundin, N. O. Lunell, L. Nylund, L. Rosenborg, Â. Pousette, Int. J. Androl. 1987, 10, 663-669. [00262] F. L. Ng, D. Y. Liu, H. W. G. Baker, Hum. Reprod. 1992, 7, 261-266. [00263] G. Huszar, A. Jakab, D. Sakkas, C-C. Ozenci, S. Cayli, E. Delpiano, S. Ozkavukcu, Reprod. BioMed. Online 2007, 14, 650-663. [00264] G. M. Whitesides, Nature 2006, 442, 368-373. [00265] G. Palermo, H. Joris, P. Devroey, A. C. Van Steirteghem, Lancet 1992, 340, 17-18. [00266] Han, C., Zhang, Q., Ma, R., Xie, L„, Qiu, T„, Wang, L„, et al. (2010). Integration of single oocyte trapping, in vitro fertilization and embryo culture in a microwell-structured microfluidic device. Lab on a Chip, 10(21): 2848-2854. [00267] J. C. Kirkman-Brown, D. J. Smith, Mol. Hum. Reprod. 2011, 17, 539-544. [00268] J. Erenpreiss, M. Spano, J. Erenpreisa, M. Bungum, A. Gi-wercman, Asian J. Androl. 2006, 8, 11-29. [00269] K. C. Worrilow, S. Eid, D. Woodhouse, M. Perloe, S. Smith, J. Witmyer, K. Ivani, C. Khoury, G. D. Bali, T. Elliot, J. Lieberman, Hum. Reprod. 2013, 28, 306-314. [00270] K. Haubert, T. Drier, D. Beebe, Lab Chip 2006, 6, 1548-9. [00271] Kantsler, V., Dunkel, J., Polin, M., Goldstein, R.E. Ciliary contact interactions dominate surface scattering of swimming eukaryo-tes. PNAS 110, 1187-1192 (2013). [00272] Katz, D.F , Pedrotti, L. Geotaxis by Motile Spermatozoa: Hydrodynamic Reorientation. J. theor. Biol. 67, 723-732 (1977). [00273] Kricka, L.J., Nozaki, O., Heyner, S., Garside, W.T., Wilding, P. Applications of a microfabricated device for evaluating sperm functi-on. Clin Chem. 39, 1944-1947 (1993). [00274] L. Mazutis, J. Gilbert, W. L. Ung, D. A. Weitz, A. D. Griffiths, J. A. Heyman, Nat. Protoc. 2013, 8, 870-891. [00275] L. Parmegiani, G. E. Cognigni, W. Ciampagiia, P. Pocogno-li, F. Marchi, M. Filicori, J. Assist. Reprod. Genet. 2010, 27, 13-16. [00276] L. Xie, R. Ma, C. Han, K. Su, Q. Zhang, T. Qiu, L. Wang, G. Huang, J. Qiao, J. Wang, J. Cheng, Clin. Chem. 2010, 56, 1270-1278. [00277] L. Y. Yeo, H-C. Chang, P. P. Y. Chan, J. R. Friend, Small 2011, 7, 12-48. [00278] Μ. A. Unger, H-P. Chou, T. Thorsen, A. Scherer, S. R. Qua-ke, Science 2000, 288, 113-116. [00279] M. Antinori, E. Licata, G. Dani, F. Cerusico, C. Versaci, D. D'Angelo, S. Antinori, Reprod. BioMed. Online 2008, 16, 835-841. [00280] M. Bungum, L. Bungum, A. Giwercman, Asian J. Androl. 2011, 13, 69-75. [00281] M. Enciso, M. Iglesias, I. Galán, J. Sarasa, A. Gosálvez, J. Gosálvez, Asian J. Androl. 2011, 13, 764-768. [00282] Makler, A., Stoller, J., Blumenfeld, Z., Feigin, P.D., Brandes, J.M. Investigation in real time of the effect of gravitation on human spermatozoa and their tendency to swim-up and swim-down. Int J Androl. 16, 251-257 (1993). [00283] Mortimer, D. (2000). Sperm Preparation Methods. J Androl. 21, 357-366. [00284] Niederberger C (2004). Do not let technician biases fool you: Frozen sperm from any azoospermic man is as good as fresh for ICSI and easierfor the couple. Urology 64(6):1072-1074. [00285] Norris S (2001). Reproductive Infertility: Prevalence, Causes, Trends, and Treatments. Parliamentary Research Branch, Library of Parliament. [00286] Nosrati, R. et al. Rapid Selection of Sperm with High DNA Integrity. Lab on a Chip. (Submitted November 2013). [00287] OVO Consulting (2009). In-vitro fertilization in Canada: Cost structure analysis. Prepared for Canadian Fertility and Andrology Society. [00288] P. Denissenko, V. Kantsler, D. J. Smith, J. Kirkman-Brown, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 2012, 109, 8007-8010. [00289] P. Galajda, J. Keymer, P. Chaikin, R. Austin, J. Bacteriol. 2007, 189, 8704-8707. [00290] Pierson R, Yupze A, Bissonnette F (2011). Human Assis-ted Reproduction live birth rates for Canada 2011. Canadian Fertility and Andrology Society, Press Release. [00291] R. E. Jackson, C. L. Bormann, P. A. Hassun, A. M. Rocha, E. L. A. Motta, P. C. Serafini, G. D. Smith, Fértil. Steril. 2010, 94, 2626-2630. [00292] R. J. Aitken, A. R. Hanson, L. Kuczera, Hum. Reprod. 2011, 26, 1955-1964. [00293] R. J. Aitken, J. S. Clarkson, J. Androl. 1988, 9, 367-376. [00294] R. M. Schultz, C. J. Williams, Science 2002, 296, 2188-2190. [00295] R. Matsuura, T. Takeuchi, A. Yoshida, Asian J. Androl. 2010, 12, 753-9. [00296] Raya, A., Izpisúa Belmonte J.C. Left-right asymmetry in the vertebrate embryo: from early Information to higher-level integration. Nat Rev Genet. 7, 283-93 (2006). [00297] Roberts, A.M. Gravitational Separation of X and Y Sperma-tozoa. Nature 238, 223-225 (1972). [00298] Rothschild, L. Non-random Distribution of Bull Spermatozoa in a Drop of Sperm Suspension. Nature 198, 1221-1222 (1963). [00299] S. D. Fleming, R. S. Ilad, A-M. G. Griffin, Y. Wu, K. J. Ong, H. C. Smith, R. J. Aitken, Hum. Reprod. 2008, 23, 2646-2651. [00300] S. S. Suarez, A. A. Pacey, Hum. Reprod. Update 2006, 12, 23-37. [00301] S. Tasoglu, H. Safaee, X. Zhang, J. L. Kingsley, P. N. Cata-lano, U. A. Gurkan, A. Nureddin, E. Kayaalp, R. M. Anchan, R. L. Ma-as, E. Tüzel, U. Demirci, Small 2013, DOI: 10.1002/smll.201300020. [00302] Suh, R., Takayama, S., Smith, G.D. Microfluidic applications for andrology. J Androl. 26, 664-670 (2005). [00303] T. G. Schuster, B. Cho, L. M. Keller, S. Takayama, G. D. Smith, Reprod. BioMed. Online 2003, 7, 75-81. [00304] T. M. Said, J. A. Land, Hum. Reprod. Update 2011, 17, 719-733. [00305] Tomlinson, M.J., Kessopoulou, E., Barratt, C.L.R. The diag-nostic and prognostic value of traditional semen parameters. J Androl. 5, 588-593 (1999). [00306] Winet, H., Bernstein, G.S., Head, J. Observations on the response of human spermatozoa to gravity, boundaries and fluid shear. J. Reprod. Fert. 70, 511-523 (1984). [00307] Wolf DP, Byrd W, Dandekar P, Quigley MM (1984).

Sperm Concentration and the Fertilization of Human Eggs In Vitro. Bio-logy of Reproduction 31:837-848. [00308] World Health Organization (2010). WHO laboratory manual for the Examination and Processing of human semen, 5th Edition. [00309] X. Mu, W. Zheng, J. Sun, W. Zhang, X. Jiang, Small 2013, 9, 9-21. [00310] X. Zhang, I. Khimji, U. A. Gurkan, H. Safaee, P. N. Catala-no, H. O. Keles, E. Kayaalp, U. Demirci, Lab Chip 2011, 11, 2535-2540. [00311] Y-J. Ko, J-H. Maeng, B-C. Lee, S. Lee, S. Y. Hwang, Y. Ahn, Anal. Sei. 2012, 28, 27- 32. [00312] Yuzpe A, Pierson R, Daya S, Graves G (2002). Human Assisted Reproduction live birth rates for Canada 2002. Canadian Fer-tility and Andrology Society, Press Release. [00313] Zini, A. et al. Prevalence of abnormal sperm DNA denatura-tion in fertile and infertile men. Urology. 60, 1069-1072 (2002). [00314] Zini. A., Boman, J.M., Belzile, E., Ciampi, A. Sperm DNA damage is associated with an increased risk of pregnancy loss after IVF and ICSI: Systematic review and meta-analysis. Hum Reprod. 23, 2663-2668 (2008).

Claims

1. Aparelho para a separação de esperma, o aparelho caracterizado pelo fato de que compreende: um reservatório de entrada para receber uma amostra de sêmen; um reservatório de descarga para a coleta de espermatozóide separado da amostra; e uma matriz radial de microcanais disposta entre o reservatório de entrada e o reservatório de descarga para fornecer comunicação fluida entre os mesmos, a matriz radial de microcanais sendo configurada para direcionar o espermatozóide móvel na direção do interior do reservatório de entrada ao reservatório de descarga.

2. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a matriz radial de microcanais compreende uma pluralidade de caminhos de microcanais entre o reservatório de entrada e o reservatório de descarga, cada caminho de microcanais compreendendo uma saída de caminho adjacente ao reservatório de descarga e pelo menos um entrada de caminho adjacente ao reservatório da entrada.

3. Aparelho, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a largura de cada caminho de microcanais é entre 50 pm e 300 pm, e em que a altura de cada caminho de microcanais é entre 25 pm e 100 pm.

4. Aparelho, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a largura de cada caminho de microcanais é entre 100 pm e 200 pm, e em que a altura de cada caminho de microcanais é entre 50 pm e 75 pm.

5. Aparelho, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que um comprimento de cada caminho de microcanais é entre 6 e 9 mm.

6. Aparelho, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a pluralidade de caminhos de microcanais compreende pelo menos 200 caminhos de microcanais entre o reservatório de entrada e o reservatório de descarga.

7. Aparelho, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma entrada de caminho para cada caminho de microcanais compreende duas entradas de caminho, separadas por um membro de parede divisória.

8. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma pluralidade de membros de antirretorno localizados dentro do reservatório de descarga e configurados para restringir o espermatozóide móvel de reentrar na matriz radial de microcanais após a saída da matriz radial de microcanais.

9. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o aparelho compreende pelo menos uma matriz radial adicional de microcanais empilhados em cima de outra matriz radial de microcanais.

10. Aparelho para a separação de esperma, o aparelho caracterizado pelo fato de que compreende: um reservatório de entrada para receber uma amostra de sêmen; um reservatório de descarga para a coleta de espermatozóide separado da amostra; e pelo menos um caminho de microcanais dispostos entre o reservatório de entrada e o reservatório de descarga que fornece comunicação fluida entre os mesmos, o pelo menos um caminho de microcanais compreendendo uma entrada de caminho adjacente ao reservatório da entrada, uma saída de caminho adjacente ao reservatório da saída e uma junção localizada entre a entrada de caminho e a saída de caminho para dirigir uma porção de espermatozóide móvel que entrar na entrada de caminho em direção ao reservatório de descarga com base no comportamento de parede-natação de esperma.

11. Aparelho, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a largura de pelo menos um caminho de micro-canais é entre 50 pm e 300 pm, e em que a altura de pelo menos um caminho de microcanais é entre 25 pm e 100 pm.

12. Aparelho, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a largura do pelo menos um caminho de microcanais é entre 100 pm e 200 pm, e em que a altura do pelo menos um caminho de microcanais é entre 50 pm e 75 pm.

13. Aparelho, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que um comprimento de pelo menos um caminho de microcanais é entre 6 e 9 mm.

14. Aparelho, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a junção compreende um caminho da esquerda e um caminho da direita para um espermatozóide móvel nadando através do pelo menos um caminho de microcanais da entrada de caminho e em direção ao reservatório de descarga.

15. Aparelho, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a junção compreende ainda um caminho central disposto entre o caminho da esquerda e o caminho da direita.

16. Aparelho, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o caminho da esquerda conduz à saída de caminho e o caminho da direita conduz a uma câmara de coleta.

17. Aparelho, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o caminho da direita conduz à saída de caminho, o caminho da esquerda conduz a uma câmara de coleta.

18. Aparelho de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que um ângulo de canal lateral entre uma parede lateral do pelo menos um caminho de microcanais, localizado entre a entrada de caminho e a junção, e uma parede lateral mútua entre ambos o caminho da esquerda ou caminho da direita é inferior a cerca de 105°.

19. Aparelho, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o ângulo de canal lateral é de cerca de 45°.

20. Aparelho, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o caminho da esquerda conduz para a saída do caminho, e o caminho central e o caminho da direita conduzem cada a uma câmara de coleta.

21. Aparelho, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o caminho da esquerda conduz à saída de caminho, e o caminho central e o caminho da direita conduzem cada a uma câmara de coleta.

22. Aparelho, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o caminho central conduz à saída de caminho, e o caminho da esquerda e o caminho da direita conduzem cada a uma câmara de coleta.

23. Aparelho, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o aparelho compreende uma matriz radial de caminhos de microcanais disposta entre o reservatório de entrada e o reservatório de descarga, a matriz radial de caminhos de microcanais compreendendo o pelo menos um caminho de microcanais.

24. Aparelho, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o aparelho compreende pelo menos uma matriz radial adicional de caminhos de microcanais em camadas no topo de uma matriz adjacente de caminhos de microcanais.

25. Aparelho, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um membro an-tirretorno localizado no interior do reservatório de descarga e configurado para restringir o espermatozóide móvel de reentrar no pelo menos um caminho de microcanais após sair da saída de caminho.

26. Aparelho, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o aparelho é fabricado a partir de pelo menos um dentre: policarbonato, poliestireno e vidro.

27. Método para a separação de esperma, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: proporcionar um aparelho que compreende: um reservatório de entrada para receber uma amostra de sêmen; um reservatório de descarga para a recolha do espermatozóide separado da amostra; e uma matriz radial de microcanais disposta entre o reservatório de entrada e o reservatório de descarga para proporcionar uma comunicação fluida entre os mesmos, a matriz radial de microcanais sendo configurada para direcionar o espermatozóide móvel para dentro a partir do reservatório de entrada para o reservatório de descarga; encher o reservatório de entrada, o reservatório de descarga e a matriz radial de microcanais com um fluido tampão; introduzir uma amostra de sêmen no reservatório de entrada; e recuperar o espermatozóide separado da amostra a partir do reservatório de descarga.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cobrir o reservatório de descarga com um elemento de fechamento de saída antes do ato de introdução, e descobrir o reservatório de descarga antes do ato de recuperar.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cobrir o reservatório de entrada com um elemento de fechamento de admissão depois do ato de introdução.

30. Método para a separação de esperma, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: proporcionar um aparelho que compreende: um reservatório de entrada para receber uma amostra de sêmen; um reservatório de descarga para a coleta do espermatozóide separado da amostra; e pelo menos um caminho de microcanais disposto entre o reservatório de entrada e o reservatório de descarga para proporcionar a comunicação fluida entre os mesmos, o pelo menos um caminho de microcanal compreendendo uma entrada de caminho adjacente ao reservatório de entrada, uma saída de caminho adjacente ao reservatório de descarga, e uma junção situada entre a entrada de caminho e a saída de caminho para dirigir uma porção do espermatozóide que entrar na entrada de caminho em direção ao reservatório de descarga com base no comportamento de parede de natação do esperma; encher o reservatório de entrada, o reservatório de descarga, e o pelo menos um caminho de microcanal com um fluido tampão; introduzir uma amostra de sêmen no reservatório de entrada; e recuperar o espermatozóide separado da amostra a partir do reservatório de descarga.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cobrir o reservatório de descarga com um elemento de fechamento de saída antes do ato de introdução, e descobrir o reservatório de descarga antes do ato de recuperar.

32. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cobrir o reservatório de entrada com um elemento de fechamento de admissão depois do ato de introdução.