JP4091767B2 - 動き回る精子を分離する装置 - Google Patents

Description

【０００１】
本明細書で引用する文書は全て、参照によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、男性の生殖力試験の、特に、精液サンプルの動き回る精子を分離して検出する試験の分野である。
【０００３】
（背景技術）
妊娠を試みるカップルの約１５％が、避妊手段を用いない肉体関係に入って１年以内に妊娠しない。生殖力の専門家はこのようなカップルを不妊と定義し、そのケースの４０％は男性の要因の結果である。その大部分で、不妊に至る状態を改善するか、緩和する治療が可能である。
【０００４】
サンプル中にものになる精子が存在するか否かを試験することが望ましい他の状態も存在する。例えば、現在では避妊の方法として精管切除が頻繁に実施されているが、術後に射精してものになる精子がないことを確認することが必要である。
【０００５】
サンプル中の精子の運動性および数を評価する幾つかの方法がある。１つのこのような方法は、顕微鏡分析であり、これは通常、病院または商用ラボラトリで実施される。しかし、より最近には、精子の検出を単純化するよう意図された試験キットについて、幾つかの提案がされている。
【０００６】
国際特許第９７／４０３７６号は、３４ｋＤａ人精巣精子タンパク質の免疫検出に基づいたキットを開示している。サンプル中の精子を、ダルベッコ・リン酸緩衝生理食塩水中での遠心分離によって３回洗浄する。次に、サンプルを９５℃、１４０００ｇで熱変性させ、上澄みを分析に使用する。
【０００７】
国際特許第９５／２９１８８号は、人間の精子のＳＰ−１０抗原に対する抗体に基づく試験について記載している。
【０００８】
欧州特許第０３８７８７３号は、人間の精子の先体に固有の抗体を結合した固体ビーズを使用するキットを開示している。ビーズをサンプルと混合し、培養、分離、洗浄し、ビーズに結合した精子の数を、好ましくは顕微鏡で補助された検査によって測定する。
【０００９】
これらの試験キットの欠点は、動き回る精子と動き回らない精子とを区別しないことである。この区別は、男性不妊の最も予言的な指標である。さらに、これは、家庭では使用しない手順（例えば遠心分離、顕微鏡検査）を含み、したがって熟練した開業医による実施を必要とする。
【００１０】
これらの欠点は、国際特許第００／０９６４８号（Genosis Limited）の装置によって対応され、これは液体サンプル中の動き回る精子を動き回らない精子から分離する装置を開示し、装置は、（ｉ）サンプル受け入口、フィルタ付きサンプル出口、およびその間に装着されたサンプル分離フィルタを有する導管を備え、サンプル分離フィルタは、サンプル受け表面および反対側の表面を有し、サンプル分離フィルタは、それを通るサンプルの流れはほぼ防止するが、前記サンプル分離フィルタの前記反対側表面が液体媒体と接触した状態で配置された場合に、動き回る精子がそれを通過するのを可能にするのに有効であり、さらに（ｉｉ）前記フィルタの前記反対側表面に液体を供給する手段を備える。
【００１１】
精液の分離、検出および分析におけるさらなる改良点を、本明細書で開示する。
【００１２】
（発明の開示）
本発明は、動き回る精子を液体サンプルから分離する装置を提供し、装置は、 （ａ）サンプル入口、
（ｂ）最初は閉鎖しているサンプル出口、
（ｃ）サンプル入口を介してサンプル中の動き回る精子が入ることができるサンプル分離媒体、および、
（ｄ）サンプル出口を開放し、それによってサンプル分離媒体がサンプル出口を通って導管から流出できるようにするよう操作可能なアクチュエータを備えるサンプル分離導管を有する。
【００１３】
この装置では、導管中の分離媒体は、最初は入口を通して流れることができない。これによって、動き回る精子が、導管を出る前にサンプルからサンプル分離媒体内へと移動するのに十分な時間をかけることができる培養期間が可能になる。アクチュエータの操作では、出口を開放すると、（動き回る精子を含む）分離媒体が出口を通過し、例えば分析のために導管を出ることができる。
【００１４】
サンプル中の動き回る精子が分離媒体に入るため、入口および分離媒体は液体連絡していなければならない。しかし、このような連絡は最初は防止され、したがって装置を使用する前に入口を介した媒体の汚染が防止される。これによって、媒体が入口を介して逃げることも防止されるが、これはいずれにしても、例えば媒体の粘度または表面張力によって達成することができる。
【００１５】
したがって、この実施形態では、導管は、（ｅ）入口を介して分離媒体をサンプルと連絡させるよう操作可能な第２アクチュエータを備える。これは、第２アクチュエータを操作するまで媒体を入口から離れた場所に保存するか、あるいは最初は閉鎖または密封され、アクチュエータを使用して開放される入口を有することによって達成することができる。
【００１６】
したがって、この装置の使用中は第２アクチュエータを操作し、これによって分離媒体と入口を連絡させる。これによって、サンプル中で動き回る精子がサンプルから分離媒体へと移動する。培養期間の後、（第１）アクチュエータを操作し、それによって分離媒体（この時には動き回る精子を含む）が導管から出られるようにする。第１アクチュエータは、第２アクチュエータを操作している時まで操作できないことが好ましい。
【００１７】
機構（ｅ）は、機構（ｄ）から独立して操作できることが理解される。
【００１８】
導管は、例えば円錐または円筒形など、円形の断面でよい。
【００１９】
入口および出口は様々な形態をとることができる。例えば、入口は円筒または円錐の開放端でよい。この開放端をサンプル内に配置し、分離媒体とサンプルとが連絡すると、精子が開放端を介して陽気に入ることができる。サンプルから精子が入るのを妨げることなく、（表面張力を介して）導管内にサンプル分離媒体を保持するのを補助するため、網または格子によって開放端を覆うことが望ましいこともある。
【００２０】
出口は、導管の壁にある開口、穴または口であることが好ましく、壁は導管から出るパイプ、管または導管内へと連続してよい。
【００２１】
入口および出口は、使用中に出口が入口より上になるよう配置することが好ましい。したがって、精子は、導管を出るために重力に抗して泳がねばならず、動き回る精子と動き回らない精子との選択的移動が強化される。
【００２２】
例えばボタン、スイッチなど、装置には任意の適切なアクチュエータを使用することができる。導管が円形の断面である場合、（第１）アクチュエータは、開口を含む回転カラーであることが好ましい。カラーを閉位置から回転すると、カラーの開口と導管の壁とが整列し、それによってサンプル分離媒体が出口を介して導管を去ることができる。
【００２３】
（第１）アクチュエータの別の好ましい形態は、バレルまたは管に流体を引き込むよう作用する。例えば、シリンジのプランジャを引く。プランジャは、最初は出口を閉塞するが、プランジャを引くと、サンプル分離媒体が出口を通ってシリンジの内部空間に流入することができる。シリンジ・プランジャの引きを実行するために適切なアクチュエータは、例えばラックとピニオン機構などでプランジャに取り付けた回転式ノブである。
【００２４】
装置が第２アクチュエータを含む場合、これはボタンであることが好ましい。押下すると、装置内に保存されたサンプル分離媒体が解放され、したがって（例えば重力で）入口に到達する。これは、例えば媒体の容器を導管内に入れ、これを箔カッターとともに箔の壁で密封することによって達成することができる。第２アクチュエータを操作すると、カッターが箔を穿孔し、媒体を解放する。
【００２５】
容器の好ましい配置構成が、英国特許出願第００２１６６５．５号で開示され、ここでは分離媒体が気密容器内に保持される。装置は、容器から媒体を排出するための排出針を含み、排出針は、流体送出部分および容器排出部分を備え、容器排出部分は、針に沿って送出部分の遠位側にあり、送出部分および排出部分はそれぞれ、個々の部分から針の側壁を通って延在する流路を画定する。流路によって、使用中に送出部分が流体を容器から、例えば一方端で空気抜きし、他方端で流体を配量することによって送出することができる。この配置構成では、排気針は、少なくとも部分的に、制御されたピペット状の送出のために送出部分に有孔先端を有するカニューレであることが好ましい。近位部分および遠位部分を有する針では、遠位部分は、排出部分と送出部分との両方を備えることができる。針は、排出部分および送出部分にＣ字形区間を有することが好ましい。２つの流路は一体であることが好ましく、流路は排出部分から送出部分へと延在する。
【００２６】
排出位置で、排出針は、容器の２つの壁部分を通って延在し、したがって、排出部分は第１壁部分を通る通路を形成し、これによって容器を空気抜きすることができ、送出部分は、第２壁部分を通る通路を形成し、これによって容器から流体を配量することができる。
【００２７】
この種の配置構成を使用すると、針は、第２アクチュエータ（例えばボタンに取り付けられるか、ねじで前進する機構である）によって操作される。
【００２８】
分離媒体によって、動き回る精子は動き回らない精子より優先した、これを通して移動することができる。これは、適切なバッファ（例えばＨＥＰＥＳ、ＥＢＳＳなど）を使用して達成することができる。というのは、動き回る精子は、媒体を通して積極的に移動することができるが、該当する時間尺度で、動き回らない精子はせいぜい拡散によって受動的に入るだけだからである。しかし、動き回る精子のサンプルからの移動を強化する媒体を使用することが好ましい。適切な媒体には、子宮頚管粘液［例えばKeel & Webster（１９８８）のFertil, Steril, 49:138-143］、ポリアクリルアミドゲル［例えばLortonその他（１９８１）のFertil, Sterl, 35:222-225］、ヒアルロン酸［例えばAitkenその他（１９９２）J. Androl, 13:44-54］、またはメチルセルロースなどのセルロース誘導体［例えば国際特許出願第PCT/GB00/03130号（Genosis Limited）］がある。
【００２９】
媒体は、溶液またはゲルの形態でよい。
【００３０】
分離媒体は、精漿などの成分を除去するため、サンプルを「洗浄する」働きもするので有利である。
【００３１】
動き回る精子と動き回らない精子との分離に加えて、装置は、分離後に動き回る精子を検出できることが好ましい。したがって、本発明の装置は、導管出口と連絡する精子検出手段を備えることが好ましい。検出手段は装置と一体であるか、サンプル分離の前、最中またはその後に装置に挿入する別個の構成要素として設けることができる。
【００３２】
したがって、本発明は、液体サンプル中の動き回る精子を分離し、検出する装置を提供し、装置は、
−サンプル分離導管を有し、これは、
（ａ）サンプル入口と、
（ｂ）最初は閉鎖しているサンプル出口と、
（ｃ）サンプル入口を介してサンプル中の動き回る精子が入ることができるサンプル分離媒体と、
（ｄ）サンプル出口を開放し、これによってサンプル分離媒体がサンプル出口を通って導管から流出できるよう操作可能なアクチュエータとを備え、さらに、
−精子検出手段を有し、これは、
（ｉ）出口と連絡したアプリケーション・ゾーンと、
（ｉｉ）精子の存在を検出することができる検出ゾーンと、
（ｉｉｉ）精子と反応して、検出ゾーンにおける検出を容易にすることができる試薬を含む試薬ゾーンとを備え、
これらのゾーンは、アプリケーション・ゾーンから検出ゾーンへの精子の毛細管流動を可能にするよう配置される。
【００３３】
検出ゾーンは、これを越えて精子が流動できないゾーン（「捕捉ゾーン」）である。したがって、操作中には捕捉ゾーンを越える精子の流れが防止され、検出のために精子が浮動化される。捕捉ゾーンは、国際特許第００／２０８６６号で記載された原理を使用することが好ましい。つまりゾーンは多孔質であり、精子が入ることができないような孔のサイズである。したがって、精子は、捕捉ゾーンに流入する間、入口で捕捉され、精子濃度が上昇するにつれ、そこに保持される量も増加する。
【００３４】
捕捉ゾーンは、精子が通り抜けることができない任意の適切な多孔質材料（例えばＨＤＰＲ、ニトロセルロース）から作成することができる。この要件は、捕捉ゾーンの孔サイズに反映される。人間の精子の頭部は通常、直径が３〜５μｍであり、尾の長さは約５０〜６０μｍである。孔サイズは、これに従って選択され（例えば通常の孔サイズが５〜８μｍのニトロセルロース）、適切な孔サイズは単純な実験により経験的に決定することができる。
【００３５】
捕捉ゾーンの前に遭遇する多孔質材料は、捕捉ゾーンと異なり、精子が比較的自由に移動できるよう十分に大きい孔サイズでなければならないことが分かる。
【００３６】
当業者にはよく知られているように、多孔質材料の名目孔サイズは、硬質粒子誘発試験によって、つまり材料を通過できる球形粒子の最大直径を決定することによって求めることができる。あるいは、材料の孔サイズは、「泡立ち点」を測定することによって決定することができる。泡立て点は、（水の）湿性膜に空気を通すために必要な圧力であり、粒子固定によって測定した孔サイズと相関がある（しかし、圧力および孔サイズの極値では、相関が弱まることがある）。泡立ち点は、概ね粒子固定より測定が容易であり、したがって孔サイズを評価する場合には好ましい試験である。
【００３７】
捕捉ゾーンの入口は、より鮮明な信号を与えるために精子が集束するよう、狭いことが好ましい。
【００３８】
それほど好ましくない検出ゾーンとして、不動化した抗精子抗体を使用してもよい。
【００３９】
検出ゾーンの１つの実施形態では、検出はアクロシンに基づく。検出ゾーンは、アクロシンを検出する試薬を含み（例えばMortimerのPractical Laboratory Andrology（１９９４）９０ページを参照）、試薬ゾーンはプロティネーゼＫまたはカルシウムイオノフォアＡ２３１８７などの試薬を含み［Perryその他（１９９７）、J. Exp. Zool, 179:284-290：Perryその他（１９９７）J. Exp. Zool, 279:291-300（１９９７）：Perryその他（１９９６）Human Reprod、11:1055-1062：Perryその他（１９９５）、Fertil. Steril. 64:150-159］、これによって先体が開く。先体を溶解させるために好ましい試薬は、２％のＳＤＳの１００μｇ／ｍｌのプロティネーゼＫを１０ｍＭのトリスＨＣｌおよび０．１ＭのＥＤＴＡに入れた溶解緩衝剤である。したがって、先体は、移動中に精子から解放され、下流の検出ゾーンで検出される。
【００４０】
より一般的には、試薬ゾーンは、無傷の精子に、またはその１つまたは複数の構成要素に結合する試薬を含み、この結合反応を使用して、可視信号を生成する。したがって、試薬ゾーンは、精子に結合することができる標識を含む「標識付けゾーン」であることが好ましい。これを捕捉ゾーンと組み合わせて使用することが好ましい。
【００４１】
標識付けゾーン内の標識は、精子に結合することができる任意の適切な試薬でよく、可視信号を与えることが好ましい。動き回る精子のみが出口に到達するので、標識は精子に固有であるものである必要はない。
【００４２】
標識は、通常、精子に結合することができ、適切にタグ付けされた抗体である。コロイド金（ピンク色に見える）などの可視タグを使用することが好ましいが、蛍光、発光または放射性タグも使用することができる。「抗体」という用語は、抗精子反応が保持される限り、多クローン性抗体および単クローン性抗体、さらに抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ）₂、Ｆｃその他）も含んでよいことが理解される。
【００４３】
好ましい標識は、亜集団ではなく精子の母集団の大部分に存在する表面抗原を認識する。精子抗原を使用することができるが（例えばＰ３４Ｈ（国際特許第９７／４０８３６号）、ＳＰ−１０（国際特許第９５／２９１８８号）、欧州特許第０３８７８７３号も参照）、ＣＤ５９などの「万能」抗原を使用してもよい。また、エオシンなどの染剤を使用してもよい。
【００４４】
標識は、サンプル分離媒体が導管を出るまで活性化しないことが好ましい（例えば脱水標識の再水化）。これは、（第１）アクチュエータが作動するまで、中の標識が活性化しないよう、標識付けゾーンを配置することによって達成することができる。したがって、動き回る精子がサンプルを出て、サンプル分離媒体に入るまで、標識は静止状態である。
【００４５】
ラベル付けゾーンは、その標識が検出ゾーンで精子に接触できるよう、任意の適切な位置に配置することができる（例えば精子を捕捉ゾーンに保持する）。これはアプリケーション・ゾーンの上流または下流でよく、それと一体でもよい。上流にある場合、導管を出たサンプル分離媒体は、標識を活性化させるために、アプリケーション・ゾーンとの接触とは別個に標識付けゾーンと接触できねばならず、下流にあるか、一体である場合は、流れが自動的に標識を活性化する。
【００４６】
検出手段が「捕捉ゾーン」と「標識付けゾーン」との両方を含む場合、捕捉ゾーンの孔サイズは、（精子に結合されていない）自由標識がそれを通って流れることができ、標識に結合された標識が流れないようなサイズとなる。したがって、捕捉ゾーンに流入する間、結合した標識は入口で捕捉される。精子濃度が上昇するにつれ、捕捉標識の量も増加する。自由標識が捕捉ゾーンによって減速しないよう、標識は精子より小さくなければならないことが理解される。
【００４７】
検出手段が標識を使用する場合、これは、非結合標識を保持する検出ゾーンの下流ゾーン（「標識制御」ゾーン）を含むことが好ましい。これは通常、非結合標識を結合することができる不動化した抗体を備える（例えば、標識がマウスの単クローン性抗体である場合、標識制御ゾーンは抗マウス抗体を使用することができる）。したがって、検出ゾーンを通過する（例えば捕捉ゾーンへの入口に捕捉されない）標識は、標識制御ゾーン内に保持され、ここで測定することができる。検出ゾーンと標識制御ゾーンとにある標識の量を比較することにより、サンプル中の精子量の半定量測定が可能になる。
【００４８】
アプリケーション・ゾーンは、導管を出たサンプル分離媒体が精子検出手段と接触する場所である。これは、精子の毛細管流動を可能にするのに適した任意の材料から形成することができ、例えばＨＤＰＥ材料のパッドなどの繊維質材料、ポリエステル不織布、ガラス繊維などである。
【００４９】
しかし、精子は繊維質材料内に保持される傾向があり、したがって感度が低下することが判明している。したがって、非繊維質のアプリケーション・ゾーンを使用することが好ましい。適切な例には、毛細管、間に毛細管流動が発生できるよう接近して並置された２枚以上のシート状材料間の空間、または一連の平行な毛細管流路または溝がある。このような配置構成では、標識付けゾーンとアプリケーション・ゾーンが一体である場合、組立中に標識を貼付できるよう、２つ以上の材料から形成することが好ましい。並置シートを使用する場合は、例えば標識を１枚または複数のシートに貼付し、これを近接させて毛細管流動を可能にすることができる。同様に、平行な流路または溝を使用する場合は、標識を流路付き材料に貼付し、任意選択でさらなるシートで覆うことができる。
【００５０】
同様の配置構成では、毛細管流動が、繊維質材料を通して生じるのではなく、それを通り越して発生する。液体は、通り過ぎて繊維質材料に入ることができる（例えばそこに含浸した標識を再水化する）が、精子のアプリケーション・ゾーンを通る主要毛細管流動は、繊維質材料内ではない。
【００５１】
アプリケーション・ゾーンとサンプル出口は、基本的に一体である。
【００５２】
好ましい実施形態では、検出ゾーンへのサンプルの流れは、下流のウィットによって補助され、毛管運動を促進する。
【００５３】
したがって、好ましい装置を使用する間、サンプル中で動き回る精子の移動路は、導管の入口を介して分離媒体に入り、（培養期間の後にアクチュエータを操作すると）導管の出口を介して分離媒体から出て、アプリケーション・ゾーンに入り、捕捉ゾーンへ毛細管流動し、ここでさらなる移動が防止される。捕捉ゾーンにある可視信号が、サンプル中の動き回る精子の存在を指示する。
【００５４】
検出手段によって提供される可視信号は、導管の外側であることが好ましく、装置の外側から見えることがさらに好ましい。
【００５５】
検出手段は、導管の外側に装着した側方流試験細片の形態であることが好ましい。
【００５６】
導管は、２つ以上のサンプル出口を有することができ、それぞれが別個の検出手段に通じることが理解される。これによって、同じサンプルで別個の試験をすることが可能になる。例えば、一方の細片では動き回る精子を分析し、別の細片では先体の反応を分析する。これは、下流方向で幾つかの別個の検出手段へとつながる１つの出口を使用することによって達成することができる。
【００５７】
動き回る精子と動き回らない精子との分離を向上させるため（例えば欧州特許第０４３７５０８号）、装置は、基本的に固定した温度で操作することが好ましい。これは通常、３０℃と４４℃の間であり、３５℃と３９℃の間が好ましく、３７℃またはその周辺で固定することがさらに好ましい。したがって、装置は温度センサを含むことが好ましい。
【００５８】
温度センサは、使用温度に到達したら、それを示す単純な信号を与えることができる。装置は、信号が与えられるまで使用者の手で保持するか、温水槽に挿入することができる。
【００５９】
しかし、装置は、自身の熱源を含むことがさらに好ましく、これは、例えば熱電対制御装置などを使用して調整できることが好ましい。熱源は、主にサンプル分離媒体を含む導管の領域に熱を供給する。熱源の電源および制御回路は、アクチュエータ・ボタン内または装置の本体内に隠せるので都合がよい。
【００６０】
装置に温度調節を含むことは、装置の他の機能とは別個に操作できることが理解される。
【００６１】
本発明の装置は、適切な液体サンプルで使用することができ、これは精液サンプルであることが好ましい。装置は、サンプルの受け器を含むことができる。これはカップまたは傾斜表面の形態であり、この上にサンプルを付着させることができ、その後にベース（例えばウェル）で収集することが好ましい。次に、サンプル入口を収集したサンプルに接触させることができる。受け器は、ベース付近にオーバーフローも含むことができる。受け器は装置と一体であるか、別個の構成要素として設け、サンプル付着および／または収集の前、その間、またはその後に装置をこれに取り付けることができる。
【００６２】
受け器と導管入口との境界（例えば導管をウェルに取り付ける箇所）は画定された区域であり、それによって分析の再現性を補助するので都合がよい。
【００６３】
本発明の装置は、単純かつ安価に生産することができる。さらに、例えば一般家庭の使用者などが非常に簡単に使用することができる。したがって、本発明は、例えば男性の不妊の基本的スクリーンとして、家庭で使用することができる分析装置を提供する。
【００６４】
本発明は、対応するプロセスも提供する。したがって、本発明は、液体サンプルから動き回る精子を分離するプロセスを提供し、プロセスは、
（ａ）サンプル入口、閉じたサンプル出口、およびサンプル分離媒体を有する導管を提供するステップと、
（ｂ）５分から６０分の期間（好ましくは約３０分）で、サンプル中の精子がサンプル分離媒体へと移動できるようにするステップと、
（ｃ）サンプル出口を開放することによって、サンプル分離媒体が導管を出られるようにするステップとを含む。
【００６５】
プロセスは、最初は入口を開くステップを含む。
【００６６】
プロセスは、容器を出たら、媒体中の精子を検出するステップも含む。したがって、本発明は、液体サンプル中で動き回る精子を分離し、検出するプロセスを提供し、さらに、
（ｉ）出口を出たサンプル分離媒体が、毛管作用によって、精子を不動化できる材料に流入できるようにするステップと、
（ｉｉ）精子を標識に接触させるステップと、
（ｉｉｉ）前記材料の入口に保持された標識を検出するステップを含む。
【００６７】
本発明は、さらに、精子を分離および／または検出するステップを提供し、ここで精子は毛管作用によって非繊維質材料を通って流れる。
【００６８】
本発明は、さらに、動き回る精子と動き回らない精子とを分離するプロセスを提供し、前記プロセスは、基本的に固定された温度、好ましくは約３７℃で実施される。
【００６９】
（発明を実施するモード）
図１に示す装置（１０）は、円筒形のプラスチック導管（１５）と、０．２５ｍｍ間隔の０．１５ｍｍのストランドから形成したナイロン網（２１）で覆われたサンプル入口（２０）と、開位置で図示された側部の穴（３０）と、０．８８ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸と０．４５％のＢＳＡが補充されたＥＢＳＳの溶液（４０）と、穴（３０）と整列して出口（３５）を形成するよう図示された穴（５１）を含むプラスチックの回転式カラー（５０）と、周辺熱源（７０）に電力を提供する電池および回路を収容し、容器受け（６５、空の状態で図示）、箔シール（６６、破損状態で図示）、および中空の箔カッター（６８）が取り付けられたボタン（６０、押下状態で図示）と、外側に装着した試験細片（８０）とを備える。
【００７０】
図２は、傾斜した壁を有する精液受け（９０）に取り付けた図１の装置（１０）を示す。精液サンプル（１００）は、受け（９０）のベースでウェル（９９）に収集されるが、その一部は受けオーバーフロー（９５）へと溢れる。
【００７１】
図３は、使用直前の装置（１０）を示す。精液サンプル（１００）がウェル（９９）に収集され、入口（２０）と接触している。出口（３５）が閉じているのは、カラー（５０）の穴（５１）が導管壁の穴（３０）と整列していないからである。溶液（４０）は、入口（２０）から離れて、箔シール（６６）によって受け内に保持される。
【００７２】
試験を開始するには、図４Ａで示すようにボタン（６０）を押下する。箔カッター（６８）がシール（６６）を穿孔し、溶液（４０）を解放する。サンプル（１００）中で動き回る精子は、ここで溶液（４０）と連絡し、図４Ｂで示すように入口（２０）を通してこの中に移動することができ、ここで動き回らない精子および精漿はサンプル（１００）中に留まる。ボタン（６０）は、熱源（７０）も起動し、溶液（４０）の温度を３７℃にする。
【００７３】
動き回る精子が溶液（４０）中へと移動する約３０分の期間の後、穴（５１）が穴（３０）と整列するよう、カラー（５０）を図５に示すように回転し、これによって出口（３５）を開く。溶液（４０）は、ここでは動き回る精子を含み、自由に導管を出て、外部に装着された試験細片（８０）に接触する。
【００７４】
図６に示すように、溶液は、毛管作用により、試験細片（８０）のベースに近接して並置されたプラスチック細片（８１ａおよび８１ｂ）を通って流れる。細片（８１ａおよび８１ｂ）の間には、脱水した金の標識を付けたマウス抗体ＣＤ−５９の区域（８２）がある。溶液が、細片（８１ａおよび８１ｂ）の間の区域（８２）を通過するにつれ、抗体が再水化され、溶液中の精子と結合することができる。さらに下流で、溶液はニトロセルロース細片（８３）に到達する。細片（８３）の孔サイズは非常に小さいので、精子が入ることができず、したがってその入口（８４）で捕捉される。自由標識は、下流の不動化した抗マウス抗体の線（８５）で捕捉されるまで流れ続ける。
【００７５】
図７に示すように、入口（８４）および線（８５）は窓を通して見ることができる。図７Ｅでは、２本の線が見え、元のサンプルに動き回る精子が存在することを示す。これに対して、図７Ｆでは制御線（８５）が１本しか見えず、元のサンプルに動き回る精子がないことを示す。
【００７６】
図８および図９に示す装置（１１０）は、相互に合わせた上部片（１９１）および下部片（１９０）を備える。下部片（１９０）のベースはウェル（１９９）を含み、その中に精液サンプル（２００）を配置する。上部片（１９１）は、窪んだ窓（１１３）、ボタン（１６０）および回転式ノブ（１５０）を含む。ノブ（１５０）およびボタン（１６０）は、ボタン（１６０）が押下されるまでノブ（１５０）を回転できないよう形成される。
【００７７】
図１０には、上部片（１９１）の内部構成要素が組立分解図で図示されている。上部片（１９１）は、座（１９３）と係合した上部片（１９２）から形成される。ボタン（１６０）の底部には針（１６８）があり、ボタン（１６０）を操作すると、針（１６８）が受け（１６５）を穿孔するが、これは操作前には０．８８ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸と０．４５％のＢＳＡが補充されたＥＢＳＳの溶液（１４０）を含む。受け（１６５）はプラスチック・ハウジング（１６６）内に配置され、これは首部分（１１５）および頭部分（１２０）を有する。首（１１５）の側部は、試験細片アセンブリ（１８０）の管部分（１８６）と係合する穴（１３０）を含む。頭部分（１２０）のベースは、０．２５ｍｍ間隔の０．１５ｍｍのストランドから形成した円形のナイロン網（１２１）で覆われる。組み立てた装置（１１０）内で、網（１２１）はウェル（１９９）内のサンプル（２００）と接触する。ノブ（１５０）は、ラックおよびピニオン機構を介してプランジャ（１５５）に取り付けられ、これは使用前には管（１８６）を通過して穴（１３０）に向かう。座（１９３）は熱源（１７０）に電力を供給する電池（１９４）を含む。組み立てると、熱源（１７０）は、穴（１３０）の領域を除いて首（１１５）を周方向に囲む。
【００７８】
試験細片アセンブリ（１８０）の組立分解図を図１１に示す。組み立てた装置（１１０）内で、管状部分（１８６）が穴（１３０）と直接連絡し、使用前には、プランジャ（１５５）が管（１８６）と係合して、これを充填し、それによって液体の流れを防止する。ノブ（１５０）の図１１の矢印の方向に操作することによって、プランジャ（１５５）を引っ込めると、管（１８６）が開いて、穴（１３０）とともに出口（１３５）を形成し、これを通って液体が流れることができる。したがって、管（１８６）およびプランジャ（１５５）は、シリンジの方法で作動する。液体は管（１８６）を覆って、透明プラスチック・ハウジング（１８１ａ：１８１ｂ）間の毛管空間に流入し、脱水した金でタグ付けしたマウス抗体ＣＤ−５９を含むパッド（１８２）の下を通過する。液体がパッド（１８２）を通過するにつれ、抗体が再水化され、液体中に通り、そこで精子に結合することができる。液体は、リバガーゼ（１８８）によって補助され、ニトロセルロース細片（１８３）へと流れ続け、そこに入る。細片（１８３）の孔サイズは小さすぎて精子が入ることができず、したがって入口（１８４）で捕捉される。抗体は、入口（１８４）において捕捉精子と結合し、ピンクの線を形成することができる。自由な抗体は、下流の不動化した抗マウス抗体の線（１８５）で捕捉されるまで流れ続ける。
【００７９】
装置は、図１２から図１６で示すように使用される。
−図１２では、精液サンプル（２００：例えば自慰によって採取）を下部片（１９０）に入れ、下部片（１９０）を平坦面に載せた状態で、ウェル（１９９）に収集する。
−３０分後に、上部片（１９１）を図１３に示すように下部片（１９０）に組み付けて、装置（１１０）を形成する。
−次に、図１４に示すようにボタン（１６０）を押下する。これで溶液（１４０）が解放され、熱源（１７０）も起動して、溶液（１４０）の温度を３７℃にする。
−約３０分後、精子が溶液（１４０）に入り、温度平衡も可能になるよう、ＬＥＤ（１１６）を図１５に示すように回転するよう指示する。
−これによって、プランジャ（１５５）が引っ込み、サンプル（２００）内で動き回り、媒体（１４０）中へと泳いだ精子が、試験細片（１８０）の管部分（１８６）内へ通ることができる。溶液（１４０９は、毛管作用によって試験細片（１８０）を通り、ウィック（１８８）へと流れる。溶液中の精子は、ニトロセルロース細片（１８３）の入口（１８４）に保持される。金でタグ付けされた自由抗体は、下流で不動化した抗マウス抗体の線（１８５）で捕捉されるまで、流れ続ける。図１６の（１８４）の線は、プラスの結果を示す。（１８５）の線は、試験が適性に操作されたことを示す。
【００８０】
本発明は、例示によってのみ記載され、本発明の範囲および精神内に留まりながら変更できることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による装置を示す。
【図２】 受け器に挿入した後のこの装置を示す。
【図３】 この装置の操作を示す。
【図４】 この装置の操作を示す。
【図５】 この装置の操作を示す。
【図６】 この装置の操作を示す。
【図７】 この装置の使用の概要を示す。
【図８】 操作する前の本発明による第２の装置を示す。
【図９】 ２つの成分部片に分離した同じ装置を示す。
【図１０】 上部片の組立分解図を示す。
【図１１】 装置に使用する試験細片アセンブリの構成を示す。
【図１２】 この装置の使用の概要を示す。
【図１３】 この装置の使用の概要を示す。
【図１４】 この装置の使用の概要を示す。
【図１５】 この装置の使用の概要を示す。
【図１６】 この装置の使用の概要を示す。

Claims (13)

1. 液体サンプル中で動き回る精子を分離し、検出する装置で、 −サンプル分離導管を有し、これが、
   （ａ）サンプル入口と、
   （ｂ）最初は閉鎖しているサンプル出口と、
   （ｃ）サンプル入口を介してサンプル中の動き回る精子が流入することができるサンプル分離媒体と、
   （ｄ）サンプル出口を開放し、これによってサンプル分離媒体がサンプル出口を通って導管から流出できるよう操作可能なアクチュエータとを備え、さらに、
   −精子検出手段を有し、これは、
   （ｉ）出口と連絡したアプリケーション・ゾーンと、
   （ｉｉ）精子の存在を検出することができる検出ゾーンと、
   （ｉｉｉ）精子と反応して、検出ゾーンにおける検出を容易にすることができる試薬を含む試薬ゾーンとを備え、
   これらのゾーンは、アプリケーション・ゾーンから検出ゾーンへの精子の毛細管流動を可能にするよう配置される装置。
2. 精子の試薬ゾーンを介したアプリケーション・ゾーンから検出ゾーンへの毛細管流動を可能にするよう、ゾーンが配置される、請求項１に記載の装置。
3. 検出ゾーンが、精子を不動化することができる精子捕捉ゾーンであり、試薬ゾーンが、精子に結合することができる標識を含む標識付けゾーンである、請求項１または２に記載の装置。
4. 導管が、追加的に、（ａ）分離媒体が入口を介してサンプルと連絡できるよう操作可能な第２アクチュエータを備える、請求項１から３のいずれか１項に記載の装置。
5. 捕捉ゾーンは、自由標識がそれを通ることができ、精子に結合された標識が通れないような孔サイズで、多孔質である、請求項３または４に記載の装置。
6. 検出手段が、試料に結合されていない標識を保持する検出ゾーンの下流にあるゾーンを含む、請求項３、４または５に記載の装置。
7. アプリケーション・ゾーンが非繊維質である、請求項１から６のいずれか１項に記載の装置。
8. 装置が温度センサを含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の装置。
9. 自身の熱源、および任意選択で温度調整手段を含む、請求項８に記載の装置。
10. 液体サンプル中で動き回る精子を分離し、検出装置で、
    −サンプル分離導管を有し、これが、
    （ａ）サンプル入口と、
    （ｂ）最初は閉鎖しているサンプル出口と、
    （ｃ）サンプル入口を介してサンプル中の動き回る精子が流入することができるサンプル分離媒体と、
    （ｄ）サンプル出口を開放し、これによってサンプル分離媒体がサンプル出口を通って導管から流出できるよう操作可能なアクチュエータとを備え、さらに、
    −精子検出手段を有し、これは、
    （ｉ）出口と連絡したアプリケーション・ゾーンと、
    （ｉｉ）精子を不動化することができる捕捉ゾーンと、
    （ｉｉｉ）精子に結合することができる標識を含む標識付けゾーンとを備え、
    これらのゾーンは、アプリケーション・ゾーンから検出ゾーンへの精子の毛細管流動を可能にするよう配置される装置。
11. 貼付図面に関してほぼ請求項１から１０に記載のような装置。
12. 毛管作用による精子の流れが、非繊維質材料を通して生じる、精子を分離および／または検出する装置。
13. 動き回る精子と動き回らない精子を分離および／または検出する装置で、温度センサ、熱源、および任意選択で温度調整手段を含む装置。

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