NO860937L - Diagnostikum for assaybestemmelser. - Google Patents

Description

Innretning for for diagnostiske assaybestemmelser.

Område for oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt området med diagnostiske assaybestemmelser og apparatur og innretninger egnet for dette. Ved et annet aspekt vedrører oppfinnelsen området med reagenser for diagnostiske assaybestemmelser.

Ved et annet aspekt vedrører oppfinnelsen innretninger for nøyaktig avgivelse av små mengder av et oppløselig reagens.

Bakgrunn

Meget sensitive diagnostiske assaybestemmelser, spesielt immunoassaybestemmelser og andre ligand-receptor-bestemmelser tillater nøyaktig måling av meget små mengder analytter som forekommer i prøver av kroppsvæsker som serum eller plasma, urin og spytt/slim. Disse analyser er kompliserte ved det forhold at de avhenger av nøyaktig måling og overføring av små mengder reagens. F.eks. anvender mange immunoassaybestemmelser et oppløselig antigen eller antistoff. Ved disse assaybestemmelser tilføres antigenet eller antistoffet ofte i en frysetørket form som oppløses og overføres med pipette.

Andre problemer skriver seg fra bruken av prøver som i den form de er samlet, inneholder en stor mengde uønsket cellulært avfall som inhiberer eller maskerer dannelsen av et antigen-antistoff-kompleks, i tilfellet av en immuno-assaybestemmelse, eller andre komplekser som er karakteristiske ved en ligand-receptor-assaybestemmelse. Avfallet kan også tilstoppe eller på annen måte blokkere avgangen til overflater hvorpå noen del av assay-prosessen kan finne sted.

Disse komplikasjoner er ikke uoverstigelige når diagnosesett som hittil har kunnet fåes anvendes av øvet personell. I mange tilfeller vil de imidlertid i vesentlig grad redusere om ikke eliminere muligheten av at en assaybestemmelse kan bli pålitelig gjennomført av personer som mangler slik øvelse. Dette er meget alvorlig i tilfellet av produkter bestemt for salg over disken til uprofesjonelle personer. Innretninger for å eliminere disse problemer vil imidlertid gjøre assaybestemmelsene mer fordelaktige endog for bruk av øver personell.

Oppsummering av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse er en innretning eller apparat som kan anvendes for å redusere eller eliminere de nevnte problemer. Innretningen omfatter en formet porøs masse inneholdende en målt mengde av et oppløselig reagens dispergert i hele massen, men som kleber til eller er påført overflatene av porene eller innsperret inne i porene. Innføring av et løsningsmiddel for reagenset til den formede porøse masse rekonstituerer effektivt en oppløsning for det oppløselige reagens slik at det kan anvendes ved assay-bestemmelsen. Innretningen kan anvendes som et forfilter i en diagnostisk assaybestemmelse ved utvelgelse av en pore-størrelse som vil være liten nok til å filtrere ut uønsket cellulært avfall. Videre, da en mengde av oppløselig reagens som er innlemmet i den formede porøse masse kan forutbestemmes og innføres nøyaktig, behøver den etterfølgende bruker bare å manipulere den foremde porøse masse for å innføre en målt mengde av reagens i en diagnostisk assaybestemmelse, og dette fjerner behovet for fremstilling og pipettering av en oppløsning. Som beskrevet mer detaljert i det følgende har innretningen spesiell anvendelse ved immuno-assaybestemmelser som anvender et oppløselig mono-eller poly-klonalt antistoff-preparat som et reagens.

Endelig kan den porøse masse virke som et reaksjonskammer hvori dannelse av reaksjonsproduktet mellom det oppløselige reagens og en analytt eller en annen komponent kan finne sted.

Det er følgelig et formål for oppfinnelsen å forenkle gjennomføringen av diagnostiske assaybestemmelser.

Et ytterligere formål er å tilveiebringe et enkel innretning for nøyaktig innføring av en mengde av et oppløselig reagens til en prosess, spesielt en diagnostisk assaybestemmelse .

Enda et ytterligere formål er å tilveiebringe innretninger som samtidig virker som en filtreringsinnretning ved en diagnostisk assaybestemmelse og også avgir en forhånds-

målt mengde av et oppløselig reagens anvendt ved assay-bestemmelsen.

Gjennomføringsmåten for disse og andre formål vil fremgå av den etterfølgende beskrivelse av foretrukne utførelsesformer.

Detail ert beskrivelse

Som allerede indikert tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en innretning som har spesiell anvendelse ved diagnostiske assaybestemmelser som anvender et oppløselig reagens. Blant slike assaybestemmelser er ligand-receptor-assaybestemmelser generelt, inklusive men ikke begrenset til immuno-assaybestemmelser, som anvender enten et oppløselig antigen eller et polyklonalt eller monoklonalt antistoff-preparat som et oppløselig reagens, og DNA sonde-assaybestemmelse, som anvender en nukleinsyre-oligomer som et oppløselig reagens. Oppfinnelsen er spesielt foretrukket for bruk ved immunometriske assaybestemmelser som anvender et oppløselig merket antistoff som en komponent av assay-bestemmelsen, mest foretrukket et monoklonalt antistoff. Oppfinnelsen skal følgelig beskrives med henvisning til bruk av et monoklonalt antistoff som oppløselig reagens selv om det vil være klart for den fagkyndige at oppfinnelsen kan anvendes i forbindelse med andre oppløselige reagenser og at denne anvendelse av oppfinnelsen derfor bare et eksempelvis.

Innretningen i samsvar med oppfinnelsen omfatter en formet porøs masse inneholdende en målt mengde av det oppløselige reagens dispergert i hele den porøse struktur, påført eller på annen måte festet til overflatene av eller innestengt i den porøse masse. Den spesielle form av det porøse legeme er ikke kritisk og vil vanligvis være en form som er fordelaktig for en spesifikk anvendelse. Oftest vil den være formet til å passe inne i en beholder eller en annen emballasje egnet til å motta den porøse masse for dens påtenkte anvendelse. Med henvisning til figur 1 er den porøse masse vist som en sylindrisk patron 30 som vil ha en diameter som tillater nøyaktig innpassing i en sylindrisk beholder, selv om andre former er like brukbare, f.eks. en konisk masse eller en kubisk masse kan være bedre egnet for noen anvendelser.

Den porøse masse vil oftest være av et polymert material, som f.eks. polystyren, polyetylen, nylon, polyester, celluloseacetat og lignende. Et formet legeme av glassfibre eller mineralfibre kan også anvendes. Det spesifikke material som velges må selvfølgelig ikke være reaktivt med det oppløselige reagens og ikke bindes med reagenset på noen måte som i vesentlig grad nedsetter evnen av reagenset til fornyet oppløsning. Den fysikalske struktur av den formede masse er ikke kritisk og kan f.eks. oppnås ved å organisere individuelle fibre eller ved frigivelse av et blåsemiddel i en smeltet masse når denne avkjøles til å danne et skum med åpne celler. Metodene for fremstilling av slike kropper er selvfølgelig velkjent og utgjør ingen del av den foreliggende oppfinnelse. Som det vil fremgå klarere senere vil de prinsipielle kriterier for utvelgelse av en spesiell masse være porestørrelse-betraktninger og forlikelighet med det oppløselige middel.

Innlemmelse av det oppløselige reagens i den formede porøse masse kan oppnås ved dets tilsetning som en oppløsning til massen etterfulgt av en tørkeoperasjon, foretrukket fryse-tørking i tilfellet av temperaturfølsomme biologiske substanser som antigener, antistoffer eller nukleinsyre-oligomerer. Vanligvis anvendes en mengde oppløsning mindre enn den som vil fullstendig mette den formede masse. Hvis dette ikke gjøres vil en vesentlig del av reagenset sannsynligvis bli belagt på utsiden av den formede masse hvor det lett kan fjernes ved abrasjon. Hvis f.eks. metningsvolumet av den formede masse er 250 ul er det ønskelig å innføre reagenset i bare omtrent 200 ul total oppløsning på en måte som unngår lokal metning med resulterende vandring av en vesentlig del av oppløsningen til utsiden under forhold slik at en film av reagenset dannes på utsiden.

Foretrukket anbringes den formede masse før eller etter innføringen av det oppløselig reagens i en emballasje som vil beskytte det under lagring og håndtering. I tilfellet av en sylindrisk patron kan en beskyttende hylse anvendes. Den beskyttende emballasje kan være tilpasset til lett å kunne fjernes eller forenes med et annet element som anvendes ved assay-bestemmelsen.

En foretrukket apparatur for gjennomføring av diagnostiske assaybestemmelser, spesielt immuno-assaybestemmelser, som innretningen med fordel kan anvendes sammen med, er omhandlet i

11. mai 1984, idet læren i henhold til dette er innlemmet heri som henvisning. Dette apparat er vist i fig. 2. I fig. 2 vises således en sylindrisk beholder 10, selv om denne kan ha en hvilken som helst annen passende form, med en øvre åpning 12 avgrenset av en sidevegg 14. Beholderen kan være fremstilt av glass eller et passende plastmaterial. Som vist i fig. 2 har beholderen 10 også en nedre åpning 16 hvori det er innsatt en uttagbar plugg 18 for å tillate innstikking av en porøse del 2 0 som er en sirkulær membran-eller filter-skive og en eventuell del 21 med funksjon som beskrevet i det følgende, som hviler på den sylindriske absorberende del 22, som også er innsatt gjennom åpningen 16.

En del av beholderen 10 er innsnevret som vist i fig. 2 ved henvisningstallet 24 til å gi en innebygget trakt for å dirigere prøven ut på delen 20 og å sikre at effektiv vasking av prøven og andre tilsetningsmidler på delen 20 gj ennomføres.

Størrelsen av delen 22 og derfor volumet av beholderen 10 under innsnevringen velges foretrukket slik at all væske som tilsettes apparatet under en assaybestemmelse kan opptas i og inneholdes i den absorberende del 22. Innretninger for å slippe ut luft (ikke vist i fig. 2), f.eks. små åpninger,

er tilveiebragt i beholderen 10 nær bunnen for å tillate at fortrengt luft unnslipper. Eventuelt kan bunnen av beholderen 10 fjernes og væske få passere gjennom delene 20 og 2 2 og slippe ut fra beholderen gjennom bunnen. Da innretningen imidlertid er bestemt for engangs bruk og lette bortskaffing av prøven på en enkel og hygienisk måte, er det foretrukket å anvende en struktur vist i fig. 2.

Delen 20 kan anvendes for enten å filtrere cellulært eller annet material fra en prøve eller f.eks. som en under-støttelse for bundet antistoff mot et antigen som assaybestemmes for å fjerne antigenet fra oppløsning. I alle fall tilføres væskeprøven som assaybestemmes til delen 20 ved innføring gjennom åpningen 12. Etter at prøven har trengt gjennom delen 20 og væsken er trukket gjennom denne og inn i den absorberende del 22 tilføres en oppløsning av merket antistoff i tilfellet av en "sandwich-assaybestemmelse", foretrukket et monoklonalt antistoff, gjennom åpningen 12

til delen 20.

Det merkede antistoff binder så enten til antigenet bundet til antistoffet på delen 20 eller assosiert med cellulært material innesperret på overflaten av 20. Hvis delen 20 har et monoklonalt antistoff bundet til seg og det merkede antistoff også er et monoklonalt antistoff, velges de to antistoffer til å binde til ikke-interfererende antigen-bindingssituser som beskrevet i US patentskrift nr. 4.376.110 og ansøkning med løpenummer 323.498 inngitt 6. juni 1981, idet læren i disse er innlemmet heri som henvisning.

Foretrukket merkes det oppløselige antistoff med et enzym selv om andre konvensjonelle immuno-assay-merkinger kan anvendes ved passende forhold. F.eks. kan en fluorescerende merking eller et radionukleid anvendes.

Etter at den merkede antistoff-oppløsning har passert gjennom delen 20 tilføres en vaskevæske til delen 20 for å spyle ubundet merket antistoff fra delen 20 og inn i delen 22.

Den skrånende struktur av veggene 2 4 tilveiebringer en innebygget trakt for å lette tilføring av vaskevæske til veggene for å fjerne fastsittende rester av den merkede antistoff-oppløsning.

Tilsetningen av den merkede antistoff-oppløsning og vaske-væsken til delen 20 kan komme etter korte inkubasjons-perioder for å tillate mer utstrakt binding av antistoff eller antigen i oppløsninger innesperret på eller i hulrommene i delen 20 og derved øke følsomheten av assaybestemmelsen. Slike inkubasjons-trinn er imidlertid enten unødvendige

eller kan være meget korte, f.eks. omtrent 60 sek. eller mindre. Strømmen av oppløsninger inneholdende antigen eller merket antistoff gjennom delen 20 resulterer i en vesentlig hurtigere bindingstakt enn den som iakttas i fravær av strømmen.

Hvis antistoffmerkingen er et enzym, etter vasking for å fjerne ubundet antistoff fra delen 20, tilsettes en oppløsning av enzym-substratet til delen 20. Hvis target-antigenet er bundet enten til antistoffet bundet til delen 20 eller til cellulært material på delen 20, vil antigenet ha bundet til seg en del av det merkede antistoff. Enzymet vil bevirke substratet til å reagere og hvis det er riktig valgt, fremkalle en fargendring som kan detekteres visuelt eller ved hjelp av instrumenter.

I tilfellet av bruk av celluloseacetat-material, kan den absorberende del 22 binde merket antistoff ikke-spesifikt på sin utside. Følgelig kan noen visuell fargendring opptre ved denne overflate umiddelbart under delen 20. For å unngå at denne fargeendring blir gjort synlig gjennom delen 20 blir foretrukket en separerende del (betegnet 21 i fig. 2) av porøst polyetylen eller annet material som ikke binder antistoff ikke-spesifikt foretrukket anordnet mellom delene 20 og 22.

Fig. 3 viser bruk av den foreliggende oppfinnelse med innretningen i fig. 2. Den formede masse i fig. 1 er således vist beliggende inne i det rom som avgrenses av sideveggen 14 i beholderen 10. For å illustrere dens funksjon skal bruken av den sammensatte innretning i fig. 3 for å gjennomføre en assaybestemmelse for humant choriogonadotropin, HCG, et hormon som forhøyes under svangerskap og som kan detekteres i urinen, beskrives. I dette tilfelle er det oppløselige reagens som anvendes et monoklonalt antistoff mot HCG som er blitt frysetørket inne i delen 30, som i seg selv er fremstilt av celluloseacetat-fibre. Det monoklonale antistoff er*merket med enzymet alkalisk fosfatase, selv om andre enzymatiske, fluorescerende eller endog radioaktive merkinger kan anvendes.

En målt urinprøve tilsettes toppen av den foremde porøse masse 30, foretrukket i en mengde beregnet til ikke fullstendig å mette massen. Volumet av prøven, siden denne ikke metter massen, holdes tilbake inne i porene av massen og virker til å oppløse antistoffet, eller i det minste en vesentlig del av dette. Ved passende seleksjon av pore-størrelse virker massen også som en forfilter for å separere eventuelle epitheliale celler som finnes i urinen og som kan tilstoppe delen 20.

Urinprøven får forbli inne i delen 30 lenge nok til å

oppløse antistoffet og tillate at den bindes til eventuelt HCG i prøven. På denne måte virker delen 30 som reaksjons-beholder for immuno-reaksjonen av antistoff og HCG. Etter denne inkubasjon tilføres en vaskeoppløsning, som kan være ytterligere urin, for å vaske antistoff-antigen-komplekset fra delen 30.

Når antistoff-antigen-komplekset vaskes ut fra delen 30 kommer det i kontakt med og passerer gjennom membranen 20. Delen 20 fjernes så og kastes. Dette tilveiebringer en anledning for at antistoffet bundet til den faste fase kan binde det HCG:merkede antistoff-kompleks og fjerne det fra oppløsningen. Ubundet merket antistoff vaskes gjennom delen 20 og inn i den absorberende masse 22.

Etter at prøven og vaskeløsningene har passeret gjennom

delen 20 tilsettes en oppløsning inneholdende et substrat for alkalisk fosfatase, f.eks. indoksyl-fosfat, til toppen av delen 20 for å reagere med eventuelt enzym bundet til filteret som resultatet av reaksjonen av HCG med antistoffet bundet til delen 20 og det enzym-merkede oppløselige antistoff. Dannelse av en synlig blåfarging er en indikasjon på denne reaksjon.

Mens den trinnvise reaksjon anbefales kan under visse forhold et volum urin anvendes som overstiger metningsvolumet av den porøse del. Som et resultat dirigeres det oppløselige antistoff og ufiltrert material i prøven direkte til delen 20. Reaksjonstiden mellom antistoffet og HCG i prøven blir selvfølgelig redusert. Den trinnvise prosedyre tilveiebringes derfor vanligvis en mer følsom assaybestemmelse.

Ved en annen anvendelse kan den foremde porøse masse ha inneholdt deri et antistoff mot et antigen på overflaten av en cellulær partikkel. I dette tilfelle må porestørrelsen av delen 20 utvelges for å tillate passering av target-material som så innesperres på overflaten av delen 20. Porestørrelsen av delen 30 kan imidlertid velges for å inhibere passering av større celler som kunne forstyrre assaybestemmelsen ved å tilstoppe delen 20. Denne prosedyre er spesielt velegnet for deteksjon av bakterier, sopp, parasitter og andre spesielle organismer og virus som kan filtreres og ha assosierte antigener.

I en annen anvendelse kan den formede masse anvendes enkelt for å gi en målt mengde oppløselig antistoff på en grei måte. Etter at prøven er blitt tilsatt delen 20 innsettes således delen 30 i åpningen 12 og et løsningsmiddel for reagenset deri, f.eks. et antistoff, bringes til å strømme gjennom delen 30 for å oppløse og avgi antistoffet til overflaten av delen 20.

Den foregående beskrivelse er bare illustrerende for den

bruk som kan gjøres av innretningen i henhold til den

oppfinnelse. Rammen for oppfinnelsen skal følgelig bare ansees begrenset av de etterfølgende patentkrav.

Claims (21)

1. ^ Innretning for bruk ved en diagnostisk assaybestemmelse karakterisert ved at den anvender en målt mengde av et oppløselig reagens omfattende en formet porøs masse som har det" oppløselige' reagens dispergert inne i porene av den formede masse, idet det oppløselige reagens elueres fra den porøse masse ved passering av et løsnings-middel for antistoffer gjennom massen.
2. 2. Innretning som angitt i krav 1, karakterisert ved at det oppløselige reagens frysetørkes inne i porene av den formede masse.
3. 3. Innretning som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at den diagnostiske assaybestemmelse er en ligand-receptor-assaybestemmelse og det oppløselige reagens er i form av et ligand-receptor-par.
4. 4. Innretning som angitt i krav 3, karakterisert ved at det oppløselige reagens er valgt fra et preparat av polyklonale antistoffer, et monoklonalt antistoff, et antigen eller en nukleinsyre-oligorner.
5. 5. Innretning som angitt i krav 4, karakterisert ved at det oppløseige reagens er et monoklonalt antistoff.
6. 6. Innretning som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at den formede porøse masse er et legeme av polymert material, glass, fibre eller mineralfibre.
7. 7. Innretning som angitt i krav 6, karakterisert ved at det polymere material er valgt fra nylon, en polyester, et polyolefin, polystyren eller cellulose-acetat.
8. 8. Innretning som angitt i krav 7, karakterisert ved at det oppløselige reagens er valgt fra et preparat av polyklonale antistoffer, et monoklonalt antistoff, et antigen eller en nukleinsyre-oligomer.
9. 9. Innretning som angitt i krav 8, karakterisert ved at det oppløselige reagens er et monoklonalt antistoff.
10. 10. Fremgangamåte for diagnostisk assaybestemmelse av en prøve hvor en målt mengde av et oppløselig reagens anvendes, karakterisert ved at det oppløselige reagens tilsettes til assaybestemmelsen ved å føre et løsningsmiddel for reagenset gjennom en formet, porøs masse med et oppløselige reagens dispergert inne i porene derav, hvorved det oppløselige reagens oppløses i løsningsmidlet og vaskes fra den formede masse.
11. 11. Fremgangsmåte som angitt i krav 10, karakterisert ved at det oppløselige reagens er valgt fra et polyklonalt antistoff-preparat, et monoklonalt antistoff, et antigen eller en nukleinsyre-oligomer.
12. 12. Fremgangsmåte som angitt i krav 10 eller 11, karakterisert ved at det oppløselige reagens er merket for å tillate deteksjon.
13. 13. Fremgangsmåte som angitt i krav 12, karakterisert ved at merkingen er valgt fra et enzym, en fluorescerende komponent eller et radionukleid.
14. 14. Fremgangsmåte som angitt i krav 10 eller 11, karakterisert ved at den formede porøse masse består av et polymert material, glassfibre eller mineralfibre.
15. 15. Fremgangsmåte som angitt i krav 14, karakterisert ved at det polymere material er valgt fra nylon, polyolefin, polyester, polystyren eller cellulose-acetat.
16. 16. Fremgangsmåte som angitt i krav 10 eller 11, karakterisert ved at den formede porøse masse anvendes for å filtrere cellulært material fra prøven.
17. 17. Fremgangsmåte som angitt i krav 10 eller 11, karakterisert ved at prøven er valgt fra urin, serum, plasma eller spytt/slim.
18. 18. Fremgangsmåte som angitt i krav 16, karakterisert ved at prøven velges fra urin, serum, plasma eller spytt/slim.
19. 19. Fremgangsmåte som angitt i krav 10 eller 11, karakterisert ved at løsningsmidlet er den prøve som assaybestemmes.
20. 20. Fremgangsmåte som angitt i krav 19, karakterisert ved at prøven er urin.
21. 21. Fremgangsmåte som angitt i krav 19, karakterisert ved at det oppløselige reagens reagerer med en komponent i prøven inne i porene av den porøse masse.