DE69005023T2

DE69005023T2 - Applikatorröhrchen mit einem Filter.

Info

Publication number: DE69005023T2
Application number: DE1990605023
Authority: DE
Inventors: Gary A Ascani; Richard B Mortensen; Daniel B Rosman; Douglas D Rundle; Henry Tom
Original assignee: Quidel Corp
Current assignee: Quidel Corp
Priority date: 1989-05-18
Filing date: 1990-05-18
Publication date: 1994-06-01
Anticipated expiration: 2010-05-19
Also published as: ES2049420T3; EP0398739B1; EP0398739A3; DE69005023D1; CA2017084A1; JPH0356150A; EP0398739A2

Description

HINTERGRUND DAR ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft im allgemeinen Verfahren und Vorrichtungen zum Bestimmen von Analyten in biologischen Proben. Im spezielleren betrifft sie die Konstruktion und Verwendung eines Flüssigkeitsprobenapplikators, der eine innere Matrix aufweist, die Teilchenmaterial aus der Probe abtrennt und die ein dispergiertes Reagens enthält.
Das Immunoassay biologischer Proben hat sich in einer Vielzahl von Umständen als enorm vorteilhaft erwiesen, wie bei der Krankheitsdiagnose, dem Drogennachweis und dem überwachen physiologischer Stoffwechselprodukte. Bei der Durchführung von Immunoassays an flüssigen biologischen Proben ist häufig Vorbehandlung erforderlich, um Teilchen, wie Zellbruchstücke, zu entfernen, die das Assaygerät verschmutzen oder die Assayergebnisse stbren kdnnten. Die Teilchen können beispielsweise durch Filtrieren der flüssigen Probe während eines getrennten Schritts im Assayverfahren entfernt werden. Obwohl es wirksam ist, um die Stbrungsprobleme zu Überwinden, ist das Hinzufügen eines Filtrierschritts nicht wünschenswert, da es die Zeitdauer und Komplexität des Assayverfahrens erhöht. Es wäre daher wünschenswert, Filtrierverfahren und -vorrichtungen zu schaffen, die die Assayvorschrift in einem Durchgang erfüllen können und das gesamte Verfahren nicht zeitaufwendiger oder komplexer machen wUrden.
Ein Ansatz zur Probenfiltration ist im von Abbott Laboratorties, North Chicago, Illinois erhältlichen Test-Pack-Assaysystem und dem von Leeco Diagnostics, Inc., Southfield, Michigan, erhältlichen Preview Serum/Harn-hCG-Assaysystem zu finden. In beiden Fällen wird ein abnehmbarer Filter an eine Membran, die fUr den interessierenden Analyten spezifische gebundene Antikörper enthält, in Position eingeschnappt. Durch den Filter hindurch wird Probe auf die Membran aufgebracht und der Filter vor der Entwicklung des Assays entfernt. Obwohl es die Funktion des Entfernens von Teilchenmaterial erfüllt, hat die Verwendung eines derartigen Assaysystems bestimmte Nachteile. Insbesondere kann die Zeit, die erforderlich ist, damit die Probe den Filter durchdringt, nicht weniger als 1 Minute oder mehr betragen, was die zur Durchführung des Assays erforderliche Zeit verlängert. Darüberhinaus bedeutet die Notwendigkeit, den Filterhalter vor der Entwicklung zu entfernen, einen weiteren Schritt, der die zur Durchführung des Assays erforderliche Zeit weiter verlängert und, wenn er vergessen wird, die Testergebnisse vollkommen wertlos machen.
Außerdem erfordern biologische Assays oft die Kombination eines oder mehrerer Reagenzien mit einer Testprobe oder anderem flüssigen Assaybestandteil im Verlauf des Assays. Bisher hat die Reagenshinzufdgung im allgemeinen (einen) diskrete(n) Hinzufugungsschritt(e) erfordert, der zu entsprechenden Zeitpunkten während des Assays durchgeftihrt wurde. Während das sicherlich machbar ist, erhöht jeder zusätzliche Assayschritt die Assaykomplexität, die zur DurchfUhrung der Assays erforderliche Zeit und die Wahrscheinlichkeit, daß Verunreinigungen und Fehler in das Endergebnis eingebracht werden. Es wäre daher wünschenswert, (eine) Reagenskombination(en) gleichzeitig mit der Übertragung von flüssiger Probe oder anderem flüssigen Assaybestandteil durchzuführen, wodurch die Anzahl an tatsächlich beteiligten Assayschritten verringert wird, bei gleichzeitiger Verringerung der zur Durchführung des Assays erforderlichen Zeit und Mühe.
Die vorliegende Erfindung schafft einen neuen Applikator zum Einbringen eines Reagens in eine flüssige biologische Probe oder einen anderen flüssigen Assaybestandteil. Der Applikator umfaßt ein Rohr, das ein inneres Lumen definiert und eine integrale durchlässige Matrix mit einem darin dispergierten Reagens umfaßt. Wenn ein(e) flüssige(r) Probe oder Assaybestandteil durch die durchlässige Matrix und in den Applikator gesaugt wird, wird der Reagensbestandteil mit der Probe oder einem anderen flüssigen Assaybestandteil kombiniert und darin freigesetzt. Die Probe und das Reagens werden daraufhin zurück durch die durchlässige Matrix hindurch in ein/eine Assaymedium oder -vorrichtung abgegeben. Das führt zur Verringerung in der Anzahl an Schritten des Assays, da das Erfordernis des Ausmessens und Hinzufügens (wie durch das Zählen von Tropfen) von Reagens zur Probe oder einem anderen Assaybestandteil oder von Probe und/oder Reagens zum/zur Assaymedium oder -vorrichtung vor oder nach der Übertragung der Probe oder eines anderen Assaybestandteils ausgeschaltet wird. Weiters filtriert die Matrix die Flüssigkeit in einem; überraschenderweise wird nicht festgestellt, daß das abgeben der Probe und des Reagens zurück durch die Matrix eine wesentliche Freisetzung von Teilchen in die abgebende Flüssigkeit verursacht.
In den Zeichnungen:
zeigt Fig. 1 eine erste Ausführungsform dem Applikators gemäß vorliegender Erfindung, der für die manuelle Übertragung von flüssigen Proben bestimmt ist,
ist Fig. 2 eine schematische Darstellung der Verwendung des Applikators gemäß vorliegender Erfindung in einer automatisierten Immunoassayvorrichtung,
veranschaulicht Fig. 3 eine weitere Ausführungsform des Applikators gemäß vorliegender Erfindung, die eine Membran an einer Füll-Leitung im Applikatorrohr umfaßt,
veranschaulicht Fig. 4 eine weitere Ausführungsform des Applikators gemäß vorliegender Erfindung, der ein einstückiger Applikator ist, worin der Vakuumkolben ein integraler Teil des Applikators und nicht abnehmbar ist.

BESCHREIBUNG SPEZIELLER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Gemäß vorliegender Erfindung umfaßt ein Flüssigkeitsprobenapplikator ein Rohr, das ein inneres Lumen begrenzt und eine an einem Ende des Rohres innerhalb des Lumens angeordnete Filtermatrix aufweist. Der Applikator kann weiters einen Vakuumkolben an seinem anderen Ende aufweist, sodaß er auf eine Art verwendet werden kann, die der Verwendung eines herkömmlichen Fluidtropfers beim Übertragen flüssiger Proben bei der Durchführung von Immunoassays ähnlich ist. Alternativ dazu kann das andere Ende des Applikators zum Anbringen an einer Vakuumvorrichtung ausgebildet sein, die Teil eines automatisierten Assaygeräts ist. In diesem Fall kann der Applikator weiters immunologische Reagenzien umfassen, die an seiner inneren Oberfläche immobilisiert sind, und der Applikator kann gemäß ansonsten herkömmlicher Vorschriften für automatisierte Assays verwendet werden. In beiden Fällen sorgt das Einschließen der Filtermatrix für das Filtrieren des Probenfluids in zwei Richtungen, ohne daß zur Durchführung des Assays zusätzliche Assayschritte oder Zeit erforderlich sind. Überraschenderweise ist festgestellt worden, daß das Abgeben der Probe durch die Filtermatrix hindurch nicht zu einer nennenswerten Freisetzung der Teilchen zurück in die flüssige Probe führt.
Die vorliegende Erfindung ist nützlich zur Durchführung von Assays bezüglich einer großen Vielzahl von löslichen Analyten in so gut wie jedem Typ biologischer Probe, die flüssig ist oder verflüssigt werden kann. Das Verfahren und die Vorrichtung finden größte Anwendung für Proben wie Blut, Serum, Plasma, Harn, Zerebralfluid, Rückenmarksflüssigkeit, Okularlinsenflüssigkeit (Tränen), Speichel, Sputum, Samen, Zervikalschleim, Abstriche, Abwischproben und ähnliches. Die Verwendung des Filterapplikators gemäß vorliegender Erfindung hat sich als besonders wertvoll bei der Durchführung von Harnassays auf menschliches Choriongonadotropin (hCG) und luteinisierendes Hormon (LH) erwiesen, bei denen die Störung durch verschiedene Teilchenmaterialien und lösliche Substanzen bisher ein Problem dargestellt hat.
Die Proben enthalten im allgemeinen Teilchenverunreinigungen, die das Assayverfahren auf irgendeine Art stören können. Beispielsweise können die Teilchen die zur Analytbestimmung erforderlichen immunologischen Reaktionen chemisch stören, könnten das Assayverfahren mechanisch stören, wie durch das Verstopfen von Öffnungen oder Membranen, oder könnten die Bestimmung von Assayergebnissen stören, wie durch das Beeinflussen der Ablesungen der optischen Dichte. Derartige störende Teilchen können aus einer Vielzahl von Quellen stammen, wie Zellbruchstücken, Schleim, ausgefällten biologischen Salzen und ähnlichem.
Nun auf Fig. 1 bezugnehmend umfaßt ein gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung konstruierter Applikator 10 ein längliches Rohr 12, das ein inneres Lumen 14 begrenzt und eine Filtermatrix 16 aufweist, die innerhalb des Lumens an einem Ende des Rohres angeordnet ist. In der ersten Ausführungsform von Fig. 1 umfaßt der Applikator 10 weiters einen Vakuumkolben 18, der an dem der Filtermatrix entgegengesetzten Ende angeordnet ist. Der Kolben 18 befindet sich in abdichtendem Eingriff mit dem Rohr 12, sodaß Manipulation des Kolbens dazu führt, daß Fluid in das Lumen 14 gesaugt oder aus diesem ausgestoßen wird. Das Rohr 12 kann aus einer Vielzahl von Materialien gebildet sein, einschließlich Glas, Metallen, Keramikmaterialien, organischen Polymeren, wie Polypropylen, Polyvinylchlorid, Nylon, Polyäthylen und ähnlichem. Der Vakuumkolben 18 ist typischerweise aus einem elastomeren Polymer gebildet, wie natürlichem Gummi. Normalerweise ist das der Filtermatrix 16 nahe Ende 20 des Rohres 12 verjüngt. Jedoch ist das nicht erforderlich, wie durch das Ende 70 in Fig. 4 veranschaulicht. Die Konstruktion des Rohres 12 und des Vakuumkolbens 18 ist ähnlich der, die für herkömmliche Fluidtropfer eingesetzt wird, und im Handel erhältliche Fluidtropfer können bei der Herstellung der Applikatoren 10 gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden.
Die Filtermatrix 16 ist fähig, Teilchen zu entfernen, die Abmessungen von nicht mehr als etwa 2 um, üblicherweise nicht mehr als etwa 1 um und vorzugsweise nicht mehr als etwa 0,5 um oder darunter aufweisen. Die Teilchen können selbstverständlich viel größer sein und sind häufig 3 um oder größer. Zumindest etwa 75% der anfänglich in der flüssigen Probe vorhandenen kleinsten Teilchen werden entfernt, üblicherweise zumindest etwa 90% derartiger Teilchen und häufiger zumindest etwa 95% derartiger Teilchen. Die Filter sollten aus einem Material gebildet sein, das im wesentlichen den interessierenden Analyten nicht bindet. Häufig ist es jedoch wünschenswert, daß das Filtermedium lösliche Substanzen (mit Ausnahme des Analyten) einschließlich Ionen, organischer Moleküle, wie Creatinine, Bilirubine, Pigmente und Hämoglobin und anorganischer Moleküle entfernt. Geeignete Materialien umfassen Polyester, Zelluloseacetate, Polyacrylonitrile. Besonders bevorzugt werden Filtermatrizen, die aus poly(Athylenterephthalat) gebildet sind, das ein Polyester mit der empirischen Formel C&sub1;&sub0;H&sub8;O&sub4; n ist.
Um effiziente Teilchenentfernung zu erzielen, ist es notwendig, daß die Filtermatrix 16 so angeordnet ist, daß die flüssige Probe durch das Material hindurch und nicht nur am Filtermaterial entlang gelangt. Daher sind bestimmte Filterkonfigurationen, wie eine Spiralrolle, bei der Probe durch benachbarte Schichten ablaufen kann, ungeeignet. Geeignete Konfigurationen umfassen das Anordnen einer Filtermembran quer über das Lumen 14 des Applikators 10, sodaß der Fluß durch die Membran hindurchgehen muß, oder das ausreichend dichte Packen eines Filtermediums innerhalb des Lumens, sodaß Fluß durch das Medium hindurch gewährleistet ist.
Die Filtermatrix 16 ist vorzugsweise aus Polyesterfasern mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 5 bis 50 um, üblicherweise im Bereich von etwa 10 bis 20 um gebildet. Die Fasern werden in einem Bündel angeordnet, das eine Vielzahl von Fasern parallel zueinander in einer ausreichenden Dichte von etwa 1x10&sup5; bis 5x10&sup5; Fasern/cm² angeordnet aufweist, üblicherweise etwa 2,5x10&sup5; Fasern/cm² für Fasern mit einem Durchmesser von 15 um. Das Bündel ist üblicherweise mechanisch gebunden, üblicherweise in einem dünnen Kunststoffrohr, um die Handhabung und das Einfügen in das längliche Rohr 12 zu erleichtern. Die einzelnen Fasern sollten frei vdn Klebern und anderen Bindemitteln sein, da Kleber häufig Proteinbindung verursachen, die die Zusammensetzung der Probe beeinflußt, d.h. Analyt daraus entfernt. Die Länge der Fasern hängt von den Abmessungen des Applikators und dem zu behandelnden Probevolumen ab und variiert üblicherweise im Bereich von etwa 0,25 bis 5 cm, häufiger im Bereich von etwa 1,5 bis 2,5 cm, und das Faserbündel wird innerhalb des Rohres angeordnet, sodaß die Fasern in der axialen Richtung liegen.
Zweckmäßig wird das Faserbündel durch das offene Ende von Rohr 12 (das durch Kolben 18 befestigt ist) eingefügt und in die in Fig. 1 dargestellte Position vorgeschoben. Bei Applikatoren mit verjüngten Spitzen 20 wird ein kleines Leervolumen 22 innerhalb der Spitze gelassen, das nichtfiltrierte Probe enthält, während das Assay durchgeführt wird. Wie detaillierter in der Folge beschrieben, kann es wünschenswert sein, eine Teilmenge der Probe, die dem im Leervolumen 22 gehaltenen Volumen gleich ist, abzugeben, um für maximale Reduktion der Teilchen in der zur/zum Assayvorrichtung oder -medium übertragenen Probe zu sorgen.
Eine alternative Applikatorkonstruktion ist in Fig. 2 dargestellt. Das Applikatorrohr 30 ist Applikatorrohr 12 ähnlich konstruiert und enthält eine Filtermatrix 32. Das Applikatorrohr 30 umfaßt jedoch keinen Vakuumkolben und endet stattdessen mit einem offenen Flansch 34 am offenen Ende gegenüber der Filtermatrix 32. Der Flansch 34 kann in eine Öffnung 36 an einer Vakuumvorrichtung 38 eingefügt werden, die Teil eines automatisierten ssaygeräts ist. Die Vakuumvorrichtung 38 umfaßt, wie schematisch veranschaulicht, einen Spritzenkolben 40, der auf einem Spritzenzylinder 42 mit einem Hebel 44 mit Kraftantrieb montiert ist, um den Kolben 40 nach oben und unten hin- und herzubewegen. Es ist klar, daß, wenn sich das Rohr 30 innerhalb der öffnung 36 in Position befindet, wie in strichlierter Linie dargestellt, der Spritzenkolben auf herkömmliche Weise Fluid hinauf in das Rohr 30 ziehen und Fluid aus dem Rohr austreiben kann.
Die Konstruktion des automatisierten Assaysystems kann selbstverständlich stark variieren, und es wird davon ausgegangen, daß das offene Ende des Rohres 30 ausgebildet sein kann, um mit einer großen Vielzahl von Vakuumvorrichtungen in unterschiedlichen automatisierten Assaygeräten zusammenzupassen.
Beispielhafte automatisierte Assaygeräte werden in den US-PS-4,087,248 und 4,447,578 geoffenbart. Eine Anzahl von anderen kompatiblen Assaysystemen ist im Handel erhältlich.
Wenn es in ein automatisiertes Assaysystem aufgenommen wird, kann es wünschenswert sein, die innere Oberfläche des Applikatorrohres 30, insbesondere den über der Filtermatrix 32 angeordneten Abschnitt, mit einer immunologisch aktiven Substanz, wie Antikörper, Antigen und ähnlichem zu beschichten. Die Immobilisierung derartiger Substanzen darin ist ausführlich in der Patentund wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Auf diese Art kann ein/können bestimmte imunologische Bindungsschritt(e) des Assays gleichzeitig mit dem/den Probenübertragungsschritt(en) durchgeführt werden.
Eine weitere alternative Applikatorkonstruktion ist in Fig. 4 dargestellt. Der Applikator 60 ist aus einem Stück konstruiert, wobei der Vakuumkolben 68 und das Rohr 62 einstückig den Applikator bilden. Das Rohr 62 begrenzt ein inneres Lumen 64 und weist eine Filtermatrix 66 auf, die innerhalb des Lumens an einem Ende des Rohres gegenüber dem Vakuumkolben angeordnet ist. Das der Filtermatrix 66 nahe Ende ist normalerweise eben. Eine Füll-Leitung 72 kann wahlweise in diesem oder anderen Applikatoren gemäß vorliegender Erfindung eingeschlossen sein, um die Bestimmung des Proben- oder anderen Assaybestandteilvolumens zu unterstützen, das bei der praktischen Durchführung der Erfindung in den Applikator hinaufgesaugt wird.
Wenn das die Filtermatrix 66 umfassende Faserbündel in den einstückigen Applikator 60 eingefügt wird, wird es zweckmäßig durch das offene Ende 70 eingefügt.
Die Applikatoren gemäß vorliegender Erfindung können gemäß jeder Assayvorschrift verwendet werden, bei der die Verwendung eines Fluidtropfers vorgesehen ist oder die in einem automatisierten Assaygerät unter Einsatz abnehmbarer Pipettenspitzen für die Probenübertragung, Inkubation, das Ablesen oder ähnliches verwendet wird. Beispielsweise kann der Applikator 10 zum Übertragen flüssiger Probe von einem Probenreservoir, wie einer Probenschale, zu einem/-er Assaymedium oder -vorrichtung, wie einem Testrohr, einem Mikrotiternapf, einer Assaymembran oder ähnlichem verwendet werden. Ein spezielles Assayprotokoll, bei dem eine Membranassayvorrichtung eingesetzt wird, worin der Applikator gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt werden kann, wird in der US-PS-4,818,677 beschrieben.
Im allgemeinen ist die Assayvorrichtung fähig, den zu bestimmenden Analyten immunologisch zu binden, und der gebundene Analyt wird auf der Vorrichtung sichtbar gemacht, typischerweise durch Umsetzung mit enzymmmarkiertem Antikörper, der für den Analyten spezifisch ist, und Aussetzen an das Enzymsubstrat. Enzymsubstratsysteme, die fähig sind, ein gefärbtes Reaktionsprodukt zu erzeugen, werden in der Patent- und Wissenschaftsliteratur ausführlich beschrieben.
Biologische Assays erfordern häufig die Kombination eines oder mehrerer Reagenzien mit der Testprobe oder einem anderen flüssigen Assaybestandteil im Verlauf des Assays. Bisher war(en) für die Reagenshinzufügung im allgemeinen (ein) diskrete(r) Additionsschritt(e) erforderlich, der/die zu geeigneten Zeitpunkten während des Assays durchgeführt wurde(n). Während das sicherlich machbar war, erhöhte jeder zusätzliche Assayschritt die Assaykomplexität, die zur Durchführung der Assays erforderliche Zeit und die Wahrscheinlichkeit, daß Verunreinigungen und Fehler in das Endprodukt eingebracht werden. Es wäre daher wünschenswert, Reagenskombination(en) gleichzeitig mit dem Übertragen von flüssiger Probe oder anderem flüssigen Assaybestandteil durchzuführen, wodurch die Anzahl an tatsächlich beteiligten Assayschritten verringert wird, mit einer damit einhergehenden Reduktion der Zeit und Mühe, die zur Durchführung des Assays erforderlich sind.
Daher schafft die vorliegende Erfindung weiters einen neuen Applikator zum Einbringen eines Reagens in eine flüssige biologische Probe oder einen anderen flüssigen Assaybestandteil. Der Applikator umfaßt eine integrale durchlässige Matrix (üblicherweise einen Filter, wie oben beschrieben) mit einem darin dispergierten Reagens. Wenn eine flüssige Probe oder ein Assaybestandteil durch die durchlässige Matrix hindurch und in den Applikator gezogen wird, wird der Reagensbestandteil mit der Probe und dem anderen flüssigen Assaybestandteil zusammengeführt und in diese(n) freigesetzt. Die Probe und das Reagens werden daraufhin durch die durchlässige Matrix in ein(e) Assaymedium oder -vorrichtung, wie ein Testrohr, einen Mikrotiternapf, eine Assaymembran oder ähnliches abgegeben. Somit wird die Anzahl an Schritten im Assay verringert, da die Anforderung des Ausmessens und Hinzufügens (wie durch Tropfenzählen) von Reagens zur Probe oder anderem Ässaybestandteil oder von Probe und/oder Reagens zum/zur Assaymedium oder -vorrichtung vor oder nach der Übertragung der Probe ausgeschaltet wird.
Gemäß vorliegender Erfindung umfaßt der Applikator zur Verwendung beim Einbringen eines Reagensbestandteils in eine flüssige Probe oder einen anderen Assaybestandteil ein Rohr, das ein inneres Lumen begrenzt, eine innerhalb des Lumens an einem Ende des Rohres angeordnete durchlässige Matrix und ein innerhalb der durchlässigen Matrix dispergiertes Reagens. Der Applikator umfaßt weiters eine Einrichtung zum Einsaugen von Probe in das Rohr und Austreiben von Probe aus dem Rohr. Die Einrichtung kann einen Vakuumkolben am anderen Ende des Rohres umfassen, sodaß sie auf eine Art verwendet werden kann, die der Verwendung eines herkömmlichen Fluidtropfers bei der Übertragung von flüssigen Proben oder anderen Bestandteilen bei der Durchführung von Assays ähnlich ist. Alternativ dazu kann das andere Ende des Applikators zum Montieren an einer Vakuumquelle ausgebildet sein, die Teil einer automatisierten Assayvorrichtung ist. Im allgemeinen hat der Applikator die allgemeine Konstruktion, wie in den Fig. 1, 2, 3 und 4 dargestellt.
Die durchlässige Matrix 16, 32 oder 66 wird aus jenen Materialien ausgewählt, die das Reagens reversibel einschließen können, es jedoch nicht irreversibel binden, während das Hindurchgehen des flüssigen Bestandteils zugelassen wird, sodaß, wenn der flüssige Bestandteil durch die Matrix hindurchgeht, das Reagens freigesetzt wird. Die durchlässige Matrix wird üblicherweise aus Filtermaterialien wie oben beschrieben gebildet, einschließlich Zelluloseacetaten, gebundener oder ungebundener Polyester, Polyacrylnitrilen, Nylon, Baumwolle und jeglichem anderen künstlich hergestellten oder natürlichen faserigen oder porösen Materials, das den obigen Kriterien entspricht (oder so modifiziert werden kann, daß es ihnen entspricht). Außerdem kann die durchlässige Matrix aus einer Vielzahl anorganischer Materialien gebildet sein, einschließlich Keramik, Gläsern, Silikas und ähnlichem, die zu porösem Substrat geformt werden können, typischerweise durch Sintern. Wenn es gewünscht wird, daß die durchlässige Matrix auch fähig ist, Teilchen zu entfernen, muß die durchlässige Matrix auch diese Filtereigenschaften aufweisen, wie zuvor hierin besprochen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Matrizen aus poly(Äthylenterephthalat) gebildete Filtermatrizen, das ein Polyester mit der empirischen Formel (C&sub1;&sub0;H&sub8;O&sub4;)n ist. Andere bevorzugte Materialien umfassen Zelluloseacetate und Polyacrylnitrile
Das Volumen oder die Masse der durchlässigen Matrix 16 oder 32 im Rohr 12 oder 30 hängt von den physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften des speziellen Matrixmaterials, den Abmessungen des Applikators und dem speziell zu verwendenden Reagens und seinem Volumen ab, sowie dem Volumen der Probe oder eines anderen flüssigen Bestandteils, die/der zu behandeln ist. Üblicherweise wird ausreichend durchlässiges Matrixmaterial vorgesehen, um rasche und gleichmäßige Übertragung des Reagensbestandteils in die Probe oder andere Flüssigkeit zu fördern. Das Matrixvolumen sollte jedoch nicht so groß sein, daß es zu inakzeptablem Aufhalten von Probe oder anderer Flüssigkeit in der Matrix führt. Die Höhe der durchlässigen Matrix in der beispielsweisen Rohrausführungsform variiert üblicherweise im Bereich von 0,25 bis 5 cm, häufiger im Bereich von 0,5 bis 1,5 cm.
Das Reagens kann jede Substanz sein, die mit dem Analyten, der Probenflüssigkeit oder anderem flüssigen Assaybestandteil reagieren oder auf andere Weise interagieren kann. Derartige Reagenzien können ausgewählt werden, sind aber nicht darauf beschränkt, aus Salzen; Puffersalzen; freien monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern; monoklonalen oder polyklonalen Antikörperkonjugaten; freien Proteinen; kolloidalen Suspensionen; Perlenstrukturen; Antigenen; Haptenen; Kofaktoren; Aktivatoren; Scavengern; Inhibitoren; Stabilisatoren; Tensiden; und Markern, wie Enzymen, Farbstoffen, fluoreszierenden Mitteln, chemilumineszierenden Mitteln, Spinmarkierungen, Radionukliden, Biotin, Avidin und ähnlichen. Derartige Reagenzien und ihre Verwendung werden ausführlich in der Patent- und Wissenschaftsliteratur beschrieben. Eine umfassende Liste einiger der möglichen Reagenzien wird in der US-PS-4,391,904 angeführt. Das Reagens kann ein Reagens oder eine Mischung aus Reagenzien umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Reagens eine immunologisch aktive Substanz, wie Antikörper, Antigen oder ähnliches, die fähig ist, den Analyten spezifisch zu binden oder kompetitiv an den Analyten zu binden.
Der Reagensbestandteil kann durch jedes geeignete Verfahren in die durchlässige Matrix eingebracht werden. Wünschenswert führt das Verfahren zur im wesentlichen gleichmäßigen Dispersion des Reagens über die gesamte Filtermatrix. Beispielsweise kann die durchlässige Matrix vorgesättigt werden, indem vor dem Einfügen der Matrix in dasApplikatorrohr der Matrix flüssiger Reagensbestandteil hinzugefügt wird. Alternativ dazu kann der Reagensbestandteil auf die durchlässige Matrix aufgebracht werden, nachdem die Matrix im Rohr angeordnet ist, indem eine enge Pipette mit Reagens in der Spitze 20 eingefügt und Vakuum oder Kapillarwirkung eingesetzt wird, um das Reagens von der Pipette in die Filtermatrix zu ziehen. Eine vierte Alternative bestünde darin, ein Vakuumsystem einzusetzen, um flüssiges Reagens in die Applikatorspitze zu ziehen (wie allgemein in der US-PS-4,087,248 beschrieben), oder positiven Druck einzusetzen, um flüssiges Reagens in die Spitze zu drängen (wie allgemein in der US-PS-4,447,578 beschrieben). Es ist auch möglich, Festphasenreagenzien in das Matrixmaterial einzubringen, typischerweise durch das Kombinieren in einer flüssigen Aufschlämmung nach einer der soeben beschriebenen Techniken. Ein weiteres Verfahren kann darin bestehen, eine Injektionsnadel in die Spitze 20 einzuführen, die das Reagens enthält, und das Reagens in die Filtermatrix zu injizieren.
Der Reagensbestandteil in der durchlässigen Matrix kann in einer Vielzahl von Formen vorhanden sein, einschließlich getrockneten (durch Luft oder Vakuum), lyophilisierter, in Pelletform (vorzugsweise eine Vielzahl von diskreten Pellets, die gleichmäßig in der gesamten Matrix dispergiert sind), in Suspension oder Emulsion, in einem Gel oder in einer stabilen flüssigen Form. Flüssige Reagenzien werden typischerweise in der Matrix absorbiert, während Feststoffe innerhalb der Matrix physikalisch eingeschlossen oder absorbiert werden.
Die vorliegende Erfindung ist nützlich zum Einbringen einer großen Vielzahl von Reagenzien in so gut wie jeden Typ von biologischer Probe, die flüssig ist oder die verflüssigt werden kann. Das Reagens wird durch das Kombinieren mit einer flüssigen Probe (oder einem anderen flüssigen Assaybestandteil) rekonstituiert, wenn die Flüssigkeit durch die durchlässige Matrix in dem Applikator gesaugt wird. Die große Oberfläche innerhalb der Matrix, über die das Reagens vorzugsweise dispergiert ist, ermöglicht das rasche Rekonstituieren von Reagens und gründliches Mischen mit Probe oder anderer Flüssigkeit.
Das bevorzugte Verfahren gemäß vorliegender Erfindung zum Einbringen eines Reagens in eine flüssige biologische Probe oder anderen Assaybestandteil umfaßt:
das Ziehen von zumindest einer Teilmenge der flüssigen Probe oder des Assaybestandteils aus einem Reservoir in das Applikatorrohrlumen durch die durchlässige Matrix hindurch, wodurch das Reagens durch die flüssige Probe rekonstituiert und mit ihr gemischt wird; und
das Abgeben der/des kombinierten flüssigen Probe und Reagens aus dem Lumen des Applikatorrohrs an ein(e) Assaymedium oder -vorrichtung durch die durchlässige Matrix hindurch in einer Fließrichtung, die der entgegengesetzt ist, in der die flüssige Probe in das Applikatorrohr gezogen wurde.
Bei einer bevorzugteren Ausführungsform der Erfindung wird das Mischen weiter verstärkt, indem Luft in Form von Blasen in die Probe/Reagens-Lösung im Lumen des Applikatorrohres eingebracht wird. Dieser Vorgang bewirkt, daß Blasen durch die Probe/Reagens-Lösung perkolieren, sodaß die Mischeffizienz und Reaktionskinetik verbessert wird, um eine raschere Reaktion zu ermöglichen. Das kann erreicht werden, indem Luft durch die durchlässige Matrix hinter dem gemessenen Probevolumen gezogen wird. Luft kann auch eingebracht werden, indem eine Membran 50 (Fig. 3) an einer Füll-Leitung quer über dem Applikatorrohr 12 angeordnet wird, welche Membran Luft aber keine Flüssjgkeit durchläßt, sobald sie benetzt ist. Die Membran 50 läßt nur das gewünschte Probenvolumen in den Applikator eintreten, läßt aber das Hinzufügen von hindurchgehenden Luftmengen zu, sobald die Applikatorspitze 20 von der Probe entfernt wird. Die gleiche Wirkung kann mit einer undurchlässigen Barriere erreicht werden, die eine oder mehrere kleine Öffnungen aufweist, die eine solche Größe haben, daß das Hindurchtreten von Luft, nicht aber von Probe ermöglicht wird.
Daher kann das erfindungsgemäße Verfahren weiters das Einbringen von Luft in der Form von Blasen in die Probe/Reagens-Lösung vor dem Abgeben der Probe und des Reagens vom Applikatorrohr an das Assaymedium oder die -vorrichtung umfassen.
Die Applikatoren gemäß vorliegender Erfindung, die ein Reagens in der durchlässigen Matrix enthalten, können gemäß jeder Assayvorschrift verwendet werden, bei der ein Schritt des Einbringens eines Reagens in eine flüssige Probe oder einen anderen flüssigen Assaybestandteil vorgesehen ist. Die Verwendung des Applikators gemäß vorliegender trfindung ermo glicht die Kombination eines Flüssigkeitsübertragungsschritts mit einem oder mehreren Reagenshinzufügungschritten, wodurch die Gesamtzahl an Schritten, die zur Durchführung einer speziellen Assayvorschrift erforderlich sind, verringert wird. Darüberhinaus sorgt das Hinzufügen von Reagens im Applikator häufig für verstärktes Mischen des Reagens, was die Zeit verringern kann, die zur Durchführung eines Assayprotokolls und/oder der Steigerung der Genauigkeit des Assays erforderlich ist. Bei Verwendung in einem Assay, bei dem das Reagens eine immunologisch aktive Substanz ist, wird der Schritt der immunologischen Bindung des Assays typischerweise gleichzeitig mit dem Probenübertragungsschritt durchgeführt. Beispielsweise kann Analyt an das immunologische Reagens gebunden werden, wenn die Probe von einem Probenreservoirmedium zu einem/einer Assaymedium oder -vorrichtung übertragen wird.
Im allgemeinen ist die Assayvorrichtung fähig, den gebundenen Analyten visuell oder auf andere Art festzustellen. Beispielsweise wird gebundener Analyt auf der Vorrichtung sichtbar gemacht, typischerweise durch Umsetzung mit enzymmarkiertem Antikörper, der für den Analyten spezifisch ist, und Aussetzung an Enzymsubstrat. Enzymsubstratsysteme, die zur Herstellung eines gefärbten Reaktionsprodukts fähig sind, werden in der Patent- und Wissenschaftsliteratur ausführlich beschrieben. Eine besonders bevorzugte Assayvorrichtung ist in der US-PS-4,818,677 beschrieben.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung.

VERSUCHE

Beispiel 1:

Ein Applikator, wie in Figur 1 dargestellt, wurde mit einer Länge von 7,2 cm und einem Innendurchmesser von 0,53 cm hergestellt. Die Filtermatrix bestand aus Poly(äthylenterephthalat)fasern mit einer Länge von 2 cm und einem Durchmesser von etwa 15 um bei einer Dichte von 2,5x10&sup5; Fasern/cm². Am oberen Ende des Rohres war ein Fluidtropferkolben vorgesehen.
hCG-positiver Harn wurde mit hCG-negativem Harn auf eine ungefähre Konzentration von etwa 50 mIE/mL hCG (WHO First IRP Standard) verdünnt. Der Harn wurde einem Quantifizierungsassay auf hCG unterworfen, bevor und nachdem er aus dem Applikator gezogen und abgegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargelegt. Tabelle 1 hCG-Konzentration Vor dem Filtrieren Nach dem Filtrieren Proteinverlust
So führte der Filter zu keinem wesentlichen Verlust an hCG von der Probe.

Beispiel 2

Der Applikator von Beispiel 1 wurde verwendet, um Membranassays in 6 Proben frischen Morgenharns durchzuführen, die frei von hCG waren. Das Membranassay waren RAMP hCG-Assays, die von Monoclonal Antibodies, Inc., Mountain View, California, erhältlich waren. Vergleichsassays wurden mit herkömmlichen Fluidtropfern ohne Filtermatrix durchgeführt. In beiden Fällen wurde der Applikator oder Fluidtropfer verwendet, um frische Probe von einer Sammelschale zur Membran zu übertragen. Die Zeit, die erforderlich war, damit die Probe durch die Membran absorbiert wird, wurde für jede Probe sowohl für den Applikator als auch den Tropfer aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angeführt. TABELLE 2 Absorptionszeit (Sekunden) Probe Nr. Applikator Fluidtropfer (ohne Filter) 1 durchschnittlich zwei Tests, erster Tropfen entfernt 2 erster Tropfen nicht entfernt. ND: nicht durchgeführt
Wie aus den obigen Ergebnissen zu erkennen ist, wird mit dem erfindungsgemäßen Applikator eine wesentliche Verbesserung der Fließeigenschaften der Harnproben erreicht.

Beispiel 3

Zwei für unterschiedliche und nichtüberlappende Epitope auf dem hCG-Antigen spezifische Antikörper, jeder Antikörper an die Enzymalkaliphosphatase konjugiert, wurden in einem Verdünner (0,05 M Tris, 0,1M NaCl, 0,001M MgCl&sub2;) zusammengemischt und auf pH 7,4 ("hCG-Konjugat") eingestellt.
Ein Applikator wurde wie in Beispiel 1 hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Filtermatrix aus Fasern mit einer Länge von 1 cm bestand. Oben hergestellte hCG-Antikörperkonjugatlösung (25 uL) wurde dem Filter durch das Einfügen einer die Konjugatlösung enthaltenden Pipette durch die verjüngte Spitze des Applikators und Anwenden von Vakuum hinzugefügt. hCG-positiver Harn (400 uL) wurde dann aus einem Probenbehälter durch die Filtermatrix in den Applikator gezogen, und der Applikator wurde vom Probenbehälter entfernt, woraufhin der Kolben losgelassen wurde, um zu ermöglichen, daß Luftblasen durch die Filtermatrix in den Applikator eintreten. Der Inhalt des Applikators wurde 30 Sekunden lang im Rohr inkubiert und dann auf eine Membran aufgebracht, die aus Nylon zwischen zwei Pellonschichten bestand, an der an der Deckschicht ein Antikörper immobilisiert worden war, der für ein drittes nichtüberlappendes Epitop auf dem hCG-Antigen spezifisch war. Der Inhalt wurde auf der Membran 1 Minute lang inkubiert. Ein chromogenes Material, das ein blaues Reaktionsprodukt erzeugt, wenn es alkalischer Phosphatase ausgesetzt wird ("Waschen/Substrat"; 6 Tropfen) wurde dem Kissen hinzugefügt, die Reaktionsmischung wurde 3 Minuten lang inkubiert und dann wurde eine Lösung hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen ("Stop"; 4 Tropfen). Die Ergebnisse zeigten einen deutlichen, gut gefärbten blauen Fleck auf der Membran ohne Hintergrund.
Das obige Verfahren wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß keine fnkubation des Inhalts des Applikators vor dem Abgeben des Inhalts auf die Membran erfolgte. Der Inhalt wurde auf der Membran 10 Sekunden lang inkubiert, und die Behandlung wurde wie oben fortgesetzt. Die Ergebnisse ergaben einen helleren blauen Fleck und einen sauberen Hintergrund.

Beispiel 4:

Dem Filter eines Applikators wie in Beispiel 3 wurden 50 uL einer 1:1 Mischung aus Glycerin:hCG-Konjugat hinzugefügt. Der beladene Applikator wurde 5 Tage lang bei Raumtemperatur gehalten. 250 mIU/mL hCG-Harn (500 uL) wurden dann in den Applikator aufgezogen, gefolgt von Luft, und 30 Sekunden lang inkubiert. Der Inhalt wurde auf eine Membran abgegeben, wie in Beispiel 3, 10 Sekunden lang inkubiert und wie in Beispiel 3 behandelt. Ein blauer Fleck mit guter Farbintensität war das Ergebnis.

Beispiel 5

Lyophilisiertes Konjugat wurde folgendermaßen hergestellt: Um das Auflösen zu unterstützen und als Schutz während des Einfrierens wurde eine Lösung aus 2 mg/mL proteasefreiem BSA, 10% Mannit 1:1 mit hCG-Konjugat von Beispiel 3 gemischt. Diese Lösung (70 uL) wurde einem Applikator hinzugefügt, wie in Beispiel 3, und der Applikator wurde in ein Lyophilisierungsglas gegeben und über Nacht bei -80ºC gehalten, woraufhin er lyophilisiert und bei Raumtemperatur 3 Tage lang gelagert wurde.
Ein zweiter Applikator mit Filter, der Glycerin-hCG-Konjugat-Mischung (70 uL) enthielt, wurde wie in Beispiel 4 hergestellt und bei Raumtemperatur 5 Tage lang gelagert.
Etwa 500 uL 250 mIU/mL-hCG-Harn wurde in jeden der beiden obigen Applikatoren gezogen, gefolgt von Luft, woraufhin die Lösung im Applikator sofort ohne Inkubationszeit auf das Membrankissen abgegeben wurde. Sobald jede Probe fertig in das Kissen absorbiert worden war, wurde Waschen/Substrat ohne vorhergehende Inkubation hinzugefügt. Die Probe wurde dann 3 Minuten lang inkubiert, woraufhin die Reaktion gestoppt wurde.
Sowohl das lyophilisierte als auch das glycerinhältige Konjugat ergaben positive Ergebnisse, wobei das lyophilisierte Konjugat eine hellere Farbreaktion erzeugte.

Beispiel 6

Nach dem Verfahren von Beispiel 3 wurden 25 uL hCG-Konjugat einem Filter in einem Applikator hinzugefügt. Ebenso wurde ein Filter in einem anderen Applikator mit 50 uL 1:1 Glycerin:hCG-Konjugat beaufschlagt.
Dem in Beispiel 5 beschriebenen verkürzten Assayverfahren folgend wurde jeder der beiden Applikatoren mit 250 mIU/mL hCG-Harn (500 uL) beaufschlagt und bearbeitet. Konjugate von beiden Applikatoren ergaben positive Ergebnisse.

Claims

1. Verfahren zum Einbringen eines Reagens in einen flüssigen Assaybestandteil, wobei im Verfahren ein Applikatorrohr eingesetzt wird, das an einem Ende davon eine innere durchlässige Matrix umfaßt, die das Reagens innerhalb der Matrix dispergiert aufweist, wobei das genannte Verfahren umfaßt:

das Einsaugen zumindest einer Teilmenge des flüssigen Assaybestandteils aus einem Reservoir in das Applikatorrohr durch die durchlässige Matrix hindurch, wodurch das Reagens durch den flüssigen Assaybestandteil rekonstituiert und mit diesem gemischt wird;

das Abgeben des flüssigen Assaybestandteils und Reagens aus dem Applikatorrohr in ein(e) Assaymedium oder -vorrichtung durch die durchlässige Matrix hindurch in einer Fließrichtung, die jener entgegengesetzt ist, in der der flüssige Assaybestandteil in das Applikatorrohr eingesaugt wurde.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das weiters das Saugen von Luft durch die durchlässige Matrix hindurch umfaßt, nachdem ein vorherbestimmtes Volumen an flüssigem Bestandteil in das Rohr eingesaugt worden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die durchlässige Matrix aus einem Fasermaterial besteht, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyester, Zelluloseacetat, Polyacrylnitril und poly(Äthylenterephthalat) besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Reagens in flüssiger Form vorliegt und innerhalb der Matrix adsorbiert ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Reagens in fester Form vorliegt und innerhalb der Matrix physikalisch eingeschlossen oder adsorbiert ist.

6. Applikator zum Einbringen eines Reagens in einen flüssigen Assaybestandteil, wobei der genannte Applikator umfaßt:

ein Rohr, das ein inneres Lumen begrenzt;

eine flüssigkeitsdurchlässige Matrix, die innerhalb des Lumens im wesentlichen an einem Ende des Rohres angeordnet ist;

ein Reagens, das innerhalb der Filtermatrix dispergiert ist, wobei das genannte Reagens in einer Form vorliegt, die mit dem flüssigen Assaybestandteil kombiniert, wenn es diesem ausgesetzt ist; und

Einrichtungen zum Einsaugen des flüssigen Assaybestandteils in das Rohr durch die durchlässige Matrix hindurch und Austreiben der Flüssigkeit aus dem Rohr durch die durchlässige Matrix hindurch in entgegengesetzter Fließrichtung, wodurch das genannte Reagens mit dem genannten flüssigen Assaybestandteil kombiniert und abgegeben wird.

7. Applikator nach Anspruch 6, worin die durchlässige Matrix aus einem Fasermaterial besteht, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Polyester, Zelluloseacetat, Polyacrylnitril, poly(Athylenterephthalat) besteht.

8. Applikator nach Anspruch 6, worin das Reagens in flüssiger Form vorliegt und innerhalb der Matrix adsorbiert wird.

9. Applikator nach Anspruch 6, worin das Reagens in fester Form vorliegt und innerhalb der Matrix physikalisch eingeschlossen oder adsorbiert ist.

10. Verfahren zum Bestimmen eines Analyten in Probe unter Verwendung einer Assayvorrichtung, die fähig ist, den genannten Analyten immunologisch zu binden, wobei das genannte Verfahren umfaßt:

das Sammeln einer flüssigen Probe in einem Reservoir;

das Einsaugen von zumindest einer Teilmenge der flüssigen Probe aus dem Reservoir in ein Applikatorrohr, das eine innere durchlässige Matrix an einem Ende davon aufweist, wobei die durchlässige Matrix ein immunologisch aktives Reagens darin dispergiert aufweist, wodurch Analyt sich an das Reagens in der flüssigen Phase binden kann;

das Abgeben des flüssigen Bestandteils, der gebundenes Analyt-Reagens darin aufweist, aus dem Applikatorrohr an die Assayvorrichtung durch die Matrix in einer Fließrichtung, die der entgegengesetzt ist, in der die Flüssigkeit in das Applikatorrohr eingesaugt wurde; und

das Sichtbarmachen des gebundenen Analyten an der Assayvorrichtung.