DE69423896T2 - Testvorrichtung mit gefangenem teilchen-reagens - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft eine Testvorrichtung zur Verwendung bei dem Nachweis eines Analyts in einer flüssigen Probe, und im besonderen eine Vorrichtung, welche ein gefangenes Teilchen-Reagens aufweist, zur Verwendung bei dem Analytnachweis.
- Eine Anzahl verschiedener Festphasenuntersuchungstests zum Nachweis oder zur Quantifizierung von Lösungsanalyten wurde vorgeschlagen. In einem typischen Test dieses Typs wird eine Testlösung zu einem Festphasenreagens hinzugefügt, welches mit Ligandenmolekülen beschichtet ist, die fähig sind, spezifisch an den Analyten zu binden, oder mit Molekülen, die mit dem Analyt um die Bindung an Reportermarkierte Anti-Ligandenmoleküle kompetitieren können. Nach Inkubation unter Bindebedingungen wird das Festphasenreagens gewaschen, um ungebundenes Probenmaterial zu entfernen, und "entwickelt", um den Nachweis des Analyts oder der mit dem Analyt kompetitierenden Moleküle, die an das Reagens gebunden sind, zu ermöglichen.
- In einer allgemeinen Testausgestaltung ist das Festphasenreagens eine Platte oder eine Vorrichtung mit vielen Vertiefungen, die eine Anzahl von Oberflächen aufweisen, welche beschichtet sind, z. B. durch chemische Derivatisierung, mit Ligandenmolekülen. In einer anderen allgemeinen Ausgestaltung ist das Festphasenreagens ein Kügelchen oder Teilchen, welches mit Ligandenmolekülen beschichtet ist. Das Kügelchen wird normalerweise in eine Vertiefung eingebracht, wobei die verschiedenen Lösungszusatz- und -entfernungsschritte, die in einem Testverfahren vorkommen, durch vorsichtigen Lösungstransfer in die Vertiefung hinein und aus der Vertiefung heraus durchgeführt werden.
- Ein Vorteil von ligandenbeschichteten Teilchen in einem Festphasenimmunotest ist es, dass die Teilchen wesentlich einfacher als ligandenbeschichtete Vertiefungen oder Oberflächen in größerer Zahl und mit größerer Einheitlichkeit hinsichtlich der Ligandenbeschichtungsdichte hergestellt werden können. Ein anderer Vorteil ist es sowohl wegen der Krümmung des Teilchens als auch, falls das Teilchen optisch transparent ist, wegen der Möglichkeit, Reportermoleküle sowohl auf der Vorder- als auch auf der Rückseite des Teilchens nachzuweisen, dass die Oberflächenkonzentration von nachweisbaren analytbezogenen Reportermolekülen auf einem Teilchen effektiv höher als auf einer ebenen Oberfläche ist.
- Es wäre wünschenswert, eine Testvorrichtung bereitzustellen, bei der ligandenbeschichtete Teilchen oder Kügelchen verwendet werden, um die oben diskutierten Vorteile auszunutzen, und welche ebenso eine einfache Herstellung, Fangen des Kügelchens und Flexibilität bei dem Ausgestalten eines Systems zur Bestimmung einer ausgewählten Gruppe von Analyten erlaubt.
- DE-A-34 28 953 offenbart ein Teströhrchen zur Bestimmung der Konzentration einer Substanz in einer Flüssigkeit, welche z. B. durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion dazu gebracht werden kann, an ein Trägerelement in den Teströhrchen zu binden. Zwischen dem Boden des Teströhrchens und dessen offenem Ende ist eine Begrenzung längs der Querschnittsfläche eingeführt. Wenn das Teströhrchen geleert wird, kann daher die Flüssigkeit herausrinnen, aber das Trägerelement wird zurückgehalten und verbleibt in dem Teströhrchen.
- US-A-5 171 537 offenbart eine aktivierte immunodiagnostische Pipettenspitze. Die Spitze weist zwischen ihrem Ende liegend mindestens zwei axial angeordnete Vorsprünge auf, die an der Wand ihrer axialen Bohrung gebildet sind, um sich radial auszudehnen und in die Bohrung hervorzuragen, um dazwischen eine Reaktionskammer in der Bohrung der Spitze zu definieren. In der Reaktionskammer ist ein kugelförmiges Rezeptorelement angebracht für eine begrenzte pulsierende Bewegung hierin als Reaktion auf die Bewegung der Flüssigkeitsprobe in die Spitze hinein und aus der Spitze heraus. Das kugelförmige Element ist mit einem Liganden beschichtet, welcher eine spezifische Affinität für ein Zielmolekül in der Probe aufweist.
- Entsprechend einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird eine Testvorrichtung zur Verwendung bei dem Nachweis eines Analyts in einer flüssigen Probe bereitgestellt, umfassend: Wandmittel; die eine. Vertiefung umschließen, welche eine Bodenwand und eine höhergelegene Öffnung haben; mindestens ein Teilchen, welches oberflächengebundene Ligandenmoleküle für die Verwendung bei dem Analytnachweis hat; und flexible Rückhaltemittel, die an diese Wandmittel angefügt sind, für das Zurückhalten dieses Teilchens in einer gefangenen Position innerhalb dieser Vertiefung, wenn das Rückhaltemittel in nicht deformiertem Zustand ist, wobei das Rückhaltemittel deformierbar ist, um so dem Teilchen in die Vertiefung Einlass zu gewähren.
- Entsprechend einem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt ein Lochplattentest für den Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend: eine Vielzahl von Wandmitteln, wobei jedes davon eine Vertiefung umschließt, die eine Bodenwand, eine höhergelegene Öffnung und eines oder mehr Ablenkmittel hat, welche(s) die Vertiefung von einer oder mehreren angrenzenden Vertiefungen trennen bzw. trennt, wobei diese Ablenkmittel aus überlappenden Wandanteilen gebildet sind, welche eine Lichtdurchlässigkeit verhindern, aber Flüssigkeitsfluss zwischen solchen benachbarten Vertiefungen erlauben; in jeder Vertiefung ein Teilchen, welches oberflächengebundene Ligandenmoleküle für die Verwendung bei dem Analytnachweis hat; und in jeder Vertiefung flexible Rückhaltemittel, die an diese Wandmittel zum Zurückhalten des assoziierten Teilchens in einer gefangenen Position innerhalb der Vertiefung angefügt sind, wenn das Rückhaltemittel in nicht deformiertem Zustand ist, wobei das Rückhaltemittel deformierbar ist, um dem Teilchen Einlass in die Vertiefung zu gewähren.
- Entsprechend einem dritten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt ein Verfahren zur Ausführung einer Vielzahl von diagnostischen Festphasentests für ausgewählte Analyte, umfassend:
- (a) Einbringen in eine vorbestimmte Pärtikelvetteilungskorrelation:
- (i) einer Testanordnung, die eine Vielzahl von Testvertiefungen, die durch Wandmittel definiert sind, und flexible Rückhaltemittel, die an die Wandmittel angefügt sind, um ein Teilchen in einer gefangenen Position innerhalb dieser Vertiefung zurückzuhalten, wenn das Rückhaltemittel in nicht deformiertem Zustand ist, aufweist, wobei das Rückhaltemittel deformierbar ist, um dem Teilchen Einlass in die Vertiefung zu gewähren, und
- (ii) einer Teilchenverteilungsvorrichtung, die eine Vielzahl von Patronen besitzt, wobei jede Teilchen ent hält, die mit einem ausgewählten Liganden beschichtet sind,
- (b) Verteilen eines Teilchens aus einer oder mehreren dieser Patronen in eine oder mehrere ausgewählte Vertiefungen in dieser Anordnung;
- (c) Zwingen eines jeden verteilten Teilchens in die gefangene Position in der entsprechenden Vertiefung;
- (d) Wiederholen der Stufen (a) bis (c), bis Teilchen in einer Vielzahl von Vertiefungen verteilt und gefangen wurden; und
- (e) Durchführen eines diagnostischen Tests in jeder der Partikel-enthaltenden Vertiefungen.
- In einer allgemeinen Ausführungsform umfasst die flexible Rückhaltestruktur mindestens einen und vorzugsweise drei flexible(n) fingerförmige(n) Vorsprung bzw. Vorsprünge, angeordnet zwischen der Bodenwand und der Öffnung der Vertiefung, wobei mindestens einer der Vorsprünge eine nach innen gerichtete Sperre aufweist, die so ausgestaltet ist, dass sie das Teilchen in einer gefangenen Position hält, mit den Fingern in nicht deformiertem Zustand. In einer verwandten Ausführungsform umfasst mindestens einer der flexiblen fingerförmigen Vorsprünge weiterhin eine zweite Sperre, die so positioniert und ausgestaltet ist, dass sie mit der zuerst erwähnten Sperre zusammenarbeitet, um das Teilchen in einer erhöhten Position über der Bodenwand in der Vertiefung zu halten.
- In einer anderen allgemeinen Ausführungsform ist das Teilchen ein Torus mit einer zentralen Öffnung, und die flexible Rückhaltestruktur ist eine Röhre, die von dieser Bodenwand aufragt, einen erweiterten distalen Anteil hat, welcher zusammendrückbar ist, um die Aufnahme der Teilchenöffnung auf diese Röhre zu erlauben.
- Ebenso umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform die Bodenwand einen Drainageanteil, über den Flüssigkeit aus der Vertiefung abgezogen werden kann, während das Teilchen in der Vertiefung gefangen ist.
- In einer Ausgestaltung sind die Vertiefungen in der Anordnung in einer Reihe angeordnet, wobei jedes Paar benachbarter Vertiefungen durch eines der Ablenkmittel getrennt ist. In einer anderen Ausgestaltung sind die Vertiefungen in der Anordnung um eine zentrale Öffnungsregion angeordnet, wobei jede Vertiefung von dieser Öffnungsregion durch eines der Ablenkmittel getrennt ist.
- In noch einem anderen Gesichtspunkt umfasst die Erfindung eine Testvorrichtung mit vielen Vertiefungen, die zum Analytnachweis ausgestaltet ist, basierend auf Chemilumineszensreaktionen, die in benachbarten Vertiefungen der Vorrichtung auftreten. Die Wände der Vorrichtung, die benachbarte Vertiefungen trennen, sind aus einem polymeren Material, welches 0,05 bis 0,5 Gew.-% Ruß enthält, gebildet.
- Diese und andere Aufgaben und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den beigefügten Figuren näher hervor.
- Fig. 1 zeigt einen perspektivischen Blick auf eine Platte, die Testanordnungen mit vielen Vertiefungen enthält, die in Übereinstimmung mit der Erfindung konstruiert sind;
- Fig. 2 zeigt einen Teil einer der in Fig. 1 gezeigten Anordnungen, gesehen von der Oberseite der Fig. 1;
- Fig. 3 ist eine vergrößerte Ansicht einer Vorrichtung mit einer einzelnen Vertiefung in der in Fig. 2 gezeigten Anordnung;
- Fig. 4 ist eine vergrößerte Schnittansicht einer Vorrichtung mit einer einzelnen Vertiefung, wobei der Schnitt entlang der Linie 4-4 in Fig. 3 geführt wird;
- Fig. 5A und 5B zeigen den Eintritt (5A) in die und das Zurückhalten (5B) eines Teilchens in der in Fig. 4 im Querschnitt gezeigten Vorrichtung;
- Fig. 6 ist eine Querschnittsansicht einer Vorrichtung mit einer einzelnen Vertiefung, wie die in Fig. 4 gezeigte, aber ausgestaltet zur Stützung eines Teilchens in einer erhöhten Position in der Vertiefung;
- Fig. 7A und 7B zeigen den Eintritt (7A) und die Rückhaltung (7B) eines torusförmigen Teilchens in einer Testvorrichtung mit einer einzelnen Vertiefung, die entsprechend einer zweiten allgemeinen Ausführungsform der Erfindung konstruiert ist;
- Fig. 8 zeigt eine Ansicht in der Ebene eines Teils einer Anordnung mit verbundenen Vertiefungen, welche eine lineare Anordnung der Vertiefungen aufweist;
- Fig. 9 zeigt eine Ansicht in der Ebene eines Teils einer Anordnung mit verbundenen Vertiefungen, welche eine Anordnung um eine zentrale Öffnung aufweist; und
- Fig. 10 ist eine schematische Ansicht zur Verdeutlichung eines Verfahrens zur Verteilung ausgewählter Analyten- Kügelchen in ausgewählte Vertiefungen in einer Testanordnung des oben beschriebenen Typs.
- Fig. 1 zeigt in perspektivischer Ansicht eine Platte 10, die so ausgestaltet ist, dass sie eine Vielzahl von Anordnungen mit vielen Vertiefungen hält, wie beispielsweise Anordnungen 12, 14, konstruiert in Übereinstimmung mit der Erfindung. In der gezeigten Ausführungsform ist die Platte so ausgestaltet, dass sie acht solcher Anordnungen hält. Die Platte und die geladenen Anordnungen sind so ausgestaltet, um in einer Ablesevorrichtung für einen Test mit vielen Vertiefungen verwendet zu werden, wie ein Lochplattenluminometer, welches so funktioniert, dass es die Platte in einer Weise bewegt, die automatisierte, sequentielle Lumineszensauswertungen von jeder Vertiefung erlaubt.
- Fig. 2 zeigt eine Ansicht in der Ebene eines Teils der in Fig. 1 gezeigten Anordnung 12. Die repräsentative Anordnung umfasst eine lineare Reihe von Testvorrichtungen, wie beispielsweise die Vorrichtungen 16 und 18, konstruiert entsprechend der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung ist vorzugsweise als ein einzelner gegossener Plastikartikel ausgebildet, wobei die individuellen Vorrichtungen in der Anordnung über ihre oberen angrenzenden Kanten verbunden sind, wie beispielsweise die angrenzenden Kanten 20 bzw. 22 in den Vorrichtungen 16 bzw. 18 (Fig. 2 und 3). In der gezeigten Ausführungsform umfasst die Anordnung 12 Testvorrichtungen, wodurch insgesamt 96 solcher Vorrichtungen in der vollständig beladenen Platte in Fig. 1 erhalten werden.
- Fig. 3 zeigt eine vergrößerte Ansicht in der Ebene von Vorrichtung 16 in Anordnung 12. Die gleiche Vorrichtung ist in Fig. 4 im Querschnitt gezeigt. Die Konstruktion der repräsentativen Vorrichtung 16 wird mit besonderer Bezugnahme auf diese beiden Figuren erläutert werden. Wie gesehen umfasst die Vorrichtung eine gestreckte Vertiefung 24, die durch eine rechteckige Wandstruktur oder Wandmittel 26 gebildet wird. Die obere Kante der Wandstruktur umschließt eine obere Vertiefungsöffnung 28. Der untere Anteil der Wandstruktur besitzt eine reduzierte Breite und Länge, welche eine tiefere Vertiefungsregion 30 umschließt, die die Bodenwand 32 aufweist. Die Seitenwände 34 bilden die tiefere Region. Die tiefere Vertiefungsregion umfasst einen teilchenaufnehmenden Anteil 32a und einen Flüssigkeitsentfernungsanteil 32b. Die Bodenwand ist geneigt, um es der Flüssigkeit in der Vertiefungsregion für einen noch zu beschreibenden Zweck zu erlauben, von Anteil 32a nach Anteil 32b zu fließen.
- Unter weiterer Bezugnahme auf die Fig. 3 und 4 umfasst die Vorrichtung 16 drei flexible, fingerförmige Vorsprünge, wie beispielsweise die Vorsprünge 36 und 38, die von der Bodenwand der Vertiefung aufwärts in Richtung der oberen Öffnung der Vertiefung aufragen. Jeder Vorsprung weist eine nach innen gerichtete Sperre auf, wie beispielsweise Sperre 40 im Vorsprung 36, welche an dessen freiem, d. h. oberen Ende, gebildet ist. Die Vorsprünge werden hier auch insgesamt als flexible Rückhaltemittel bezeichnet. Wie gezeigt bilden die drei Vorsprünge eine Einheit mit den Seitenwänden, die die tiefere Vertiefungsregion bilden, und umfassen den teilchenempfangenden Anteil der Vertiefungsregion.
- Entsprechend eines wichtigen Merkmals der Erfindung wird ein Testteilchen oder -kügelchen 42 in der Vorrichtung in einer gefangenen Position in der tieferen Vertiefungsregion aufgenommen durch das flexible Rückhaltemittel, welches in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel die drei flexiblen Fingervorsprünge umfasst. Das Kügelchen wird in der Vertiefung in einer leicht erhöhten Position auf einem Vorsprung 35, der auf dem Boden der Vertiefung gebildet wird, gehalten, um die Flüssigkeitszirkulation um die Teil chenoberfläche herum zu verstärken und um die Analytbindung an oberflächengebundene Ligandenmoleküle auf dem Kügelchen während eines Analyttests zu verstärken.
- Das Kügelchen ist vorzugsweise ein konventionelles Glas- oder Polymerkügelchen, an das biologische Testmaterialien, besonders oberflächengebundene Ligandenmoleküle, angefügt werden können. Typischerweise weisen die Kügelchen einen Durchmesser von zwischen etwa 1 bis 7 mm auf. Einzelheiten der Herstellung der Kügelchen und ihrer Rolle in einem Teilchentest werden unten angegeben.
- Die Fig. 5A und 5B zeigen die Aufnahme und Rückhaltung des Kügelchens 42 in Vorsprung 12. Wie gezeigt, ist die Größe des Kügelchens so, dass die drei Fingervorsprünge nach außen gezwungen werden, so dass der Eintritt des Kügelchens hinter die Fingervorsprungssperren (Fig. 5A) ermöglicht wird, aber das Aufsitzen des Kügelchens auf dem Boden der Vertiefung (Fig. 5B) ermöglicht wird. In der in Fig. 5B gezeigten gefangenen Position kann das Kügelchen frei rotieren und sich vertikal zwischen seiner Ruheposition auf dem Boden der Vertiefung (in Kontakt mit Vorsprung 35) und einer erhöhten Position in Kontakt mit den unteren Oberflächen der Fingervorsprungssperren bewegen.
- Die Konstruktion und die Größe der Vorrichtung ist vorzugsweise so, dass es möglich ist, Tests mit geringen flüssigen Probenvolumina durchzuführen, wie beispielsweise Volumina von 50 bis 1000 Mikroliter, die ausreichen, den tieferen Anteil der Vertiefung der Vorrichtung mindestens bis zu einem Spiegel der Kügelchen 42 zu füllen.
- Wie oben angegeben, wird die Vorrichtung vorzugsweise als ein geformter Polymergegenstand gebildet, und ebenso vorzugsweise ist sie Teil einer Anordnung mehrerer Vorrichtungen, wie beispielsweise Anordnung 12. Wird die Anordnung für Chemilumineszenstests verwendet, ist das Materi al, welches die Anordnung bildet, vorzugsweise ein opakes Polymer, wie beispielsweise Polyethylen oder Polyacrylat, welches 4 bis 15 Gew.-% Titandioxid enthält. In Übereinstimmung mit einem Gesichtspunkt der Erfindung wurde gefunden, dass die Vertiefungen in einer Anordnung durch Zusatz von zwischen 0,0005 und 0,5 Gew.-% Ruß zu dem für die Herstellung der Anordnung verwendeten Polymermaterial vollständig undurchlässig für die Chemilumineszenslichttransmission zwischen Vertiefungen gemacht werden können. Die Erfindung umfasst in einem Gesichtspunkt eine Chemilumineszenstestvorrichtung, die aus einem opaken Polymer, welches Titandioxid und ebenso zwischen 0,0005 bis 0,5 Gew.-% Ruß enthält, aufgebaut ist.
- Fig. 6 zeigt in einer Querschnittsansicht, ähnlich zu der in Fig. 4, ein zweites Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung 46 mit einem gefangenen Kügelchen, die in Übereinstimmung mit der Erfindung gebildet ist. Die Vorrichtung weist dieselbe allgemeine Konstruktion wie die obige Vorrichtung 12 auf, umfassend eine identische Wandstruktur 47, die die Vertiefung 49 umfasst. Die Vorrichtung unterscheidet sich von Vorrichtung 12 nur hinsichtlich der Konstruktion der drei flexiblen fingerförmigen Vorsprünge, wie beispielsweise Vorsprünge 48, 50, die für das Zurückhalten des Teilchens oder Kügelchens 52 in der Vorrichtung verwendet werden.
- Der repräsentative Vorsprung 48 weist eine obere Sperre 54, ähnlich zu Sperre 40 bei Vorsprung 36 auf und eine untere Sperre 56, welche so dimensioniert ist, dass sie in Kombination mit den unteren Sperren der anderen beiden Vorsprünge in der Vorrichtung das Kügelchen zwischen den beiden Sätzen von Sperren wie gezeigt fängt. Das Kügelchen kann in eine zweite "Reaktions"-Position unterhalb der unteren Sperren bewegt werden, indem das Kügelchen über die unteren Sperren gezwungen wird. Der Zweck des Zwei- Positionen-Merkmals in einem Test wird unten beschrieben werden.
- Eine dritte Ausführungsform einer Kügelchen-Rückhaltevorrichtung, die entsprechend der Erfindung konstruiert ist und generell bei 58 angezeigt wird, ist in Fig. 7A und 7B gezeigt. Die Vorrichtung umfasst Wandstruktur 60, umschließend eine Vertiefung 62, im wesentlichen identisch mit der Wandstruktur in Vorrichtung 12. Die Vorrichtung unterscheidet sich von Vorrichtung 12 hinsichtlich der Konstruktion des Testteilchens und den Mitteln für das Zurückhalten oder Fangen des Teilchens in der Vorrichtung.
- Genauer gesagt umfasst das Rückhaltemittel eine einzelne vertikal aufragende Röhre oder Pfosten 70, welcher flexible bewegliche erweiterte Anteile 74 aufweist, die aus dem oberen Ende des Pfostens ausgeschnitten sind und von diesem im entspannten Zustand wegragen, wie in Fig. 7B gezeigt.
- Das ligandenbeschichtete Teilchen in der Vorrichtung ist ein torusförmiges Teilchen 76, dessen innere Öffnung so ausgestaltet ist, dass sie frei über Pfosten 70 gleitet. Um das Teilchen in der Vorrichtung in gefangenem Zustand zu plazieren, wird das Teilchen auf dem Pfosten wie in Fig. 7A gezeigt plaziert, wobei durch Abwärtsbewegung die Anteile 74 gegen die Seiten des Pfostens gepresst werden, wodurch bewirkt wird, dass der entspannte Zustand der Anteile 74 verformt wird. Sobald das Teilchen an einer unteren Region des Pfostens aufgenommen ist, kehren die abgeflachten Anteile in ihren entspannten Zustand zurück, wie in Fig. 7B gezeigt, wodurch verhindert wird, dass das Teilchen von dem Pfosten heruntergleitet.
- Bei der Handhabung der oben beschriebenen Vorrichtungen wird ein beschichtetes Teilchen, wie beispielsweise Teilchen 42 in Fig. 2, welches mit einem ausgewählten analyt bezogenen Liganden beschichtet ist, in der Vertiefung der Vorrichtung plaziert, wodurch das Teilchen in der Vertiefung gefangen wird. Es werden Serien von Probe- und Testlösungen zu der Vertiefung unter Verwendung ausgewählter Inkubationszeiten und Reaktionstemperaturen hinzugefügt und entfernt, die für den jeweiligen Test geeignet sind. Ein beispielhafter Test für die Detektion eines DNA- Analyts ausgewählter Sequenz wird in dem Beispiel unten beschrieben.
- Wie oben bemerkt, wird das Teilchen in der Vertiefung vollständig jeder Probe- oder Testlösung ausgesetzt, die zu der Vertiefung hinzugefügt wird, dadurch, dass das Teilchen in der Vertiefung in einer leicht erhöhten Position sich befindet, und durch die Fähigkeit des Teilchens, in diesem gefangenen Zustand frei zu rotieren. Nach ausgewählter Inkubationszeit wird die Flüssigkeit in der Vertiefung durch Absaugen aus dem Flüssigkeitsentfernungsabschnitt 32b der Vertiefung entfernt, wodurch dieser Abschnitt so wirkt, dass Flüssigkeit aus dem teilchenaufnehmenden Abschnitt der Vertiefung entfernt wird, um eine im wesentlichen vollständige Flüssigkeitsentfernung zu gewährleisten.
- Das Rückhaltemittel in der Vorrichtung bewirkt ebenso, dass das Teilchen in einer gewünschten Reaktionsposition gehalten wird, wenn Proben- oder Testlösung zu der Vertiefung hinzugefügt wird. In der in Fig. 6 gezeigten Ausführungsform kann das Teilchen zusätzlich in einer gefangenen Position in dem oberen Anteil der Vertiefung plaziert werden, um das Vermischen einer chemischen Lösung und Reaktion in der Vertiefung ohne Exposition des Teilchens zu erlauben.
- Nachdem der Zyklus von Testlösungen und -reaktionen vollständig ist, wird das Teilchen auf analytbezogene Oberflächen-Reportergruppen getestet, typischerweise indem das Teilchen in einer geeigneten Detektionslösung verteilt wird, z. B. einem Enzymsubstrat, falls der gefangene Reporter ein Enzym ist, wie für den in dem Beispiel beschriebenen Chemilumineszenstest gezeigt.
- Nach dem Testverfahren kann das Teilchen aus der Vertiefung entfernt werden, wodurch es ermöglicht wird, die Vorrichtung wiederzuverwenden, falls sie gewaschen wird und mit einem frischen Teilchen beladen wird.
- Unter einem anderen Gesichtspunkt umfasst die Erfindung eine Testanordnung mit vielen Vertiefungen, die flüssigkeitsverbundene, aber lichtisolierte Vertiefungen aufweist.
- Fig. 8 zeigt eine Anordnung 80, die entsprechend einer Ausführungsform dieser Erfindung gebildet ist. Die Anordnung umfasst ein Gehäuse mit vielen Vertiefungen 82, welches integral gebildete Seitenwände, wie beispielsweise die Wände 84 und 86, Endwände, wie beispielsweise die Endwand 88, und eine Bodenwand 90 aufweist, die zusammen einen verlängerten Kanal 92 bilden. Der Kanal ist in eine Vielzahl, typischerweise 4 bis 8, Vertiefungen, wie beispielsweise Vertiefungen 94 und 96, durch Ablenkungen, wie beispielsweise Ablenkung 98, eingeteilt.
- Wie gezeigt wird, wird jede Ablenkung aus einem Paar von überlappenden Wandverlängerungen gebildet, wie beispielsweise die Verlängerungen 100 und 102, die die Ablenkung 98 bilden, und von den Seitenwänden 84 bis 96 aufragen. Wie der Figur entnommen werden kann, erlauben die Ablenkungen den Fluss von Flüssigkeit zwischen angrenzenden Vertiefungen, blockieren jedoch die direkte Lichttransmission aus zentralen Regionen von benachbarten Vertiefungen. Die oberen Kanten (die in Fig. 8 gezeigten) der Wandanteile und Ablenkungen, die jede Vertiefung umschließen, bilden eine obere Öffnung in jeder Vertiefung, wie beispielsweise Öffnung 104 in Vertiefung 94.
- In jeder Vertiefung, wie beispielsweise Vertiefung 94, ist ein flexibles Rückhaltemittel zum Zurückhalten eines ligandenbeschichteten Teilchens bereitgestellt, wie beispielsweise Teilchen 106, welches in der Figur in gepunkteten Linien gezeigt ist. In der gezeigten Ausführungsform umfasst das Rückhaltemittel 3 fingerförmige Vorsprünge, wie beispielsweise die Vorsprünge 108 und 110, welche als Bestandteil der Bodenwand der Anordnung gebildet werden und von dieser aufwärts ragen. Jeder Vorsprung weist eine nach innen gerichtete Sperre auf, wie beispielsweise Sperre 112 an Vorsprung 110, welche so ausgestaltet ist, dass die Teilchen in einer gefangenen Position in der Vertiefung gehalten werden, wenn die Vorsprünge sich in einem entspannten, d. h. nicht deformierten Zustand befinden. Die Finger können nach außen deformiert werden, wie oben hinsichtlich von Vorrichtung 16 beschrieben, um den Eintritt des Teilchens in die Vertiefung zu ermöglichen.
- Die Anordnung, einschließlich der Wandstrukturen, Ablenkungen und des Rückhaltemittels, ist vorzugsweise als ein im Ganzen geformter oder spritzgegossener opaker Polymergegenstand ausgebildet. Bei einer Anordnung, die für Chemilumineszenstests verwendet wird, enthält das Material, welches die Vorrichtung bildet, vorzugsweise 0,05 bis 0,5 Gew.-% Ruß, wie oben, um Störlicht durch die Wände oder Ablenkungen zu verhindern.
- Die jede Vertiefung umschließende Wandstruktur, das Rückhaltemittel in dieser Vertiefung und das Teilchen, welches in der Vertiefung durch das Rückhaltemittel gefangen wird, werden hier auch als Testvorrichtung bezeichnet. Eine solche Vorrichtung unterscheidet sich von der oben beschriebenen Vorrichtung 16 dadurch, dass (a) die Bodenwände je der Vertiefung flach und nicht geneigt sind und (b) mindestens eine umschließende Seitenwand in der Vorrichtung eine Ablenkung, wie beispielsweise Ablenkung 98, ist.
- Bei der Handhabung wird ein beschichtetes Teilchen, wie beispielsweise Teilchen 106, in jeder Vertiefung der Anordnung plaziert, wodurch das Teilchen in der Vertiefung gefangen wird. Entsprechend einem wichtigen Merkmal der Erfindung können die Proben- und Testlösungen zu den Vertiefungen hinzufügt werden und von den Vertiefungen entfernt werden in der Anordnung aus einer einzigen Vertiefung, z. B. Vertiefung 94, während die Flüssigkeit frei zu allen Vertiefungen während der Flüssigkeitszusetzung zirkuliert und von allen Zellen während des Flüssigkeitsentfernens entfernt wird. Der Vorteil dieses Vorgehens ist es, dass alle Vertiefungen die gleiche Lösung bei jedem Flüssigkeitswechsel erhalten, wodurch die Einheitlichkeit der Testbedingungen innerhalb der verschiedenen Vertiefungen verbessert wird.
- Nachdem der Zyklus der Testlösungen und -reaktionen vervollständigt ist, wird das Teilchen für analytbezogene Oberflächen-Reportergruppen, wie oben beschrieben, getestet. Nach einem Testverfahren kann das Teilchen aus der Vertiefung entfernt werden, wodurch es ermöglicht wird, dass die Vorrichtung wiederverwendet wird, falls sie mit einem frischen Teilchen beladen wird.
- Fig. 9 beschreibt eine andere Ausführungsform einer Anordnung von verbundenen Vertiefungen, hier mit 116 bezeichnet. Die Anordnung umfasst ein Gehäuse mit vielen Vertiefungen 118, welches eine äußere Wand 120 aufweist, welche von vier sich kreuzenden U-förmigen Wandanteilen gebildet wird, wie beispielsweise Wandanteil 122, und eine Bodenwand 124. Jeder Wandanteil, wie beispielsweise Wandanteil 122, die darunterliegende Bodenwand und die nach innen vorragenden Endabschnitte angrenzender Wandanteile, wie beispielsweise die Endanteile 128 und 130, bilden eine Vertiefung, wie beispielsweise Vertiefung 126, welche eine obere Vertiefungsöffnung, wie beispielsweise Öffnung 132, aufweist. Die zwei Endabschnitte, die die innere Wand einer jeden Vertiefung umschließen, sind gewinkelt, wie gezeigt, um eine Ablenkung zu bilden, wie Ablenkung 138 in Vertiefung 126, welche den Flüssigkeitsfluss erlaubt, aber die Lichttransmission zwischen der Vertiefung und einer zentralen Region 136 der Anordnung blockiert.
- Die Gestalt der Vertiefung ist im wesentlichen wie die der oben beschriebenen Vertiefung 24 in Vorrichtung 16, wobei die Vertiefung eine untere, reduzierte Querschnittsregion aufweist und eine Bodenwand, die nach unten von der teilchenaufnehmenden Region geneigt ist, wie beispielsweise Region 134 in Vertiefung 126, in Richtung auf die Zentralregion der Anordnung.
- In jeder Vertiefung in der Anordnung, wie beispielsweise Vertiefung 126, ist ein flexibles Rückhaltemittel zur Rückhaltung eines ligandenbeschichteten Teilchens bereitgestellt, wie beispielsweise als Teilchen 146 in der Figur gezeigt. In der gezeigten Ausführungsform umfasst das Rückhaltemittel drei fingerförmige Vorsprünge, wie beispielsweise Vorsprung 140, die als integraler Bestandteil der Bodenwand der Anordnung geformt sind und von dieser aufwärts ragen. Jeder Vorsprung weist eine nach innen gerichtete Sperre, wie beispielsweise Sperre 142 auf Vorsprung 140, auf, die so ausgestaltet ist, dass sie das Teilchen in einer gefangenen Position in der Vertiefung hält, wenn die Vorsprünge sich im entspannten, d. h. nicht deformiertem Zustand, befinden. Die Finger können nach außen deformiert werden, wie oben hinsichtlich Vorrichtung 16 beschrieben, um den Eintritt des Teilchens in die Vertiefung zu ermöglichen.
- Die Wandstruktur, die jede Vertiefung umschließt, das Rückhaltemittel in der Vertiefung und das in der Vertiefung durch das Rückhaltemittel gefangene Teilchen werden hier auch als Testvorrichtung bezeichnet, wie beispielsweise Vorrichtung 148. Jede Vorrichtung ist im wesentlichen gleich der oben beschriebenen Vorrichtung 16, außer dass eine innere Wand bereitgestellt wird, die von der zentralen Fläche durch eine lichtundurchlässige Ablenkung getrennt ist. Die Anordnung wird vorzugsweise als ein einzelner geformter Gegenstand gebildet, wie oben beschrieben.
- Die Handhabung der Anordnung in einem Untersuchungsverfahren, welches viele Proben betrifft, ist wie für Anordnung 80 oben beschrieben, wobei die Proben- und Testflüssigkeit hingefügt wird zu und entfernt wird von der Anordnung über die zentrale Region 136.
- Die Teilchen, die in den oben beschriebenen Testvorrichtungen verwendet werden, sind vorzugsweise sphärischkugelförmige oder torusförmige Teilchen. Die Teilchen werden hergestellt unter Verwendung von bekannten Glas- oder Polymerkügelchen definierter Größe, wie Polystyrol-, Polyacrylamid-, Polymethylacrylat-, derivatisierte Cellulosefasern-, carboxyliertes Polystyrol-, Polyvinylchlorid-, Polymethylacrylat-, Polypropylen-, Latex-, Polytetrafluorethylen- oder Polyacrylnitril-Kügelchen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Teilchen Polystyrol- Kügelchen, die geschliffene Oberflächen aufweisen, um nichtspezifisches Binden von Molekülen an die Teilchenoberflächen zu minimieren. Die Teilchen besitzen eine bevorzugte Größe zwischen ungefähr 1 bis 7 mm, vorzugsweise zwischen etwa 2 bis 5 mm.
- Der analytbezogene Ligand, welcher an die Teilchenoberfläche gebunden ist, wird ausgewählt, um spezifisch an ein Analyt oder ein Reagens, welches fähig ist, mit dem Analyt um die Bindung an den teilchengebundenen Liganden zu kompetitieren, zu binden. Der Ligand wird an die Teilchenoberfläche entweder kovalent oder durch Adsorption unter Verwendung von konventionellen chemischen Kupplungs- oder Oberflächen-Adsorptionsverfahren angefügt. Ein beispielhaftes Verfahren zur Verwendung bei der Anfügung von DNA-Ligandenmolekülen an Polystyrol-Kügelchen ist in dem Beispiel unten angegeben.
- Nachzuweisende Analytmoleküle sind typischerweise Nukleinsäuren, entweder DNA oder RNA, oder Antigen- oder Antikörper-Analyte. Die Nukleinsäureanalyte können von RNA- oder DNA-Viren, Bakterien, Pilzen oder ähnlichen, die einen spezifischen Wirt infizieren können, erhalten sein. Zusätzlich können die Analyte abgeleitet sein aus dem Genom eines Wirtes, von dem angenommen wird, dass es Allele, Mutationen oder Läsionen enthält, die möglicherweise den Wirt anfällig für Krankheiten machen.
- Die Nukleinsäure umfasst normalerweise zwischen 20 und 2000 Basen, vorzugsweise zwischen 30 und 500 Basen. In manchen Fällen kann es notwendig sein, die Probennukleinsäure zu verdauen, um die geeignete Größe zu erhalten vor dem Hybridisierungsschritt. Falls der Nukleinsäureanalyt in doppelsträngiger Form vorliegt, wird das Nukleinsäuremolekül in die einzelsträngige Form durch Behandlung mit Hitze und Natriumhydroxid vor der Hybridisierung überführt.
- Die Nukleinsäureanalyte werden typischerweise mindestens eine Region mit komplementärer Sequenz zu dem Nukleinsäureligandenmolekül enthalten, welche mindestens 10 Nukleotide und bis zu 1000 Nukleotide lang ist, typischerweise jedoch Längen zwischen 15 und 200 Nukleotiden aufweist.
- Alternativ können die Analyte Antigene sein oder andere Moleküle, die durch die Verwendung von Antikörpern, die mit den Molekülen reagieren, nachgewiesen werden können. Um diese Analyte an die Teilchenoberfläche zu binden, werden zuerst Antikörper, die mit den Analyten reagieren, auf die Oberfläche gebunden. Um oberflächengebundene Analyte nachzuweisen, werden die Teilchen mit einem zweiten Antikörper inkubiert, der eine Signalgenerierende Markierung trägt.
- In einer Ausführungsform der Erfindung hat das Teilchen eine ausgewählte spezifische Dichte, z. B. 1 bis 1,05, welches erlaubt, das Teilchen zwischen der erhöhten und der niedrigeren gefangenen Position hin- und herzubewegen, entsprechend der Dichte der flüssigen Testreagentien, die zu den Vertiefungen hinzugefügt werden. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, während anfänglicher Phasen eines Tests die Probe komplett zu mischen, aber dann das Teilchen auf der Oberfläche der Flüssigkeit in der Vertiefung aufschwimmen zu lassen zum Nachweis des an das Teilchen gebundenen Reporters am Schlussschritt des Testverfahrens.
- Ein Vorteil der oben beschriebenen Testanordnung ist die Fähigkeit, die Anordnung zur Verwendung in einer Reihe verschiedener Analyttestausgestaltungen vor Ort herzustellen. Unter einem Gesichtspunkt umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Ausführen einer Vielzahl von festphasendiagnostischen Tests für ausgewählte Analyte. Das Verfahren wird unter Bezugnahme auf Fig. 10 beschrieben werden.
- Die Figur zeigt einen Anteil einer Testanordnung mit vielen Vertiefungen 150 des beispielsweise unter Bezugnahme auf Fig. 2 beschriebenen Typs. Kurz gesagt umfasst die Anordnung eine Vielzahl von Strukturen, die die Vertiefung umschließen, wie beispielsweise die Strukturen 152 und 154, welche die Testvertiefungen umschließen und flexible Teilchenrückhaltestrukturen bereitstellen, wie beispielsweise Struktur 156. Die Anordnung wird auf einer beweglichen Plattform 158 getragen, die in Richtung des Pfeils 160 gehoben werden kann, um die Vertiefungen in der Anordnung in ausgewählte teilchenaufnehmende Positionen zu bringen.
- Die Teilchen werden in die Vertiefungen verteilt durch eine Teilchenverteilungsvorrichtung 162, welche eine Vielzahl von Patronen hat, wie Patronen 164 und 166. Jede Patrone kann mit Teilchen beladen werden, wie beispielsweise Teilchen 168 in Patrone 166, die mit einem ausgewählten Liganden beschichtet sind, der verwendbar ist für das Testen eines bestimmten ausgewählten Analyts. Beispielsweise kann, wenn der Analyt, der zu testen ist, ein ausgewähltes Antigen ist, der Ligand ein Antikörper sein, der spezifisch gegen das Analyt -Antigen gerichtet ist. Vorzugsweise trägt jede Patrone Teilchen, die einen bestimmten oberflächengebundenen Liganden haben. Die Teilchen werden in jeder Patrone durch eine flexible Lippe zurückgehalten, wie beispielsweise Lippe 171, auf dem Boden von Patrone 166.
- Jede Patrone ist verschiebbar, z. B. unter elektromagnetischer oder pneumatischer Kontrolle, zwischen einer angehobenen Position, wie für vier der Stempel gezeigt, und einer gesenkten Abgabeposition, wie für die Patronen 164 und 166 gezeigt.
- Mit jeder Patrone verbunden und dadurch anhebbar ist ein Stempel, wie beispielsweise Stempel 169, verbunden mit Patrone 164. Jeder Stempel umfasst einen Kolben, beispielsweise wie Kolben 170 in Stempel 169, der anhebbar ist, z. B. unter elektromagnetischer oder pneumatischer Kontrolle, von einer erhöhten Position, in eine Vielzahl von niedrigeren Positionen, um Teilchen aus der Patrone zu verteilen, wie unten beschrieben werden wird.
- Bei der Handhabung wird die Testanordnung in eine ausgewählte Position angehoben, bei der eine oder mehrere Vertiefung (en) in der Anordnung so positioniert ist, dass sie aus einer oder mehrerer Patrone(n) ein ausgewähltes Ligandenteilchen erhält. Sobald die Position eingenommen ist, wird (werden) die gewählte(n) Patrone(n) in eine Position heruntergefahren, die für die Patronen 164 und 166 in Fig. 10 gezeigt ist. Für jede gewählte Patrone wird der assoziierte Kolben abgesenkt, um das unterste Teilchen aus der Patrone freizusetzen und so das Teilchen in die Vertiefung abzugeben (wie für Patrone 164 in Fig. 10 gezeigt), und die Kolbenbewegung fortgesetzt, wodurch das abgegebene Teilchen in eine gefangene Position in die Vertiefung gezwungen wird (wie für die Patrone 166 in Fig. 10 gezeigt).
- Nach diesem Teilchenabgabeschritt wird jede Patrone in die erhöhte Position gefahren, und die Anordnung wird durch Absenken von Plattform 158 bewegt zu einer neuen Position, bei der eine oder mehrere ungefüllte Vertiefungen so positioniert werden, dass sie ein ausgewähltes ligandenbeschichtetes Teilchen von einer oder mehrerer der Patronen erhalten. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis die gewünschte Anzahl von Vertiefungen mit den gewählten Teilchen gefüllt wurde. Die Anordnung wird dann verwendet, um Tests auf mehrere Analyten durchzuführen, wie oben beschrieben.
- Das folgende Beispiel zeigt einen Nukleinsäureanalyttest, der ausgeführt wird unter Verwendung von beschichteten Kügelchen des Typs, der für die Verwendung in der vorliegendne Erfindung geeignet ist. Das Beispiel soll den Umfang der Erfindung beschreiben, aber keinesfalls begrenzen.
- Eine Charge von 1000 3,12 mm Polystyrolkügelchen, erhalten von Hoover Precision Plastics (Sault Ste. Marie, MN), wurden in 200 ml 1 N HCl eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 100 UpM getränkt. Nach einmaligem Waschen mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung wurden die Kügelchen in 200 ml 1 N NaOH eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 100 UpM getränkt. Dann wurden die Kügelchen viermal mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen.
- Poly(phe-lys) wurde von Sigma Chemicals, Inc. (St. Louis, MO) erhalten. Dieses Polypeptid hat ein molares Verhältnis von phe:lys von 1 : 1 und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 47.900 g/mol. Es weist eine durchschnittliche Länge von 309 Aminosäuren auf und enthält 155 Amine/Molekül. Zu 1000 Kügelchen wurden 10 mg Poly(phe-lys) in 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7, 8 hinzugefügt, und die Mischung wurde über Nacht bei 4ºC geschüttelt.
- Zu 10.000 Picomolen des folgenden Oligonukleotids (SEQ ID NO:1) 3'-CACTTCACTTTCTTTCCAAGAGX-5' (X ist das Langketten - amin-modifizierte Nukleotid (N4-(6-Aminocaproyl-2-aminoethyl)derivat des 5-Methylcytidins)) in 50 mM Natriumphosphat pH 7, 8 wurden 15 mg Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS³) hinzugefügt. Die Mischung wurde stark gerührt und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. Eine Gelfiltrationssäule (NAP-25; Pharmacia), äquilibriert mit 10 mM Natriumphosphat pH 6,5, wurde verwendet, um das aktivierte Oligonukleotid zu reinigen. Die Reaktionsmischung mit dem aktivierten Oligonukleotid wurde auf die Säule aufgetragen und filtriert. Das Eluat wurde gesammelt und auf 100 ml mit 50 ml Natriumphosphat, pH 7, 8 verdünnt und zu den Kügelchen hinzugefügt. Die Mischung wurde über Nacht bei 4ºC unter Schütteln inkubiert. Die Kügelchen wurden dann viermal mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen.
- Um die derivatisierten Kügelchen von nur lose gebundener DNA zu befreien, wurden die folgenden Waschschritte verwendet. 1000 Kügelchen wurden in einem 300 ml Endvolumen von 0,2 N NaOH, 0,5% SDS 1,5 Stunden bei 63ºC unter Schütteln behandelt. Nach Abkühlen bei Raumtemperatur für 10 Minuten wurden die Kügelchen viermal mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Die Kügelchen wurden dann unter Verwendung von 50 mg/100 ml BS³ in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7, 8, bei 4ºC über Nacht unter Schütteln überkuppelt. Die Kügelchen wurden viermal mit 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, und dann bei 37ºC getrocknet und bei 4ºC aufgebewahrt.
- Als Zielmolekül wurde ein synthetisches RNA-Transkript (welches die pol-Region der HIV-1-Sequenz enthält) hergestellt und mit 1,2 · 10&sup6;, 6,0 · 10&sup5; und 3 · 10&sup5; Kopien/ml verwendet. Die Negativkontrolle enthielt keine Ziel -RNA.
- Die Probenvorbereitung bestand in der Abgabe von 300 ul 60 Units/ml Proteinase K in 175 mM HEPES, pH 7,5, 14 mM EDTA, 1,75% Lithiumlaurylsulfat, 1,025 M Lithiumchlorid und 33 fmol Einfangübertragungssonden (capture extender probes), die spezifisch für die HIV-pol-Region (jeweils) sind und 555 fmol Markierungsübertragungssonden, die spezifisch für die HIV-pol-Region (jeweils) sind, in jede Vertiefung, die ein DNA-beschichtetes Kügelchen enthielt. 100 ul der RNA in den oben angeführten Mengen, verdünnt in negativem humanem Plasma, wurde dann zu den Vertiefungen hinzugefügt.
- Die Vertiefungen wurden geschüttelt, um die Inhalte zu vermischen, bedeckt und für 16 h bei 63ºC inkubiert.
- Nach einer weiteren 10-Minuten-Periode bei Raumtemperatur wurden die Inhalte jeder Vertiefung abgesaugt, um die gesamte Flüssigkeit zu entfernen, und die Vertiefungen wurden zweimal mit Waschpuffer (0,1% SDS, 0,015 M NaCl, 0,0015 M Natriumcitrat) gewaschen. Ein verzweigtes DNA- Signalamplifikations-Multimer wurde dann zu jeder Vertiefung hinzugefügt (50 ul der 600 fmol/ml Lösung in 0,6 M NaCl, 0,06 M Natriumcitrat, 1,3% SDS, 50% Pferdeserum). Nach Bedeckung der Platten und Schütteln, um die Inhalte in den Vertiefungen zu mischen, wurden die Platten bei 53ºC 30 Minuten inkubiert.
- Nach einer weiteren einminütigen Periode bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen wie oben beschrieben gewaschen.
- Alkalische Phosphatase-Markierungssonde, offenbart in EP 883096976, wurde dann zu jeder Vertiefung hinzugefügt (50 ul 500 fmol/ml Lösung in 0,6 M NaCl, 0,06 M Natriumcitrat, 1,3% SDS, 50% Pferdeserum). Nach 15minütiger Inkubation bei 53ºC und 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Vertiefungen wie oben dreimal gewaschen und dann dreimal mit 0,015 M NaCl/0,0015 M Natriumcitrat.
- Ein enzymaktiviertes Dioxetan (Schaap et al., Tet. Lett. (1987) 28 : 1159-1162 und EPA Nr. 0 254 051), erhalten von Lumigen, Inc., wurde verwendet. 50 ul Lumiphos 530 (Lumigen) wurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Die Vertiefungen wurden leicht aufgeklopft, so dass das Reagens auf den Boden fallen sollte und wurden leicht gewirbelt, um das Reagens gleichmäßig über dem Boden zu verteilen. Die Vertiefungen wurden bedeckt und bei 37ºC für 20 bis 40 Minuten inkubiert.
- Der Lichtausstoß, ausgehend von dem Dioxetanreagens, wurde dann in einem Luminometer gemessen. Der Ausstoß wurde angegeben als das Gesamtintegral des Lichts, welches während der Reaktion produziert wurde, mit den Resultaten wie in der Tabelle unten angegeben.
Claims (16)
1. Testvorrichtung zur Verwendung zum Nachweis eines
Analyts in einer flüssigen Probe, umfassend: Wandmittel, die
eine Vertiefung umschließen, welche eine Bodenwand und eine
höhergelegene Öffnung haben; mindestens ein Teilchen, welches
oberflächengebundene Ligandenmoleküle für die Verwendung bei
dem Analytnachweis hat; und flexible Rückhaltemittel, die an
diese Wandmittel angefügt sind, für das Zurückhalten dieses
Teilchens in einer gefangenen Position innerhalb dieser
Vertiefung, wenn das Rückhaltemittel in nicht deformiertem
Zustand ist, wobei das Rückhaltemittel deformierbar ist, um so
dem Teilchen in die Vertiefung Einlaß zu gewähren.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei dieses flexible
Rückhaltemittel mindestens einen flexiblen fingerförmigen
Vorsprung umfaßt, der zwischen dieser Bodenwand und der
Öffnung angeordnet ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei dieses flexible
Rückhaltemittel drei nach oben vorstehende flexible
fingerförmige Vorsprünge beinhaltet, die in freien Enden enden,
wobei mindestens eine davon eine nach innen gerichtete Sperre
besitzt, die so ausgebildet ist, daß sie das Teilchen in
einer gefangenen Position hält, wenn diese Finger in nicht
deformiertem Zustand sind.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei mindestens eine
dieser drei flexiblen fingerförmigen Vorsprünge weiterhin eine
zweite Sperre umfaßt, die so angebracht und ausgestaltet ist,
daß sie mit der zuerst erwähnten Sperre zusammen arbeitet, um
das Teilchen in einer erhöhten Position über der Bodenwand in
der Vertiefung zu halten.
5. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche,
wobei diese Bodenwand einen Drainageanteil umfaßt, über den
Flüssigkeit aus der Vertiefung abgezogen werden kann, während
das Teilchen in der Vertiefung gefangen ist.
6. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche,
welche weiterhin ein Mittel umfaßt, das an der Bodenwand
ausgebildet ist, und so wirkt, daß das Teilchen in einer erhöhten
Position in der Vertiefung getragen wird.
7. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Teilchen ein
Torus mit einer zentralen Öffnung ist, und das flexible
Rückhaltemittel eine Röhre ist, die von der Bodenwand aufragt,
und einen erweiterten distalen Anteil hat, welcher
zusammendrückbar ist, um die Aufnahme der Öffnung des Teilchens auf
diese Röhre zu erlauben.
8. Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche zur
Verwendung zum Nachweis eines Nucleinsäureanalyts, wobei die
Ligandenmoleküle einzelsträngige Nucleinsäuremoleküle sind,
die Sequenzkomplementarität zu dem Nucleinsäureanalyten
umfassen.
9. Lochplattentest für den Nachweis eines oder mehrerer
Analyten in einer flüssigen Probe, umfassend: eine Vielzahl
von Wandmitteln, wobei jedes davon eine Vertiefung
umschließt, die eine Bodenwand, eine höhergelegene Öffnung und
eines oder mehr Ablenkmittel hat, welche(s) die Vertiefung
von einer oder mehreren angrenzenden Vertiefungen trennen
beziehungsweise trennt, wobei diese Ablenkmittel aus
überlappenden Wandanteilen gebildet sind, welche eine
Lichtdurchlässigkeit verhindern, aber Flüssigkeitsfluß zwischen solchen
benachbarten Vertiefungen erlauben; in jeder Vertiefung ein
Teilchen, welches oberflächengebundene Ligandenmoleküle für
die Verwendung bei dem Analytnachweis hat; und in jeder
Vertiefung flexible Rückhaltemittel, die an diese Wandmittel
angefügt sind zum Zurückhalten des assoziierten Teilchens in
einer gefangenen Position innerhalb der Vertiefung, wenn das
Rückhaltemittel in nicht deformiertem Zustand ist, wobei das
Rückhaltemittel deformierbar ist, um dem Teilchen Einlaß in
die Vertiefung zu gewähren.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei diese
Vertiefungen in einer Reihe angeordnet sind, und jedes Paar
benachbarter Vertiefungen durch die Ablenkmittel getrennt ist.
11. Anordnung nach Anspruch 9, wobei die Vertiefungen um
eine zentrale Öffnungsregion angeordnet sind, und jede
Vertiefung von dieser Öffnungsregion durch die Ablenkmittel
abgegrenzt ist.
12. Anordnung nach Anspruch 11, wobei die Bodenwände
dieser Vertiefungen geneigt sind, um Flüssigkeit in den
Vertiefungen in die zentrale Öffnungsregion ausfließen zu
lassen.
13. Anordnung nach Anspruch 9 zur Verwendung zum
Nachweis eines Nucleinsäureanalyts, wobei erste Ligandenmoleküle
auf einem ersten Teilchen in der Vorrichtung
Analytenligandenmoleküle, umfassend einzelsträngige Nucleinsäuremoleküle,
die Sequenzkomplementarität zu dem Nucleinsäureanalyten in
der Probe aufweisen, sind.
14. Anordnung nach Anspruch 13, wobei zweite und dritte
Ligandenmoleküle auf einem zweiten bzw. dritten Partikel in
der Vorrichtung Referenzligandenmoleküle, umfassend
unterschiedliche einzelsträngige Nucleinsäuremoleküle mit
Sequenzkomplementarität zur ersten und zweiten Referenznucleinsäure,
sind.
15. Anordnung nach Anspruch 9 zur Verwendung zum
Nachweis eines Analyts durch einen Chemilumineszenzdetektor,
wobei das Wandmittel ein opakes Polymer, enthaltend 0,05 bis
0,5 Gew.-% Ruß, ist.
16. Verfahren zur Ausführung einer Vielzahl von
diagnostischen Festphasen-Tests für ausgewählte Analyte, umfassend:
(a) Einbringen in eine vorbestimmte
Partikelverteilende Beziehung:
(i) einer Testanordnung, die eine Vielzahl von
Testvertiefungen, die durch Wandmittel definiert sind, und
flexible Rückhaltemittel, die an die Wandmittel angefügt
sind, um ein Teilchen in einer gefangenen Position innerhalb
dieser Vertiefung zurückzuhalten, wenn das Rückhaltemittel in
nicht deformiertem Zustand ist, aufweist, wobei das
Rückhaltemittel deformierbar ist, um dem Teilchen Einlaß in die
Vertiefung zu gewähren, und
(ii) einer Teilchenverteilungsvorrichtung, die
eine Vielzahl von Patronen besitzt, wobei jede Teilchen
enthält, die mit einem ausgewählten Liganden beschichtet sind,
(b) Verteilen eines Teilchens aus einer oder mehreren
dieser Patronen in eine oder mehrere ausgewählte Vertiefungen
in dieser Anordnung;
(c) Zwingen eines jeden verteilten Teilchens in die
gefangene Position in der entsprechenden Vertiefung;
(d) Wiederholen der Stufen (a) - (c), bis Teilchen in
einer Vielzahl von Vertiefungen verteilt und gefangen wurden;
und
(e) Durchführen eines diagnostischen Tests in jeder
der Partikel-enthaltenden Vertiefungen.
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