DE60027009T2

DE60027009T2 - Schwach bindende vorrichtung zur rückhaltung von flüssigkeiten und zur filterung

Info

Publication number: DE60027009T2
Application number: DE60027009T
Authority: DE
Inventors: Daniel Micky Newark TORTORELLA
Original assignee: Bristol Myers Squibb Pharma Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Pharma Co
Priority date: 1999-07-16
Filing date: 2000-07-14
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2020-07-15
Also published as: EP1220716B1; US20030124715A1; AU6097500A; EP1220716B8; DE60027009D1; EP1220716A4; US6635430B1; US6887671B2; US6544417B1; JP2003527568A; EP1220716A1; JP3746005B2; WO2001005509A1

Description

Die vorliegende Anmeldung beansprucht das Vorrecht der Anmeldedaten der vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/145,527.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neuartige Filterplatteneinrichtungen zur Verwendung bei Screening-Untersuchungen mit Hochleistungsdurchsatz.
Hintergrund der Erfindung
Die Bindung kleiner Moleküle und Peptide an Protein ist ein sehr wichtiger Meßparameter in der pharmazeutischen Industrie. Da die Pharmaindustrie bestrebt ist, neuartige kleine Moleküle und Peptide zur Behandlung von verschiedenen Leiden zu entwickeln, die von lebensbedrohlichen Krankheiten einschließlich Krebs, AIDS und Herzkrankheiten bis zu kosmetischen Beschwerden wie AKNE, Altersflecken und Falten reichen, ist eine erfolgreiche Verabreichung dieser Wirkstoffe von entscheidender Bedeutung. Zahlreiche Wirkstoffe, die sich bei Bestimmungen in vitro als sehr wirksam erwiesen haben, zeigten keine Wirksamkeit bei Tieranwendungen oder beim Menschen wegen der von diesen Verbindungen gezeigten hohen Plasmaproteinbindung. Wenn ein Molekül im Blut hochgradig an Proteine gebunden wird, wird die Menge des für ein Diffundieren in das Zielgewebe verfügbaren Wirk stoffes in signifikanter Weise reduziert, und die Wirkung des Arzneistoffes erweist sich unvermeidlich als gering.
Ob sich ein kleines Molekül an Plasmaproteine bindet oder nicht, ist üblicherweise abhängig von der Größe des Moleküls, der Aminosäurenzusammensetzung und der Tertiärstruktur des Moleküls. Wenn sich ein kleines Molekül an Plasmaproteine bindet, ist die Interaktion üblicherweise ein Ergebnis starker ionischer und hydrophober Interaktionen. Da das Blut mehrere hundert Proteine enthält, liegt eine hohe Wahrscheinlichkeit vor, daß jedes kleine Molekül einen gewissen Bindungsgrad zeigt. Die Bestimmung des Bindungsgrades ist daher von entscheidender Bedeutung und steht in direktem Zusammenhang mit der Wirksamkeit des Moleküls. Eine Vorhersage, ob ein Molekül eine hohe oder niedrige Proteinbindung auf der Grundlage der Molekularstruktur zeigen wird, hat sich als sehr schwierig erwiesen. Der einzige sichere Weg zu bestimmen, ob ein Molekül eine hohe oder niedrige Proteinbindung zeigt, besteht darin, das Molekül direkt in einer Proteinbindeuntersuchung zu testen.
Die bekannteste Methode, die zum Messen des von Verbindungen erbrachten Grads der Proteinbindung verwendet wird, ist die Gleichgewichtsdialyse-Untersuchung. Bei derartigen Untersuchungen wird eine festgesetzte Konzentration eines Wirkstoffes (gewöhnlich 1 μM) einer festgesetzten Menge menschlichen Plasmas (gewöhnlich 3 ml) zugesetzt. Das Gemisch wird in der Dialyseleitung mit einer Molekulargewichtsabtrennung von 30 kDa zugegeben. Man läßt das Gemisch in einer großen Menge Wasser (üblicherweise 4 Liter) 24 Stunden bei 37°C inkubieren. Nach der Inkubation wird die Probe genommen und die Konzentration des Wirkstoffes er rechnet. Falls die Verbindung vollständig an Protein ungebunden ist, wäre die Konzentration nach der Dialyse 0, wenn 50% gebunden sind, wäre die Konzentration 0,5 uM usw.. Obschon sich die Gleichgewichtsdialyse als genau und konsistent erwiesen hat, ist sie sehr zeitaufwendig, und die Anzahl von Wirkstoffen, die der Wissenschaftler in einer Untersuchung testen kann, ist davon abhängig, wie viele 4-Liver-Becherglässer er/sie ansetzen kann. Es besteht somit in der pharmazeutischen Industrie ein Bedarf an einer schnellen Untersuchungseinrichtung mit hoher Durchsatzleistung.
Die Bindung kleiner Moleküle sogar an die Kunststoffe wie etwa die Polypropylenleitungen und Filterplatten kann ein Problem sein. Polypropylen (PP) wird derzeit als die beste Art einer im Handel erhältlichen Kunststofffilterplatte auf der Grundlage seiner geringen nicht-spezifischen Bindeeigenschaften und Lösemittelfestigkeit angesehen. Selbst die nicht-spezifische Bindung (NSB) an Polypropylen kann sich störend auf die Errechnung der genauen Plasmaproteinbindewerte auswirken.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf eine Filtereinrichtung gerichtet, die ein polymeres Material und ein Zusatzmittel umfaßt, zu dem Biomoleküle eine minimale oder keine Bindung zeigen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Filtereinrichtung eine Filtereinheit-Halteplatte und umfaßt ein Polyolefin, in der bevorzugtesten Form Polypropylen, und Teflon^®-Harz, in der bevorzugtesten Form etwa 2,5% Teflon^®-Harz und etwa 97,5% Polypropylen. Diese Platte enthält eine Mehrzahl von Durchgangslöchern, von denen jedes in der Lage ist, eine Filtereinheit, wie etwa eine Fil tereinheit Microcon-3, 10, 30 oder 100^® (vgl. 4, 5, 7 und 8) sicher zu halten. Dieser Filtereinheit (vgl. 1) enthält einen Behälter und eine Filtermembran, die in der Filtereinheit-Halteplatte enthalten ist. Die Filtereinheit enthält ferner einen Boden, der in einer Öffnung in jedem der Durchgangslöcher der Filtereinheit-Halteplatte und vorzugsweise in eine Reversibilitätsmulden-Halteplatte (vgl. 9, 10, 11 und 12) eingesetzt ist. Diese "Reversibilitätsmulden-Sammelplatte" besteht ebenfalls aus einem polymeren Material und einem Zusatzmittel, zu dem Biomoleküle eine minimale oder keine Bindung zeigen, vorzugsweise Polypropylen und Teflon^®-Harz (am meisten bevorzugt, wiederum, mit etwa 2,5% Teflon^®-Harz und etwa 97,5% Polypropylen), und enthält ebenfalls eine Mehrzahl von Mulden. Die Sammelplatte ist so ausgebildet, daß ihre Mulden jedes Ende der Filtereinheit aufnehmen können.
Die Filtereinheit-Halteplatte und die Sammelplatten sind, zusammen mit den darin enthaltenen Filtereinheiten, sicher aneinander befestigt und werden in Screening-Untersuchungen mit hoher Durchsatzleistung hinsichtlich der Bindung von kleinen Molekülen und Peptiden an Proteine verwendet. Die Ausbildung der Platten und ihre Zusammensetzung führt zu mehreren Vorteilen bei der Durchführung solcher Screening-Untersuchungen, wie es hier beschrieben wird.
Die Filtratplattenvorrichtung nach der vorliegenden Erfindung besteht aus einer Mehrmuldenplatte mit Halter in einem besonderen Mikroanordnungsformat, das für, beispielsweise, 96 Microcon-Filtereinheiten ausgebildet ist. Der Halter enthält eine Mehrzahl von Durchgangslöchern, wo die Filtereinheiten eingesetzt werden. Die Rippe der Filtereinheit liegt an der Oberseite des Durchgangslochs und der Boden (Basis) der Filtereinheit geht hindurch. Wenn die Filtereinheiten in den Halter eingesetzt sind, wird er oben auf eine Mehrfachmulden-Sammelplatte mit dem gleichen Mikroanordnungsformat wie der Halter aufgesetzt. Der Aufsatz wurde so ausgebildet, daß mehrere mm des Bodens der Filtereinheit in die Mulden der Sammelplatte vorstehen. Dieses ist eine Möglichkeit, ein Überlaufen von Mulde zu Mulde bei der Zentrifugierung zu verhindern. Statt dessen kann ein Auslauf 60 (14) zur Vermeidung einer Quer-Verunreinigung verwendet werden. Die Sandwich-Konstruktion von Halter/Platte kann in einer Tischzentrifuge mit einem Schwingbecher zum Sammeln des Filtrats geschleudert werden. Die Platten wurden so ausgebildet, daß eine Stapelung der Sandwich-Konstruktionen übereinander möglich ist, damit mehrere Platten gleichzeitig geschleudert werden können.
Was das Verfahren angeht, so werden Probenherstellungseinheiten in den nach Maß gefertigten Behälter eingesetzt, der sodann auf die Sammelplatte aufgesetzt wird. 200 ul Probenmaterial werden beispielsweise in die Filtereinheiten in Gegenwart oder Abwesenheit der kleinen Moleküle mit einer Konzentration von 1 uM eingegeben. Die Platten werden in einen Schwingbecherrotor eingesetzt, der Microtiter-Plattenhalter enthält. Die Platten werden mit geeigneten Geschwindigkeiten, wie etwa 3000 g, 30 Minuten lang geschleudert. Die freien kleinen Moleküle (typisches Molekulargewicht 300–600 Dalton) gehen ohne weiteres durch die Filtermembran und gelangen in die Sammelmulde. Die gebundenen Moleküle werden mit den Plasmaproteinen zurückgehalten, die im Molekulargewichtsbereich von 20.000 bis 500.000 Dalton liegen. Die Sammelplatte enthält die freie Verbindung (Filtrat), und der Filterbehälter enthält die gebundene Verbindung (Retentat). Die im Filtrat ent haltene freie Verbindung kann durch Massenspektrometrie, Elektrospray oder eine Bio-Analyse bestimmt werden.
Zum Sammeln des Retentats wird eine weitere Sammelplatte mit nach unten gerichteten Mulden auf die Filtereinheiten aufgesetzt. Die Platte ist so ausgebildet, daß sie stramm um das offene Ende der Filtereinheiten sitzt. Als nächstes wird der Halter umgekehrt und weitere fünf Minuten zum Sammeln des Retentats in der zweiten Sammelplatte geschleudert. Das Filtrat ist dann bereit für eine Analyse auf gebundene Verbindung. Schließlich sind der Filtereinheitshalter und die Sammelplatten mit V-Nuten an der Außenseite der Platten ausgebildet, die sie für eine Automation unter Verwendung von Roboterwerkzeugen geeignet machen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1, 1A: Filtereinheit Microcon-10 (1) und Sammelrohr (1A). Die Filtereinheit Microcon-10 besteht aus einem Behälter, der bis zu 500 μl Flüssigkeit enthält, der YM-Membran und einem Boden, der das Filtrat in das Mikrofuge-Sammelrohr während des Zentrifugierens leitet.
2: Bindung kleiner Moleküle an Membranen. Die Bindung von 50 kleinen Molekülen an die Membranen YM, Spectra/por und Slide-A-Lyzer wurde durch Inkubieren jedes Moleküls bei einem Bereich von Konzentrationen, 1–1000 nM, mit jeder der drei Membranen bestimmt. Man ließ den Wirkstoff mit der Membran in einem Volumen von 500 μl für 30 Minuten bei 37°C inkubieren. Nach der Inkubation wurden die Proben gesammelt, und die Wirkstoffkonzentrationen wurden errechnet. Die Ab nahme in der Konzentration wurde zum Berechnen der Bindungswerte an die Membran benutzt.
3: Korrelation zwischen Gleichgewichtsdialyse und Microcon-10-Zentrifugierung. Die Menge an Serumbindung von 50 kleinen Molekülen wurde unter Verwendung einer Standard-Gleichgewichtsdialyse und Microcon-10-Zentrifugierung errechnet. Die in den beiden Untersuchungen erzeugten Bindungswerte wurden verglichen, und eine Korrelationskurve wurde aufgetragen. Der R²-Wert beträgt 0,98.
4: Filtereinheithalter. Draufsicht auf den Filtereinheithalter, der ein neuartiges Mikroanordnungsformat enthält, mit der Möglichkeit, 96 Microcon-Filtereinheiten zu halten. Der Halter enthält 96 Durchgangslöcher, wo der Boden der Filtereinheit sitzt, und ragt, bei einer Ausführungsform, in die Sammelplatte vor.
5, 5A: Filtereinheithalter. Diese Darstellungen sind eine Seitenansicht (5) und eine Bodenansicht (5A) des Halters. Die Seitenansicht veranschaulicht das Eindringen der Microcon-Filtereinheiten in die Durchgangslöcher des Halters. Die Rippe der Filtereinheit liegt oben auf dem Durchgangsloch, und der Boden steht einige Millimeter vor. Der Boden des Halters enthält mehrere vorstehende Zapfen, die in die Filtratsammelplatte mit Klemmwirkung eingreifen. Dieses ermöglicht es, daß der Halter stramm oben auf der Sammelplatte bei der Zentrifugierung fest sitzt.
6, 6A: Filtereinheithalter. Veranschaulicht wird die Anordnung des Filtereinheithalters und der Sammelplatte. Der Halter, der 96 Microconeinheiten enthält, ist oben auf die Sammelplatte aufgesetzt. Der Boden der Filtereinheit ragt in die Durchgangslöcher hinein, und die Zapfen am Boden des Halters schließen die beiden Teile ab.
7: Sammelplatte. Draufsicht auf die Sammelplatte, die ein neuartiges Mikroanordnungsformat enthält, mit der Möglichkeit, 96 Microcon-Filtereinheiten zu halten. Die Platte ist mit dem Filtereinheithalter kompatibel. Die Platte enthält Bodenmulden mit den Außenabmessungen einer Standard-96-Muldenplatte. Die Mulden können flach, U-förmig oder V-förmig sein oder andere Formen in Abhängigkeit von ihrer Verwendung aufweisen. Die Platte enthält V-Nuten, die die Platte kompatibel mit Roboterarmen machen.
8: Die Darstellung ist eine Seitenansicht der Sammelplatte. Die Platte ist zum Halten von 96 Microcon-Filtereinheiten ausgebildet. Die Filtereinheit kann direkt in die Mulde eingesetzt werden. In der gezeigten Ausführungsform liegt die Rippe der Filtereinheit oben auf der Außenseite der Mulde, so daß gerade der Boden der Filtereinheit in die Mulden vorragen kann. Dieses Merkmal verhindert ein Überlaufen von Mulde zu Mulde bei der Zentrifugierung der Proben.
9: Umkehrmuldensammelplatte. Die Platte enthält ein neuartiges Mikroanordnungsformat, mit der Möglichkeit, 96 Microcon-Filtereinheiten zu halten. Der Halter enthält 96 Durchgangslöcher, wo die Böden der Filtereinheiten hindurchgehen und in die Mulden der Umkehrmuldensammelplatte zur Rückgewinnung des Filtrats vorragen. Der Halter richtet auch das offene Ende der Microcon-Behälter aus, die ebenfalls in die Mulden der Umkehrmuldensammelplatte eingepaßt werden können. Dieses Merkmal macht das 96-Mulden-Umkehrschleudern möglich.
10: Umkehrmuldenhalter. Die Darstellung ist eine Seitenansicht der Ausrichtung von Retentathalter und Sammelplatte. Die Darstellung veranschaulicht, daß das Mikroanordnungsformat zwischen dem Halter und der Sammelplatte ausgerichtet ist.
11, 11A und 11B: Draufsicht, Vorderansicht und Seitenansicht der Umkehrmuldensammelplatte. Die Sammelplatte enthält ein neuartiges Mikroanordnungsformat, mit der Möglichkeit, 96 Microcon-Filtereinheiten zu halten. Die Platte wurde so ausgebildet, daß die Mulden in jedes Ende der Filtereinheiten passen können. Somit kann, in der bevorzugten Ausführungsform, die Umkehrmuldensammelplatte zum Sammeln sowohl des Filtrats als auch des Retentats verwendet werden. Die Platte ist mit dem Umkehrmuldenhalter kompatibel. Die Platte kann U-Bodenmulden mit den Außenabmessungen einer Standardplatte mit 96 Mulden enthalten. Die Platte kann auch V-Nuten enthalten, die sie kompatibel mit Roboterarmen machen.
12: Umkehrmuldensammelplatte. Die Seitenansicht der Umkehrmuldensammelplatte veranschaulicht, wie beide Seiten der im Halter enthaltenen Microcon-Filtereinheiten in die Mulden eingepaßt sein können. Die an der Sammelplatte gebildeten erhabenen Vorsprünge machen es möglich, daß das offene Ende der Microcon-Behälter stramm in die Mulden paßt. Dieses besondere Merkmal ermöglicht das Sammeln sowohl des Filtrats als auch des Retentats in einer einzigen Untersuchung ohne ein Überfließen von Mulde zu Mulde.
13: Bindung kleiner Moleküle an Polypropylen und Polypropylen mit Teflon^®. Die Bindung von 50 kleinen Molekülen an Polypropylen und Polypropylen mit 2,5% Teflon^® wurde durch Inkubation jedes Moleküls in einem Bereich von Konzentrationen, 1–1000 nM, mit jeder der beiden Kunststoffplatten bestimmt. Man ließ den Wirkstoff in der Mulde in einem Volumen von 500 ul Wasser für 30 Minuten bei 37°C inkubieren. Nach der Inkubation wurden die Proben gesammelt, und die Wirkstoffkonzentrationen wurden errechnet. Die Abnahme in der Konzentration wurde zum Berechnen der Bindungswerte an den Kunststoff verwendet.
14, 14A: Alternative Ausführungsform, die einen Auslauf für ein direktes Abfließen in die Mulden der Sammelplatte verwendet.
15: Grafische Darstellung, die die verschiedenen Mengen von Teflon-Harz und die resultierende Bindung für 10 verschiedene Hydroxamsäuren zeigt. Die Daten zeigen, daß praktisch keine Bindung für alle getesteten Verbindungen auftrat, wenn die Menge des Teflon-Harzes nur 1% betrugt. Akzeptable Werte einer Bindung für die Verbindungen H, I und J ergaben sich selbst bei Teflon-Harzmengen von nur 2,5% und 1%.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf ein polymeres Gemisch zur Verwendung bei der Probenherstellung, Meßgeräten (wie etwa Pipetten) oder Lagervorrichtungen (wie etwa Rohre), das eine minimale oder keine Bindung an Biomoleküle (d.h. Mole külle, die Lebensprozesse beeinflussen bzw. daran beteiligt sind, einschließlich synthetischer kleiner Moleküle, Peptiden, Proteinen, Nukleinsäuren wie etwa DNA und RNA, Oligonukleotiden, Polysacchariden, Lipiden usw.) zeigt. Das polymere Gemisch wird vorzugsweise in Teilen der Vorrichtungen verwendet, wo ein Kontakt mit der Flüssigprobe auftritt oder wahrscheinlich auftritt. In der bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Vorrichtung eine Filtereinheithalteplatte, eine Filtriervorrichtung wie etwa die im Handel von der Millipore Corporation erhältliche MICROCON-Filtereinheit, und eine oder mehrere optionale Sammeleinheiten. Zum Zwecke der Erläuterung konzentriert sich die nachfolgende Besprechung auf diese bevorzugte Ausführungsform, obgleich der Fachmann versteht, daß die vorliegende Erfindung andere Vorrichtungen zur Probenherstellung mit unterschiedlichen Ausgestaltungen umfaßt.
Es sei nun zuerst auf 1 Bezug genommen. Hier ist eine Filtereinheit 5 gezeigt, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Die gezeigte Filtereinheit ist eine Filtereinheit MICROCON-10, die im Handel von der Millipore Corporation erhältlich ist. Sie umfaßt einen Probenbehälter 6, einen Boden 8, der, wie in der Figur gezeigt, unter dem Probenbehälter 6 gelegen ist, und eine Membran 7, die den Behälter 6 vom Boden 8 trennt. Die Membran ist in der Einheit 5 abgestützt, und eine flüssigkeitsdichte Abdichtung ist zwischen dem Umfang des Probenbehälters 6, der Membran 7 und der Membranabstützung, wie etwa mit einem O-Ring, vorgesehen. Einer oder mehr Filtratkanäle sind in der Einheit 5 vorgesehen, um das Ablaufen von Filtrat von der Membran 7 in den Boden 8 zu ermöglichen. Vorzugsweise ist die Membran eine Retentionsmembran, wie etwa eine YM-Membran, die in der Lage ist, große Moleküle zurückzuhalten, während sie kleine Moleküle durchläßt (der Durchgang von kleinen Molekülen durch die Membran ermöglicht es einem zu bestimmen, ob sie sich beispielsweise an die Serumproteine gebunden haben).
2 veranschaulicht die Bindung von Molekülen an solche Membranen. Im einzelnen wurde die Bindung von 50 Biomolekülen, eine Reihe von Hydroxamsäuren, bestimmt, indem jedes Molekül in einem Bereich von Konzentrationen, 1–1000 nM, mit jeder der drei Membranen zur Inkubation gebracht wurde. Man ließ den Wirkstoff mit der Membran in einem Volumen von 500 μl für 30 Minuten bei 37°C inkubieren. Nach der Inkubation wurden die Proben gesammelt, und die Wirkstoffkonzentrationen wurden errechnet. Die Abnahme in der Konzentration wurde zum Berechnen der Bindungswerte an die Membran verwendet. In allen Fällen ergibt die Membran YM eine gleichwertige oder geringere Bindung der kleinen Moleküle als die Membranen Spectr/por und Slide-A-Lyzer. In den meisten Fällen ergibt die Membran YM eine wesentliche niedrigere Bindung.
In der bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung eine Filtereinheithalteplatte 20 (vgl. 4, 5 und 6) mit einem polymeren Material vor, wie etwa einem Polyolefyn, PFA, PTFE, CORIAN, oder einem Thermoplast, wie etwa Styrol, Acetobutylstyrol, Polycarbonat oder Acryl, vorzugsweise einem Polyolefyn und am meisten bevorzugt Polypropylen. Ein Zusatzmittel, das minimale oder keine Bindungseigenschaften in Bezug auf Biomoleküle, wie zum Beispiel Proteine und/oder DNA und/oder RNA, zeigt, wird dem polymeren Material in einer Menge zugesetzt, die geeignet ist, das resultierende Gemisch nicht-bindend zu machen.
Geeignete Zusatzmittel umfassen Teflon^®-Harz, Polyetheretherketon (PEEK), Polyphenylensulfid (PPS oder RYTON), Perfluoralkoxyalkan (PFA), fluoriertes Ethylenpropylen (FEP) und CORIAN (eine Mischung von natürlichen Mineralien und reinem Acryl). Vorzugsweise ist das Polymer Polypropylen, und das Zusatzmittel ist Teflon^®-Harz.
Die Filtereinheithalteplatte 20 enthält eine Mehrzahl von Durchgangslöchern 21, wie etwa 96 Durchgangslöchern, wobei jedes der Durchgangslöcher in der Lage ist, eine Filtrationsvorrichtung, wie etwa eine Filtereinheit Microcon-3, 10, 30 oder 100^®, sicher zu halten, die Durchgangslöcher 21 eine Öffnung 22 in ihrer Bodenfläche enthalten, die in ihrer Größe dazu ausreichen, daß der Boden 8 der Filtereinheit 5, jedoch nicht der Behälter 6 bzw. die Filtermembran 7 der Filtereinheit 5, durch die Bodenfläche hindurch und in eine Filtratsammelvorrichtung (5) gelangen können, die Durchgangslöcher 21 vorzugsweise einen kreisförmigen Umfang haben, die Durchgangslöcher 21 vorzugsweise symmetrisch in der Platte angeordnet sind und die Mitte jedes Durchgangsloches 21 vertikal mit den Durchgangslöchern 21 in den Reihen über und unter dem Durchgangsloch ausgerichtet ist und die Mitte jedes Durchgangsloches horizontal mit der Mitte der Durchgangslöcher in Reihen links und rechts vom Durchgangsloch 21 ausgerichtet ist.
Wie aus den 5 und 6 ersichtlich ist, sitzt jede Filtereinheit 5, und insbesondere der Boden 8 jeder Filtereinheit 5, in einer jeweiligen Öffnung 22 in jedem Durchgangsloch 21 des Filtereinheithalters 20. Der Außendurchmesser des Bodens 8 beträgt etwas weniger als der Durchmesser der Öffnung 22, was es ermöglicht, daß der Boden stramm in das Durchgangsloch 21 hineinpaßt. Unterhalb der Membran 7 hat der Boden 8 einen Außendurchmesser, der kleiner ist als der Außendurchmesser des Behälters 6, wodurch eine Schulter 9 (1) gebildet ist. Die Schulter 9 liegt oben auf der Öffnung 22 und bildet einen vertikalen Anschlag, der die Einheit 5 daran hindert, weiter in die Mulde 21 einzutreten. Vorzugsweise tritt das untere freie Ende des Bodens 8 leicht durch die Öffnung 22 hindurch, so daß ein Filtrat, das vom Boden abfließt, in eine entsprechende Mulde in der Sammelplatte (nachstehend besprochen) hineinfließt, ohne daß ein Überfließen in andere nahegelegene Mulden bzw. deren Verunreinigung erfolgt. Jedoch darf die Filtereinheit 5 nicht zu tief in das Durchgangsloch 21 eingesetzt werden, da der zum Abdichten der Membran in der Einheit 5 verwendete O-Ring überlastet werden und im Ergebnis ausfallen könnte. Statt dessen könnte das untere freie Ende des Bodens 8 im wesentlichen eben bzw. eben mit der Bodenfläche des Filterhalters 20 ausgeführt sein, und Ausläufe 60 (14, 14A) könnten zur Lenkung des Filtratstroms zwecks Vermeidung einer Quer-Verunreinigung verwendet werden. Der Auslauf 20 kann Teil der Filtereinheit 5 sein und eine Position in einem optimalen Abstand von der Mulde der Sammelplatte einnehmen, in die die Flüssigkeit abtropft.
Bei einer Ausführungsform enthält die äußere Bodenfläche der Filtereinheithalteplatte 20 eine Mehrzahl von Zapfen 23 (5), die von dieser in Anzahl und Größe ausreichend für eine Verbindung der Platte mit einer Umkehrmulden-Sammelplatte vorstehen (diese "Umkehrmulden-Sammelplatte" ist die hier beschriebene und beanspruchte reversible Sammelplatte). Statt dessen kann die Sammelplattenoberfläche eine Mehrzahl von Noppen enthalten, die in entsprechenden Öffnungen im Boden des Filtereinheithalters 20 zur Erleichterung ihres Zusammensetzens aufgenommen werden. Die Außenabmessungen der Filtereinheithalteplatte 20 sind etwa die gleichen wie die Außenabmessungen einer Standardplatte mit 96 Mulden, wie sie für Screening-Untersuchungen mit hohem Durchsatz verwendet wird. Vorzugsweise ist die Filtereinheithalteplatte 20 aus etwa 1 bis 10% Teflon^®-Harz und etwa 90 bis 91 % Polypropylen, in besonders bevorzugter Weise etwa 2,5% Teflon^®-Harz und etwa 97,5% Polypropylen zusammengesetzt. Diese Vereinigung von Teflon®-Harz verhindert die Bindung von Molekülen an die Oberfläche der Mulden 21 der Platten und steht somit für effizientere und verläßlichere Untersuchungen.
In dem Fall, daß ein Kontakt der Probe mit der Filterhalteplatte 20 unwahrscheinlich ist, ist die Verwendung des polymeren Gemisches nach der vorliegenden Erfindung für diesen Bereich der Vorrichtung nicht notwendig.
Nach der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Sammelplatte 30 vorgesehen (6–12), die vorzugsweise eine Umkehrmulden-Sammelplatte ist. Da die Sammelplatte 30 mit der Probe in Kontakt kommt, besteht sie vorzugsweise aus dem polymeren Gemisch nach der vorliegenden Erfindung, in besonders bevorzugter Weise aus Polypropylen und Teflon^®-Harz. Die Sammelplatte 30 enthält ebenfalls vorzugsweise eine Mehrzahl von Mulden 37, wobei jede der Mulden 37 in der Lage ist, eine Filtereinheit Microcon-3, 10, 30 oder 100^® zu halten, die Oberseite jeder Mulde 37 in der Lage ist, jedes Ende der Filtereinheit sicher zu halten, die Mulden 37 eine U-förmige Bodenfläche aufweisen können, so daß diese Fläche jedes Ende der Filtereinheit sicher halten kann, und wobei die Seiten- und Bodenfläche der Filtrat sammelplatte eine Mehrzahl V-förmiger Nuten enthalten kann, die in Anzahl und Größe dazu ausreichen, daß die Platte von einer Standard-Roboter- bzw. Automatenvorrichtung gehandhabt werden kann, und die Außenabmessungen der Filtratsammelplatte etwa die gleichen sind wie die Außenabmessungen einer 96-Mulden-Standardplatte. Wie in 10 gezeigt, umfaßt die Sammelplatte 30 vorzugsweise eine Mehrzahl ausgerichteter Stifte 32 mit halbkreisförmigem Querschnitt, die dazu beitragen, die Sammelplatte 30 unter dem Halter 20 oder oben auf den Filtereinheiten 5 bei der Rückgewinnung auszurichten. Jeder der Stifte 32 ist mittig zu vier symmetrischen Mulden 37 angeordnet und so bemessen, daß er zwischen vier entsprechende Filtereinheiten 5 im Rückgewinnungsbetrieb paßt. Vorzugsweise ist die Platte zusammengesetzt aus etwa 1–20% Teflon^®-Harz und etwa 80–99% Polypropylen, in weiter bevorzugter Form 1–10% Teflon^®-Harz und 90–99% Polypropylen und in besonders bevorzugter Form etwa 2,5% Teflon^®-Harz und etwa 97,5% Polypropylen. Das Bindungsverhalten muß abgewogen werden gegen die Kosten bei der Bestimmung der optimalen Mengen von Teflon-Harz. Andere Kunststoffe und Zusatzmittel, die oben mit Blick auf den Filtereinheithalter 20 erwähnt wurden, sind ebenfalls geeignete Herstellungsmaterialien für die Sammelplatte. Vorzugsweise ist die Filtereinheit eine Filtereinheit Micron-10^®. Eine Umkehrmulden-Sammelplatte, die aus Polypropylen und Teflon^®-Harz besteht und 96 Mulden enthält, im wesentlichen wie in den 9, 10, 11 und 12 gezeigt, wird besonders bevorzugt.
Für den Fachmann versteht sich, daß die Filtereinheit ebenfalls aus dem polymeren Gemisch nach der vorliegenden Erfindung hergestellt sein kann.
Die Filtereinheithalte- und Sammelplatte sind so ausgebildet, daß sie in Verbindung mit Filtereinheiten zusammen in Screening-Untersuchungen mit hohem Durchsatz zur Absonderung kleiner Moleküle ("klein" bedeutet im allgemeinen Moleküle mit einem Molekulargewicht von etwa 300–600 Dalton, obgleich kleinere und größere Moleküle ihrerseits separiert werden können) arbeiten, die sich an bestimmte Proteine binden, von solchen, die dies nicht tun. Somit sieht die vorliegende Erfindung desweiteren eine Screening-Untersuchung mit hohem Durchsatz für die Bestimmung der Bindung kleiner Moleküle an Protein vor, die die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Eine das kleine Molekül enthaltende Flüssigkeitsprobe wird in eine Vorrichtung zur Probenherstellung wie eine Filtereinheit Microcon-3, 10, 30 der 100^® mit einer Membran eingegeben, die Moleküle mit einem bestimmten Molekulargewicht zurückhält;
(b) die gefüllte Filtereinheit nach Schritt (a) wird sicher in die Filtereinheithalteplatte 20 nach der vorliegenden Erfindung eingesetzt;
(c) der Boden der befüllten Filtereinheithalteplatte nach Schritt (b) wird sicher an der Oberseite der Umkehrmulden-Sammelplatte nach der vorliegenden Erfindung angebracht, derart, daß der Boden der Filtereinheit durch den Boden der Filtereinheithalteplatte (in der Ausführungsform, bei der eine andere Einrichtung zur Filtratlenkung nicht verwendet wird) vorsteht und sicher in die Mulden der Umkehrmulden-Sammelplatte eingepaßt ist;
(d) das Filtrat aus den Mulden der Sammelplatte wird gesammelt, um die kleinen Moleküle zu bestimmen, die sich nicht an das Protein binden ("frei"), wobei das Sammeln dadurch erfolgt, daß die Plattenkombination nach Schritt (c) für einen Zeitraum zentrifugiert wird, der dazu ausreicht, daß die freien kleinen Moleküle durch die Filtermembran hindurch und in die Sammelmulden hineingehen können, während im wesentlichen keines der gebundenen kleinen Moleküle durch die Membran hindurchgehen kann, und
(e) die gebundenen Moleküle aus dem Schritt (d) werden gesammelt, wobei das Sammeln dadurch erfolgt, daß die Mulden einer zweiten Umkehrmulden-Sammelplatte, mit nach unten weisenden Mulden, fest mit den oberen Enden der Filtereinheiten verbunden werden, die Kombination Filtereinheit/Umkehrmulde sicher umgekehrt und dann die umgekehrte Kombination für eine Zeitspanne zentifugiert wird, die dazu ausreicht, daß die gebundenen kleinen Moleküle in die Mulden der Sammelplatte gelangen können.

Diese Untersuchung wird ohne weiteres von in üblicher Weise geschulten Facharbeitern, denen die Lehren der vorliegenden Erfindung vermittelt werden, und ohne übermäßiges Experimentieren ausgeführt. Beispielsweise sind diese Facharbeiter durchaus in der Lage, die ausreichende Zentrifugiergeschwindigkeit und -zeit sowohl für den Schritt der Filtratsammlung (z.B. 3000 U/min für 30 Minuten) als auch der Retentatsammlung (z.B. 5 Minuten) zu bestimmen. Diese Untersuchung bietet eine Reihe von Vorteilen, die derzeit beim Screening mit hohem Durchsatz nicht erreichbar sind. Beispielsweise werden aufgrund der Einbeziehung von Teflon^®-Harz in beide Platten kleine Moleküle daran gehindert, an den Oberflächen der Mulden der Platten festzukleben, was damit zu einer genaueren Bewertung der freien und gebundenen Moleküle führt. Ferner kann das Filtrat aufgrund der Art der Ausbildung der Mulden der Umkehrmuldenplatten, die die Fähigkeit der Anbringung an jedem Ende der Filtereinheit haben, von den Ausgangsfiltereinheiten in einem bequemen Schritt gesammelt werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen das Wesen der vorliegenden Erfindung weiter. Jedoch ist es für den Fachmann selbstverständlich, daß diese Beispiele lediglich der Erläuterung der Erfindung dienen, wie sie vollständig in den Ansprüchen, die nachstehend folgen, definiert ist.
Beispiele
Studie 1
Verwendung von Filtereinheiten Microcon-10 statt Dialyseleitung Die Filtereinheiten Microcon-10 wurden von der Millipore Corporation (Danvers, MA Katalog #42407) bezogen. Die Filtervorrichtung Microcon-10 enthält eine schwach bindende, anisotrope, hydrophil-regenerierte Cellulosemembran (YM-Membran) mit einem Größenausschluß von 10.000 Dalton (1). Der die Membran enthaltende Probenbehälter wurde in ein Microfugerohr eingesetzt. Der Probenbehälter enthält bis zu 500 ul Lösung. Die Flüssigkeit wurde durch die Größenausschlußmembran über Zentrifugierung in einer Tisch-Mikrozentrifuge geleitet.
Das Ziel der ersten Untersuchung bestand darin nachzuweisen, daß die YM-Membran sehr niedrige Werte einer Bindung an kleine Moleküle zeigt; falls eine Membran zeigt, daß sie sich an eine große Anzahl unterschiedlicher kleiner Moleküle bindet, ist die Verwendung dieser Membran zum Bestimmung eines genauen Proteinbindungswertes für ein Molekül nicht möglich. Die Bindungseigenschaften der YM- Membran mit denjenigen zweier im Handel erhältlicher Dialysemembranen, Spectra/Por (Spectrum, Laguna Hills, CA Katalog #132670) und Slide-A-Lyzer (Pierce, Rockford, IL Katalog #66426) wurden verglichen; beide Dialysemembranen hatten ein Molekulargewicht-Rückhaltevermögen von 10.000 Dalton. Fünfzig kleine Moleküle, die eine Serie von Hydroxamsäuren darstellten, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, sich an die drei verschiedenen Membranen zu binden. Dies erfolgte, indem jedes Molekül, in einem Konzentrationsbereich von 1–1000 nM, in einem Volumen von 500 ul jeder der drei Membranen zugegeben wurde. Man ließ die Wirkstoffe in den Membranen 30 Minuten lang bei 37°C inkubieren. Nach der Inkubation wurde der Betrag der Bindung der Moleküle an jede Membran errechnet. Dies erfolgte, indem die Proben von den Membranen entfernt wurden und die Konzentration des verbleibenden Wirkstoffes durch Massenspektrometrie oder Bio-Analyse berechnet wurde (2). Die Bindung von Molekülen an die YM-Membran war sehr schwach. Siebenundvierzig der 50 getesteten Moleküle zeigten keine feststellbaren Bindungswerte und drei der Moleküle zeigten eine Bindung von 2 bzw. 3 bzw. 4%. Im Gegensatz dazu zeigten die beiden anderen Dialysemembranen eine sehr hohe Bindung: 25 Moleküle zeigten eine größere Bindung als 10% an Slide-A-Lyzer, wobei die Moleküle 44 bis 50 eine größere Bindung als 25% zeigten. In gleicher Weise zeigte auch die Membran Spectra/Por eine sehr hohe Bindung, wobei 20 Moleküle eine größere Bindung als 10% und die Moleküle 44 bis 50 eine größere Bindung als 20% zeigten.
Wegen dieses hohen Bindungsgrades, den Slide-A-Lyzer und Spectra/Por zeigten, verbietet sich die Verwendung dieser Membranen in einem Proteinbindungstest.
Beispielsweise wäre die Bestimmung genauer Proteinbindungswerte für die Verbindungen 44 bis 50 unter Verwendung der Membranen Slide-A-Lyzer und Spectra/Por unmöglich. Es wäre sehr schwierig zu unterscheiden, wieviel des Moleküls an Protein gegenüber an der Membran gebunden ist. Im Gegensatz dazu würde aufgrund der niedrigen Werte einer Bindung an die YM-Membran die Verwendung der Filtereinheit Microcon-10 in einem Proteinbindungstest genauere Daten erbringen.
Das Ziel des nächsten Experiments war es zu bestimmen, ob wir die Filtereinheiten Microcon-10 in einer Untersuchung zur Errechnung genauer Proteinbindungswerte kleiner Moleküle verwenden könnten. Ferner zu bestimmen, ob die unter Verwendung der Filtereinheiten Microcon-10 erzeugten Proteinbindungswerte mit denjenigen Werten vergleichbar sind, die unter Anwendung der Standard-Gleichgewichtsdialyse-Methode erzeugt wurden. Um diese Fragen zu beantworten, wurden 50 kleine Moleküle im Molekulargewichtsbereich von 200 bis 400 Dalton parallel auf Bindung an menschliche Serumproteine unter Verwendung der Filtereinheiten Microcon-10 oder der Gleichgewichtsdialyse mit den Spectra/Por-Membranen analysiert. Für die die Filtereinheiten Microcon-10 verwendende Untersuchung wurde jedes der 50 Moleküle auf eine Endkonzentration von 1 uM in 500 ul Ganzhumanserum verdünnt. Man ließ die Proben 30 Minuten lang bei 37°C in einem Brutapparat inkubieren. Nach der Inkubation wurden die Proben an die Microcon-10-Probenbehälter übergeben und der freie Wirkstoff wurde von serumgebundenem Wirkstoff durch Schleudern der Filtereinheiten bei 12.000 g bei 37°C für 10 Minuten getrennt.
20% des Gesamtvolumens (100 ul) ließ man durchlaufen, und die Wirkstoffkonzentration im Filtrat, das das freie, ungebundene Molekül enthält, wurde berechnet. Die Abnahme in der Wirkstoffkonzentration im Filtrat ist ein Maß der Proteinbindung und wird errechnet, indem einfach die Ausgangskonzentration (1 uM) durch die Wirkstoffkonzentration im Filtrat geteilt wird. Für die Untersuchung unter Verwendung der Gleichgewichtsdialyse wurde jedes der 50 Moleküle auf eine Endkonzentration von 1 uM in 500 ul Ganzhumanserum verdünnt. Mal ließ die Proben 30 Minuten lang bei 37°C in einem Brutapparat inkubieren. Nach der Inkubation wurden die Proben an ein Dialyseleitungssystem mit einem Oberflächenquerschnitt von 3 cm² übergeben und mit Dialyseklammern abgeschlossen. Das Leitungssystem wurde in 4 Liter Wasser eingesetzt, das auf 37°C vor-abgeglichen war. Jeder 4-Liter-Becher enthielt 10 Dialysebeutel, und man überließ die Proben 24 Stunden lang der Dialyse. Nach der Inkubation wurden die Proben gesammelt, und die Konzentration des im Beutel verbleibenden Wirkstoffes wurde berechnet.
Die Abnahme in der Wirkstoffkonzentration ist ein Maß der Proteinbindung und wird berechnet, indem einfach die Ausgangskonzentration (1 uM) durch die nach der Dialyse verbleibende Wirkstoffkonzentration geteilt wird. Die in beiden Untersuchungen erzeugten Proteinbindungswerte wurden verglichen (vgl. 3). Es liegt eine starke positive Korrelation zwischen den unter Verwendung der Gleichgewichtsdialyse erzeugten Bindungswerten und der Microcon-10-Zentrifugierung vor. Der R²-Wert beträgt 0,98 für die in der Studie analysierten 50 kleinen Moleküle. Diese Daten lassen erkennen, daß die Filtereinheiten Microcon-10 zur Berechnung genauer Proteinbindungswerte für kleine Moleküle vergleichbar mit der Gleichgewichtsdialyse benutzt werden können. Jedoch gibt es auch praktische Vorteile bei der Verwendung der Microcon-10-Vorrichtungen zur Bestimmung der Proteinbindung kleiner Moleküle; diese umfassen die Schnelligkeit der Untersuchung und eine reduzierte Einrichtungszeit.
Studie 2
Formulierung von Kunststoffmaterial, das geeignet ist, die Bindung kleiner Moleküle an den Boden der Mulden in den Sammelplatten zu reduzieren.
Sowohl die Retentat- als auch die Filtratsammelplatten waren ursprünglich aus reinem Polypropylen hergestellt. Jedoch zeigte nach einer Protein-Bindungsuntersuchung der im Filtrat enthaltene freie Wirkstoff eine Bindung an die Oberfläche der Mulde. Diese Bindung an Polypropylen wurde für zahlreiche kleine Moleküle beobachtet. Daher war in vielen Fällen die errechnete Wirkstoffkonzentration im Filtrat ungenau und führte zur Extrapolation fehlerhafter Proteinbindungswerte. Um die Bindung kleiner Moleküle an die Polypropylenplatten auszuschalten, wurde ein neuartiges Kunststoffgemisch formuliert. Teflon-Harz wurde mit reinem Polypropylen gemischt und zur Herstellung der Retentat- und Filterplatten verwendet. Der Hybridkunststoff enthielt 2,5% Teflon-Harz und 97,5% Polypropylen. Um die Bindungseigenschaften des Hybridkunststoffs mit denjenigen von reinem Polypropylen zu vergleichen, wurde die Bindung von 50 kleinen Molekülen an beide Kunststoffe bestimmt. Diese erfolgte durch Inkubieren jedes der kleinen Moleküle in einem Konzentrationsbereich (1–1000 nM) in der Mulde einer Platte, die aus reinem Polypropylen oder aus Polypropylen mit 2,5% Teflon hergestellt war. Man ließ die kleinen Moleküle in der Mulde in einem Volumen von 200 μl Wasser 30 Minuten lang bei 37°C inkubieren.
Nach der Inkubation wurden die Proben aus den Mulden entfernt, und die Wirkstoffkonzentration wurde unter Verwendung der Massenspektrometrie oder Bio-Analyse berechnet. Die Einbeziehung des Teflon-Harzes schaltete die Bindung an die Oberfläche der Mulden nahezu vollständig aus (13). Diese Daten lassen erkennen, daß die Einbeziehung von Teflon-Harz in die Polypropylenplatten bei der Verringerung der Bindung kleiner Moleküle und anderer Biomoleküle an den Boden der Mulden sehr wertvoll ist.

Claims

Vorrichtung zur Probenherstellung mit einer Flüssigkeitsrückhaltevorrichtung, wobei die Flüssigkeitsrückhaltevorrichtung folgendes umfaßt: Ein Substrat (20, 30) mit zumindest einer Substratmulde (21, 37), wobei sich das Substrat zusammensetzt aus einem polymeren Gemisch, bestehend aus (i) einem Polymer mit einer ersten Biomolekül-Bindekapazität und (ii) einem Zusatzpolymer mit einer zweiten Biomolekül-Bindekapazität, die kleiner ist als die erste Biomolekül-Bindekapazität, wobei die zumindest eine Substratmulde zur Probenaufnahme aus der Vorrichtung zur Probenherstellung ausgebildet ist, und wobei der Zusatz ausgewählt ist aus: Tetrafluorethylenharz, Polyetheretherketon, Polyphenylensulfid, Perfluoralkoxyalkan, fluoriertem Ethylenpropylen und einem Gemisch von natürlichen Mineralien und Acryl, auch bekannt als CORIAN^®.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der sich das Substrat aus etwa 1–10% Polytetrafluorethylenharz und etwa 90–99% Polypropylen zusammensetzt.
Vorrichtung nach Anspruch 2, bei der sich das Substrat aus etwa 2,5% Polytetrafluorethylenharz und etwa 97,5% Polypropylen zusammensetzt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Probenherstellungsvorrichtung einen Probenbehälter (6), einen Boden (8) und eine Membran (7) zwischen dem Probenbehälter und dem Boden umfaßt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der das Substrat eine Mehrzahl von Substratmulden (21, 37) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der der Zusatz Polytetrafluorethylenharz ist.