JP2003527568A - 低結合性液体保持用および濾過用器具 - Google Patents

低結合性液体保持用および濾過用器具

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ポリプロピレンおよびテフロン（登録商標）から構成される濾液−ホルダープレートおよび可逆−ウエル収集プレートに関し、そして、適合性のある濾過ユニットに関連して、小分子の蛋白質に対する結合性の評価のための高処理スクリーニング分析法におけるそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は米国仮出願出願番号60/145,527号の出願日の利益を請求する。
【０００２】
【発明の分野】
本発明は、高処理スクリーニング分析法に使用するための新規なプレート器具
に関する。
【０００３】
【発明の背景】
タンパク質に対する小分子やペプチドの結合は医薬産業において非常に重要な
被測定パラメーターである。医薬会社は、癌、AIDSおよび心臓病を含む生死にか
かわる疾患からアクネ(ACNE)、老人斑(age spots)および皺のような化粧品によ
る疾病までに及ぶ種々の疾患を治療するために新規な小分子やペプチドを設計し
ようと試みているので、循環器系を介してこれらの薬物を成功裡に投与すること
は重要である。インビトロの分析で非常に活性であることを示す多くの薬物が、
これらの化合物により呈される高い血漿タンパク質結合の理由のために動物モデ
ルおよびヒトにおいて有効性を示さない。血液中で分子がタンパク質に高く結合
されるとき、目標組織中に拡散するために利用できる薬物量が顕著に減少し、薬
物の有効性が必然的に低くなる。
【０００４】 小分子は血漿蛋白質に結合するかしないかは、普通、分子の寸法、アミノ酸組
成および分子の三次構造に依存する。小分子が血漿蛋白質に結合するとき、普通
、強イオンおよび疎水性相互作用により、相互作用がもたらされる。血液は数百
種の蛋白質を含有するので、いずれの小分子もある程度の結合を示す高い確率が
ある。したがって、結合の程度を決定することは重要であり、分子の有効性と直
接相関しうる。分子が分子構造に基づいて高または低結合性を示しそうかどうか
を予測することは非常に困難であることが証明された。分子が高または低蛋白結
合性を示すかどうかを決定する唯一の確実な方法は蛋白質結合分析で直接分子を
試験することである。
【０００５】 化合物により示される蛋白質結合のレベルを測定するのに使用される最も慣用
的な方法は平衡透析分析法である。このような分析法では、所定濃度の薬物（普
通１μＭ）を所定容量のヒト血漿（普通３ml）に加える。得られた混合物を、分
子量を30 kDaで遮断する透析管に加える。混合物を大量の水中（普通４リットル
）で２４時間３７℃でインキュベートさせる。インキュベートに続いて、サンプ
ルを集め、薬物の濃度を算出する。化合物が蛋白質に全く結合していないとき、
透析後の濃度は０であり、５０％結合のとき、濃度は0.5μＭ等である。平衡透
析法は正確でしかも一貫性があることが示されているけれども、それは非常に時
間消費性であり、研究者が１分析に試験できる薬物の数は研究者がいかに多くの
４リットルビーカーを設定できるかどうかに依存する。したがって、医薬産業で
は迅速、高処理分析の必要性がある。
【０００６】 プリプロピレン管やプレートのようなプラスチックに対してさえ小分子の結合
は問題となることがある。ポリプロピレン(PP)は、その低い非特異結合特性およ
び溶媒抵抗性に基づいて最も優れた種類の商業的に入手できるプラスチック製プ
レートであると現在考えられている。ポリプロピレンに対する非特異結合性(non
-specific binding： NSB)でさえ、正確な血漿蛋白質結合値の算出を妨害するこ
とがある。
【０００７】
【発明の概要】
本発明は、生体分子が可及的に少なく結合するか全く結合しないポリマー材料
および添加剤を含む濾過器具に関する。好適な実施態様では、濾過器具は濾液ユ
ニットホルダープレートを含み且つポリオレフィン、最も好ましくはポリプロピ
レンとテフロン（登録商標）樹脂とからなり、最も好ましくは約2.5%テフロン（
登録商標）樹脂および約97.5%ポリプロピレンからなる。前記プレートは複数の
貫通孔を含み、その各々が、Microcon-3, 10, 30 または 100（登録商標）濾過
ユニットのような濾過ユニットを確実に収容できる（図４、５、７および８参照
）。前記濾過ユニットは（図１参照）リザバーと濾過膜とを含み、濾過ユニット
ホルダープレート内に含まれる。濾過ユニットはさらに底部を含み当該底部は濾
過ユニットホルダープレート貫通孔の各々の開口部に配置され、好ましくは可逆
−ウエル収集プレート中に配置される（図９、１０、１１および１２参照）。前
記「可逆ウエル収集プレート」は、生体分子が可及的に少なく結合するかまたは
全く結合しないポリマー材料および添加剤も含み、好ましくは、ポリプロピレン
およびテフロン（登録商標）樹脂(最も好ましくは、再度、約2.5% テフロン（登
録商標）樹脂および約97.5% ポリプロピレン)を含み、そしてさらに複数のウエ
ルを含有する。収集プレートは、ウエルが濾過ユニットのいずれかの端部を収容
できるように設計される。
【０００８】 濾過ユニットホルダープレートおよび収集プレート、ならびにその中に含有さ
れる濾過ユニットは、共に確実に嵌合され、小分子やペプチドの蛋白質に対する
結合の高処理スクリーニング分析に使用される。プレートのデザインおよびそれ
らの組成は、本明細書中で記載されているように、このようなスクリーニングを
行うのに幾つかの利点を見込むことができる。
【０００９】 本発明の濾液プレート器具は、例えば、96個の Microcon濾過ユニットを嵌合
するように設計された独特の微小列形態(micro-array format)を備えた多数個の
ウエルプレートおよびホルダーから構成される。ホルダーは複数の貫通孔を有し
、そこに濾過ユニットが挿入される。濾過ユニットの隆起部(ridge)が貫通孔の
頂部に置かれており、濾過ユニットの底部（底:base）が突き抜けている。一旦
、濾過ユニットがホルダー中に挿入されると、ホルダーと同じ微小列形態を備え
た多数ウエル収集プレートの頂部に置かれる。収集プレートのウエル中に濾過ユ
ニットの底部の数ミリメートルが突き出るように構成を設計する。これは、遠心
分離のときにウエルからウエルにあふれ出るのを防止する一方法である。あるい
は、噴出口60（図１４）を使用して交叉汚染を避けることができるであろう。ホ
ルダー／プレートサンドイッチは揺動性バケツを備えた卓上遠心分離器を回転さ
せ、濾液を収集することができる。プレートは、前記サンドイッチを互いの頂部
で積み重ねができ、より多くのプレートが一度に回転できるように設計された。
【００１０】 方法に関して、サンプル調製ユニットを特注設計(custom-designed)のホルダ
ー中に挿入し、次いでそのホルダーを収集プレートの頂部に置く。例えば、２０
０μｌのサンプルを１μＭの濃度の小分子の存在下または不存在下で濾過ユニッ
トに加える。プレートをマイクロタイタープレートホルダーを備えた揺動バケツ
ローター中に入れる。3000 gのような適当な速度で３０分間プレートを回転させ
る。遊離小分子（典型的な分子量は３００〜６００ダルトン）は容易に濾過膜を
通過し、収集ウエル中に入る。結合分子は血漿蛋白質と共に保持され、20,000〜
500,000ダルトンの分子量範囲である。収集プレートは遊離化合物（濾液）を含
み、濾過リザバーは結合化合物（保持体）を含む。濾液中に含有されている遊離
化合物は、質量分光分析、エレクトロスプレー(electrospray)またはバイオアッ
セイにより決定することができる。
【００１１】 保持体を収集するために、別の収集プレートをウエルが濾過ユニットの頂部に
下向きに面するようにして置く。このプレートは濾過ユニットの開口端部の周り
で緊密に嵌合できるように設計されている。次に、ホルダーを逆さにしてさらに
５分間回転してその第二の収集プレート中に保持体を収集する。次いで、濾液は
結合化合物について分析されるよう準備する。最後に、濾過ユニットホルダーお
よび収集プレートを、プレートの外部上に、これらのプレートがロボット工学を
使用する自動化を容易にするＶ字溝を持つように設計する。
【００１２】
【発明の詳細な記述】
本発明は、サンプル調製器具、測定（ピペットのような）器具または貯蔵（管
のような）器具に使用するためのポリマーブレンドに関し、当該ブレンドは生体
分子（すなわち、合成小分子、ペプチド、DNAやRNAのような核酸、オリゴヌクレ
オチド、多糖類、脂質等を含む生命過程に影響を与えるかまたは関連する分子）
に可及的に少なくしか結合しないか全く結合しない。ポリマーブレンドは、液体
サンプルと接触するか接触しそうな器具の一部に使用するのが好ましい。好適な
実施態様では、この器具は濾過ユニットホルダープレート、Millipore Corporat
ionから市販されているMICROCON濾過ユニットのような濾過器具、および１種以
上の任意の収集ユニットを含む。例証の目的のため、下記の検討は本好適実施態
様に焦点を当てるが、当業者は異なる形状のその他のサンプル調製器具を本発明
が包含することを了解するであろう。
【００１３】 先ず図１を参照すると、本発明で使用するのに適している濾過ユニット５が示
されている。示されている濾過ユニットはMillipore Corporationから市販され
ているMICROCON-10濾過ユニットである。それは、サンプルリザバー６、図に描
写されているようなリザバー６の下部に位置する底部８、および底部８からリザ
バー６を分離する膜７を含む。膜はユニット５中に支持され、そして水密シール
がサンプルリザバー６、膜７およびＯリングのような膜支持体の周縁の間に与え
られる。１以上の濾液ダクトがユニット５中に与えられ、膜７から底部８への濾
液の通路となる。好ましくは、膜は、大分子を保持すると同時に小分子を通過さ
せることができるYM膜のような保持膜である（膜を通過する小分子の通路は、例
えば、分子が血漿蛋白質に結合するかどうかを決定できる）。
【００１４】 図２は、このような膜に分子が結合することを例証する。特に、50種の生体分
子（一連のヒドロキサム酸）の結合を、濃度１〜1000ｎＭの範囲の各分子を３種
の膜各々と一緒にインキュベートすることにより決定した。薬物を膜と500μｌ
の容量中で３０分間３７℃でインキュベートさせた。インキュベートに続いて、
サンプルを収集し、薬物濃度を算出した。濃度の減少を使用して膜に結合したレ
ベルを算出した。すべての場合、YM膜が、Spectr/porまたはSlide-A-Lyzer膜に
等しいかそれよりも低い小分子との結合を示す。殆どの場合で、YM膜は実質的に
低い結合を与える。
【００１５】 好適な実施態様では、本発明は、ポリマー材料からなる濾過ユニットホルダー
プレート20を提供する（図４、５および６を参照）。このポリマー材料には、ポ
リオレフィン、PFA、 PTFE、 CORIANのようなものや、スチレン、アセトブチル
スチレン、ポリカーボネートもしくはアクリル樹脂のような熱可塑性樹脂があり
、好ましくはポリオレフィンであり、最も好ましくはポリプロピレンである。生
体分子、例えば、蛋白質および／またはDNAおよび／またはRNAに関して結合特性
を可及的に少なくさせるか全く示させない添加剤を、得られたブレンドを非結合
性にさせるのに適切な量でポリマー材料に加える。適切な添加剤には、テフロン
（登録商標）樹脂、ポリエーテルテーテルケトン(PEEK)、ポリフェニレンスルフ
ィド(PPSすなわちRYTON)、ペルフルオロアルキルオキシアルカン(PFA)、フッ素
化エチレンプロピレン(FEP)、およびCORIAN (天然鉱物と純粋アクリル樹脂との
混合物)等がある。好ましくは、ポリマーはポリプロピレンであり、そして 添加
剤はテフロン（登録商標）樹脂である。
【００１６】 濾過ユニットホルダープレート20は、複数の貫通孔２１、例えば、96個の貫通
孔含み、ここで、当該貫通孔の各々は濾過器具、例えば、Microcon-3, 10, 30
または100（登録商標）フィルターユニットを確実に収容でき、前記貫通孔21は
前記濾過ユニット5の底部8を貫通孔の底部表面を通過させて濾液収集器具中に入
れるが、前記濾過ユニット５のリザバー６または濾過膜７を通過させない適切な
寸法の貫通孔の底部表面に開口部22を有し（図５）、当該貫通孔21は好ましくは
円形外周であり、当該貫通孔21は好ましくはプレート内で対称的に配列され、そ
して各貫通孔21の中心は、当該各貫通孔の上下の列の貫通孔21と垂直に整列し且
つ各貫通孔の中心は当該貫通孔21の左右の行の貫通孔の中心と水平に整列してい
る。
【００１７】 図５および６に示すことができるように、各濾過ユニット５、さらに詳細には
各濾過ユニット５の底部８が濾過ユニットホルダー20の各貫通孔21の各開口部22
に座す。底部８の外径は開口部22の径よりも僅かに小さく、貫通孔21中に当該底
部が密に嵌合できる。膜７の下で底部８の外径はリザバー６の外径よりも小さく
、したがって、肩９を形成する（図１）。肩９は開口部22の頂部に置かれ、ユニ
ット５がウエル21中にさらに侵入するのを防止する垂直停止を与える。好ましく
は、底部８の低い方の自由端部が開口部22を通過して僅かに突き出て、その結果
、底部から流れるいずれの濾液も収集プレート（以下で検討する）中の対応する
ウエル中にその他の近くのウエルに漏れるまたは近くのウエルを汚染させること
なく流れる。しかし、濾過ユニット５は貫通孔21中で過度に深く挿入されるべき
でない。ユニット５中の膜をシールするのに使用されるＯリングに応力がかかり
、結果としてつぶれる可能性があるからである。あるいは代替として、底部８の
低い方の自由端部は濾過ホルダー20の底面で実質的に平らか平らであり、噴出口
60（図１４、１４Ａ）を使用して交叉汚染を回避するために濾液の流れを導くこ
とができる。噴出口60は濾過ユニット５の一部であることができ、流体が落下す
る収集プレートのウエルから最適な距離に配置される。
【００１８】 １実施態様では、前記濾過ユニットホルダープレート20の外部底面は複数のペ
グ23（図５）を含み、可逆−ウエル収集プレートに前記ホルダープレートを接続
するのに足る数と寸法のペグが突き出る（前記「可逆−ウエル収集プレート」は
本明細書中で詳述し特許請求した可逆収集プレートである）。あるいは代替とし
て、収集プレート表面は複数の節を含むことができ、これらの節は濾過ユニット
ホルダー20の底の対応する凹部中に受容されこれらの集成を容易にする。前記濾
過ユニットホルダープレート20の外部寸法は高処理スクリーニング分析法に使用
される標準96ウエルプレートの外部寸法と概ね同じである。好ましくは、前記濾
過ユニットホルダープレート20は約１〜10％のテフロン（登録商標）樹脂および
約90〜99％のポリプロピレン、最も好ましくは約2.5％のテフロン（登録商標）
樹脂および約97.5％のポリプロピレンから構成される。テフロン（登録商標）樹
脂のこの配合は分子の前記プレートのウエル21の表面に対する結合を阻止し、し
たがって、より効率的で信頼できる分析をもたらす。
【００１９】 万が一、サンプルと濾過ユニットホルダープレート20との接触が起こりそうも
ない場合、本発明のポリマーブレンドの使用は器具のこの部分について必要ない
。
【００２０】 本発明はさらに収集プレート30（図６〜12）も提供し、当該プレートは、好ま
しくは可逆−ウエル収集プレートである。この収集プレート30はサンプルと接触
し得るので、好ましくは本発明のポリマーブレンドを含み、最も好ましくはポリ
プロピレンとテフロン（登録商標）樹脂である。収集プレート30は、好ましくは
複数のウエル37も含み、ここで、当該ウエル37の各々は Microcon-3、10、30ま
たは100（登録商標）濾過ユニットを確実に収容でき、各ウエル37の頂部は濾過
ユニットのいずれかの端部を確実に収容でき、ウエル37は、前記濾過ユニットの
いずれかの端部を底面が確実に収容できるに足るＵ−型底面を備えることができ
、そして、前記濾液収集プレートの側面および底面が、当該プレートが標準のロ
ボットまたは自動化装置によりうまく扱われることができるに足る数と寸法の複
数のＶ−型溝を有することができ、そして、前記濾液収集プレートの外部寸法が
標準の96−ウエルプレートの外部寸法と概ね同じである。図10に示されているよ
うに、収集プレート30は、好ましくは複数の整列した横断面半円のピン32を有し
、当該ピンはホルダー20の下部の、または回収中の濾過ユニット５の頂部の収集
プレート30を整列させるのを助ける。ピン32の各々は４個の対称ウエル37につい
て中心に配置され、回収時で４個の対応濾過ユニット５間で嵌合するように寸法
合わせされている。好ましくは、プレートは約１〜20％のテフロン（登録商標）
樹脂および約80〜99％のポリプロピレン、より好ましくは、１〜10％のテフロン
樹脂および90〜99％のポリプロピレン、最も好ましくは、約2.5％のテフロン樹
脂および約97.5％のポリプロピレンから構成される。結合能力は、最適量のテフ
ロン樹脂を決定する際にコストに対して手加減されなければならない。濾過ユニ
ットホルダー20に関して上述のその他のプラスチックおよび添加剤も収集プレー
トのために構成の適切な材料である。好ましくは、濾過ユニットはMicron-10（
登録商標）濾過ユニットである。図９、１０、１１および１２に示されているよ
うなポリプロピレンおよびテフロン（登録商標）樹脂を含み、実質的に96ウエル
を有する可逆−ウエル収集プレートが特に好適である。
【００２１】 当業者は、濾過ユニットが本発明のポリマーブレンドから構成することもでき
ることを了解するであろう。 濾過ユニットホルダーおよび収集プレートは、濾過ユニットに関連し、一定の
蛋白質に結合する小分子（「小」とは、一般に約300〜600ダルトンの分子量を有
する分子を意味するが、より小さい分子およびより大きい分子も同様に分離でき
る）を結合しないものから分離する高処理スクリーニング法において共に作動す
るように設計される。したがって、本発明はさらに下記のステップを含む蛋白質
に対する小分子の結合性を検出するための高処理スクリーニング分析法を提供す
る。すなわち、当該ステップは、 (a)小分子を含有する液体サンプルを、一定の分子量の分子を保持する膜を有
するMicrocon-3, 10, 30または100（登録商標）濾過ユニットのような試料調製
器具中に装填し、 (b)ステップ(a)の前記装填済み濾過ユニットを本発明の濾過ユニットホルダー
プレート20中に確実に配置し、 (c)ステップ(b)の前記装填済み濾過ユニットホルダープレートの底部を本発明
の可逆−ウエル収集プレートの頂部に確実に付けさせ、その結果、前記濾過ユニ
ットの底部は濾過ユニットホルダープレートの底部を通過して突き出て（濾液を
導くためのその他の手段を使用しない場合の実施態様）、しかも可逆−ウエル収
集プレートのウエル中に確実に嵌合させ、 (d)蛋白質に結合しない（「遊離」）小分子を決定するように収集プレートの
ウエルから濾液を収集し、ここで当該収集は、遊離小分子が濾過膜を通過して収
集ウエルに入ることができるが、結合した小分子のいずれも膜を実質的に通過し
ないのに足る時間にわたってステップ(c)のプレート組合せを遠心分離すること
による、そして (e)ステップ(d)から結合した分子を収集する、ここで、当該収集は第二の可逆
−ウエル収集プレートのウエルを連結させることにより、当該ウエルは、濾過ユ
ニットの頂部端部に対して確実に下向きに面し、濾過ユニット／可逆−ウエル組
合せを確実に逆にし、次いで、逆にした組合せを、結合した小分子が収集プレー
トのウエル中に入ることができるに足る時間にわたって遠心分離する各ステップ
である。
【００２２】 前記分析法は、本発明の教示を与えられた当業者により過度の実験をすること
なく容易に実施される。例えば、前記当業者は、適切な遠心分離速度や濾液収集
（例えば、３０分間3000 rpm）および保持体収集(例えば、５分）ステップの双
方を十分決定できる。前記分析法は、現在高処理スクリーニング技術で利用でき
ない多くの利点を提供する。例えば、双方のプレートにテフロン（登録商標）を
配合するために、小分子はプレートウエルの表面に粘着することがなく、したが
って、遊離分子および結合分子のより正確な評価に導くことができる。さらに、
濾過ユニットのいずれの端部にも結合できる能力を有する可逆−ウエルプレート
のウエルの構造の性質のために、濾液を都合のよいステップで最初の濾過ユニッ
トから収集できる。
【００２３】
【実施例】
下記の実施例は本発明の性質をさらに例証する。しかし、当業者は、これらの
実施例が特許請求の範囲で十分に定義したとおりの本発明の単なる例証であるこ
とを容易に理解するであろう。
【００２４】 検討１ 透析管の代わりにMicrocon-10濾過ユニットを使用 Millipore Corporation (Danvers, MA カタログ#42407)からMicrocon-10濾過
ユニットを購入した。Microcon-10濾過ユニットは低結合性、異方性、親水性再
生セルロース膜(YM膜)を含み、10,000ダルトンのサイズ排除能力を有する（図１
）。微小除外管中に前記膜を含むサンプルリザバーを挿入した。サンプルリザバ
ーは500μｌまでの溶液を保持しうる。卓上マイクロ遠心分離機中で遠心分離に
よりサイズ排除膜に液体を通過させた。
【００２５】 最初の実験の目的は、YM膜が小分子に対して非常に低いレベルで結合すること
を示すことを立証することにあり、膜が多数の異なる小分子に結合することが示
される場合、分子についての正確な蛋白質結合値を決定するためのその膜の使用
は不可能である。YM膜の結合特性を２種類の市販透析膜であるSpectra/Por (Spe
ctrum, Laguna Hills, CA カタログ# 132670)およびSlide-A-Lyzer (Pierce, Ro
ckford, IL カタログ# 66426)と比較した。これらの透析膜双方は10、000ダルト
ンの分子量遮断を含んでいた。一連のヒドロキサム酸を表す50種の小分子を３種
の異なる膜に結合する能力について試験した。これは、500μｌの容量中濃度１
〜1000ｎＭの範囲の各分子を３種の膜の各々に加えることにより行った。これら
の薬物を膜中で３０分間３７℃でインキュベートさせた。インキュベート後、各
膜に対する分子の結合量を算出した。これは、膜からサンプルを除去し、質量分
光測定またはバイオアッセイにより薬物残留濃度を算出することにより行った（
図２）。YM膜に対する分子の結合は非常に低かった。試験した50分子のうち47分
子が検出できないレベルの結合を示し、残りの３分子がそれぞれ2、 3および4 %
結合を示した。対照的に、その他の２種類の透析膜は非常に高い結合を示した。
すなわち、25分子がSlide-A-Lyzer に対して10％を超える結合性を示し、分子44
〜50が25％を超える結合性を示した。同様に、Spectra/Por膜も非常に高い結合
性を示した。すなわち、20分子が10％を超える結合性を示し、分子44〜50が20％
を超える結合性を示した。
【００２６】 Slide-A-LyzerおよびSpectra/Porにより示された高程度の結合性のため、蛋白
結合性分析においてこれらの膜の使用は賢明でない。例えば、化合物44〜50につ
いての正確な蛋白質結合値を決定することはSlide-A-LyzerおよびSpectra/Por膜
を使用しては不可能である。どれくらい多くの分子が蛋白質対膜に対して結合さ
れるか区別するのは困難である。対照的に、YM膜に対して結合レベルが低いので
、蛋白質−結合性分析においてMicrocon-1 0濾過ユニットを使用してより正確な
データを得るであろう。
【００２７】 次の実験の目的は、小分子の正確な蛋白質結合値を算出する分析においてMicr
ocon-10濾過ユニットを使用できるかどうかを決定することであった。さらに、M
icrocon-10濾過ユニットを使用して得られた蛋白質結合値が標準の平衡透析法を
使用して得られた結合値に匹敵するかどうかを決定することであった。これらの
問題を検討するために、200〜400ダルトンの分子量の範囲の50種の小分子をMicr
ocon-10濾過ユニットかまたはSpectra/por膜を用いる平衡透析を使用してヒト血
清蛋白質に対する結合について平行して分析した。Microcon-10濾過ユニットを
使用する分析のために、50種の各分子を500μｌの全ヒト血清中に１μＭの最終
濃度に希釈した。インキュベーター中でサンプルを３０分間３７℃でインキュベ
ートさせた。インキュベート後、サンプルをMicrocon-10サンプルリザバーに移
し、遊離薬物は濾過ユニットを12、000gで１０分間３７℃で回転させることによ
り血清結合薬物から分離した。
【００２８】 総容積（100μｌ）の20％を通過させ、遊離、すなわち未結合分子を含有する
濾液中の薬物濃度を算出した。濾液中の薬物濃度の減少は蛋白質結合性の尺度と
なり、濾液中の薬物の濃度により出発濃度（１μＭ）を単に割ることにより算出
される。平行透析法を使用する分析のため、50種の分子の各々を、500μｌの全
ヒト血清中１μＭの最終濃度に希釈した。サンプルをインキュベーター中で３０
分間３７℃でインキュベートさせた。インキュベートに続いて、サンプルを表面
積３ｃｍ2の透析管に移し、透析クランプでシールした。この管を、３７℃に予
め平衡化させた４リットルの水中に入れた。４リットルビーカーの各々は10個の
透析袋を有し、サンプルを24時間透析した。インキュベートに続いて、サンプル
を集め、袋中に残留する薬物の濃度算出した。
【００２９】 薬物濃度の減少は蛋白質結合性の尺度であり、出発濃度[1 μM]を透析後に残
留する薬物の濃度により単に割ることにより算出される。両分析において得られ
た蛋白質結合値を比較した（図３参照）。平行透析分析法およびMicrocon-10遠
心分離法を使用して得られた結合値間に強力な正の相関がある。この検討で５０
種の小分子についてR2値は0.98である。これらのデータは、Microcon-10濾過ユ
ニットを使用して平衡透析に匹敵しうる小分子についての正確な蛋白質結合値を
算出できることを示す。しかし、小分子の蛋白質結合性を決定するためにMicroc
on-10器具を使用するのに実際的な利点もある。これらには分析速度および設定
時間の少なさがある。
【００３０】 検討２ 収集プレートのウエルの底部に対する小分子の結合性を減少できるプラスチッ
ク製容器の配合物 保持体収集プレートおよび濾液収集プレートの双方は最初ポリプロピレン単独
から構成された。しかし、蛋白質−結合性分析に続いて、濾液中に含まれる遊離
薬物はウエルの表面に対して結合性を示した。ポリプロピレンに対するこの結合
性は多くの小分子について観察された。したがって、多くの場合で、濾液中の薬
物の算出濃度は正しくなく、間違った蛋白質結合値の推測値に導いた。ポリプロ
ピレンプレートに対する小分子の結合性を排除するために、新規なプラスチック
の混合物を配合した。テフロン樹脂を純粋なポリプロピレンと混合して保持体プ
レートと濾液プレートを製造するのに使用した。混成プラスチックは2.5%テフロ
ン樹脂および97.5%ポリプロピレンを含有した。混成プラスチックの結合特性を
純粋ポリプロピレンの結合特性と比較するために、50種の小分子の両プラスチッ
クに対する結合性を決定した。これは、純粋ポリプロピレンまたはポリプレンと
2.5％テフロンから構成されるプレートのウエル中に所定濃度範囲(1〜1000 nM)
の小分子の各々をインキュベートすることにより行った。小分子を、ウエルの20
0μｌの容量の水中で３０分間３７℃でインキュベートさせた。
【００３１】 インキュベートに続いて、ウエルからサンプルを取り出し、薬物の濃度を質量
分光測定法またはバイオアッセイを使用して算出した。テフロン樹脂の配合によ
り殆ど完全にウエル表面の結合性を排除させた（図１３）。これらのデータは、
ポリプロピレンプレートにテフロン樹脂を配合すると小分子またはその他の生体
分子のウエルの底部に対する結合性を減少させるのに非常に有用であることを示
す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Microcon-10濾過ユニット（図１）および収集管（図１Ａ）を示す。Microcon-
10濾過ユニットは500μｌまでの液体を収容するリザバー、ＹＭ膜および遠心分
離中に微小除去物−収集管中に濾液を導く底部から構成される。
【図２】 膜に対する小分子の結合性を示す。YM、 Spectra/por、およびSlide-A-Lyzer
各膜に対する５０種の小分子の結合を、各３種の膜と共に、１〜1000ｎＭの濃度
範囲の各分子をインキュベートすることにより決定した。500μｌの容量中３０
分間３７℃で薬物を膜と共にインキュベートさせた。インキュベート後、サンプ
ルを収集し、薬物濃度を算出した。濃度の減少を使用して膜に対する結合性のレ
ベルを算出した。
【図３】 平衡透析法とMicrocon-10遠心分離との間の相関関係を示す。５０種の小分子
の血漿結合性の量を標準的な平衡透析法およびMicrocon-10遠心分離法を使用し
て算出した。これらの２種の分析法において形成した結合値を比較し相関曲線を
プロットした。Ｒ2値は0.98である。
【図４】 濾過ユニットホルダーを示す。96個のMicrocon濾過ユニットを収容できる新規
な微小列形態を含む濾過ユニットホルダーの平面図である。ホルダーは９６個の
貫通孔を有し、当該貫通孔に濾過ユニットの底部が座し、そして一実施態様では
収集プレート中に当該底部が突き出る。
【図５】 図５、５Ａは濾過ユニットホルダーを示す。これらの図はホルダーの側面図（
図５）および底面図（図５Ａ）である。側面図は、ホルダーの貫通孔中にMicroc
on濾過ユニットの貫通を例証する。濾過ユニットの隆起部は貫通孔の頂部に置か
れ、底部は数ミリメートル突き出ている。ホルダーの底部は、濾液収集プレート
中で把持する数個の突き出たペグを含む。これにより、ホルダーが遠心分離して
いる間に収集プレートの頂部に密に嵌合できる。
【図６】 図６、６Ａは濾過ユニットホルダーを示す。濾過ユニットホルダーと収集プレ
ートとの集成を例証する。96個のMicroconユニットを有するホルダーが収集プレ
ートの上に配置されている。濾過ユニットの底部が貫通孔中に突き出ており、ホ
ルダーの底部にペグがこの２部品をシールする。
【図７】 収集プレートを示す。96個のMicrocon濾過ユニットを収容できる新規な微小列
形態を有する収集プレートの平面図である。このプレートは濾過ユニットホルダ
ーと適合性である。このプレートは標準的な96−ウエルプレートの外形寸法をも
つ底ウエルを有する。ウエルは平面、Ｕ型、Ｖ型または用途に依存してその他の
形状であることができる。このプレートはロボットの腕と適合できるプレートを
製造するＶ溝を有する。
【図８】 図８は収集プレートの側面図を示す。このプレートは96個のMicrocon濾過ユニ
ットを収容するように設計されている。濾過ユニットはウエル中に直接挿入され
ることができる。例示した実施態様では、濾過ユニットの隆起部がウエルの外側
の上部に置かれ、ちょうど濾過ユニットの底部がウエル中に突き出る。この特徴
はサンプルの遠心分離中にウエルからウエルへあふれ出るのを防止する。
【図９】 可逆−ウエル収集プレートを示す。このプレートは96個のMicrocon濾過ユニッ
トを収容できる新規な微小列形態を有する。ホルダーは96個の貫通孔を有し、当
該貫通孔で濾過ユニットの底部が通過し、濾液の回収のため可逆−ウエル収集プ
レートのウエル中に突き出る。このホルダーは、可逆ウエル−収集プレートのウ
エル中にも嵌合できるMicroconリザバーの開口端部をも整列させる。この特徴は
、96ウエル逆回転を可能にする。
【図１０】 可逆−ウエルホルダーを示す。この図は保持体ホルダーと収集プレートとの整
列を示す側面図である。この図は、ホルダーと収集プレートとの間の微小列形態
を例証する。
【図１１】 可逆−ウエル収集プレートの平面図（図１１）、正面図（図１１Ａ）および側
面図（図１１Ｂ）を示す。この収集プレートは96個のMicrocon濾過ユニットを収
容できる新規な微小列形態を有する。このプレートは濾過ユニットのいずれかの
端部中にウエルが嵌合できるように設計された。したがって、好適な実施態様で
は、可逆−ウエル収集プレートは濾液および保持体の双方の収集のために使用で
きる。このプレートは可逆−ウエルホルダーと適合性である。このプレートは、
標準の96−ウエルプレートの外形寸法をもつＵ字−底部ウエルを有することがで
きる。このプレートは、ロボット腕と適合させるＶ−溝を含むこともできる。
【図１２】 可逆−ウエル収集プレートを示す。可逆−ウエル収集プレートの側面図は、ホ
ルダー中に含まれるMicrocon濾過ユニットの両側がいかにしてウエルに嵌合でき
るかを例証する。収集プレート上に形成された上昇部は、Microconリザバーの開
口端部がウエル中に密に嵌合できるようにする。この独特の特徴は、単一の実験
でウエルからウエルにあふれ出ることなく濾液と保持体との双方の収集をできる
。
【図１３】 小分子のポリプロピレンに対する結合ならびにポリプロピレンおよびテフロン
（登録商標）に対する結合を示す。50種の小分子の、ポリプロピレンならびにポ
リプロピレンおよび2.5％テフロンに対する結合を、濃度１〜1000ｎＭの範囲の
各分子と、これら２種のプラスチック製プレートとをインキュベートすることに
より決定した。容量500μｌ水のウエル中で３０分間３７℃で薬物をインキュベ
ートさせた。インキュベートに続いて、サンプルを集め、薬物濃度を算出した。
濃度の減少を使用してプラスチックに結合したレベルを算出した。
【図１４】 収集プレートのウエル中に流れを導く噴出口を使用する代替実施態様を示す。
【図１５】 種々の量のテフロン樹脂および１０種の異なるヒドロキサム酸に対する得られ
た結合を示す図表を示す。データは、テフロン樹脂が１％程度の低い量のとき試
験したすべての化合物について事実上結合しなかったことを示す。化合物Ｈ、Ｉ
およびＪについての結合レベルは、2.5％および１％程度の低いテフロン樹脂量
でさえ許容できるレベルとなった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 BB05 BB50 DA80 HA20 2G052 AA28 AB00 AD06 AD26 AD46 DA06 DA21 EA01 EA14 JA04 JA09 JA16 4B029 AA09 CC01 GA02 HA05 4G057 AB07 AB38

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 サンプル調製器具とともに使用するのに適している液体保持
    用器具であって、少なくとも１個の支持体ウエルを有する支持体を含み、当該支
    持体は、第１の生体分子結合能力を有するポリマーと当該第１の生体分子結合能
    力よりも小さい第２の生体分子結合能力を有する添加剤とから構成され、前記少
    なくとも１個の支持体ウエルは前記サンプル調製器具からサンプルを受容する形
    状である、前記液体保持用器具。
  2. 【請求項２】 前記支持体が約１〜１０％のテフロン（登録商標）樹脂と約
    ９０〜９９％のポリプロピレンとから構成される請求項１に記載の器具。
  3. 【請求項３】 記支持体が約２．５％のテフロン（登録商標）樹脂と約９７
    ．５％のポリプロピレンとから構成される請求項２に記載の器具。
  4. 【請求項４】 前記サンプル調製器具がサンプルリザバー、底部、および当
    該サンプルリザバーと前記底部との間の膜を含む請求項１に記載の器具。
  5. 【請求項５】 前記支持体が複数の支持体ウエルを有する請求項１に記載の
    器具。
  6. 【請求項６】 前記添加剤がテフロン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン、
    ポリフェニレンスルフィド、ペルフルオロアルコキシアルカン、フッ素化エチレ
    ンプロピレンおよびコリアンからなる群から選択される請求項１に記載の器具。
  7. 【請求項７】 タンパク質に対する生体分子の結合を検出するための高処理
    スクリーニング分析法であって、 (a) 生体分子を含有する液体サンプルを、底部とタンパク質を保持する膜と
    を有するサンプル調製器具中に装填するステップ、 (b) ステップ(a)の前記装填済みサンプル調製器具を、少なくとも１個の支持
    体ウエルを有する支持体中に確実に入れるステップ、 (c) ステップ(b)の前記装填済み支持体をウエルを有する収集プレートの頂部
    に確実に付けさせ、その結果、前記サンプル調製器具の前記底部が前記支持体の
    前記ウエル中に突き出て前記収集プレートの前記ウエル中に確実に嵌合するよう
    になるステップ、 (d) 前記タンパク質に結合しない生体分子を決定するために前記収集プレー
    トの前記ウエルから濾液を収集するステップであり、当該収集が、ステップ(c)
    の組み合わせを、遊離生体分子が前記膜を通過して前記収集ウエルに入ることが
    できるが、結合した生体分子のいずれも当該膜を実質的に通過できないような適
    切な時間にわたって遠心分離をすることによる当該ステップ、そして (e) ステップ(d)からの結合分子を収集するステップであり、当該収集するス
    テップが第２の収集プレートのウエルであって、当該第２プレートの当該ウエル
    が下向きになっているウエルを前記サンプル調製器具の頂部末端に確実に連結さ
    せ、前記連結後濾過ユニット／可逆−ウエルプレートを確実に逆さまにし、次い
    で、逆さまにした組み合わせを結合生体分子が第２収集プレートのウエル中に入
    るのに足る時間にわたって遠心分離をする、各ステップを含む前記高処理スクリ
    ーニング分析法。
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