JP2005528630A - 薬物の結合性を研究するための限外ろ過装置 - Google Patents
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Abstract
試験を受ける化学物質ＣＥの低い非特異的結合性ＮＳＢおよび高いタンパク質保持性を有する支持ＵＦメンブランを１つの装置に組み合わせたものはＳＢＳに従うことが難しい。ＮＳＢを低減させ、タンパク保持性を改善し、薬物や薬物候補（および他の小分子）などのＣＥのＮＳＢを減少させる簡単で柔軟な方法を提供するために使用される、１つまたは複数の一体化ウエルを形成するためにメンブランはヒートシールされ、したがって薬物の結合性研究が、これらの化合物のインヴィーヴォでの挙動をより詳細に予測することができる。
Description
本発明は、薬物や可能性のある薬物候補や治療効果のある分子などの化学物質のインヴィーヴォ試験のためのＵＦメンブランを含む、単一または複数ウエル装置に関する。さらに詳しくは、本発明は、薬物−タンパク質の結合性のインヴィーヴォ測定、あるいは臨床試験の最中での遊離した薬物濃度の測定のための、低い非特異的結合性および高いタンパク質保持性を有するＵＦメンブランを含む、単一または複数ウエル装置に関する。
タンパク質の結合性は、血漿中の利用できる遊離ＣＥの量および／または血流中の薬物などのＣＥの分布を予測するので、薬物、薬物候補、治療薬、およびその他の小分子物質などの化学物質（ＣＥ）の、吸収、分配、代謝および排出（ＡＤＭＥ）、ならびに前臨床試験に対する重要な特性である。
煩わしい手順、１８から２４時間のインキュベーションを要する平衡透析が、ＣＥのタンパク質結合性を決定するために現在受け入れられている方法である。
さらに近年では、ＣＥの結合特性を決定するより速い方法として、マルチウエルプレート中で限外ろ過メンブランを使用することが導入された。
通例のごとく、このメンブランは極めて脆いために、それをウエル内に挿入してウエルとの間に液漏れのないシールを形成する簡便な方法が全くなく、マルチウエルプレートに入れる限外ろ過メンブランは未だ市販されていない。
別法として、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）のミリポアコーポレーションから入手できる、マイクロコン（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）（登録商標）９６システムとして知られている９６ウエル装置は、９６個の別々のろ過装置で作られていて、それぞれがろ過装置内にガスケットによりシールされたＵＦメンブランを有している。国際公開０１／０５５０９Ａ１号パンフレットを参照のこと。次に、これら９６個の装置を９６ウエル配列（８×１２）に配置し、そのろ液を回収するために、非特異的結合性の低い受器プレートを使用する。この受器プレートは、多種類の小分子および薬物に対してうまくはたらき、従来技術に対する改善を示した。
しかし、低溶解性または親油性のＣＥの場合には、この装置でさえ、低溶解性および／または親油性のいくつかのＣＥに対して、測定可能なレベルの非特異的結合性（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ，ＮＳＢ）を有することが示された。特に、メンブランを装置内に保持するために、装置中のメンブランがＯリングガスケットでシールされている。このガスケットは比較的高いＮＳＢをもつ。遺憾ながら、このメンブランは、ガスケットを取り除いて、代わりにヒートシールを施すことができない。さらに、システムは、個々の装置が配列されてできているため、この装置は厳しい寸法制限を受け、９６ウエルプレート装置の寸法に対する工業基準（バイオモレキュラ スクリーニング協会（Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ［ＳＢＳ］）に適合しない。したがって、ロボット型実験装置で扱うことができず、自動化された高速処理スクリーニング技術に対応しない。
ＳＢＳ基準に適合する真正な９６ウエルデザイン（米国特許第６，３０９，６０５号明細書参照）は、ＵＦメンブランをプレート集合体に結合させることができ、最初に市販された実施可能なＵＦプレートであった。この装置のメンブランは複合ＵＦメンブランであり、裏当てまたは支持層としてプレキャストした多孔質メンブラン上に、ＵＦ層が形成されている。このメンブランの裏当ては、各ウエル内のメンブランをシールするために使用される。使用可能な装置は、キャストした超高分子量のポリエチレン（ＵＰＥ）メンブラン上に形成されたセルロース製のＵＦ複合メンブランを使用する。ＣＥの非特異的結合性（ＮＳＢ）（薬物候補などのＣＥは、支持構造体に吸収されまたは結合して、ろ液から除かれる）は、これらの装置では大変高い。
ＵＰＥメンブランの代わりに不織布支持体層を使用する、別のメンブランが存在する。それは低いＮＳＢを有するものの、マルチウエル装置内のメンブランのこの種のシーリング性能は一致しておらず、このような研究に相応しくない。
ＣＥの結合性のアッセイをインヴィーヴォ挙動がより予測できるものにするため、低いＮＳＢ、高いタンパク質保持性、すべてのウエルが一体化しＳＢＳに適合する十分なシーリング性を有する、より汎用性のある装置が必要とされている。
ＣＥの非特異的結合性（ＮＳＢ）を減少させ、タンパク質の保持性を改善し、薬物や薬物候補（および他の小分子）などのＣＥのＮＳＢを減少させた簡単で柔軟性のある方法を提供するために、メンブランがヒートシールされた装置の中で、不織布で支持されたＵＦメンブランの組み合わせたものを使用し、結果として結合性の研究がインヴィーヴォでのそれら化合物の挙動をより詳細に予測できる。
本発明の目的は、低いＮＢＳおよび高いタンパク質保持性を有する限外ろ過メンブランを使用した、一連の結合性研究を行うためのろ過装置を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、１個または複数のウエルを有するマルチウエルプレートを提供することであり、各ウエルは多孔性構造体で閉じた底部を有し、その多孔構造体は、薬物結合性の研究のために低いＮＳＢおよび高いタンパク質保持性を有する、不織布で支持されたＵＦメンブランである。
本発明の更なる目的は、１個または複数のウエルを含むろ過装置の提供であり、１個または複数のウエルは、メンブラン支持体がその中に形成された底部を有し、限外ろ過メンブランは１個または複数のウエルのメンブラン支持体にシールされ、したがってウエル内の全ての流体が１個または複数のウエルの底部から出るのにメンブランを通過しなければならず、メンブランは低い非特異的結合性と高いタンパク質保持性を有する。
本発明のもう１つの目的は、１個または複数のウエルを含むろ過装置を提供することであり、１個または複数のウエルは、メンブラン支持体がその中に形成された底部を有し、限外ろ過メンブランは１個または複数のウエルのメンブラン支持体にシールされ、したがってウエル内の全ての流体が１個または複数のウエルの底部から出るのにメンブランを通過しなければならず、メンブランは低い非特異的結合性（１０％未満）と高いタンパク質保持性（９９％を超える）を有する。
本発明の更なる目的は、試験を受ける薬物を選択することと、１個または複数のウエルをもつ試験装置であって、各ウエルは多孔性構造体で閉じた底部を有し、多孔性構造体は、低ＮＳＢおよびタンパク質の高保持性を有しウエルにヒートシールされた不織布で支持されたＵＦメンブランである、試験装置を選択することと、装置を１個または複数のウエルからなる受器装置であって、各ウエルは開いた上部と閉じた底部を有し試験装置のウエルと位置合せされ、試験装置の１個または複数のウエルからろ液を受けるようになっている受器装置の上に配置することと、薬物を液体キャリヤ中で稀釈することと、薬物候補を試験装置の１個または複数のウエルに加えることと、ならびにその候補の薬物結合レベルを決定することとを含む、薬物候補の試験方法を提供することである。
本発明は、メンブランが化学物質に対する低いＮＳＢ、高いタンパク質保持性および良好なシール特性を有する不織布で支持されたＵＦメンブランである、メンブラン使用の限外ろ過装置に関する。
化学物質または複数の化学物質（ＣＥまたはＣＥ類）は、薬物であるか、薬物または治療薬の特性をもつ物質であるか、あるいは薬物または治療薬の特性を予備選択されている（薬物候補として知られる）物質である、任意の低分子量の有機化合物を意味する。
低い非特異的結合性（ＮＳＢ）とは、使用中に到達した低濃度（例えば、１０ナノモル）で、装置構成物に対する薬物の非特異的な結合が、その薬物の約１０質量％損失より少ないことを意味する。高いタンパク質保持性とは、フィルターが、血漿や血清などのサンプル流体の少なくとも９９％、ある実施形態では少なくとも９９．５％のタンパク質であって、メンブランの遮断規格分子量と同じかより大きいサイズのタンパク質の、フィルター通過を阻止することを意味する。
本発明は、単一ウエルもしくはマルチウエルのろ過装置内にヒートシールできる、限外ろ過（ＵＦ）メンブランに関する。このＵＦメンブランは低いＮＳＢ（１０％未満）高いタンパク質保持性（９９．０％を超える）をもたなければならず、マルチウエルの場合には形式はＳＢＳに従う。このようなメンブランの１つは、マサチューセッツ州ビレリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）のミリポアコーポレーションから入手できるＰＬＧＣＡセルロースメンブランとして知られている。それは、ポリプロピレンの不織布材の上にキャストされたセルロース製のＵＦ層で形成された、不織布で支持されたＵＦメンブランである。湿潤剤はしばしば液中に抽出されるので、このメンブランは湿潤剤のレベルも低く、薬物の研究に有用である。湿潤剤のレベルがより低いと、抽出可能なもののレベルを少なくするのに役立つ。さらに、このメンブランは、片面のポアが別の面のポアより小さく、片面から別の面にポアサイズが徐々に増加するという意味で、僅かに非対称のポア構造を有している。このメンブランは、１個または複数のウエルをもつ装置に熱結合できて、低いＮＳＢと高いタンパク質保持性を有する。
さらに、ポリプロピレンとポリエチレンのブレンド上に、ポリエチレンの外層で被覆されたポリプロピレンのコアを含む鞘に似た構造物上に、あるいはＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）樹脂上にキャストした、別のセルロースベースの複合ＵＦメンブランも、本発明で有用である。
裏当て自体は低いＮＳＢを持っていなければならず、典型的には１０％未満である。本発明での使用に適する複合ＵＦメンブランを形成するためには、低いＮＳＢを有する任意の裏当てを使用できる。この裏当ては、平均で約８０ミクロン未満のポアサイズを有し、実用的であると同時に最小限の表面積を有し、それでもなおＵＦ層に対する基質として作用することが好ましい。一般的には、約０．０５〜０．５ｍ２／グラムの表面積が好ましい。
１つまたは複数の個別のウエルまたは反応チャンバーを有する試験用プレートは、一般的な実験室のツールである。このような装置は多様な目的およびアッセイのために採用され、米国特許第４，９０２，４８１号明細書を参照されたい。これらは、マルチスクリーン（ＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮ）（登録商標）プレートの商品名で、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ）のミリポアコーポレーションから市販されている。単一ウエル装置もよく知られていて、米国特許第３，４８３，７６８号明細書、米国特許第４，６３２，７６１号明細書、および米国特許第４，７２２，７９２号明細書を参照されたい。これらは、セントリコン（ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ）（登録商標）装置、セントリフリー（ＣＥＮＴＲＩＦＲＥＥ）（登録商標）装置、ミクロコン（ＭＩＣＲＯＣＯＮ）（登録商標）装置、およびアミコン（登録商標）ウルトラ（ＡＭＩＣＯＮ ＵＬＴＲＡ）装置の商品名で、マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポアコーポレーションから市販されている。以下で詳細に記述する実施形態は、マルチウエル装置に関するものであるが、単一ウエル装置を本発明から排除するという意図は全くない。
本発明は、１個または複数のウエルを有する装置を選択することで作成でき、各ウエルは片端が開いていて、他端（下側の端）は小さい開口部（一般に噴出口（ｓｐｏｕｔ）と呼ばれる）を除いて基本的に閉じている。基本的に閉じている端部の上面には、それを横断するようにシールされた限外ろ過メンブランがあり、したがってそのメンブランを通して液体をろ過するために真空または陽圧を掛けるまで、どのような液体も装置のウエル内に保持される。メンブランの支持層はウエルの閉じた端部の上表面に、加熱結合、超音波結合、振動結合、または摩擦結合などの任意の常法によりシールされる。米国特許第６，３０９，６０５号明細書を参照されたい。メンブランは加熱結合でシールされるのが好ましい。米国特許第６，３０９，６０５号明細書に示されているように、フィルター支持体を溶融させて、ウエル支持構造体の上部表面と結合させるために、フィルター支持体の縁を加熱するように熱したダイを使用してもよい。
本発明の代表的なマルチウエル装置は、図１に示されたものに類似したものを含む。このシステムは、代表的には数が１２、２４、４８、または９６個の一連のウエル４を有するプレート２を含むが、より少ない数（例えば１、２、または６個のウエル）またはより大きい数（例えば３８４または１５３６個のウエル）を使用できる。
ウエルの上部６は開いていて、底部８は支持構造体９、典型的には多孔性織布により、幾分閉じていて、外周の縁はウエル内に延び、支持体の網状構造体はウエルの径を横切って伸び、または一連の放射物がウエルの中心から外部に広がっている（荷馬車の車輪のそれに類似している）。
ＵＦメンブラン１０は支持構造体９の上部にシールされ、したがってメンブランの最大ポアサイズより大きいサイズの成分、あるいはろ過推進力の不足により表面張力で保持された成分はウエル内に留まり、拡散または加圧のいずれかにより液体のみがメンブラン１０を通過する。排出口１２は、液体および小さい構成成分がウエルから出るのを可能にするため、ウエル内の支持体９の下の形成される。示されている様に、それは、排出物を正しい位置に集め、または誘導するために、誘導口または噴出口１３を含む。
受器プレート１４は、プレート２の下に置かれる。この受器プレート１４は、開いた上部１８と、閉じた底部２０を有する一連のウエル１６をもつ。ウエルの数、サイズおよび形状は、プレート２のものと一致するように設計され、したがってプレート２のウエル４を出る全ての液体は排出口１２を通り、受器プレート１４のそれぞれのウエル１６に流れ込む。
プレート２は、単一ピースのプラスチックでできているのが好ましい。開放ウエルプレートや暗渠プレートなど２個のピースでできたデザインのものは、血清、血漿および他の粘性試験液のろ過で通常使用される遠心分離の厳しさに十分耐えるほど堅ければ、使用してかまわないし、通常は、溶媒結合、接着剤結合、振動結合およびヒートシールを含めたよく知られた任意の方法で永久的に相互に結合すべきである。
薬物候補などの化学物質（ＣＥ）は、インヴィーヴォ投与に適すると思われる濃度に稀釈される。一般的には、ＣＥは、アッセイならびに試験を受けるＣＥに応じて、約１０マイクロモル（μＭ）から約０．１ナノモル（ｎＭ）までのレベルに稀釈される。
次いで、ＣＥはプレート２のウエル４の開いた上部に加えられえる。ある時間の経過後、一般的には１時間そこらで、２枚のプレート２と１４を遠心分離し、その後に分離して、受器プレート１４のウエル１６の中の液体と、プレート２の中のろ過層上の物質の一方または双方で、ＣＥの含有量を分析する。
メンブランの非特異的結合性の試験
ミクロコン（登録商標）装置の調製：試験を受けるメンブランを、装置の直径にあわせた適当なダイカッターで切り取った。組み立ては、メンブランを支持体の上に置き、続いてガスケットを加えることであった。次に、この組み立てたものの上にカラーを置き、６５から１００ｐｓｉに変化する圧力でシールした。
ミクロコン（登録商標）装置の調製：試験を受けるメンブランを、装置の直径にあわせた適当なダイカッターで切り取った。組み立ては、メンブランを支持体の上に置き、続いてガスケットを加えることであった。次に、この組み立てたものの上にカラーを置き、６５から１００ｐｓｉに変化する圧力でシールした。
装置の適切な組み立てと完全性の試験：
ａ）ガスケットが変形していないことを確認することで装置の目視検査を行った。
ｂ）装置を分解して、ガスケットがメンブラン上に一様に付着していることを確認した。一様でない場合、検査で適切な付着が認められるまで組み立て圧力を増した。
ｃ）「赤色染料」５００μＬを加え、装置を遠心分離機に入れて１４０００×ｇで３分間回転させ、装置のシールが適切かを試験した。ろ過されなかった全ての染料を装置から取り除いた。カラーおよびガスケットを取り除き、メンブランのガスケット被覆部分に染料のないことが期待された。染料が退けられていなければ、シールする圧力を増した。限外ろ過液が無色であれば、試験前に予めメンブランを適切な溶媒で濡らすべきであったことを示していることに注意すべきである。
ａ）ガスケットが変形していないことを確認することで装置の目視検査を行った。
ｂ）装置を分解して、ガスケットがメンブラン上に一様に付着していることを確認した。一様でない場合、検査で適切な付着が認められるまで組み立て圧力を増した。
ｃ）「赤色染料」５００μＬを加え、装置を遠心分離機に入れて１４０００×ｇで３分間回転させ、装置のシールが適切かを試験した。ろ過されなかった全ての染料を装置から取り除いた。カラーおよびガスケットを取り除き、メンブランのガスケット被覆部分に染料のないことが期待された。染料が退けられていなければ、シールする圧力を増した。限外ろ過液が無色であれば、試験前に予めメンブランを適切な溶媒で濡らすべきであったことを示していることに注意すべきである。
放射性分析物の調製：分析物を調製するために、下式を使用した。
［分析物の濃度］×［マイクロリットルでの実験に要する容積］×［固有放射能（Ｃｉ／ｍｏｌ）］×［１／濃度（Ｃｉ／μＬ）］。
［分析物の濃度］×［マイクロリットルでの実験に要する容積］×［固有放射能（Ｃｉ／ｍｏｌ）］×［１／濃度（Ｃｉ／μＬ）］。
この値が１μＬ未満であれば、ピペッティングの誤差を少なくするために、実験のための容量を増やした。
分析物の必要量を、適量のＰＢＳに加えた。この調製物の２００μＬをサンプルごとに使用した。
メンブラン試験：各メンブランは３枚試験した。各ミクロコン（登録商標）装置を、標識を適切に付した濃縮液／ろ液のバイアルに入れた。この方法で始める前に、試験するメンブランを前もって濡らす必要がある場合には、入手したメンブランを試験前に、最後的にＰＢＳで一度すすぐことを確認する必要があった。分析液２００μＬをミクロコン（登録商標）装置に加え、ミクロ遠心分離機中で乾くまで（２０〜３０分）回転させた（１４０００−×ｇ）。２５μＬを各装置に加えて洗浄し、ミクロ遠心分離機中で１０分間回転させた（１４０００−×ｇ）。
メンブランに対する非特異的結合量を決定するために、カラーおよびガスケットを除き、メンブランをガラス製シンチレーションバイアルに入れた。各バイアルに、シンチレーションカクテル３ｍＬを加えた。参考のために、元の溶液のアリクウォット（ａｌｉｑｕｏｔ）２０μＬを、シンチレーションカクテル３ｍＬに加えた。設備の製造者の記述に従って、カウント時間１分間とし、保存されたクエンチ曲線を使用して、液体シンチレーション計測により放射能（ＤＰＭ）を決定した。
データ解析：加えた放射能の全量に対する、メンブラン上で見いだされた放射能の比をパーセントで報告し、試験を受けているメンブランのＣＥに対するＮＳＢの評価に使用した。
最初のコントロールプレートである、ヒートシールしたＵＰＥ（超高分子量ポリエチレン）複合ＵＦメンブランを含むマルチスクリーン（登録商標）９６ウエルプレートを、結合性の研究に使用した。ＵＰＥ裏当ては高いＮＳＢ（１０％を超える）とタンパク質の比較的高い保持性（９９％未満）を有していたので、この目的には不適当であることが分った。
最初のコントロールプレートと同じ材料の第２のコントロールプレートでは、限外ろ過稀釈剤を添加した。ＮＳＢには殆ど変化がなく、タンパク質保持性の増加も全く示さなかった。
ポリプロピレン不織布で裏当てしたセルロース製ＵＦメンブラン（マサチューセッツ州ビレリカのミリポアコーポレーションから入手できるＰＬＧＣＡ）を有する本発明によるプレートを、９６ウエルのマルチスクリーン（登録商標）プレート内にヒートシールして、ＣＥの結合性の研究に使用した。ＮＳＢは１０％を下回り、タンパク質保持性は高く（９９．５％を超える）、９６個全てのウエルが一体化していることが分り、このプレートはＳＢＳに従っていた。
タンパク質保持性試験の方法：
装置：ウルトラセル（商標）ＰＰＢ９６ウエルろ過装置を、２種類の異なるＵＦメンブラン、マサチューセッツ州ビレリカのミリポアコーポレーションのＰＬＧＣＡおよびＰＬＧＣＤで作成した。エアー性能試験を使用してウエルの完全性試験を行った。一体化が認められたウエルのみを、この試験に使用した。
装置：ウルトラセル（商標）ＰＰＢ９６ウエルろ過装置を、２種類の異なるＵＦメンブラン、マサチューセッツ州ビレリカのミリポアコーポレーションのＰＬＧＣＡおよびＰＬＧＣＤで作成した。エアー性能試験を使用してウエルの完全性試験を行った。一体化が認められたウエルのみを、この試験に使用した。
手順：
チトクロームＣの調製：
１．チトクロームＣ（シグマ−ＱＣ級）０．２５ｍｇ／ｍＬの４０ｍＬを、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で混合した。
チトクロームＣの調製：
１．チトクロームＣ（シグマ−ＱＣ級）０．２５ｍｇ／ｍＬの４０ｍＬを、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で混合した。
ＦＩＴＣ−ＢＳＡ血清溶液の調製：
１．ＦＩＴＣ ＢＳＡ（シグマ）１ｍｇ／ｍＬの２０ｍＬをＰＢＳ中で混合する。
２．撹拌セル中で、この混合物をＰＬＴＫメンブラン（ミリポアコーポレーションから入手できる）で予備ろ過した。
３．ＰＢＳでこの濃縮液を始めの容量に戻した。
４．このＦＩＴＣ ＢＳＡ溶液を同量の清澄なＦＢＳと混合し、最終濃度をＦＩＴＣ ＢＳＡ０．５ｍｇ／ｍＬとし、清澄なＦＢＳ４１ｍｇ／ｍＬとした。
１．ＦＩＴＣ ＢＳＡ（シグマ）１ｍｇ／ｍＬの２０ｍＬをＰＢＳ中で混合する。
２．撹拌セル中で、この混合物をＰＬＴＫメンブラン（ミリポアコーポレーションから入手できる）で予備ろ過した。
３．ＰＢＳでこの濃縮液を始めの容量に戻した。
４．このＦＩＴＣ ＢＳＡ溶液を同量の清澄なＦＢＳと混合し、最終濃度をＦＩＴＣ ＢＳＡ０．５ｍｇ／ｍＬとし、清澄なＦＢＳ４１ｍｇ／ｍＬとした。
プレート調製：
１．各ウエルの中のウルトラセル（商標）プレートを脱イオン水１００μＬで濡らして、完全性を再度測定した。全ての不良を指摘した。
２．試験の準備が整うまで、プレートに水を残しておいた。完全性試験で不良の空のウエルは、試験しなかった。
１．各ウエルの中のウルトラセル（商標）プレートを脱イオン水１００μＬで濡らして、完全性を再度測定した。全ての不良を指摘した。
２．試験の準備が整うまで、プレートに水を残しておいた。完全性試験で不良の空のウエルは、試験しなかった。
プレート試験とコントロール：
１．ＦＩＴＣ−ＢＳＡ血清溶液３００μＬ／ウエルを、各プレートのセルの半分と、マサチューセッツ州ビレリカのミリポアコーポレーションから入手できる３個のセントリフリー（登録商標）装置に加えた。
２．チトクロームＣ溶液３００μＬ／ウエルを、各プレートの残りのウエルおよび３個のセントリフリー（登録商標）装置に加えた。
３．装置を、コスター（Ｃｏｓｔａｒ）ＰＳコレクションプレートの中に置いた。
４．すべての装置を、スイングするバケットの遠心分離機中３０００×ｇで、３７℃で３０分間回転させた。
５．スペクトロマックス（Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ）プレートリーダーを使用して、限外ろ過液中のチトクロームＣを、４１０ｎｍで標準曲線に対比して測定した。
６．スペクトロマックスプレートリーダーを使用して、限外ろ過液の容積を、９００〜１０００ｎｍで水に対比させて測定した。
７．プレート中で回収された容積を決定することで結果の妥当性を評価した。容積が２００μＬ未満であれば、プレートを再度回転させてステップの５と６を再度実施した。
８．限外ろ過液をグリナー（Ｇｒｉｎｅｒ）黒色ＰＳプレートに移した。
９．ワラックヴィクター（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ）プレートリーダー中で、フルオレセイン法により、限外ろ過液中のＦＩＴＣ ＢＳＡを測定した。
１．ＦＩＴＣ−ＢＳＡ血清溶液３００μＬ／ウエルを、各プレートのセルの半分と、マサチューセッツ州ビレリカのミリポアコーポレーションから入手できる３個のセントリフリー（登録商標）装置に加えた。
２．チトクロームＣ溶液３００μＬ／ウエルを、各プレートの残りのウエルおよび３個のセントリフリー（登録商標）装置に加えた。
３．装置を、コスター（Ｃｏｓｔａｒ）ＰＳコレクションプレートの中に置いた。
４．すべての装置を、スイングするバケットの遠心分離機中３０００×ｇで、３７℃で３０分間回転させた。
５．スペクトロマックス（Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ）プレートリーダーを使用して、限外ろ過液中のチトクロームＣを、４１０ｎｍで標準曲線に対比して測定した。
６．スペクトロマックスプレートリーダーを使用して、限外ろ過液の容積を、９００〜１０００ｎｍで水に対比させて測定した。
７．プレート中で回収された容積を決定することで結果の妥当性を評価した。容積が２００μＬ未満であれば、プレートを再度回転させてステップの５と６を再度実施した。
８．限外ろ過液をグリナー（Ｇｒｉｎｅｒ）黒色ＰＳプレートに移した。
９．ワラックヴィクター（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ）プレートリーダー中で、フルオレセイン法により、限外ろ過液中のＦＩＴＣ ＢＳＡを測定した。
データ解析：ＦＩＴＣ−ＢＳＡタンパク質保持性を下式により計算した。
チトクロームＣの保持性を下式により計算した。
タンパク質保持性データ
本発明のフィルターを含む装置のみが、所望のタンパク質保持性を可能にした。
本発明は、他の装置でしばしば認められる干渉を排除し、または顕著に低減した、潜在的薬物候補や治療薬などの化学物質のＡＤＭＥスクリーニングのための装置および方法論を提供するものである。本発明は、アッセイが、ヒトや動物の体内で起きる実際の効果をより密接にまねることを可能にし、研究者が潜在的な化学物質の可能性をより良く、より早く、より正確に決めることを可能にし、研究者が数千もの可能性のある候補をより素早くスクリーニングして適切な特性および可能性をもたないものを排除することを可能にする。
本技術の特に有用な適用分野の１つは、流体サンプルとして血漿、血清、およびその他の高粘性材料を使用する、薬物のスクリーニングである。１個の成形マルチウエル装置の形式に収め、必要とされた特性である低いＮＳＢと高いタンパク質保持性をもつメンブランを使用して、ならびに遠心力をろ過推進力として使用して、９６個のサンプルおよび候補を速くより正確に同時処理することができる。
Claims (18)
- １個または複数のウエルを含むろ過装置であって、１個または複数のウエルはメンブラン支持体がその中に形成された底部を有し、限外ろ過メンブランが１個または複数のウエルのメンブラン支持体にヒートシールされていて、したがってウエル内の全ての液体は１個または複数のウエルの底部から出る前に前記メンブランを通過しなければならず、メンブランは１種または複数の化学物質の低い非特異的結合性と高いタンパク質保持性を有する装置。
- １種または複数の化学物質の非特異的結合性は約１０％未満であり、高いタンパク質保持性は約９９％を超える請求項１に記載の装置。
- ウエルの数は少なくとも２個である請求項１に記載の装置。
- ウエルの数は少なくとも９６個である請求項１に記載の装置。
- ウエルの数は９６個である請求項１に記載の装置。
- ウエルの数は９６個であり、プレートは単一成形体設計である請求項１に記載の装置。
- ウエルの数は９６個であり、プレートは単一体設計であり、装置は１種または複数の化学物質の非特異的結合性が約１０％未満であり、高いタンパク質保持性が約９９％を超え、メンブランは、ポリプロピレン、ポリプロピレンとポリエチレンのブレンド、ポリプロピレンの核の上に形成されたポリエチレン被覆物およびポリテトラフルオロエチレンからなる群から選択された不織布の裏当て上にキャストされたセルロース製限外ろ過層から形成された複合物である請求項１に記載の装置。
- １個または複数のウエルのそれぞれの底部は噴出口を含む請求項１に記載の装置。
- 装置の下方に配置され取り付けられた受器プレートをさらに含む請求項１に記載の装置。
- 装置の下方に配置され取り付けられた受器プレートをさらに含み、受器プレートは装置のウエルと等しい数のウエルを有し、受器プレートのウエルは装置のウエルと位置合せされ、したがって装置のウエルから出た全ての液体が受器プレートのそれぞれのウエルに流れ込む請求項１に記載の装置。
- 装置の下方に配置され取り付けられた受器プレートをさらに含み、受器プレートは装置のウエルと等しい数のウエルを有し、受器プレートのウエルは装置のウエルと位置合せされ、したがって装置のウエルから出た全ての液体が受器プレートのそれぞれのウエルに流れ込み、受器プレートのウエルは開いた上部と閉じた底部を有する請求項１に記載の装置。
- 裏当ては約０．０５から約０．５ｍ２／グラムの表面積を有する請求項１に記載の装置。
- 試験をうける化学物質を選択することと、１個または複数のウエルを有し、各ウエルが多孔質構造体で閉じた底部を有し、前記多孔質構造体が低い非特異的結合性と高いタンパク質保持性を有する不織布で支持された限外ろ過メンブランであり、ウエルにヒートシールされていて、したがって１個または複数のウエルの底部から出た全ての流体がメンブランを通過しなければならない試験装置を選択することと、１個または複数のウエルからなる受器装置であって、受器装置の前記１個または複数のウエルのそれぞれが、開いた上部と閉じた底部を有し、試験装置のウエルと位置合せされ、試験装置の前記１個または複数のウエルからのろ液を受けるようになっている受器装置の上に装置を配置することと、液体キャリヤ中の化学物質を試験装置の前記１個または複数のウエルに加えることと、限外ろ過メンブランを通して化学物質と液体キャリヤをろ過することと、ならびに化学物質の結合レベルおよび／またはタンパク質の保持性を決定することとを含む薬物候補の試験方法。
- ろ過が液体キャリヤに真空および陽圧からなる群から選択された力を掛けることによって行われる請求項１３に記載の方法。
- メンブランは、約１０％未満の非特異的結合性および約９９％を超える高いタンパク質保持性を有する請求項１３に記載の方法。
- 装置が９６個以上のウエルを含む請求項１３に記載の方法。
- 薬物が、液体キャリヤ中で約１０マイクロモル（μＭ）から約０．１ナノモル（ｎＭ）までのレベルに稀釈される請求項１３に記載の方法。
- ろ過が遠心分離によって加えられた陽圧で行われる請求項１３に記載の方法。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071106 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080401 |