JP4057534B2 - 希釈剤の製造方法および使用 - Google Patents
希釈剤の製造方法および使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4057534B2 JP4057534B2 JP2003568410A JP2003568410A JP4057534B2 JP 4057534 B2 JP4057534 B2 JP 4057534B2 JP 2003568410 A JP2003568410 A JP 2003568410A JP 2003568410 A JP2003568410 A JP 2003568410A JP 4057534 B2 JP4057534 B2 JP 4057534B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- molecular weight
- diluent
- wells
- source
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 title claims description 71
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 43
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 31
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 28
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 28
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 23
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 13
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 11
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 7
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 5
- 238000013149 parallel artificial membrane permeability assay Methods 0.000 claims description 5
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 claims description 2
- 238000007921 solubility assay Methods 0.000 claims description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 49
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 10
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 8
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 7
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 238000007705 chemical test Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000009061 membrane transport Effects 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000098 polyolefin Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、生体適合希釈剤ならびにその製造方法および使用に関する。より詳細には、本発明はｉｎ ｖｉｖｏの化学物質試験における小分子の非特異的結合を防ぐ希釈剤に関する。
高スループットのスクリーニングアッセイ（たとえばＣａｃｏ−２薬物輸送、並行人工膜透過性アッセイ（Ｐａｒａｌｌｅｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、ＰＡＭＰＡ）、血漿タンパク質薬物結合、溶解性試験など）は、１２〜１５３６個のうち任意の数の分離した複数のウェルからなる装置内で実施する。これらは、ある程度の製薬的用途がある、またはあると考えられている、様々な低分子量有機分子（化学物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｔｉｔｙ）すなわち「ＣＥ」）を同定し特徴付けるのに使用される。一般的にＣＥは、有効となる可能性がある薬物候補であるかどうかを判断するために、創薬（ｄｒａｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）手順において調査される。
しばしば、これらのプレートたとえばＣａｃｏ−２ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（登録商標）プレートのウェルの底は、スクリーニングアッセイの一部の面を助長または可能にするために、膜やフィルターを有する。フィルターまたは膜を有する底のプレートを使用する場合は、複数ウェルのプレートの下にはめる受け皿を用いることもでき、この中に試料を濾過させるまたはフィルタープレートの内容物を拡散させることができる。ＣＥはこれらプレート内に非常に低い濃度（＜＜１マイクロモル濃度）で導入され、あるいは最終的に受けプレートボリューム中で非常に低い濃度（＜＜１マイクロモル濃度）となる可能性がある。これら希釈液中のＣＥの絶対濃度が測定可能であることは決定的に重要であり、プラスチック表面、膜、および試験液の他の成分たとえばタンパク質にＣＥが非特異的結合することによる損失があると、これら装置の有用性が潜在的に制限される可能性がある。
溶液中に低濃度（＜＜１μＭ）で存在することに加えて、多くのＣＥは親油性なので、プラスチック表面、たとえば複数ウェルプレート、膜、受けプレート、あるいはタンパク質など試験液の他の成分に非特異的に吸着または結合（より一般的には非特異的薬物結合と呼ばれる、以降「ＮＳＢ」）する傾向があり、試験液から消失するように見える。このＣＥの消失は、アッセイの成果や解釈に有意な影響を及ぼす可能性があり、不正確な誤解を招く結果をもたらす。表面積と体積の比が増大し、濃度が低下するにつれて、ＮＳＢ問題が起こる可能性が高くなる。
ＮＳＢを減少させるためにいくつかの試みがなされてきた。
一般的に、ＮＳＢを抑制するには、受けプレートに使用するプラスチックの選択が重要であると考えられている。ＮＳＢをなくす手段として、プラスチック表面を覆う様々な種類の機構が試されてきた。
比較的少量の有機溶媒（たとえばＤＭＳＯ、メタノール、ＤＭＦ、ＴＨＦなど）の添加により、一部の場合でＣＥのＮＳＢレベルが有意に低下することが見出されたが、これらの溶媒は、血漿タンパク質に対するこれらＣＥの結合の挙動を変化させる潜在的可能性があり、またその明らかな透過性により一般的に受け入れられない。
受けプレートに対するＮＢＳを低下させる別の方法は、プラスチックをブロック剤でプレコートすることである。ＢＳＡなどのタンパク質が一部のＣＥに有効であることが見出されたが、これらがＣＥと結合してアッセイ系から取り除き、間違った結果をもたらす危険性がある。
ＮＳＢを最小限にする別の解決法は、少量のＰＴＦＥまたは他の低ＮＳＢポリマーと混合したポリオレフィンを使用することであった。このような受けプレートの１つは、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）フィルター装置と一緒に使用されるＰＴＦＥ／ポリプロピレン受けプレートであり、これらはいずれもマサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能である。２０００年３月３１１日出願の米国特許出願第０９／５４０，０３０号および２０００年７月１４日出願の米国特許出願第０９／６１６，５９７号参照。
この受けプレートは大部分のＣＥおよび薬物に効果があり、従来技術の受けプレートに比べて大幅な改善を示す。しかし、溶解性が低いまたは親油性のＣＥでは、この受けプレートでも、多数の低溶解性ＣＥおよび／または親油性ＣＥで有意なレベルのＮＳＢがあることが示された。
あるいは、ＮＳＢを低下させるために親水性ポリマーでプレコートしたプラスチック受けプレートを使用することもできる。この解決法は基本的に信頼できるように思えるが、これには少なくとも２つの重大な制限がある。第１には、これらの表面処理した受けプレートは、少なくとも現在供給されている状態では、深刻な寸法の制約がある。受けプレートは、いくつかの変数、たとえばトッププレートの設計や形式、行う試験、個々の製造者の設計および優先事項などに応じて、大きさおよび形式が異なる。したがって、これらは、ロボット式の実験室装置によって処理することができず、自動高スループットスクリーニング技術に適合していない。第２には、これらのコーティングした受けプレートでは、装置内の他の表面上（たとえばトッププレート、膜、フローダイレクター（ｆｌｏｗ ｄｉｒｅｃｔｏｒ）など）または試験溶液自体のＮＳＢに対する保護が全く提供されない。
これらのタイプのアッセイを、ｉｎ ｖｉｖｏ挙動をより予測可能なものにするために、ＮＢＳを防ぐまたは低下させる、より普遍的な方法が必要とされている。
非特異的薬物結合（ＮＢＳ）を低下させるための希釈剤の使用は、薬物および薬物候補（および他の小分子）の試験中などでのＣＥの非特異的結合（ＮＢＳ）を低下させて、バイオアッセイの結果がこれら化合物のｉｎ ｖｉｖｏ挙動をより正確に予測できるようにする、単純で、柔軟な生体適合性のある方法を提供する。さらに、これは、部品の１つだけではなく、試験装置の全体にわたりＮＳＢに対する利点を提供する。これは、ＮＳＢ問題の普遍的な解決法を提供し、所望する任意の試験で任意のプレート設計を用いることを可能にする。本発明が教示する血漿希釈剤、血清希釈剤、または合成希釈剤の、ＣＥ希釈剤としての使用は、高スループットＣＥアッセイ、たとえばＣａｃｏ−２薬物輸送アッセイ、血漿タンパク質薬物結合アッセイ、ＰＡＭＰＡアッセイ、透過性アッセイ、薬物溶解性アッセイから生じるデータの予測的な性質を高める。
本発明の目的は、５０ｋＤ、好ましくは３０ｋＤ以下の公称排除限界分子量を有する膜で血清または血漿を濾過することによって生成した希釈剤を利用する、細胞に基づくアッセイおよび細胞に基づかないアッセイを含めて様々な化学物質（ＣＥ）アッセイを実施するための生体適合希釈剤を提供することである。
本発明のさらなる目的は、血漿、血清の個々の成分およびその混合物からなる群から選択された材料源を選択するステップと、個々の成分を緩衝生理食塩溶液中で混合して希釈剤を形成するステップとを含む、希釈剤を形成する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、希釈剤が５０ｋＤ未満の公称分子量を有し、血漿、血清、またはその混合物からなる群から選択された材料源から形成され、材料源を約５０ｋＤ未満の公称分子量を有するフィルターで濾過することからなる群から選択された方法によって、または約５０ｋＤの公称分子量を有する材料源の個々の成分を緩衝生理食塩溶液中で混ぜ合わせることによって形成され、希釈剤が生体適合性であり、薬物または小分子の溶解性および生体利用特性を維持する、希釈剤を含む生物試験システム中の化学物質の非特異的結合を低下させるための希釈剤を提供することである。
本発明のさらなる目的は、１つまたは複数の血漿、血清、またはその混合物からなる材料源から選択するステップと、約３０ｋＤ、好ましくは約１０ｋＤの公称排除限界分子量を有する限外濾過膜で材料源を濾過するステップと、濾過ステップから濾液を回収するステップとを含む、希釈剤を形成する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、試験するＣＥおよびＣＥを試験する方法を選択すること、１個または複数のウェルを有する複数ウェルプレートを選択すること、複数ウェルプレートの１個または複数のウェルでアッセイを実施すること、非特異的ＣＥ結合が低い希釈剤を用いてＣＥを所望の濃度に希釈すること、複数ウェルプレートの１個または複数のウェルのプレートに希釈したＣＥを施用すること、および、ＣＥを回収して分析することを含む、化学物質（ＣＥ）の非特異的結合を低下させる方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、試験するＣＥを選択すること、各ウェルが多孔性構造体によって閉じられている底を有する、１個または複数のウェルを有する試験装置を選択すること、各ウェルが、試験装置の１個または複数のウェルから濾液を受けられるように、試験装置のウェルと位置を合わせた、開いた上部と閉じられた底を有する１個または複数のウェルからなる装置を回収装置の上方に置くこと、希釈剤でＣＥを所望の濃度に希釈し、希釈したＣＥを試験装置の１個または複数のウェルに施用すること、受け装置の１個または複数のウェルで試験装置の濾液を捕捉すること、および濾液を回収して薬物活性を分析することを含む、ＣＥたとえば薬物候補を試験するプロセスを提供することである。
本発明のさらなる目的は、希釈剤が３０ｋＤ未満、好ましくは１０ｋＤ未満の公称分子量を有し、血漿、血清およびその混合物からなる群から選択された材料源から形成され、希釈剤が生体適合性であり、薬物または小分子の溶解性および生体利用特性を維持する、希釈剤を含む生物試験システム中のＣＥたとえば薬物や他の小分子の非特異的結合を低下させるための希釈剤を提供することである。
本発明の別の目的は、希釈剤が血漿および血清の個々の滅菌成分、およびその混合物から形成され、希釈剤が生体適合性であり、ＣＥの溶解性および生体利用特性を維持する、希釈剤を含む生物試験システム中のＣＥたとえば薬物や他の小分子の非特異的結合を低下させるための希釈剤を提供することである。
本発明は、化学物質（ＣＥ）の希釈剤に関する。より詳細には、本発明は、この希釈剤に関し、ならびに、ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物の挙動に予測的なアッセイにおいて、試験装置表面に対する非特異的結合（ＮＢＳ）、および化合物の輸送、溶解性、吸着、拡散、結合および化学物質の他の化合物特性を測定するのに使用する流体に対するＮＳＢを低下しまたはなくすための、好ましい希釈剤としてのその使用に関する。
この希釈剤は、化学物質のＮＳＢに寄与しないか、あるいはＮＳＢをなくし、ＣＥの分析にほとんどまたは全く悪影響を与えず、このようなＣＥの決定および定量用の方法やアッセイを妨害しない、低分子量成分からなる水性溶液である。
この希釈剤は、血漿、血清などの自然源を選択的に濾過してＮＳＢを増大させる成分を取り除いて形成するか、または自然源の個々の成分を混合することによって作成することができる。
この希釈剤は通常、血漿または血清が化学物質（ＣＥ）の非特異的結合に寄与するタンパク質および他の成分をほとんど含まないように、１つまたは複数の濾過ステップ、主に限外濾過ステップにかけた血漿または血清から形成される。好ましくは、これは、実質的にすべての成分が約５０キロダルトン（ｋＤ）未満の公称分子量である流体であり、より好ましくは、これは、３０キロダルトン（ｋＤ）未満の公称分子量を有する成分を含み、さらに好ましくは、これは、１０キロダルトン（ｋＤ）未満の公称分子量を有する成分を含み、実質的にタンパク質を含まない。所望する場合は、より細かい範囲たとえば５ｋＤ以下の公称分子量の希釈剤を用いることもできる。しかし、大部分の用途では、３０ｋＤ未満の公称分子量を有する希釈剤が許容でき、期待されるすべての利点を提供する。
あるいは、血清または血漿の様々な低分子量成分、たとえば塩、トリグリセリド、コレステロール、糖など（５０未満のｋＤ、好ましくは３０ｋＤ未満、より好ましくは１０未満）を緩衝生理食塩溶液に混合して希釈剤を形成することによって、溶液を作成することができる。これらの成分は当分野でよく知られており、様々な市販源から入手することができ、また当分野の技術者によって実験室内で通常の技術および装置を用いて容易に分離することもできる（たとえば表１参照）。
血漿、血清、または選択される個々の成分は、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）たとえば蓄牛（ｃａｔｔｌｅ）や子ウシ胎児の血清、ヒツジ、ヤギ、ヒトの血漿および血清、タンパク質を含まない血清製品、タンパク質を含まない非動物性の（ａｎｉｍａｌ−ｆｒｅｅ）血清製品などを含むがそれだけには限定されない様々な源に由来するものでよい。これらは、様々な製造者たとえばＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｉｎｃ．、Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である。
自然源の希釈剤は、１つまたは複数の血漿源や血清源であれ１つまたは複数の血漿、血清、または両方の混合物であれ、所望の材料源を選択すること、および、少なくとも１つのステップが約５０ｋＤ、３０ｋＤ、または１０ｋＤの公称排除限界分子量を有する限外濾過膜で材料源を濾過することである、１つまたは複数回の濾過ステップに所望の材料源をかけることによって作成する。特に普通なら限外濾過膜を詰まらせるまたは汚してしまう、血漿または血清が大量の大きな分子量の成分を有する場合に、この限外濾過ステップの前により粗いプレフィルターを使用してもよい。さらに、所望する場合は、特定の用途に望まれるまたは必要であるならば、より細かい生成物を作成するために追加の限外濾過ステップを用いることもできる。
限外濾過ステップは、ステンレス鋼フィルターホルダーまたはＳＷＩＮＮＥＸ（登録商標）フィルターホルダーに収容した、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）遠心濾過装置内など通常のフローフィルター、ＰＬＧＣ ＵＦ膜（１０ｋＤ Ｎ．Ｍ．Ｗ．Ｃ．Ｏ．）、ＹＭＴ１０膜（Ｎ．Ｍ．Ｗ．Ｃ．Ｏ．の１０ｋＤ）、ＰＬＴＫ ＵＦ膜（３０ｋＤ Ｎ．Ｍ．Ｗ．Ｃ．Ｏ．）などの限外濾過膜、攪拌セル、ＰＬＴＫまたはＰＬＧＣ ＵＦ膜を収容したＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ＵＦカセットなどの接線方向フローフィルター装置、あるいは米国特許第５，６２６，７５８号に示すような中空糸装置で行うことができる。どのシステムを選択するかはこの用途には重要でなく、それよりも濾過する材料源のスケール／体積および手近にある既存装置に関係する所が多い。
好ましい方法は、ウシ胎児血清を材料源として使用し、マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＳｔｅｒｉｃｕｐ（登録商標）フィルター装置で浄化するものである。マサチューセッツ州ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからいずれも入手可能なＵｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）ＰＬＧＣまたはＹＭＴ１０膜（１０ｋＤのＮ．Ｍ．Ｗ．Ｃ．Ｏ．）をはめたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ攪拌セルを使用して、浄化した血清を分離して希釈剤を調製した。
ＣＥを薬物候補などとして調査および／または開発するために、いくつかの異なるアッセイが使用される。Ｃａｃｏ２細胞などの試験細胞の使用を用いて、ＣＥの腸管輸送特性を試験することができる。血漿タンパク質結合、溶解性試験、ＰＡＭＰＡ、他の「人工」膜輸送（または透過性）アッセイなど他の方法では細胞の使用が必要とされない。本発明は、いずれの試験タイプでも使用できる希釈剤を提供することを意図する。
典型的なアッセイは、図１に示す装置に類似した装置を使用することを含む。本実施形態は、細胞に基づくアッセイで使用することができる。細胞に基づかないアッセイでは、システム内に細胞を含まない同様のシステムを使用することができる。このシステムは、通常は１２、２４、４８、９６個であるがより少ないまたは多い数（たとえば３８４または１５３６個のウェル）を使用してもよい、一連のウェル４を有するトッププレートすなわち細胞プレート２を備える。
ウェルの上部６は開いており、底８は中実の底または多孔性構造体１０のいずれか、通常は微小孔性膜またはガラスフィルターによって閉じられている。多孔性構造体１０は、大きさが膜またはフィルターの最大孔より大きい細胞および／または添加成分、あるいは濾過の駆動力を欠く場合に表面張力によって保持される細胞および／または添加成分はウェル内に保持され、液体のみが拡散によってまたは圧力下で多孔性構造体１０を通るように、プレートウェルの底に密閉されている。多孔性構造体１０の上側表面上で細胞１２を増殖させて、多孔性構造体１０の上側表面全体にわたって一体の層Ｉを形成させる。
フィルタープレートの使用では、受けプレート１４を細胞プレート２の下方に配置する。受けプレート１４は、開いた上部１８と閉じられた底２０とを有する一連のウェル１６を有する。ウェルの数、大きさ、構成は、細胞プレート２のウェル４Ａを出るすべての液体が受けプレート１４の対応するウェル１６Ａに流れ込むように、細胞プレートのウェルの数、大きさ、構成と位置が合うように設計されている。細胞を用いないアッセイの一部では、受けプレートは必要ない。
本発明の希釈剤中で、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に適切と考えられる濃度に化学物質を希釈する。通常、ＣＥは、アッセイおよび試験するＣＥに応じて、希釈剤中で約１０マイクロモル濃度（μＭ）〜約０．１ナノモル濃度（ｎＭ）のレベルに希釈する。
その後、希釈剤中のＣＥを、細胞プレートのウェル４の開いた上部に、好ましくは細胞を乱さないようにウェル４の側面に沿って加え、細胞と相互作用させる。好ましくは、受けプレート１４のウェル１６も（ＣＥを含まない）希釈剤で満たす。
一定時間後、通常は約１時間後に、２つのプレート２、１４を分離し、受けプレート１４のウェル１６中の液体を分析する。
この希釈剤は、あらゆる試験表面または流体に対する、ＣＥのどのようなＮＳＢの可能性も低減させる。さらに、これは自然の産物であり細胞を増殖させる液体と類似しているので、従来技術の他の方法たとえば溶媒の使用とは異なり、細胞やＣＥの挙動にわずかしか悪影響を与えない。また、試験システム全体から分かるように、これは、受けプレートウェルのみならず、細胞プレート２、希釈容器（図示せず）、施用具たとえばシリンジまたはピペット、多孔性構造体などにおけるＮＳＢも低下させる。本発明は、ガラスであれプラスチックであれ、あるいはプラスチックの混合物や親水性コーティングでコーティングしたプラスチックであれ、システムで使用する材料に関わらず機能し、低ＮＳＢプレートとみなされていたプレートでもＮＳＢを低下させることが分かった。最後に、この希釈剤は溶液中のＣＥと全く結合せず、これは、ＣＥの生体利用に全く悪影響を及ぼさないことを意味する。
本発明の発明は、ｉｎ ｖｉｖｏ環境に最もよく似ているので、幅広いアッセイで使用される材料の好ましい希釈剤であることが見出された。本発明を緩衝液、培養基、または生物アッセイやバイオ予測的（ｂｉｏｐｒｅｄｉｃｔａｂｌｅ）アッセイで化合物の挙動を評価するのに使用する様々な化合物の希釈剤として使用することができる。
放射標識した様々な薬物（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１０ｎＭの濃度）のＮＳＢを、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）の９６穴受けプレート（ＰＴＦＥ樹脂ポリプロピレン混合物により形成）に加え、６０分間プレート内に放置した。ＮＳＢで失われた薬物量を測定し、図２にまとめて示す。
様々なプラスチックから作成された他の９６ウェルプレートに対する薬物ＮＳＢ（リン酸緩衝液中１０ｎＭの薬物）も試験した。ＰＴＦＥを含めたこれらプレートのすべてで結合が有意であり、損失の程度は薬物の溶解性に関連していた（すなわち、薬物が親油性であるほど、ＮＳＢによる損失が大きかった）。実際、タキソールおよびテストステロンのＰＰおよびＰＴＦＥプレート上でのＬＣ−ＭＳを用いた時間経過研究では、薬物ＮＳＢはプレート材料に依存しないように思えた（データ示さず）。
本発明で請求する希釈剤中の薬物の希釈液を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）９６穴受けプレート（ＰＴＦＥ樹脂／ポリプロピレン混合物）、ポリプロピレンから形成した９６ウェルプレート、およびＰＴＦＥ樹脂から形成した９６ウェルプレート中で様々な薬物を用いて試験し、すべてにおいてＮＢＳが有意に低下したことが示された。結果を図３に示す。
希釈剤中で希釈した結果として観察された薬物ＮＳＢの劇的な低下に加えて、この希釈剤はｉｎ ｖｉｖｏ「移動相」に最もよく似ているので、幅広いアッセイにおける理想的な希釈剤であると考えられる。
Claims (22)
- ５０ｋＤの排除限界分子量を有する膜で濾過した、血漿、血清およびそれらの混合物、ならびに血漿、血清およびそれらの混合物の５０ｋD未満の分子量を有する個々の成分の緩衝生理食塩溶液中の混合物からなる群から選択された材料源から形成され、５０ｋＤ未満の分子量を有する、試験装置への低分子量有機分子の非特異的結合を低下させるための生体適合希釈剤。
- 血漿、血清、およびその混合物からなる群から選択される材料源を選択するステップと、材料源を５０ｋＤの排除限界分子量を有する限外濾過膜で濾過するステップと、濾過ステップから濾液を回収するステップとを含む、請求項１に記載の希釈剤を形成する方法。
- 材料源が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ヒト、およびそれらの混合物からなる群から選択された源に由来する請求項１に記載の希釈剤。
- 材料源が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ヒト、およびそれらの混合物からなる群から選択された源に由来する請求項２に記載の方法。
- 材料源がウシ胎児血清である請求項１に記載の希釈剤。
- 材料源がウシ胎児血清である請求項２に記載の方法。
- 材料源がヒト血漿である請求項１に記載の希釈剤。
- 材料源がヒト血漿である請求項２に記載の方法。
- 希釈剤が３０ｋＤ未満の分子量を有する請求項１に記載の希釈剤。
- 希釈剤が１０ｋＤ未満の分子量を有する請求項１に記載の希釈剤。
- 限外濾過膜が３０ｋＤの排除限界分子量を有する請求項２に記載の方法。
- 限外濾過膜が１０ｋＤの排除限界分子量を有する請求項２に記載の方法。
- 希釈剤が５ｋＤ未満の分子量を有する請求項１に記載の希釈剤。
- 材料源が、タンパク質を含まない血清製品およびタンパク質を含まない非動物性の血清製品からなる群から選択される請求項１に記載の希釈剤。
- 材料源が、タンパク質を含まない血清製品およびタンパク質を含まない非動物性の血清製品からなる群から選択される請求項２に記載の方法。
- 試験する低分子量有機分子を選択すること、１個または複数のウェルを有する試験装置を選択すること、希釈剤を用いて低分子量有機分子を所望の濃度に希釈し、希釈した低分子量有機分子を試験装置の１個または複数のウェルに施用すること、および材料を回収して分析することを含む、試験装置への低分子量有機分子の非特異的結合を低下させて低分子量有機分子を試験する方法であって、前記希釈剤が、血漿、血清、その混合物からなる群から選択される材料源から、材料源を５０ｋＤより小さい排除限界分子量を有するフィルターで濾過するプロセスおよび緩衝生理食塩溶液中で材料源の５０ｋＤより小さい分子量を有する個々の成分を混ぜ合わせるプロセスからなる群から選択されるプロセスによって形成されることを特徴とする前記方法。
- 各ウェルが多孔性構造体によって閉じられた底を有し、各ウェルが、受けプレートの１個または複数のウェルが試験装置の１個または複数のウェルと位置が合うように、試験装置の下方に配置された受けプレートをさらに備え、試験装置の１個または複数のウェルからの濾液を受けプレートの１個または複数のウェルで受けるため受けプレートの上方に試験装置を配置すること、試験装置の濾液を受けプレートの１個または複数のウェルで捕捉すること、および濾液を回収し分析することを含む請求項１６に記載の方法。
- 各ウェルが多孔性構造体によって閉じられた底を有し、各ウェルが、試験装置の１個または複数のウェルの内側の多孔性構造上に形成した、低分子量有機分子を試験する細胞株をさらに備え、ここで試験装置の下方に受けプレートが配置され、試験装置の１個または複数のウェルと受けプレートの１個または複数のウェルとの位置が合わせされていることを特徴とし、試験装置の１個または複数のウェルからの濾液を受けプレートの１個または複数のウェルで受けるため受けプレートの上方に試験装置を配置すること、試験装置の濾液を受けプレートの１個または複数のウェルで捕捉すること、および濾液を回収し分析することを含む請求項１６に記載の方法。
- 試験が、Ｃａｃｏ−２薬物輸送アッセイ、血漿タンパク質薬物結合アッセイ、ＰＡＭＰＡアッセイ、透過性アッセイ、薬物溶解性アッセイからなる群から選択される請求項１６に記載の方法。
- 血漿、血清、およびその混合物からなる群から選択された材料源に由来し、材料源を５０ｋＤより小さい排除限界分子量を有するフィルターで濾過するプロセスおよび緩衝生理食塩溶液中で材料源の５０ｋＤより小さい分子量を有する個々の成分を混ぜ合わせるプロセスからなる群から選択されたプロセスによって形成される希釈剤を使用すること、前記希釈剤を低分子量有機分子に加えてｉｎ ｖｉｖｏ希釈を成し遂げること、そして希釈した低分子量有機分子を試験アッセイに施用することを含む、試験装置への低分子量有機分子の非特異的結合を低下させる方法。
- 希釈剤を含む生物試験システム内で試験装置への低分子量有機分子の非特異的結合を低下させるための希釈剤であって、前記希釈剤が、５０ｋＤ未満の分子量を有し、血漿、血清、およびその混合物からなる群から選択された材料源から形成され、材料源を５０ｋＤより小さい排除限界分子量を有するフィルターで濾過するプロセスおよび材料源の５０ｋＤより小さい分子量を有する個々の成分を混ぜ合わせるプロセスからなる群から選択されたプロセスによって形成され、希釈剤が生体適合性であり、薬物または小分子の溶解性および生体利用特性を維持する前記希釈剤。
- 血漿、血清の個々の成分およびその混合物からなる群から選択された材料源を選択するステップであって、個々の成分が５０ｋD未満の分子量を有するステップと、個々の成分を緩衝生理食塩溶液中に混合して希釈剤を形成するステップとを含む、請求項１又は２１に記載の希釈剤を形成する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US35678902P | 2002-02-14 | 2002-02-14 | |
| PCT/US2003/004329 WO2003069340A1 (en) | 2002-02-14 | 2003-02-12 | Diluent, methods of manufacture and use |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2005537459A JP2005537459A (ja) | 2005-12-08 |
| JP4057534B2 true JP4057534B2 (ja) | 2008-03-05 |
Family
ID=27734677
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003568410A Expired - Fee Related JP4057534B2 (ja) | 2002-02-14 | 2003-02-12 | 希釈剤の製造方法および使用 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US20030157574A1 (ja) |
| EP (1) | EP1474688A1 (ja) |
| JP (1) | JP4057534B2 (ja) |
| AU (1) | AU2003211018A1 (ja) |
| WO (1) | WO2003069340A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8986781B2 (en) * | 2005-10-27 | 2015-03-24 | Corning Incorporated | Immobilized multi-layer artificial membrane for permeability measurements (PAMPA) |
| CN116087360A (zh) * | 2023-01-09 | 2023-05-09 | 江苏鼎泰药物研究(集团)股份有限公司 | 一种利用UPLC-MS/MS快速检测药物在Caco-2细胞模型中渗透性的方法 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE29725E (en) * | 1966-04-26 | 1978-08-08 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Analytical test pack and process for analysis |
| US4902481A (en) * | 1987-12-11 | 1990-02-20 | Millipore Corporation | Multi-well filtration test apparatus |
| US5077198A (en) * | 1988-04-14 | 1991-12-31 | Eastman Kodak Company | Diagnostic kit and method for rapid detection of antibodies |
| US5360605A (en) * | 1990-09-04 | 1994-11-01 | Edward Shanbrom | Preservation of blood, tissues and biological fluids |
| WO1992015670A1 (en) * | 1991-02-28 | 1992-09-17 | Hyclone Laboratories, Inc. | Blended bovine sera cellular growth media and their methods of production and use |
| US5444155A (en) * | 1991-09-10 | 1995-08-22 | The Scripps Research Institute | Molecules with antibody combining sites that induce asymmetry |
| WO1993021529A1 (en) * | 1992-04-14 | 1993-10-28 | Duke University | Method of detecting tumors containing complexes of p53 and hsp70 |
| US5316917A (en) * | 1992-11-04 | 1994-05-31 | Duke University | Automated analysis of free l-carnitine and total short-chain acylcarnitine |
| US5441894A (en) * | 1993-04-30 | 1995-08-15 | Abbott Laboratories | Device containing a light absorbing element for automated chemiluminescent immunoassays |
| US6156495A (en) * | 1994-02-14 | 2000-12-05 | Abbott Laboratories | Hepatitis GB virus recombinant proteins and uses thereof |
| US5626758A (en) * | 1995-08-08 | 1997-05-06 | Rensselaer Polytechnic Institute | Coiled membrane filtration system |
| AUPP790898A0 (en) * | 1998-12-23 | 1999-01-28 | Life Therapeutics Limited | Renal dialysis |
| US6309605B1 (en) * | 1999-05-05 | 2001-10-30 | Millipore Corporation | Well(s) containing filtration devices |
| US6635430B1 (en) * | 1999-07-16 | 2003-10-21 | Dupont Pharmaceuticals Company | Filtrate plate device and reversible-well plate device |
| US6440642B1 (en) * | 1999-09-15 | 2002-08-27 | Shipley Company, L.L.C. | Dielectric composition |
-
2003
- 2003-02-12 JP JP2003568410A patent/JP4057534B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-02-12 WO PCT/US2003/004329 patent/WO2003069340A1/en active Search and Examination
- 2003-02-12 EP EP03739785A patent/EP1474688A1/en not_active Withdrawn
- 2003-02-12 AU AU2003211018A patent/AU2003211018A1/en not_active Abandoned
- 2003-02-12 US US10/365,208 patent/US20030157574A1/en not_active Abandoned
-
2006
- 2006-01-05 US US11/325,899 patent/US20060121627A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-10-22 US US11/975,768 patent/US20080044929A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-04-10 US US12/082,376 patent/US20080193913A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20080193913A1 (en) | 2008-08-14 |
| JP2005537459A (ja) | 2005-12-08 |
| US20060121627A1 (en) | 2006-06-08 |
| AU2003211018A1 (en) | 2003-09-04 |
| WO2003069340A1 (en) | 2003-08-21 |
| EP1474688A1 (en) | 2004-11-10 |
| US20030157574A1 (en) | 2003-08-21 |
| US20080044929A1 (en) | 2008-02-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5139685A (en) | Blood separation filter assembly and method | |
| Beltramo et al. | Millimeter-area, free standing, phospholipid bilayers | |
| JP5254000B2 (ja) | 液体中に含まれる生物学的粒子を垂直濾過することによって分離する方法及び装置 | |
| EP0296415B1 (en) | Multiwell plates containing membrane inserts | |
| US20030219716A1 (en) | Method and apparatus for improving in vitro measurement of membrane permeability of chemical compounds | |
| US10843111B2 (en) | Process of separating blood plasma/serum from whole blood | |
| JP3746005B2 (ja) | 低結合性液体保持用および濾過用器具 | |
| JPS6041576A (ja) | 流体やプラスチツク材または固形材の物質、または粒子状生成物の産出または遊離及び分離の装置及び方法とその装置の使用法 | |
| CN116059826A (zh) | 多孔装置和使用方法 | |
| Watanabe et al. | Quantitative analysis of membrane surface and small confinement effects on molecular diffusion | |
| JP4057534B2 (ja) | 希釈剤の製造方法および使用 | |
| CN107576807A (zh) | 一种血型检测质控品及其制备方法和在血型检测中的应用 | |
| CN103599817B (zh) | 免疫学化验系统和方法 | |
| US7527975B2 (en) | Determination of high lipophilicity values | |
| WO2002090975A2 (de) | Verfahren und vorrichtung zur bestimmung von flüchtigen substanzen in lösung | |
| US20050266577A1 (en) | Ultrafiltration device for drug binding studies | |
| Higuchi et al. | Permeation of γ-globulin through microporous membranes in the presence of trace DNA | |
| US20240085283A1 (en) | Apparatus and devices for processing fluid samples | |
| Lucas | Catch and Display Profiling of Small Extracellular Vesicles: A Microfluidic Approach for Surveillance of Cancer and Immunity | |
| DE202006009728U1 (de) | Mikroarray-Anordnung, die eine mikroporöse Membran und eine spezifische Inkubationskammeranordnung umfaßt | |
| WO2024228966A2 (en) | Charged hydrogels for concentrating proteins | |
| Zhu et al. | Blood Cell Separation Issues in Miniature Blood Diagnostic Kits | |
| EP1559481A1 (en) | Screening assay for the detection of biomolecules |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060523 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20060821 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20060828 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061122 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070116 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070328 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070405 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070625 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070807 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071106 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20071204 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20071213 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101221 Year of fee payment: 3 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |