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Stand der Technik
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein mikrofluidisches Filterelement zum Abscheiden von Probenbestandteilen aus einem biologischen Probenfluid.
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Zur Diagnose und Wahl der richtigen Therapie vieler Krankheiten ist der Nachweis bestimmter Probenbestandteile, z.B. pathogener Zellen, Bakterien, Viren, Endotoxinen oder anderer, den Nachweismethoden zugänglichen Molekülen, aus verschiedenen Probenflüssigkeiten wie zum Beispiel Blut, Urin oder Sputum unabdingbar. In der Vergangenheit wurden zum Nachweis von Zellen, z.B. von Bakterien, meistens mikrobiologische Verfahren eingesetzt. Bei diesen zellkulturbasierten Bestimmungen handelt es sich jedoch um sehr zeitaufwändige Verfahren, da die Anzucht der Kulturen und deren Auswertung zwei bis drei Tage benötigen. Um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten ist es außerdem eine notwendige Voraussetzung, dass die zu detektierenden Bestandteile des Probenfluids von diesem abgetrennt werden können. Die oftmals geringe Konzentration dieser Bestandteile stellt jedoch eine Herausforderung bei der Isolierung dar.
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Um die nachzuweisenden Bestandteile abzutrennen, werden im Stand der Technik eine Vielzahl von unterschiedlichen Filtern eingesetzt, die je nach Größe der abzutrennenden Bestandteile einerseits sowie der restlichen im Probenfluid befindlichen Bestandteile andererseits ausgewählt werden. Die Größe der zu detektierenden Bestandteile der Probe muss sich demnach ausreichend von den restlichen Bestandteilen der Probenflüssigkeit unterscheiden. Im Fall von Bakterien in Vollblut ist diese Voraussetzung nicht erfüllt, da die Größe der Bakterien mit der Größe der zellulären Bestandteile des Blutes vergleichbar ist. Eine Möglichkeit zur Umgehung dieses Problems sind Mikrokanal-basierte Abtrennverfahren, welche die unterschiedlichen hydrodynamischen Eigenschaften, beispielsweise von Erythrozyten und Bakterien, ausnutzen.
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Eine weitere bekannte Möglichkeit der Filtrierung bieten analytenspezifische Bindungsmoleküle, die an diversen Filtermaterialien immobilisiert vorliegen. Die
GB-2401942 A offenbart ein Filterelement zur Verwendung in einem Detektionsassay, bei dem an der Oberfläche einer porösen Membran spezifische Bindungsmoleküle immobilisiert sind. Die gewünschten Zielkomponenten werden mithilfe der Bindungsmoleküle abgefangen und so auf der Unterseite der Membran fixiert.
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Eine weitere Möglichkeit ist die Abtrennung spezifischer Probenbestandteile aus einem Probenfluid mit Hilfe von funktionalisierten Beads von wenigen Mikrometern Durchmesser. Hierzu werden beispielsweise Antikörper auf der Beadoberfläche immobilisiert. Nach Zugabe der Beads zum Probenfluid binden diese an den zugehörigen Antigenen und sammeln auf diese Weise die gewünschten Probenbestandteile, wie zum Beispiel pathogene Zellen, ein. Die Abtrennung der Beads inklusive der pathogenen Zellen aus dem Probenfluid erfolgt anschließend durch Filtrierung oder, im Falle von magnetischen Beads, durch äußere Magnetfelder.
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Offenbarung der Erfindung
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein mikrofluidisches Filterelement zum Abscheiden bestimmter Probenbestandteile aus einem biologischen Probenfluid, aufweisend
- – mindestens ein Substrat,
- – mindestens eine im Substrat angeordnete Filterkammer,
- – mindestens einen im Substrat angeordneten Kanal zum Zuführen des biologischen Probenfluids und mindestens einen im Substrat angeordneten Kanal zum Ableiten der nach dem Filtervorgang verbliebenen Bestandteile des biologischen Probenfluids,
- – in der Filterkammer angeordnetes Filtermaterial und
- – am Filtermaterial immobilisierte Fängermoleküle für die bestimmten Probenbestandteile, wobei das Filtermaterial mit den Fängermolekülen durchsetzt ist.
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Die spezifischen Fängermoleküle wie zum Beispiel Antikörper oder Enzyme, aber auch Polynukleinsäuren, Polymere, etc. sind auf der Oberfläche des Filtermaterials immobilisiert, so dass beim Durchfließen der Probenflüssigkeit die gesuchten Probenbestandteile an die Fängermoleküle gebunden werden. Dabei erfolgt das Abscheiden der gesuchten Probenbestandteile verteilt über das gesamte Filtermaterial, da das Filtermaterial mit den Fängermolekülen durchsetzt ist und somit den gesuchten Probenbestandteilen eine extrem hohe Zahl an möglichen Bindungsstellen gegenübersteht. Aufgrund dieser Eigenschaft arbeitet das erfindungsgemäße Filterelement extrem effizient und hochspezifisch. Die Poren des Filtermaterials sind dabei so dimensioniert, dass Bestandteile der Probenflüssigkeit, die nicht mit den Fängermolekülen wechselwirken, den Filter im Wesentlichen passieren können. Eine mechanische Filtrierung durch das reine Filtermaterial spielt demnach eine untergeordnete Rolle.
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Unter dem Begriff der bestimmten Probenbestandteile werden alle gewünschten spezifischen Bestandteile des biologischen Probenfluids verstanden, die mithilfe des mikrofluidischen Filterelements gezielt separiert werden können. Dies sind insbesondere sowohl pathogene als auch nicht-pathogene Zellen oder Viren sowie deren Bestandteile wie zum Beispiel Endotoxine, Nukleinsäuren, Proteine oder weitere zelluläre Einzelbestandteile.
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Mit dem erfindungsgemäßen mikrofluidischen Filterelement lassen sich die Probenbestandteile aus einem biologischen Probenfluid sehr effizient und hochspezifisch separieren. Dabei können die Größe der zu filtrierenden Probenbestandteile und der restlichen Bestandteile der Probe vergleichbar sein. Dies ist unter anderem darauf zurückzuführen, dass auf eine mechanische Filtrierung komplett verzichtet wird und somit die Poren des Filters relativ groß gewählt werden können, so dass ein sehr viel höherer Durchsatz möglich ist. Außerdem ist aufgrund der großen Poren eine Filtrierung großer Mengen an Probenfluid möglich, ohne dass der Filter zum Verstopfen neigt. Das erfindungsgemäße mikrofluidische Filterelement stellt somit eine deutliche Weiterentwicklung bekannter mikrofluidischer Filtersysteme dar, da diese bisher nur für geringe Durchsatzmengen geeignet waren.
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Ebenso kann auf den Einsatz von Beads verzichtet werden. Durch den Einsatz der immobilisierten Fängermoleküle, die das gesamte Filtermaterial durchsetzen, ist eine hochspezifische Filtrierung im Vergleich zu herkömmlichen Filtern oder Methoden, die auf hydrodynamischen Effekten beruhen, möglich. Auf eine Verdünnung des Probenfluids im Vorfeld der Filtrierung kann dabei verzichtet werden.
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Der Verzicht auf Beads spart außerdem weitere Verfahrensschritte zum Mischen bzw. Trennen der Beads mit dem bzw. vom Probenfluid und dem damit verbundenen zusätzlichen Einsatz von Filtern bzw. externer Magnetfelder ein. Hierdurch entstehen enorme Kosteneinsparungen im Vergleich zu herkömmlichen Systemen zur Handhabung von Beads.
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Die Bindung der bestimmten Probenbestandteile an die Fängermoleküle kann durch geeignete Lösungen, z.B. geeignete Pufferlösungen, aufgehoben werden. Dabei lässt sich das Filterelement sowohl mit dem ursprünglichen Filterfluss als auch in entgegengesetzter Richtung ausspülen. Im Gegensatz dazu können andere Pufferlösungen, die die spezifische Bindung der gewünschten Probenbestandteile an die Fängermoleküle nicht beeinflussen, über den Filter gespült werden, ohne die gewünschten Probenbestandteile auszuspülen. Hierdurch kann eine weitere Aufreinigung der Probenbestandteile erreicht werden.
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Unter dem Begriff Substrat wird im Folgenden ein Trägermaterial verstanden, in dem die einzelnen Bestandteile des mikrofluidischen Filterelements angeordnet sind. Das mikrofluidische Filterelement weist mindestens eine im Substrat angeordnete Filterkammer, die einen Hohlraum bildet, in dem das eigentliche Filtermaterial angeordnet ist, auf. Dieses Filtermaterial wiederum ist mit den immobilisierten Fängermolekülen zur Bindung der gewünschten Probenbestandteile durchsetzt. Zur Filterkammer führt mindestens ein innerhalb des Substrats angeordneter Kanal zum Zuführen des biologischen Probenfluids und mindestens ein Kanal zum Ableiten der nach dem Filtervorgang verbleibenden Bestandteile des biologischen Probenfluids.
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In einer Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements ist dieses aus mehreren übereinander geschichteten Substraten aufgebaut, in denen mindestens eine Filterkammer und die Kanäle zum Zuführen des biologischen Probenfluids und zum Ableiten der nach dem Filtervorgang verbliebenen Bestandteile des biologischen Probenfluids zumindest teilweise in unterschiedlichen Substratschichten angeordnet sind und das Filtermaterial transversal angeströmt wird.
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Durch den Aufbau aus mehreren Substratschichten wird ein transversales Anströmen erst möglich, da die Kanäle zum Zuführen des biologischen Probenfluids und zum Ableiten der verbliebenen Bestandteile des Probenfluids auf unterschiedlichen Ebenen liegen, so dass das dazwischenliegende Filtermaterial in der Filterkammer großflächig transversal angeströmt werden kann. Der mehrschichtige Substrataufbau ist außerdem in der Herstellung von Vorteil, da die einzelnen Kammern und Kanalkomponenten durch ihre Anordnung in unterschiedlichen Schichten besser aufeinander abgestimmt werden können.
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In einer weiteren Ausführungsform ist das mikrofluidische Filterelement aus einem Substrat mit mindestens einer Filterkammer und Kanälen zum Zuführen des biologischen Probenfluids und zum Ableiten der nach dem Filtervorgang verbliebenen Bestandteile des biologischen Probenfluids aufgebaut und wird das Filtermaterial lateral angeströmt. Diese vereinfachte Ausführungsform erlaubt das Arbeiten in einer Ebene, was für verschiedene Anwendungen im mikrofluidischen Bereich von Vorteil sein kann.
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In einer weiteren Ausführungsform weist das mikrofluidische Filterelement mindestens einen weiteren Kanal, mindestens ein Ventil und/oder mindestens eine Auffangkammer für die verbleibenden Bestandteile des biologischen Probenfluids auf.
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Wie bereits oben erwähnt, werden die weiteren Kanäle zum Beispiel zum Spülen mit Pufferlösungen oder zum Eluieren der gebundenen Probenbestandteile verwendet. Die Ventile regulieren die Flussraten innerhalb der Kanäle. Dazu können einzelne oder aber alle Kanäle separat mit Ventilen ausgestattet sein. Da die Filterwirkung nicht entscheidend von der Flussrate abhängt, ist es möglich, zur Erzeugung des Flusses günstige, integrierte Pumpen einzusetzen, z.B. peristaltische Pumpen, die beispielsweise keinen kontinuierlichen Fluss erzeugen. Alternativ sind jedoch auch extern, d.h. außerhalb des mikrofluidischen Systems angebrachte, Pumpen zur Steuerung der Flussrate möglich. Des Weiteren können innerhalb des Substrats eine oder mehrere Auffangkammern für die verbleibenden Bestandteile des biologischen Probenfluids angeordnet sein. Darüber hinaus sind auch Auffangkammern für die Pufferlösungen oder die bereits eluierten spezifischen Probenbestandteile denkbar.
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In einer der Ausführungsformen weist das mikrofluidische Filterelement Kanäle mit einer Höhe und einer Breite von jeweils 5 µm bis 5 mm, vorzugsweise 50 µm bis 2 mm, auf und das Filterelement ist insgesamt zur Aufnahme eines biologischen Probenfluids mit einem Volumen von 1 µl bis 20 ml, vorzugsweise 10 µl bis 10 ml, ausgelegt.
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Generell sind die Abmessungen jedoch leicht dem zu untersuchenden Probenfluid und den darin enthaltenen Bestandteilen anzupassen.
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In einer weiteren Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements sind die Fängermoleküle ausgewählt aus der Gruppe von Proteinen, vorzugsweise Antikörpern oder Enzymen, Polynukleinsäuren, vorzugsweise DNA oder RNA, und Polymeren. Es sind jedoch auch andere Fängermoleküle möglich. Die Fängermoleküle sind beispielsweise durch Silanisierung, Aminopropyltriethoxysilan (APTES), kovalente Bindungen mittels einer EDC/NHS-Chemie oder Protein A immobilisiert.
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Die Fängermoleküle sind in jedem Fall spezifisch auf die gesuchten Probenbestandteile abgestimmt und gehen mit diesen eine reversible oder auch irreversible Bindung ein. Darüber hinaus ist auch eine direkte Umsetzung der gesuchten Probenbestandteile durch die Fängermoleküle möglich. Dies ist zum Beispiel der Fall, wenn es sich bei dem Fängermolekül um ein Enzym handelt, das ein bestimmtes Enzymsubstrat aus dem Probenfluid filtriert. Die Immobilisierung der Fängermoleküle erfolgt nach gängigen Methoden wie zum Beispiel der Silanisierung. Dabei ist das Filtermaterial komplett mit den Fängermolekülen durchsetzt ist.
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In einer Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements ist das Filtermaterial ausgewählt aus der Gruppe von Fasern, vorzugsweise Silicafasern; Membranen, vorzugsweise Kapillarmembranen aus einem Polymermaterial oder Cellulose; Schüttungen aus Partikeln, vorzugsweise aus Kolloiden, besonders bevorzugt aus Silica, Polymethylmethacrylat oder Melamin; und Metallgittern, vorzugsweise Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern.
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Wie bereits dargestellt müssen zur Separation der gewünschten Probenbestandteile aus dem Probenfluid spezifische Fängermoleküle im Filtermaterial immobilisiert werden. Hierzu kommen, je nach Filtermaterial, unterschiedliche Verfahren zum Einsatz. Im Sinne einer hohen Effizienz des Filters muss die für die Wechselwirkung zur Verfügung stehende Oberfläche möglichst groß sein. Als Filter kommt jedes Material mit kontrollierbaren Porengrößen in Frage. Hierzu eignen sich insbesondere Faserfilter, vorzugsweise auf Silicabasis, oder Membranfilter, die sowohl als Porenmembranfilter oder aber als Kapillarmembranfilter aus Polymermaterial oder Cellulose hergestellt sein können. Neben den klassischen Filtermaterialien eignen sich jedoch auch Schüttungen aus Partikeln wie zum Beispiel Kolloide für die Anwendung in dem erfindungsgemäßen Filterelement. Die Funktion der Kolloide besteht dabei darin, einen Filter mit einstellbarer Porengröße zu erzeugen. Die eigentliche Separation der gewünschten Probenbestandteile erfolgt aber weiterhin über die Fängermoleküle. Als bevorzugte Materialien werden hier Silica, Polymethylmethacrylat oder Melamin eingesetzt.
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In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Filtermaterial aus Metall-Netzen oder Metall-Gittern in der Art, wie sie beispielsweise für die Transmissionselektronenmikroskopie eingesetzt werden. Die sogenannten TEM-Grids sind kommerziell erhältlich und weisen definierte Lochgrößen von ca. mehreren 100 µm bis ca. 10 µm auf. Auch das Übereinanderlegen mehrerer Netze oder Gitter ist in einer weiteren Ausführungsform des Filterelements vorgesehen.
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In einer weiteren Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements sind die Partikel und Metallgitter mit Gold oder Platin beschichtet. Dadurch kann die Funktionalität des Filtermaterials erhöht und eine Kopplung von Fängermolekülen vereinfacht werden.
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In einer weiteren Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements weist das Filtermaterial eine Dicke von 100 µm bis 10 mm, vorzugsweise 30 µm bis 7 mm, besonders bevorzugt 50 µm bis 5 mm und eine Porengröße von 0,5 bis 1000 µm, vorzugsweise 1 bis 500 µm, besonders bevorzugt 5 bis 300 µm, auf.
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Im Falle der erwähnten TEM-Grids wird die minimale Dicke des Filtermaterials durch die Dicke eines einzelnen TEM-Grid vorgegeben.
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Die Poren des Filtermaterials sind so dimensioniert, dass Bestandteile der Probenflüssigkeit, die keine der gesuchten Probenbestandteile enthalten, den Filter im Wesentlichen passieren können. Im Falle von Bakterien in Vollblut ergibt sich damit z.B. eine minimale Porengröße von mehreren µm. Größere Poren verringern den fluiden Widerstand. Gleichzeitig wird damit jedoch die Effizienz des Filtermaterials gesenkt. Daraus ergeben sich je nach Anwendung Porengrößen bis zu mehreren 100 µm. Die Größe der Filterkammer wird im Vorfeld dem gewünschten Filtermaterial und dessen Ausmaß angepasst. Der Durchmesser der Filterkammer liegt jedoch im Allgemeinen zwischen 1 und 30 mm.
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In einer weiteren Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements besteht das Substrat aus einem Polymer, vorzugsweise einem Polykarbonat, Polypropylen, Cycloolefin-Copolymer, Copolymer oder Polymethylmethacrylat; einem Glas oder einem Silizium enthaltenden Material.
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In Prinzip sind jedoch alle Materialien, die sich durch Extrudieren, Tiefziehen oder Prägen im Mikromaßstab formen lassen, geeignet.
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In einer bevorzugten Ausführungsform des mikrofluidischen Filterelements weist das Substrat eine Dicke von 0,2 bis 8 mm, vorzugsweise 0,5 bis 3 mm und ein Außenmaß von 10 × 10 bis 100 × 100 mm2 auf.
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Auch hier gilt, dass das Substrat in seinen Abmessungen dem Einsatz in einem mikrofluidischen System angepasst sein muss.
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In einem weiteren Aspekt der Erfindung erfolgt die Verwendung des zuvor beschriebenen mikrofluidischen Filterelements in einem Lab-on-Chip-System oder in einem Aufreinigungsröhrchen.
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Mit dem Einsatz des erfindungsgemäßen Filterelements wird somit der Übergang vom Bereich großer Probenvolumina (Milliliter) in den Bereich kleiner Probenvolumina (Mikroliter) erleichtert. Dabei bezieht sich die Anwendung nicht nur auf den Bereich der klassischen Mikrofluidik, sondern auch auf andere Anwendungen, bei denen eine derartige Aufreinigung erreicht werden soll, z.B. mittels Aufreinigungsröhrchen. Solche aus dem Stand der Technik bekannten Kit-Systeme, die auf Aufreinigungsröhrchen basieren, werden häufig in der Invitro-Diagnostik eingesetzt.
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Zeichnungen
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Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Filterelements werden durch die Abbildungen veranschaulicht und in der nachfolgenden Beschreibung erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Abbildungen nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken. In den Abbildungen werden folgende Bezugszeichen verwendet:
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Substrat
- 2
- Kanal zum Zuführen des biologischen Probenfluids
- 3
- Kanal zum Ableiten nach dem Filtervorgang verbliebener Bestandteile des biologischen Probenfluids
- 4, 5
- weitere Kanäle
- 6, 7, 8, 9
- Ventile
- 10
- Auffangkammer
- 11
- Filterkammer
- 12
- Filtermaterial
- 13
- Fängermoleküle
- 14
- spezifische Probenbestandteile
- 15
- sonstige Probenbestandteile
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1 zeigt schematisch das Filterprinzip des erfindungsgemäßen Filterelements
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2 zeigt das erfindungsgemäße Filterelement in Draufsicht
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3 zeigt das mikrofluidische Filterelement als ein Schichtsystem aus mehreren Substraten 1
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1 zeigt schematisch das Filterprinzip des erfindungsgemäßen Filterelements am Beispiel eines Faserfilters. Am Filtermaterial 12 sind Fängermoleküle 13 immobilisiert. An diesen immobilisierten Fängermolekülen 13 werden die bestimmten Probenbestandteile 14 durch Bindung aus dem Probenfluid separiert. Sonstige Probenbestandteile 15 passieren das Filtermaterial 12 aufgrund der großen Poren im Filtermaterial 12 im Wesentlichen ungehindert. Die Abbildung ist an das Beispiel eines mit Antikörpern 13 funktionalisierten Faserfilters angelehnt. Dabei werden aus einem biologischen Probenfluid, z.B. Blut, Bakterien 14 filtriert. Die sonstigen Probenbestandteile 15, z.B. Erythrozyten, können das Filtermaterial 12 weitestgehend ungehindert passieren. Das Prinzip lässt sich jedoch auf eine Vielzahl von Anwendungen übertragen.
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2 zeigt eine einfache Realisierung des erfindungsgemäßen Filterelements. Ausgehend von einem Polymersubstrat 1 werden in diesem Substrat 1 die Kanäle zum Zuführen des biologischen Probenfluid 2 und zum Ableiten der nach dem Filtervorgang verbliebenen Bestandteile des biologischen Probenfluids 3, weitere Kanäle 4/5 für das Zu- und Abführen der Pufferlösung, sowie in den Kanäle 2/3, 4/5 platzierte Ventile 6/7/8/9 angeordnet. Außerdem weist das Substrat 1 eine Filterkammer 11 mit darin befindlichem Filtermaterial 12 sowie eine Auffangkammer 10 auf. Bei geschlossenen Ventilen 8/9 wird Probenfluid über Kanal 2 in die Filterkammer 11 eingebracht und durchströmt das Filtermaterial 12 lateral. Während die spezifischen Probenbestandteile 14 an den entsprechenden Fängermolekülen 13 binden, werden die restlichen Probenbestandteile 15 der Probenflüssigkeit über den Kanal 3 in die Auffangkammer 10 geleitet. Um alle restlichen Bestandteile 15 der Probenflüssigkeit aus dem Filtermaterial 12 zu entfernen, kann mit einer entsprechenden Pufferlösung nachgespült werden. Dazu werden die Ventile 8/9 geöffnet und die Ventile 6/7 geschlossen, so dass die Kanäle 4/5 geöffnet werden. Durch Spülen mit der Pufferlösung durch die Kanäle 4/5 können nun die sonstigen Probenbestandteile 15 entfernt werden. Auf gleichem Wege lassen sich auch die gesuchten spezifischen Probenbestandteile 14 zur weiteren Verarbeitung aus dem Filtermaterial 12 eluieren. Alternativ können die konzentrierten Probenbestandteile 14 direkt auf dem Filtermaterial 12 zur Analyse und Diagnostik, z.B. für eine PCR-Analyse, weiterverwendet werden.
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3 zeigt das mikrofluidische Filterelement als ein Schichtsystem aus mehreren Substraten 1. Mit diesem Aufbau wird ein transversales Durchströmen des Filtermaterials 12 möglich.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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