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Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zur Markierung von Zellen einer Zellsuspension mit superparamagnetischen Markierungspartikeln, die hierzu insbesondere mit einem spezifischen Antikörper versehen sind.
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Die Markierung von zellulärem Material in einer Zellprobe mittels unterschiedlicher Markierungsmethoden erlaubt dessen Selektion aus und Quantifizierung in komplexen Zellproben. Es sind Methoden bekannt, die eine Quantifizierung von zellulärem Material auf Basis der Zählung einzelner Zellen erlauben. Diverse durchflusszytometrische Verfahren erlauben die Quantifizierung von Zellen mit Hilfe von fluoreszenzbasierten oder magnetischen selektiven Markierungen. Diese Methoden setzen jedoch nachteiligerweise eine arbeitsintensive Aufarbeitung der zu messenden Probe voraus. Eine Aufarbeitung der Probe kann Arbeitschritte wie beispielsweise ein Zentrifugieren, Filtrieren, Sedimentieren uvm. voraussetzen. Oft sind solche Arbeitsmethoden mit einem partiellen Verlust des Analyten verbunden.
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Dabei ist es bei bekannten Methoden der Zytometrie ein Basisproblem, die vorliegende geringe Anzahl von Zellen in der Zellprobe zu markieren und letztlich zu zählen. Daher sind die bekannten Methoden darauf ausgerichtet, aus geringen Mengen von markierten Zellen ein ausreichendes Signal zu generieren. Nachteilig bei den bekannten Methoden der Durchfluss-Zytometrie ist, dass sie nur schwer mit einer Zellprobe umzugehen vermögen, die eine hohe Anzahl von zu markierenden Zellen enthält, beispielsweise mit einer Dichte von 104 Zellen/μl, da unter anderem aufgrund der hohen Rezeptorkonzentration – viele Zellen – für eine ausreichend gute magnetische Markierung viele Markierungspartikel benötigt werden.
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Aus der
US 2007/0031283 A1 ist ein Verfahren zum Detektieren und/oder Quantifizieren eines Analyten einer biologischen Probe, zum Beispiel einer Zelle oder einer zellulären Komponente eines Virus, bekannt. Dazu wird eine tragbare Kartusche verwendet, die eine Inkubations- und eine Messtunnel umfasst.
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Die
DE 10 2010 042 737 A1 beschreibt ein Verfahren zur magnetischen Durchflusszytometrie. Eine entsprechende Vorrichtung umfasst ein geschlossenes Durchflusssystem mit einem Probenreservoir, einem Durchflusskanal sowie eine Ansaugeinrichtung.
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In einer Vorrichtung zur magnetischen Durchflusszytometrie gemäß der
DE 10 2011 080 012 A1 wird ein laminarer Fluss einer Zellprobe erzeugt und die Zellen werden mittels Führungsschwellen in einem vorgebbaren Teilvolumen des Durchflusskanals angereichert.
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Eine Sensorkartusche zum Bestimmen mehrerer Analyte einer flüssigen Probe ist weiterhin aus der
EP 2 034 324 A2 bekannt. Das Analyt wird dabei in einer ersten Region einer Reaktionskammer mit magnetischen Objekten in Kontakt gebracht, inkubiert und in einer zweiten Region der Reaktionskammer über einen Sensor detektiert.
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Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Anordnung zur Quantifizierung von Zellen einer Zellprobe anzugeben, die das eingangs genannte Problem vermindert, insbesondere also auch mit Zellproben mit vergleichsweise hoher Konzentration von zu erfassenden Zellen umzugehen vermag.
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Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 1 gelöst. Eine weitere Lösung besteht in der Anordnung gemäß Anspruch 8. Die Unteransprüche betreffen vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Markierung von Zellen einer Zellsuspension wird als ein erster Schritt eine mikrofluidische Kammer mit an im Wesentlichen einer inneren Oberfläche der Kammer konzentrierten superparamagnetischen Markierungspartikeln bereitgestellt, wobei die Markierungspartikel insbesondere einen spezifischen Antikörper zur Anbindung an Zellen aufweisen. Als zweiter Schritt wird die Zellsuspension in die Kammer gefüllt.
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Vorteilhaft wird hierdurch erreicht, dass ein genau bestimmbarer Anteil der Zellen in einer Suspension markiert wird. Lediglich jene Zellen der Zellsuspension, die im Bereich der inneren Oberfläche fließen, an der die Markierungspartikel konzentriert sind, werden auch markiert. Zellen, die nicht im Bereich dieser inneren Oberfläche fließen, erhalten keinen Kontakt zu den Markierungspartikeln und werden somit auch nicht markiert.
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Durch die Vorgehensweise wird also mit anderen Worten erreicht, dass ein definierter Anteil der Zellen, aber weitgehend auch nur dieser definierte Anteil markiert wird.
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Dabei ist wichtig, dass in der mikrofluidischen Kammer aufgrund ihrer Abmessungen ein weitgehend laminarer Fluss vorherrscht. Dabei vermischen sich die verschiedenen Schichten der durchfließenden Zellsuspension kaum miteinander, so dass im Wesentlichen nur solche Zellen eine Markierung erfahren, die in unmittelbarer Nähe derjenigen inneren Oberfläche ankommen, die mit den Markierungspartikeln belegt ist. Es handelt sich hierbei im Wesentlichen um einen diffusionsabhängigen Schritt: Nur Platelets, die an die Markierungspartikeln anstoßen, können an sie anbinden. Ab dem Zeitpunkt beginnen sie abzurollen und nehmen dabei noch mehr Markierungspartikeln auf.
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Damit kann der Anteil an markierten Zellen leicht aus der Dicke der Kammer senkrecht zu der inneren Oberfläche und der Dicke der Schicht der Zellsuspension, die der Markierung unterliegt, bestimmt werden.
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Die hier beschriebene Erfindung erlaubt also die kontrollierte, partielle und verlustfreie Markierung von zellulärem Material mit superparamagnetischen Nano- oder Mikropartikeln innerhalb kleiner Volumina komplexer Proben in einem mikrofluidischen System. Dabei ist vorteilhaft kein Verdünnungsschritt erforderlich. Das zelluläre Material, das bereits in großen Mengen vorliegt, muss dabei nicht im Vorhinein angereichert oder von anderen Zelltypen getrennt werden. Das vorgestellte System vereinfacht vorteilhaft die Arbeitsschritte der Aufreinigung und Markierung von Zellen in komplexen Proben wie Körperflüssigkeiten oder Körpersekreten.
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Vorteilhaft ist es dabei, wenn eine Kammer verwendet wird, deren Hohlraum im Wesentlichen quaderförmig ist. Durch die einfache Geometrie lässt sich damit der Anteil markierter Zellen besonders gut bestimmen.
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Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn die Kammer eine Dicke zwischen 10 μm und 1000 μm aufweist, wobei die Dicke die Ausdehnung senkrecht zu der inneren Oberfläche beschreibt, an der die Markierungspartikel konzentriert sind. Im Bereich dieser Dicken lässt sich am besten ein laminarer Fluss realisieren und gleichzeitig ein Anteil der Zellen markieren, der im Prozent- oder Promillebereich liegt. Über die Festlegung dieses Anteils über die Dicke der Kammer kann auch vermieden werden, dass eine Zellsuspension verdünnt werden muss.
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Um die mikrofluidische Kammer bereitzustellen, werden die folgenden Schritte ausgeführt:
- – Füllen der mikrofluidischen Kammer mit einer Suspension mit den Markierungspartikeln,
- – Konzentrieren der Markierungspartikel an der inneren Oberfläche der Kammer mittels eines Magneten.
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Hierzu wird bevorzugt ein Permanentmagnet eingesetzt. Alternativ ist es aber auch möglich, einen Elektromagneten einzusetzen.
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Das Füllen der Zellsuspension in die Kammer erfolgt zweckmäßig in einem Pumpschritt, der gleichzeitig die Reste der Suspension mit den Markierungspartikeln aus der Kammer entfernt. Das Einfüllen in die Kammer kann in der Folge unterbrochen werden, so dass die Zellsuspension für eine Standzeit in der Kammer in Ruhe verbleibt. Beispielsweise kann als Standzeit eine Zeit von einer Sekunde oder weniger gewählt werden. Die Standzeit erhöht den Anteil im Bereich der inneren Oberfläche markierter Zellen durch beispielsweise die einwirkende Gravitation, erlaubt aber auch eine Zelldiffusion in der Kammer, wodurch Zellen markiert werden können, die eigentlich nicht im Markierungsbereich nahe der inneren Oberfläche waren. Alternativ wird die Zellsuspension ohne Unterbrechung durch die Kammer geführt.
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In beiden Fällen kann die Zellsuspension beispielsweise zum Zählen der markierten Zellen zu einer Messvorrichtung geführt werden.
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Außerhalb der Kammer, aber im Bereich der inneren Oberfläche der Kammer, ist eine Spule mit Eisenkern angeordnet. Der Eisenkern dient der Formung des Magnetfelds, das die Markierungspartikel zu der inneren Oberfläche zieht. Vorteilhaft wird dadurch erreicht, dass die Markierungspartikel gleichmäßiger an der inneren Oberfläche anliegen, da Inhomogenitäten des Magnetfelds durch den Eisenkern verringert werden. Ein Anhäufen der Markierungspartikel zu einem Ende der Kammer hin wird so verringert. Dabei ist es zweckmäßig, wenn eine zur inneren Oberfläche der Kammer gerichtete Außenfläche des Eisenkerns wenigstens die Abmessungen der inneren Oberfläche hat. Idealerweise ist der Eisenkern etwas größer als die mikrofluidische Kammer. Die Spule erzeugt zweckmäßig ein Magnetfeld, das größer, insbesondere wesentlich größer ist als das des Magneten.
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In einer Weiterbildung der Erfindung weist der Eisenkern auf der zur inneren Oberfläche der Kammer gerichteten Außenfläche Einkerbungen auf. Diese sind bevorzugt in einem regelmäßigen Muster angeordnet. Die Einkerbungen können dabei beispielsweise parallele Linien sein oder beispielsweise einem quadratischen Linienmuster folgen. Hiermit kann die Form der Anlagerung der Markierungspartikel bestimmt werden.
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Alternativ zur Verwendung eines Eisenkerns ist es auch möglich, die innere Oberfläche selbst mit Einkerbungen zu versehen. Hiermit wird ebenfalls ein Anhäufen der Markierungspartikel zu einem Ende der Kammer hin verringert, da die Markierungspartikel sich innerhalb der Einkerbungen sammeln und sich unter dem Einfluss des Magnetfelds kaum noch zwischen den Einkerbungen bewegen können.
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Weitere zweckmäßige Ausgestaltungen und Vorteile der Erfindung sind Gegenstand der nachfolgenden Beschreibung eines Ausführungsbeispiels der Erfindung unter Bezug auf die Figuren der Zeichnung, wobei gleiche Bezugszeichen auf gleich wirkende Bauteile verweisen. Dabei zeigen
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1 eine Anordnung zur Zellmessung mit einem mikrofluidischen System,
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2 eine mikrofluidische Kammer in der Vorbereitung für die Zellmessung,
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3 einen Ausschnitt der mikrofluidischen Kammer mit teilweise markierten Zellen,
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4 eine Ausgestaltung der Anordnung mit zusätzlichem Eisenkern,
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5 eine Ausgestaltung der Anordnung mit einem Eisenkern, der Einkerbungen aufweist,
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6 eine Ausgestaltung der Anordnung mit Einkerbungen in einer Wand der mikrofluidischen Kammer.
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Das folgende Ausführungsbeispiel bezieht sich auf eine Anordnung 1 für die Zellmessung gemäß 1, bei der Zellen 15, 16 einer Zellsuspension mit sehr hoher Zelldichte markiert werden und sodann einer Zählvorrichtung 14 zugeführt werden, um eine Quantifizierung vorzunehmen. Die Anordnung 1 weist dabei auf einem gemeinsamen Träger angeordnet einen Permanentmagneten 12 auf, auf dessen Oberfläche ein mikrofluidisches System aufgebaut ist. Das mikrofluidische System umfasst dabei eine Probenzuführung 18 zur Zuführung von Flüssigkeiten in eine mikrofluidische Leitung 13 auf.
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Die Probenzuführung 18 führt die Flüssigkeiten in eine mikrofluidische Kammer 10, in der eine Markierung von Zellen vorgenommen wird. Die Kammer 10 ist dabei auf dem Permanentmagneten realisiert. Ausgangsseitig führt das mikrofluidische System weiter zu einer Zählvorrichtung 14, in der markierte Zellen gezählt werden können.
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Die Zählvorrichtung 14 basiert im vorliegenden Beispiel auf der Detektion von Magnetfeldern, beispielsweise GMR, AMR oder TMR. Eine zu hohe Konzentration markierter Zellen in der Flüssigkeit, die an der Zählvorrichtung 14 vorbeigeleitet wird, führt dabei zu einer Sättigung des Sensors und damit zu einer Verfälschung der Messung. Daher wird für die hier verwendete Zellsuspension, in der eine Zelldichte von beispielsweise 105 Zellen/μl vorliegt, eine besondere Markierungsmethode verwendet, deren Vorbereitung im Folgenden anhand von 2 näher ausgeführt wird.
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In 2 ist die Vorbereitung der mikrofluidischen Kammer 10 für die Zellmarkierung dargestellt, die in einem ersten Schritt 100 bereitgestellt wird. Die mikrofluidische Kammer 10 kann vorteilhaft mittels einer Spritzgusstechnik hergestellt sein. Im vorliegenden Beispiel soll die Dicke D der mikrofluidischen Kammer 10 D = 100 μm sein. Es sind aber auch andere Maße wie beispielsweise D = 10 μm, D = 50 μm oder D = 980 μm möglich. Die mikrofluidische Kammer 10 weist auf ihren Stirnseiten 21 eine Einlass- und eine Auslassöffnung auf, die in der 2 nicht dargestellt sind. Das Gesamtvolumen der Kammer ist im vorliegenden Beispiel 1 μl, wobei die Kammer 10 mm lang und 1 mm hoch bei der bereits genannten Dicke von 100 μm ist.
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In einem zweiten Schritt 110 wird eine Suspension mit superparamagnetischen Markierungspartikeln 11 in die mikrofluidische Kammer 10 eingeleitet. Die Markierungspartikel 11 weisen dabei typischerweise noch keine besondere Aufteilung in der Suspension auf, sondern sind zuerst gleichmäßig verteilt. Weiterhin weisen die Markierungspartikel 11 im vorliegenden Beispiel spezifische Antikörper auf. In alternativen Ausführungen können auch Markierungspartikel 11 ohne Antikörper verwendet werden.
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In einem dritten Schritt 120 werden dann die Markierungspartikel 11 durch magnetische Krafteinwirkung, in diesem Beispiel durch den Permanentmagneten 12 auf den Boden der mikrofluidischen Kammer 10 gezogen.
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Nachfolgend wird in einem vierten Schritt 130 die Suspension – abzüglich der vom Permanentmagneten 12 gehaltenen Markierungspartikel 11 – aus der mikrofluidischen Kammer 10 entfernt. Dabei wird das vorgelegte Lösungsmittel der Markierungspartikel 11 durch Luft ersetzt, bevor die eigentliche Analytlösung hinzukommt. Die Markierungspartikel 11 werden dadurch getrocknet. Die Dauer dieses Schrittes kann durch das Volumen des gesamten Systems (vom Einlass bis zur Kammer) beeinflusst werden. Im gleichen Schritt wird eine Zellsuspension mit anfänglich unmarkierten Zellen 15 in die mikrofluidische Kammer 10 eingefüllt. Dies passiert in diesem Beispiel durch Ansaugen bei einem Ende 17 der mikrofluidischen Leitung 13, die von der mikrofluidischen Kammer 10 über die Zellmessvorrichtung 14 führt.
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Befindet sich die Zellsuspension in der mikrofluidischen Kammer 10, wird sie dort für eine sehr kurze Zeit, beispielsweise eine halbe Sekunde belassen. In dieser Zeit bleiben die unmarkierten Zellen 15 der Zellsuspension weitgehend statisch in der mikrofluidischen Kammer 10, eine Umschichtung oder Absenkung findet praktisch nicht statt. Diejenigen unmarkierten Zellen 15, die in der Nähe der paramagnetischen Markierungspartikel 11 ankommen, binden diese jedoch an und werden so zu markierten Zellen 16. Die markierten Zellen 16 entstehen somit nur in einem wohldefinierten Bereich nahe des Bodens der mikrofluidischen Kammer 10.
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3 zeigt schematisch, was bei Befüllen der mikrofluidischen Kammer 10 mit der Zellsuspension passiert. Derjenige Teil der Zellen, der sich nahe der inneren Oberfläche mit den Markierungspartikeln 11 befindet, rollt an der inneren Oberfläche der Kammer ab und nimmer dabei häufig eine Vielzahl der Markierungspartikel 11 auf. Während also der geometrisch von der inneren Oberfläche ferne Teil der Zellen 15 weitgehend unmarkiert bleibt, werden die markierten Zellen 16 mit einer erheblichen Menge an Markierungspartikeln 11 versehen.
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Im vorliegenden Beispiel werden all jene unmarkierten Zellen 15 potentiell markiert, die sich in einem Bereich von 5 μm vom Boden der Kammer 10 ab befinden. Da davon ausgegangen werden kann, dass nahezu alle Zellen 15, die sich in diesem Bereich aufhalten, beim Durchfließen der Kammer 10 auch tatsächlich markiert werden, werden bei einfacher Berechnung 5% der Zellen 15 zu markierten Zellen 16. Dabei kann zur Erhöhung der Genauigkeit auch der Durchmesser der Zellen berücksichtigt werden.
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Da nur ein vergleichsweise geringer, aber gut definierter Anteil der Zellen 16 markiert ist, kann die Zählvorrichtung 14 unproblematisch eine Zellzählung vornehmen und es kann die tatsächliche Zelldichte hochgerechnet werden.
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Das mikrofluidische System kann dabei vorteilhaft so gestaltet werden, dass ein Austausch der Kammer 10 mit den Markierungspartikeln 11 leicht möglich ist. So kann über die Wahl der Markierungspartikel 11 oder Kammergeometrie die Markierung an die Art der vorliegenden Zellsuspension angepasst werden.
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Problematisch kann die Anordnung der mikrofluidischen Kammer 10 auf dem Permanentmagneten 12 sein: Da sich die Markierungspartikel 11 nach dem Magnetfeld richten, häufen sie sich zu dem Ende der Kammer 10 hin an, das nahe an der Mitte 44 des Permanentmagneten 12 liegt. Um damit umzugehen, gibt es verschiedene Möglichkeiten:
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Ausführungsbeispiel 2:
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Wie in der 4 dargestellt, wird an einer Seite der mikrofluidischen Kammer 10 abseits des Permanentmagneten 12 eine Spule 41 mit einem Eisenkern angeordnet. Die Spule erzeugt ihrerseits ein Magnetfeld, das durch die Magnetfeldlinien 43 angedeutet ist. Soweit dieses über die Länge der mikrofluidischen Kammer 10 homogen ist und deutlich stärker als das des Permanentmagneten 12, werden die Markierungspartikel 11 gleichmäßig zur entsprechenden Wand der mikrofluidischen Kammer 10 hingezogen, auch wenn die mikrofluidische Kammer 10 in diesem Beispiel deutlich abseits der Mitte 44 des Permanentmagneten 12 angeordnet ist. Die benötigte Energie der Spule ist abhängig von ihrem Abstand zum Magneten, da die magnetische Kraft mit der Entfernung abnimmt. Durch die Anpassung der Entfernung zum Magneten kann Energie gespart werden und die Spule beispielsweise auch mit kleineren Energiezellen versorgt werden.
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Ausführungsbeispiel 3:
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5 zeigt Ausführungsformen für den Eisenkern: In einer ersten Ausführungsform 51 weist der Eisenkern Einkerbungen 52 auf, wobei die zwischen den Einkerbungen 52 verbleibenden Stege quer zur Flussrichtung in der mikrofluidischen Kammer 10 Linien bilden. Die Markierungspartikel 11 werden zu den verbleibenden Stegen hingezogen und formen so Linien auf der Oberfläche der mikrofluidischen Kammer 10.
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In einer zweiten Ausführungsform 53 des Eisenkerns weist de Eisenkern verkleinerte Einkerbungen 54 auf, wobei die verbleibenden Stege in dieser Ausführungsform 53 ein quadratisches Linienmuster bilden. Die Markierungspartikel 11 setzen sich deshalb in einem quadratischen Muster auf der Oberfläche der mikrofluidischen Kammer 10 ab.
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Ausführungsbeispiel 4:
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6 zeigt eine alternative Ausgestaltung der mikrofluidischen Kammer 10. In diesem Fall wird keine Spule 41 verwendet. Hier ist stattdessen die Oberfläche der mikrofluidischen Kammer 10 strukturiert. Die Partikel werden zur Mitte 44 des Permanentmagneten 12 gezogen, können sich aufgrund der Oberflächenstrukturierung jedoch nicht entlang der Kammeroberfläche bewegen. Die Partikel werden dadurch an definierten Positionen festgehalten. Hierfür weist die innere Oberfläche der mikrofluidischen Kammer 10, an der sich die Markierungspartikel 11 absetzen, Kerben 61 auf. Die Kerben 61 sind gleichmäßig über die Länge der mikrofluidischen Kammer 10 verteilt.
