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Stand der Technik
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Parametererfassung
nach dem Anspruch 1 und eine Mikrofluidvorrichtung nach dem Anspruch 11.
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Aus
dem Stand der Technik ist es bekannt, die Dissoziationstemperatur
einer DNA zu bestimmen, indem die DNA in Lösung langsam
erwärmt wird. Dabei wird die optische Absorption bei 260
nm Wellenlänge verfolgt. Eine Dissoziation der Doppelhelix
wird über eine Zunahme der Absorption erfasst. Nachteilig
an diesem Verfahren ist, dass es sehr zeitaufwändig ist.
Weiterhin ist es bekannt, Formamid einzusetzen, das die Dissoziationstemperatur
in Abhängigkeit der Konzentration des Formamids in der Lösung
herabsetzt. Um die Dissoziationstemperatur einer DNA zu bestimmen
ist dann keine Erwärmung sondern ein Bereitstellen verschiedener
Lösungen mit unterschiedlicher Formamid-Konzentration nötig. Dazu
sind aus dem Stand der Technik Mikrofluidvorrichtungen bekannt,
bspw. aus „A robust and scalable microfluidic metering
method that allows Protein crystal growth by free interface diffusion",
C. H. Hansen et al., PNAS, Vol. 99, No. 26, pp. 16531–16536,
2002. Diese Veröffentlichung schlägt
zur Erfassung eines Konzentrations-abhängigen Parameters
vor, mehrere Reservoirs vorzusehen, in denen jeweils verschiedene
Flüssigkeitsmischungen hergestellt werden. Nachteilig an
diesen Mikrofluidvorrichtungen ist jedoch, dass sie sehr aufwändig
sind, da für jede Flüssigkeitsmischung ein eigenes
Reservoir nötig ist.
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Offenbarung der Erfindung
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Eine
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Mikrofluidvorrichtung und ein
Verfahren anzugeben, mit denen eine einfachere und bessere Parametererfassung
eines Parameters einer Flüssigkeitsmischung möglich
ist. Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung eine einfachere
Vorrichtung und ein vereinfachtes Verfahren zur Bereitstellung einer
Flüssigkeitsmischung anzugeben.
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Dieses
Problem wird gelöst durch ein Verfahren zur Parametererfassung,
insbesondere zur Erfassung einer Dissoziationstemperatur, mit den Schritten:
Befüllen eines ersten Reservoirs mit einer ersten Flüssigkeit
und eines zweiten Reservoirs mit einer zweiten Flüssigkeit,
Abwarten, bis sich in einem Verbindungskanal, der das erste Reservoir
mit dem zweiten Reservoir verbindet, eine Flüssigkeitsmischung
der ersten Flüssigkeit und der zweiten Flüssigkeit
mit einem im wesentlichen linear veränderlichen Mischungsgradienten
einstellt, und Erfassen eines Parameters der Flüssigkeitsmischung
in dem Verbindungskanal. Das Verfahren bietet den Vorteil, dass
entlang des Verbindungskanals eine Flüssigkeitsmischung
mit einem veränderlichen Mischungsverhältnis bereitgestellt
wird. Da das Mischungsverhältnis im wesentlichen linear
ist, ist das Mischungsverhältnis an jeder Stelle des Verbindungskanals
bekannt. Daher kann an jeder beliebigen Stelle des Verbindungskanals
der Parameter für ein bekanntes Mischungsverhältnis
erfasst werden. Vorzugsweise wird der Parameter oder ein aus dem
Parameter abgeleiteter Wert oder eine aus dem Parameter abgeleitete
Kurve ausgegeben.
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Vorzugsweise
wird das Verfahren auf einer Mikrofluidvorrichtung durchgeführt.
Die Herstellung und der Betrieb einer solchen Mikrofluidvorrichtung sind
in der Veröffentlichung „Monolithic Microfabricated
Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography", Unger et al.,
Science, Vol. 288, pp. 113–116, 2000, deren Inhalt
hierin aufgenommen wird, insbesondere in Bezug auf die Herstellung,
den Aufbau und den Betrieb einer Mikrofluidvorrichtung, beschrieben.
Eine Mikrofluidvorrichtung zeichnet sich beispielsweise dadurch
aus, dass die Höhe der Kanäle kleiner als 500 μm,
bevorzugter kleiner als 100 μm ist. Dies bietet den Vorteil,
dass geringe Probenmengen benötigt werden. Vorteilhafterweise
ist die Mikrofluidvorrichtung wenigstens im Bereich des Verbindungskanals
transparent, so dass der Parameter optisch erfasst werden kann.
Besonders bevorzugt wird eine Mikrofluidvorrichtung aus einem transparenten
Elastomer, beispielsweise Polydimethylsiloxane (PDMS) oder einem
anderen geeigneten Elastomer hergestellt.
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Vorteilhafterweise
sind der Verbindungskanal, das erste Reservoir und das zweite Reservoir
so ausgebildet, dass sich in dem Verbindungskanal durch Diffusion
eine Flüssigkeitsmischung der ersten Flüssigkeit
und der zweiten Flüssigkeit mit einem im wesentlichen linear
veränderlichen Mischungsgradienten einstellt. Vorzugsweise
ist dazu die Länge des Verbindungskanals mindestens doppelt
so lang wie der Umfang des Verbindungskanals. Vorteilhafterweise
ist der Querschnitt des Verbindungskanals zumindest über
ein Teilstück, vorzugsweise über seine gesamte
Länge, konstant. Weiterhin ist vorteilhafterweise das Volumen
jedes des ersten Reservoirs und des zweiten Reservoirs zumindest
2 mal, bevorzugterweise 5 mal so groß wie das Volumen des
Verbindungskanals. Diese Merkmale bieten jeweils den Vorteil, dass
sie die Einstellung eines linear veränderlichen Mischungsverhältnisses
in dem Verbindungskanal fördern. Die Erfindung geht dabei
von der Erkenntnis aus, dass in den Reservoiren auch bei geöffnetem
Verbindungskanal nur eine sehr langsame Verunreinigung der jeweils
darin enthaltenen Flüssigkeit durch die Flüssigkeit
des jeweils anderen Reservoirs auftritt, da die in den Reservoiren
vorhandenen Flüssigkeitsvolumina groß sind im
Vergleich mit dem für den Austausch zur Verfügung
stehenden Querschnitt des Verbindungskanals.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Mikrofluidvorrichtung
zur Parameterbestimmung, insbesondere zur Bestimmung einer Dissoziationstemperatur,
mit einem ersten Reservoir, das zur Aufnahme einer ersten Flüssigkeit
eingerichtet ist, einem zweiten Reservoir, das zur Aufnahme einer zweiten
Flüssigkeit eingerichtet ist, einem Verbindungskanal, der
zwischen dem ersten Reservoir und dem zweiten Reservoir angeordnet
ist und der eine Verbindung zwischen dem ersten Reservoir und dem zweiten
Reservoir bildet, wobei der Verbindungskanal, das erste Reservoir
und das zweite Reservoir ausgebildet sind, so dass sich in dem Verbindungskanal
durch Diffusion eine Flüssigkeitsmischung der ersten Flüssigkeit
und der zweiten Flüssigkeit mit einem im wesentlichen linear
veränderlichen Mischungsgradienten einstellt, und einer
Erfassungseinrichtung, die einen Parameter der sich in dem Verbindungskanal
befindenden Flüssigkeitsmischung erfasst. Für
die erfin dungsgemäße Mikrofluidvorrichtung wird
wiederum auf die oben genannte Veröffentlichung von Unger
et al. und die dort genannten vorteilhaften Merkmale verwiesen.
Allgemein bietet die Mikrofluidvorrichtung den Vorteil, dass mit
ihr einfach eine Flüssigkeitsmischung mit einem veränderlichen Mischungsverhältnis
hergestellt werden kann, so dass eine konzentrationsabhängige
Parametererfassung erleichtert wird. In dieser Anmeldung wird mit Mikrofluidvorrichtung
die gesamte Vorrichtung, gegebenenfalls einschließlich
der Erfassungseinrichtung bezeichnet, wobei die genannte Veröffentlichung
Unger et al. im wesentlichen eine Anleitung zur Herstellung des
Systems aus Kanälen, Ventilkanälen und Reservoiren
darstellt. Vorzugsweise wird der Parameter oder ein aus dem Parameter
abgeleiteter Wert oder eine aus dem Parameter abgeleitete Kurve
ausgegeben.
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Vorteilhafterweise
ist an dem Verbindungskanal ein steuerbares Ventil angeordnet. Geeignete Ventile
sind beispielsweise pneumatische Ventile, die einen Ventilkanal
aufweisen, der in weichem Material über dem Verbindungskanal
angeordnet ist, so dass eine Druckerhöhung in dem Ventilkanal
eine Schließung des Verbindungskanals bewirkt. Vorzugsweise ist
während dem Befüllen des ersten Reservoirs und dem
Befüllen des zweiten Reservoirs das Ventil, das an dem
Verbindungskanal angeordnet ist, geschlossen und wird nach dem Befüllen
des ersten Reservoirs und des zweiten Reservoirs geöffnet.
Dies bietet den Vorteil, dass die Diffusionsmischung der ersten
und der zweiten Flüssigkeit zu einem bestimmten Zeitpunkt
erfolgen kann. Vorzugsweise ist das Ventil im mittleren Drittel
des Verbindungskanals angeordnet. Dies bietet den Vorteil, dass
sich das Mischungsverhältnis, das sich durch Diffusion
einstellt, schneller aufbaut, wenn das Ventil geöffnet
wird.
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Vorzugsweise
ist der Parameter das Absorptionsvermögen der Flüssigkeitsmischung
für eine elektromagnetischen Strahlung mit einer vorbestimmten
Wellenlänge oder die Fluoreszenz der Flüssigkeitsmischung.
Entsprechend ist die Erfassungseinrichtung dazu eingerichtet, das
Absorptionsvermögen der Flüssigkeitsmischung für
eine elektromagnetischen Strahlung mit einer vorbestimmten Wellenlänge
zu erfassen. Dies bietet den Vorteil einer einfachen und schnellen
Erfassung des Parameters. Vorteilhafterweise wird elektromagnetische
Strahlung, beispielsweise Laser-Licht, verwendet, die von einer
Seite auf den Verbindungskanal gerichtet wird. Auf der anderen Seite
kann dann die den Verbindungskanal durchdringende Strahlung optoelektronisch
gemessen werden, um auf das Absorptionsverhalten der Flüssigkeitsmischung
in dem Verbindungskanal zu schließen.
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Vorteilhafterweise
wird der Parameter an einer Mehrzahl von Punkten des Verbindungskanals erfasst.
Besonders bevorzugt wird der Parameter nahezu kontinuierlich entlang
des Verbindungskanals erfasst, beispielsweise durch mindestens 10
Messpunkte, die über die Länge des Verbindungskanals im
wesentlichen gleich oder äquidistant verteilt sind. Die
Länge des Verbindungskanals bezeichnet dabei die Erstreckung
des Kanals zwischen dem ersten Reservoir und dem zweiten Reservoir.
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Vorzugsweise
umfasst die erste Flüssigkeit oder die zweite Flüssigkeit
biologisches Material. Mit umfasst ist hierbei gemeint, dass biologisches
Material in der Flüssigkeit vorhanden ist und auch weitere Stoffe
in der Flüssigkeit neben Wasser oder einem anderen Lösungsmittel
vorhanden sein können. Damit kann ein Parameter des biologischen
Materials als Parameter erfasst werden. Bevorzugter enthalten beide
Flüssigkeiten, d. h. die erste Flüssigkeit und
die zweite Flüssigkeit biologisches Material. Dies bietet den
Vorteil, dass in dem Verbindungskanal über die gesamte
Länge biologisches Material vorhanden ist.
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Vorzugsweise
ist der Parameter der Flüssigkeitsmischung von einem Zustand
des biologischen Materials abhängig, beispielsweise kann
die Absorptionsfähigkeit von dem Zustand des biologischen
Materials, vorzugsweise seinem Aufbau, abhängig sein. Die
Fluoreszenz der Flüssigkeitsmischung kann von dem Zustand
des biologischen Materials abhängig sein, wobei es möglich
ist, das biologische Material mit fluoreszierenden Stoffen zu versehen,
die bei einer Zustandsänderung des biologischen Materials (bspw.
Denaturierung) ihre nach außen wahrnehmbaren Fluoreszenzeigenschaften ändern.
Dies bietet den Vorteil, dass Zustandsänderungen des biologischen
Materials über den Parameter erfasst werden können.
Der Zustand ist vorzugsweise die Denaturierung des biologischen
Materials. Dies bietet den Vorteil, dass eine Denaturierung des
biologischen Materials über den Parameter erfasst werden
kann.
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Vorteilhafterweise
ist das biologische Material ein Polynukleotid, beispielsweise eine
DNA oder eine RNA, oder ein Polypetid. Damit kann die Denaturierung
dieser Materialien in Abhängigkeit des Mischungsverhältnisses,
das sich linear über den Verbindungskanal ändert,
bestimmt werden. Das biologische Material kann gekennzeichnet sein,
beispielsweise durch Fluoreszenz-Partikel, um eine Zustandsänderung
durch Aufnehmen der emittierten Fluoreszenz-Strahlung zu ermitteln.
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Vorzugsweise
umfasst eine der ersten Flüssigkeit und der zweiten Flüssigkeit
ein Dissoziationsmittel, wobei das Dissoziationsmittel konzentrationsabhängig
eine Änderung des Zustands oder eine Denaturierung des
biologischen Materials bewirkt. Geeignete Dissoziationsmittel sind
Formamid oder Harnstoff. Dies bietet den Vorteil, dass nach Mischen der
beiden Flüssigkeiten in dem Verbindungskanal ein linear
veränderliches Konzentrationsgefälle des Dissoziationsmittels
geschaffen wird, so dass die Reaktion des biologischen Materials
und insbesondere des Parameters auf unterschiedliche Konzentrationen
des Dissoziationsmittels beobachtet werden kann.
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Vorzugsweise
wird aus dem erfassten Parameter eine Dissoziationstemperatur des
biologischen Materials abgeleitet. Falls wie oben beschrieben ein Konzentrationsgefälle
eines Dissoziationsmittels in dem Verbindungskanal geschaffen wird,
kann durch Erfassen des Parameters, beispielsweise der Absorptionsfähigkeit
der Flüssigkeitsmischung eine Dissoziation des biologischen
Materials erfasst werden. Die Konzentration des Dissoziationsmittels
lasst sich in eine Herabsetzung der Dissoziationstemperatur umrechnen,
beispielsweise bei Formamid +0,6°C/1% Formamid. Vorteilhafterweise
wird dazu der Parameter nahezu lückenlos über
die Länge des Verbindungskanals erfasst, so dass eine durchgehende Kurve
auf Stützpunkten, die den Stellen entsprechen, an denen
der Parameter erfasst wird, ermittelt werden kann.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Mikrofluidvorrichtung
zur Parameterbestimmung, insbesondere zur Bestimmung einer Dissoziationstemperatur,
mit Mitteln, die dazu eingerichtet sind, eines der oben beschriebenen
Verfahren durchzuführen, wobei bevorzugte Ausgestaltungen
sich aus den bevorzugten Verfahrensmerkmalen mit den entsprechenden
Vorteilen ergeben.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Nachfolgend
wird ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung
anhand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert.
Dabei zeigen:
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1 eine
Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Mikrofluidvorrichtung;
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2 eine
Draufsicht der erfindungsgemäßen Mikrofluidvorrichtung
der 1;
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3 eine
Darstellung eines Verfahrensablaufs eines erfindungsgemäßen
Verfahrens.
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Ausführungsform(en) der Erfindung
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Die 1 und 2 zeigen
eine Mikrofluidvorrichtung und werden im Folgenden gemeinsam erläutert,
wobei gleiche Bezugszeichen gleiche Teile kennzeichnen. Die Mikrofluidvorrichtung
verfügt über ein erstes Reservoir 1 und
ein zweites Reservoir 2, die über einen Verbindungskanal 4 verbunden
sind. Weiterhin sind an den Reservoiren 1 und 2 jeweils Zuläufe 6 und 8 und
Abläufe 10 und 12 angeordnet, über
welche die Reservoire 1 und 2 beschickt werden können.
Der Verbindungskanal 4 ist durch ein Ventilkanal 14 pneumatisch
absperrbar, wobei der Ventilkanal 14 über dem
Verbindungskanal 4 angeordnet ist, so dass eine Druckerhöhung
in dem Ventilkanal 14 ein Schließen des Verbindungskanals 4 bewirkt. Die
Kanäle 4 und 14 und die Reservoire 1 und 2 sind jeweils
20 μm hoch. Die Kanäle 4 und 14 sind
außerdem 100 μm breit, wobei der Verbindungskanal
300 μm lang ist. Die Reservoire 1 und 2 haben
jeweils einen Durchmesser von 500 μm. Die Kanäle 4 und 14, die
Reservoire 1 und 2, die Zuläufe 6 und 8 und
die Abläufe 10 und 12 sind aus ausgehärteten,
transparenten, zweikomponentigen Elastomer (Polydimethylsiloxan,
PDMS) hergestellt.
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Die
Mikrofluidvorrichtung umfasst weiterhin eine Erfassungsvorrichtung,
die einen Sender 16 und einen Empfänger 18 umfasst.
Mit dem auf einer Seite des Verbindungskanals 4 angeordnetem
Sender 16 wird Licht der Wellenlänge 260 nm auf
den Verbindungskanal 4 gerichtet. Mit dem auf der anderen
Seite des Verbindungskanals 4 angeordneten Empfänger 18 wird
eine Absorption des Lichts durch die in dem Verbindungskanal 4 enthaltene
Flüssigkeit als Parameter erfasst.
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Die 3 zeigt
einen Verfahrensablauf einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei die oben
im Zusammenhang mit den 1 und 2 beschriebene
Mikrofluidvorrichtung verwendet wird. Die oben genannten Bezugszeichen
werden zur Bezeichnung der Teile im Folgenden verwendet. Das Verfahren
startet in einem Schritt 20. Anschließend wird
in einem Schritt 22 bei geschlossenem Ventil, d. h. in
dem Ventilkanal 14 herrscht ein Überdruck, so
dass der Verbindungskanal 4 geschlossen ist, in das erste
Reservoir 1 über den Zulauf 6 eine erste
Flüssigkeit eingefüllt und über das zweite
Reservoir 2 über den Zulauf 8 eine zweite Flüssigkeit
eingefüllt. Die Flüssigkeiten dringen dabei auch
in den Verbindungskanal 4 ein, wobei dieser jedoch noch
geschlossen ist. Die erste Flüssigkeit enthält
95% Formamid die zweite Flüssigkeit hingegen nicht. Beide
Flüssigkeiten enthalten Phosphat-Puffer, 150 mM NaCl und
je 2,5 mM zweier teilweise oder vollständig komplementärer
DNA-Stränge. Anschließend wird in einem Schritt 24 der
Verbindungskanal 4 durch Druckabbau in dem Ventilkanal 14 geöffnet, so
dass durch Diffusion eine Flüssigkeitsmischung der beiden
Flüssigkeiten in dem Verbindungskanal 4 entsteht.
Dabei stellt sich nach einem Abwarten für eine Minute in
einem Schritt 26 ein im wesentlichen lineares Mischungsverhältnis
der beiden Flüssigkeiten in dem Verbindungskanal 4 ein.
Damit wird in dem Verbindungskanal 4 ein Konzentrationsgefälle des
Formamid mit einem konstanten Gradienten geschaffen. Anschließend
wird in einem Schritt 28 an 20 Punkten, die äquidistant über
die Länge des Verbindungskanals verteilt sind, die Absorption
der Flüssigkeitsmischung als Parameter mit der darin enthaltenen
DNA gemessen. Dazu wird der Sender 16 und der Empfänger 18 verwendet.
In einem Schritt 30 werden dann die Ergebnisse berechnet
und ausgegeben. Die Messung besteht in der Aufnahme der optischen
Absorption entlang des Verbindungskanals. Die optische Absorption
A ist definiert als: A·d = –ln(Id/I0), wobei I0 die
Lichtintensität vor der Durchquerung des untersuchten Materials
und Id die Lichtintensität nach
der Durchquerung der Strecke d durch das untersuchte Material ist.
Zur Optimierung der Messung, kann das System bevorzugt durch eine Kalibrierungsmessung,
die aus den Schritten 20 bis 32 besteht, jedoch
ohne dass sich DNA in dem System befindet, kalibriert werden. Da
der Gradient im wesentlichen linear ist, kann für jeden
Messpunkt an der Stelle x in μm eine Formamidkonzentration
F in % angegeben werden: F(x) ≅ (95%/300 μm)·x.
Die virtuelle Temperatur T in °C kann an der Stelle x dann durch
T = F(x)·(0.6°C/%) berechnet werden. Der Wert
T1/2 eines sigmoidalen Fits des Plots der
Werte A über T gibt die Schmelztemperatur an. Das Verfahren
endet in einem Schritt 32.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - „A
robust and scalable microfluidic metering method that allows Protein
crystal growth by free interface diffusion", C. H. Hansen et al.,
PNAS, Vol. 99, No. 26, pp. 16531–16536, 2002 [0002]
- - „Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer
Soft Lithography", Unger et al., Science, Vol. 288, pp. 113–116,
2000 [0005]