-
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Dissoziationstemperatur von DNA nach Anspruch 1.
-
Aus dem Stand der Technik ist es bekannt, die Dissoziationstemperatur einer DNA zu bestimmen, indem die DNA in Lösung langsam erwärmt wird. Dabei wird die optische Absorption bei 260 nm Wellenlänge verfolgt. Eine Dissoziation der Doppelhelix wird über eine Zunahme der Absorption erfasst. Nachteilig an diesem Verfahren ist, dass es sehr zeitaufwändig ist. Weiterhin ist es bekannt, Formamid einzusetzen, das die Dissoziationstemperatur in Abhängigkeit der Konzentration des Formamids in der Lösung herabsetzt. Um die Dissoziationstemperatur einer DNA zu bestimmen ist dann keine Erwärmung sondern ein Bereitstellen verschiedener Lösungen mit unterschiedlicher Formamid-Konzentration nötig. Dazu sind aus dem Stand der Technik Mikrofluidvorrichtungen bekannt, bspw. aus „A robust and scalable microfluidic metering method that allows protein crystal growth by free interface diffusion”, C. H. Hansen et al., PNAS, Vol. 99, No. 26, pp. 16531–16536, 2002. Diese Veröffentlichung schlägt zur Erfassung eines Konzentrations-abhängigen Parameters vor, mehrere Reservoirs vorzusehen, in denen jeweils verschiedene Flüssigkeitsmischungen hergestellt werden. Nachteilig an diesen Mikrofluidvorrichtungen ist jedoch, dass sie sehr aufwändig sind, da für jede Flüssigkeitsmischung ein eigenes Reservoir nötig ist.
-
Die
US 6,238,874 B1 offenbart die Möglichkeit, zwischen zwei Reservoiren einen Konzentrationsgradienten einer Flüssigkeitsmischung einzustellen, wobei zumindest eine der gemischten Flüssigkeiten biologisches Material umfasst.
-
Die
US 5,965,410 A offenbart eine Parametererfassung eines biologischen Materials in Abhängigkeit einer in einem zweiten Reservoir vorhandenen chemischen Substanz.
-
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, eine Mikrofluidvorrichtung und ein Verfahren anzugeben, mit denen eine einfachere und bessere Parametererfassung eines Parameters einer Flüssigkeitsmischung möglich ist. Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung eine einfachere Vorrichtung und ein vereinfachtes Verfahren zur Bereitstellung einer Flüssigkeitsmischung anzugeben.
-
Dieses Problem wird gelöst durch ein Verfahren zur Erfassung einer Dissoziationstemperatur mit den Schritten: Befüllen eines ersten Reservoirs mit einer ersten Flüssigkeit und eines zweiten Reservoirs mit einer zweiten Flüssigkeit, Abwarten, bis sich in einem Verbindungskanal, der das erste Reservoir mit dem zweiten Reservoir verbindet, eine Flüssigkeitsmischung der ersten Flüssigkeit und der zweiten Flüssigkeit mit einem im wesentlichen linear veränderlichen Mischungsgradienten einstellt, und Erfassen eines Parameters der Flüssigkeitsmischung an einer Mehrzahl von Punkten in dem Verbindungskanal. Das Verfahren bietet den Vorteil, dass entlang des Verbindungskanals eine Flüssigkeitsmischung mit einem veränderlichen Mischungsverhältnis bereitgestellt wird. Da das Mischungsverhältnis im wesentlichen linear ist, ist das Mischungsverhältnis an jeder Stelle des Verbindungskanals bekannt. Daher kann an jeder beliebigen Stelle des Verbindungskanals der Parameter für ein bekanntes Mischungsverhältnis erfasst werden.
-
Vorzugsweise wird das Verfahren in einer Mikrofluidvorrichtung durchgeführt. Die Herstellung und der Betrieb einer solchen Mikrofluidvorrichtung sind in der Veröffentlichung „Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography”, Unger et al., Science, Vol. 288, pp. 113–116, 2000, deren Inhalt hierin aufgenommen wird, insbesondere in Bezug auf die Herstellung, den Aufbau und den Betrieb einer Mikrofluidvorrichtung, beschrieben. Eine Mikrofluidvorrichtung zeichnet sich beispielsweise dadurch aus, dass die Höhe der Kanäle kleiner als 500 μm, bevorzugter kleiner als 100 μm ist. Dies bietet den Vorteil, dass geringe Probenmengen benötigt werden. Vorteilhafterweise ist die Mikrofluidvorrichtung wenigstens im Bereich des Verbindungskanals transparent, so dass der Parameter optisch erfasst werden kann. Besonders bevorzugt wird eine Mikrofluidvorrichtung aus einem transparenten Elastomer, beispielsweise Polydimethylsiloxane (PDMS) oder einem anderen geeigneten Elastomer hergestellt.
-
Der Verbindungskanal, das erste Reservoir und das zweite Reservoir sind so ausgebildet, dass sich in dem Verbindungskanal durch Diffusion eine Flüssigkeitsmischung der ersten Flüssigkeit und der zweiten Flüssigkeit mit einem im wesentlichen linear veränderlichen Mischungsgradienten einstellt. Vorzugsweise ist dazu die Länge des Verbindungskanals mindestens doppelt so lang wie der Umfang des Verbindungskanals. Vorteilhafterweise ist der Querschnitt des Verbindungskanals zumindest über ein Teilstück, vorzugsweise über seine gesamte Länge, konstant. Weiterhin ist vorteilhafterweise das Volumen jedes des ersten Reservoirs und des zweiten Reservoirs zumindest 2 mal, bevorzugterweise 5 mal so groß wie das Volumen des Verbindungskanals. Diese Merkmale bieten jeweils den Vorteil, dass sie die Einstellung eines linear veränderlichen Mischungsverhältnisses in dem Verbindungskanal fördern. Die Erfindung geht dabei von der Erkenntnis aus, dass in den Reservoiren auch bei geöffnetem Verbindungskanal nur eine sehr langsame Verunreinigung der jeweils darin enthaltenen Flüssigkeit durch die Flüssigkeit des jeweils anderen Reservoirs auftritt, da die in den Reservoiren vorhandenen Flüssigkeitsvolumina groß sind im Vergleich mit dem für den Austausch zur Verfügung stehenden Querschnitt des Verbindungskanals.
-
Die Mikrofluidvorrichtung zur Bestimmung einer Dissoziationstemperatur ist ausgestattet mit einem ersten Reservoir, das zur Aufnahme einer ersten Flüssigkeit eingerichtet ist, einem zweiten Reservoir, das zur Aufnahme einer zweiten Flüssigkeit eingerichtet ist, und einem Verbindungskanal, der zwischen dem ersten Reservoir und dem zweiten Reservoir angeordnet ist und der eine Verbindung zwischen dem ersten Reservoir und dem zweiten Reservoir bildet, wobei der Verbindungskanal, das erste Reservoir und das zweite Reservoir so ausgebildet sind, so dass sich in dem Verbindungskanal durch Diffusion eine Flüssigkeitsmischung der ersten Flüssigkeit und der zweiten Flüssigkeit mit einem im wesentlichen linear veränderlichen Mischungsgradienten einstellt. Eine Erfassungseinrichtung erfasst einen Parameter der sich in dem Verbindungskanal befindenden Flüssigkeitsmischung. Für diese Mikrofluidvorrichtung wird wiederum auf die oben genannte Veröffentlichung von Unger et al. und die dort genannten vorteilhaften Merkmale verwiesen. Allgemein bietet die Mikrofluidvorrichtung den Vorteil, dass mit ihr einfach eine Flüssigkeitsmischung mit einem veränderlichen Mischungsverhältnis hergestellt werden kann, so dass eine konzentrationsabhängige Parametererfassung erleichtert wird. In dieser Anmeldung wird mit Mikrofluidvorrichtung die gesamte Vorrichtung, gegebenenfalls einschließlich der Erfassungseinrichtung bezeichnet, wobei die genannte Veröffentlichung Unger et al. im wesentlichen eine Anleitung zur Herstellung des Systems aus Kanälen, Ventilkanälen und Reservoiren darstellt. Vorzugsweise wird der Parameter oder ein aus dem Parameter abgeleiteter Wert oder eine aus dem Parameter abgeleitete Kurve ausgegeben.
-
Vorteilhafterweise ist an dem Verbindungskanal ein steuerbares Ventil angeordnet. Geeignete Ventile sind beispielsweise pneumatische Ventile, die einen Ventilkanal aufweisen, der in weichem Material über dem Verbindungskanal angeordnet ist, so dass eine Druckerhöhung in dem Ventilkanal eine Schließung des Verbindungskanals bewirkt. Vorzugsweise ist während dem Befüllen des ersten Reservoirs und dem Befüllen des zweiten Reservoirs das Ventil, das an dem Verbindungskanal angeordnet ist, geschlossen und wird nach dem Befüllen des ersten Reservoirs und des zweiten Reservoirs geöffnet. Dies bietet den Vorteil, dass die Diffusionsmischung der ersten und der zweiten Flüssigkeit zu einem bestimmten Zeitpunkt erfolgen kann. Vorzugsweise ist das Ventil im mittleren Drittel des Verbindungskanals angeordnet. Dies bietet den Vorteil, dass sich das Mischungsverhältnis, das sich durch Diffusion einstellt, schneller aufbaut, wenn das Ventil geöffnet wird.
-
Der Parameter ist entweder das Absorptionsvermögen der Flüssigkeitsmischung für eine elektromagnetischen Strahlung mit einer vorbestimmten Wellenlänge oder die Fluoreszenz der Flüssigkeitsmischung. Entsprechend ist die Erfassungseinrichtung dazu eingerichtet, das Absorptionsvermögen der Flüssigkeitsmischung für eine elektromagnetischen Strahlung mit einer vorbestimmten Wellenlänge zu erfassen. Dies bietet den Vorteil einer einfachen und schnellen Erfassung des Parameters. Vorteilhafterweise wird elektromagnetische Strahlung, beispielsweise Laser-Licht, verwendet, die von einer Seite auf den Verbindungskanal gerichtet wird. Auf der anderen Seite kann dann die den Verbindungskanal durchdringende Strahlung optoelektronisch gemessen werden, um auf das Absorptionsverhalten der Flüssigkeitsmischung in dem Verbindungskanal zu schließen.
-
Der Parameter wird an einer Mehrzahl von Punkten des Verbindungskanals erfasst. Besonders bevorzugt wird der Parameter nahezu kontinuierlich entlang des Verbindungskanals erfasst, beispielsweise durch mindestens 10 Messpunkte, die über die Länge des Verbindungskanals im wesentlichen gleich oder äquidistant verteilt sind. Die Länge des Verbindungskanals bezeichnet dabei die Erstreckung des Kanals zwischen dem ersten Reservoir und dem zweiten Reservoir.
-
Die erste Flüssigkeit oder die zweite Flüssigkeit umfasst biologisches Material. Mit umfasst ist hierbei gemeint, dass biologisches Material in der Flüssigkeit vorhanden ist und auch weitere Stoffe in der Flüssigkeit neben Wasser oder einem anderen Lösungsmittel vorhanden sein können. Damit kann ein Parameter des biologischen Materials als Parameter erfasst werden. Bevorzugt enthalten beide Flüssigkeiten, d. h. die erste Flüssigkeit und die zweite Flüssigkeit, biologisches Material. Dies bietet den Vorteil, dass in dem Verbindungskanal über die gesamte Länge biologisches Material vorhanden ist.
-
Vorzugsweise ist der Parameter der Flüssigkeitsmischung von einem Zustand des biologischen Materials abhängig, beispielsweise kann die Absorptionsfähigkeit von dem Zustand des biologischen Materials, vorzugsweise seinem Aufbau, abhängig sein. Die Fluoreszenz der Flüssigkeitsmischung kann von dem Zustand des biologischen Materials abhängig sein, wobei es möglich ist, das biologische Material mit fluoreszierenden Stoffen zu versehen, die bei einer Zustandsänderung des biologischen Materials (bspw. Denaturierung) ihre nach außen wahrnehmbaren Fluoreszenzeigenschaften ändern. Dies bietet den Vorteil, dass Zustandsänderungen des biologischen Materials über den Parameter erfasst werden können. Der Zustand ist die Denaturierung des biologischen Materials. Dies bietet den Vorteil, dass eine Denaturierung des biologischen Materials über den Parameter erfasst werden kann.
-
Das biologische Material ist eine DNA. Damit kann die Denaturierung dieser Substanz in Abhängigkeit des Mischungsverhältnisses, das sich linear über den Verbindungskanal ändert, bestimmt werden. Das biologische Material kann gekennzeichnet sein, beispielsweise durch Fluoreszenz-Partikel, um eine Zustandsänderung durch Aufnehmen der emittierten Fluoreszenz-Strahlung zu ermitteln.
-
Die erste Flüssigkeit und die zweite Flüssigkeit umfassen ein Dissoziationsmittel, wobei das Dissoziationsmittel konzentrationsabhängig eine Änderung des Zustands oder eine Denaturierung des biologischen Materials bewirkt. Geeignete Dissoziationsmittel sind Formamid oder Harnstoff. Dies bietet den Vorteil, dass nach Mischen der beiden Flüssigkeiten in dem Verbindungskanal ein linear veränderliches Konzentrationsgefälle des Dissoziationsmittels geschaffen wird, so dass die Reaktion des biologischen Materials und insbesondere des Parameters auf unterschiedliche Konzentrationen des Dissoziationsmittels beobachtet werden kann.
-
Aus dem erfassten Parameter wird eine Dissoziationstemperatur der DNA abgeleitet. Falls wie oben beschrieben ein Konzentrationsgefälle eines Dissoziationsmittels in dem Verbindungskanal geschaffen wird, kann durch Erfassen des Parameters, beispielsweise der Absorptionsfähigkeit der Flüssigkeitsmischung die Dissoziation des biologischen Materials erfasst werden. Die Konzentration des Dissoziationsmittels lässt sich in eine Herabsetzung der Dissoziationstemperatur umrechnen, beispielsweise bei Formamid +0,6°C/1% Formamid. Vorteilhafterweise wird dazu der Parameter nahezu lückenlos über die Länge des Verbindungskanals erfasst, so dass eine durchgehende Kurve auf Stützpunkten, die den Stellen entsprechen, an denen der Parameter erfasst wird, ermittelt werden kann.
-
Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der zur Durchführung des Verfahrens verwendeten Vorrichtung anhand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Dabei zeigen:
-
1 eine Seitenansicht der verwendeten Mikrofluidvorrichtung;
-
2 eine Draufsicht auf die Mikrofluidvorrichtung der 1;
-
3 eine Darstellung eines Verfahrensablaufs eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
-
Die 1 und 2 zeigen eine Mikrofluidvorrichtung und werden im Folgenden gemeinsam erläutert, wobei gleiche Bezugszeichen gleiche Teile kennzeichnen. Die Mikrofluidvorrichtung verfügt über ein erstes Reservoir 1 und ein zweites Reservoir 2, die über einen Verbindungskanal 4 verbunden sind. Weiterhin sind an den Reservoiren 1 und 2 jeweils Zuläufe 6 und 8 und Abläufe 10 und 12 angeordnet, über welche die Reservoire 1 und 2 beschickt werden können. Der Verbindungskanal 4 ist durch einen Ventilkanal 14 pneumatisch absperrbar, wobei der Ventilkanal 14 über dem Verbindungskanal 4 angeordnet ist, so dass eine Druckerhöhung in dem Ventilkanal 14 ein Schließen des Verbindungskanals 4 bewirkt. Die Kanäle 4 und 14 und die Reservoire 1 und 2 sind jeweils 20 μm hoch. Die Kanäle 4 und 14 sind außerdem 100 μm breit, wobei der Verbindungskanal 300 μm lang ist. Die Reservoire 1 und 2 haben jeweils einen Durchmesser von 500 μm. Die Kanäle 4 und 14, die Reservoire 1 und 2, die Zuläufe 6 und 8 und die Abläufe 10 und 12 sind aus ausgehärteten, transparenten, zweikomponentigen Elastomer (Polydimethylsiloxan, PDMS) hergestellt.
-
Die Mikrofluidvorrichtung umfasst weiterhin eine Erfassungsvorrichtung, die einen Sender 16 und einen Empfänger 18 umfasst. Mit dem auf einer Seite des Verbindungskanals 4 angeordnetem Sender 16 wird Licht der Wellenlänge 260 nm auf den Verbindungskanal 4 gerichtet. Mit dem auf der anderen Seite des Verbindungskanals 4 angeordneten Empfänger 18 wird eine Absorption des Lichts durch die in dem Verbindungskanal 4 enthaltene Flüssigkeit als Parameter erfasst.
-
Die 3 zeigt einen Verfahrensablauf einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wobei die oben im Zusammenhang mit den 1 und 2 beschriebene Mikrofluidvorrichtung verwendet wird. Die oben genannten Bezugszeichen werden zur Bezeichnung der Teile im Folgenden verwendet. Das Verfahren startet in einem Schritt 20. Anschließend wird in einem Schritt 22 bei geschlossenem Ventil, d. h. in dem Ventilkanal 14 herrscht ein Überdruck, so dass der Verbindungskanal 4 geschlossen ist, in das erste Reservoir 1 über den Zulauf 6 eine erste Flüssigkeit eingefüllt und über das zweite Reservoir 2 über den Zulauf 8 eine zweite Flüssigkeit eingefüllt. Die Flüssigkeiten dringen dabei auch in den Verbindungskanal 4 ein, wobei dieser jedoch noch geschlossen ist. Die erste Flüssigkeit enthält 95% Formamid die zweite Flüssigkeit hingegen nicht. Beide Flüssigkeiten enthalten Phosphat-Puffer, 150 mM NaCl und je 2,5 mM zweier teilweise oder vollständig komplementärer DNA-Stränge. Anschließend wird in einem Schritt 24 der Verbindungskanal 4 durch Druckabbau in dem Ventilkanal 14 geöffnet, so dass durch Diffusion eine Flüssigkeitsmischung der beiden Flüssigkeiten in dem Verbindungskanal 4 entsteht. Dabei stellt sich nach einem Abwarten für eine Minute in einem Schritt 26 ein im wesentlichen lineares Mischungsverhältnis der beiden Flüssigkeiten in dem Verbindungskanal 4 ein. Damit wird in dem Verbindungskanal 4 ein Konzentrationsgefälle des Formamid mit einem konstanten Gradienten geschaffen. Anschließend wird in einem Schritt 28 an 20 Punkten, die äquidistant über die Länge des Verbindungskanals verteilt sind, die Absorption der Flüssigkeitsmischung als Parameter mit der darin enthaltenen DNA gemessen. Dazu wird der Sender 16 und der Empfänger 18 verwendet. In einem Schritt 30 werden dann die Ergebnisse berechnet und ausgegeben. Die Messung besteht in der Aufnahme der optischen Absorption entlang des Verbindungskanals. Die optische Absorption A ist definiert als: A·d = –ln(Id/I0), wobei I0 die Lichtintensität vor der Durchquerung des untersuchten Materials und Id die Lichtintensität nach der Durchquerung der Strecke d durch das untersuchte Material ist. Zur Optimierung der Messung, kann das System bevorzugt durch eine Kalibrierungsmessung, die aus den Schritten 20 bis 32 besteht, jedoch ohne dass sich DNA in dem System befindet, kalibriert werden. Da der Gradient im wesentlichen linear ist, kann für jeden Messpunkt an der Stelle x in μm eine Formamidkonzentration F in % angegeben werden: F(x) ≅ (95%/300 μm)·x. Die virtuelle Temperatur T in °C kann an der Stelle x dann durch T = F(x)·(0.6°C/%) berechnet werden. Der Wert T1/2 eines sigmoidalen Fits des Plots der Werte A über T gibt die Schmelztemperatur an. Das Verfahren endet in einem Schritt 32.
