DE2733409A1

DE2733409A1 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung der osmotischen zellresistenz

Info

Publication number: DE2733409A1
Application number: DE19772733409
Authority: DE
Inventors: Yoichiro Ito
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-08-09
Filing date: 1977-07-23
Publication date: 1978-02-16
Also published as: GB1576856A; FR2361657A1; JPS6049865B2; SE7707048L; JPS5351796A; IL52311A0; CA1068587A; IL52311A; US4040742A; FR2361657B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der osmotischen Zellresistenz, insbesondere zur Ermittlung einer Hämolysekurve einer Blutprobe, die einer vorbeiströmenden Salzlösung mit gesteuerter Konzentration ausgesetzt wird.

Der Resistenztest vom Erythrocyten ist bislang in der Medizin ein etwas vernachläßigter Test gewesen. Beim herkömmlichen Parpart-Verfahren (A.K. Parpart, P.B. Lorenz, E.R. Parpart, J.R. Greeg und A.M. Chase, "The Osmotic Resistance (Fragility) of Human Red Cells", J. Clin. Invest. 26:676, 1947) werden eine Vielzahl Teströhrchen verwendet, was mit zahlreichen Schwierigkeiten verbunden und sehr zeitraubend ist und wobei von einer vollständigen Hämolysekurve nur einige wenige Punkte ermittelt werden können.

In den vergangenen Jahren sind Verfahren entwickelt worden, bei denen eine vollständige Hämolysekurve ausgemessen wird. Die Kurve kann beispielsweise mit dem Verfahren von Dannon (D. Dannon: "A Rapid Micro Method for Recording Red Cell Osmotic Fragility by Continuous Decrease of Salt Concentration", J. Clin. Path. 15:377, 1965) ermittelt werden, bei dem die Zellen mittels Dialyse einer sich verändernden Konzentration ausgesetzt werden, wobei gleichzeitig die Lichtdurchlässigkeit der Lösung beobachtet wird. Hierbei wird eine Dialysekammer benötigt, die mit zwei CeIlophanmembranen ausgerüstet ist, welche die Lösung zwischen sich aufnehmen. Die Dialyse durch die Membranen erzeugt eine abnehmende Konzentration der Salzlösung. Der Konzentrationsgradient ist eine Funktion des Abstandes und der Durchlässigkeit der Membranen. Aus diesem Grund ergeben sich bereits bei geringfügigen Änderungen des Abstandes und der Durchlässigkeit nicht reproduz ierbare Meßwerte.

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Bei dem Planetenzentrifugenverfahren (R. Harada, Y. Ito, und E. Kimura: "A New Method of Osmotic Fragility Test of Erythrocytes with Coil Planet Centrifuge", Japanese J. of Phys. 19:306-314, 1969, und K. Katzimer und S. Shibata: "Coil Planet Centrifuge and its Application to the Observation of Altered Membrane Properties of Erythrocytes in Hepatobiliary Disorders", J. Lab. Clin. Med. 85:855-864, 1975) wird ein fein aufgewickeltes Rohr mit einer Salzlösung gefüllt, welche einen genau bestimmten Konzentrationsgradienten aufweist. Blutzellen, die am Ende mit der hohen Konzentration in das Rohr eingefüllt werden, bewegen sich infolge der Zentrifugalkraft und der leichten Drehung der Spule durch das Rohr. Wenn die Zellen schließlich die kritische Konzentration in der Salzlösung erreicht haben, tritt das Hämoglobin aus, was mittels eines Densitometers über die ganze Länge des Rohres verfolgt werden kann. Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß die Hämolyse in einer reinen Salzlösung, welche frei von Hämoglobin ist, stattfindet. Dies beruht darauf, daß das ausgetretene Hämoglobin an der Austrittsstelle verbleibt und die Blutzellen, die weiter durch das Rohr wandern, durch die dort befindliche Lösung abgewaschen werden. Trotz der Vorteile dieses Verfahrens ist es nur sehr schlecht zu gebrauchen, da eine genaue Ermittlung der Hämolysekurve nur mit Schwierigkeiten möglich ist, was insbesondere durch optische Unreinheiten in der Rohrwandung hervorgerufen wird.

Aus diesen Gründen wird in den meisten Laboratorien noch das herkömmliche Parpart-Verfahren zur Bestimmung der osmotischen Resistenz von Erythrocyten benutzt.

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Aufgabe der Erfindung ist es daher, die oben geschilderten Nachteile zu vermeiden und ein verbessertes Verfahren zur Resistenzbestimmung zu schaffen.

Die Aufgabe besteht weiter darin, ein Verfahren zu schaffen, bei dem die zu überprüfenden Zellen einer reinen Salzlösung mit einem kontinuierlichen Konzentrationsgefälle in einer einfachen Vorrichtung ausgesetzt und dabei sehr genaue reproduzierbare Meßwerte erzielt werden.

Erfindungsgemäß wird die zu untersuchende Probe in eine durch ein etwa horizontal verlaufendes Kapillarrohr wirbelfrei hindurchströmende Salzlösung, deren Konzentration während der Durchlaufzeit verändert wird, gebracht, und die Zellen der Probe werden der zeitlich sich verändernden Konzentration der Salzlösung ausgesetzt, indem sie in dem horizontal verlaufenden Kapillarrohr in den nahe der Rohrinnenwand liegenden Bereich geringerer Strömungsgeschwindigkeit gelangen, worauf die Veränderungen der optischen Dichte der Flüssigkeit über die Zeit hinweg aufgezeichnet werden.

Vorzugsweise wird die die Probe aufnehmende Salzlösung in um eine senkrechte Achse verlaufenden Windungen geführt. Dabei wird die Konzentration der Salzlösung linear über die Zeit hinweg verringert.

Zweckmäßig wird als Salzlösung eine wässrige Lösung von Natriumchlorid verwendet, deren Konzentration während einer Zeit von 30 min. von etwa 0,85% auf 0% NaCl herabgesetzt wird, andererseits soll die Durchflußgeschwindigkeit der Salzlösung durch das Kapillarrohr bei einem Rohrinnendurchmesser von etwa 0,8!
(Milliliter pro Stunde) betragen.

Rohrinnendurchmesser von etwa 0,85 mm etwa auf 6,7 /h

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Die Vorrichtung zur Bestimmung der osmotischen Zellresistenz zellenthaltender Proben kennzeichnet sich durch eine Quelle für eine Salzlösung, Mittel zum Verändern von deren Konzentration während einer bestimmten Zeitdauer, ein in Schraubenwindungen um eine im wesentlichen senkrechte Achse verlaufendes Kapillarrohr und Mittel zum Fördern der aus der Quelle kommenden Salzlösung durch das Kapillarrohr sowie weitere Mittel zum Einbringen der Probe in das Kapillarrohr in der Weise, daß die Zellen im wesentlichen in den Windungen des Kapillarrohres zurückgehalten werden und die Salzlösung an ihnen vorbeiströmt. Außerdem ist schließlich eine Vorrichtung zum kontinuierlichen Messen der optischen Dichte des Ausflusses aus dem Kapillarrohr während der genannten Zeit vorgesehen. Die Vorrichtung zum kontinuierlichen Messen der optischen Dichte arbeitet bei einer Wellenlänge von etwa 547 nm über die Meßzeit hinweg.

Weitere Vorteile und Besonderheiten der Erfindung werden im Verlauf der nachfolgenden Beschreibung anhand der beigefügten Zeichnungen erläutert. Dabei zeigen:

Fig. 1a, vergrößerte Querschnitte durch verschieden 1b, 1c ausgerichtete Kapillarrohre mit darin

befindlichen roten Blutkörperchen, die sich gemäß dem Poiseuille¹sehen Strömungsgesetz angeordnet haben;

Fig. 2 eine schematische Darstellung der Vorrichtung zur Resistenzbestimmung von Erythrocyten;

Fig. 3 ein Diagramm über den Verlauf der

relativen Geschwindigkeit, mit welcher die

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Salzlösung und die roten Blutkörperchen durch das Kapillarrohr in der Vorrichtung gemäß Fig. 2 bewegt werden;

Flg. 4 ein Diagramm der typischen Hämolysekurven von vier verschiedenen Blutproben eines normalen Individuums, das mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Vorrichtung dargestellt wurde, wobei die Kochsalzkonzentration linear mit der Zeit verändert wurde.

Bei dem erfindungsgemäßen Kapillarstromverfahren wird eine Kochsalzlösung mit einem genau bestimmten Konzentrationsgradienten mit einem Gradientenmischer angesetzt und anschließend durch ein Kapillarrohr geleitet, welches spulenförmig aufgewickelt ist, wobei die Spule im wesentlichen eine senkrechte Achse aufweist, so daß die einzelnen Windungen annähernd horizontal verlaufen.

In den Fig. IA, 1B und 1C ist durch eine Parabel 11 die Stromverteilung in einem Kapillarrohr gemäß dem Poiseuille¹sehen Gesetz dargestellt. Die Parabel stellt dabei die durch die Flüssigkeit ausgeübte Vortriebskraft dar, welche in der Rohrachse ihr Maximum aufweist und sich zu den Rohrwandungen hin verringert. Die Kurve kann ebenso als Geschwindigkeitsverteilung der einzelnen Flüssigkeitsteilchen aufgefaßt werden, wobei hier ebenfalls der Flüssigkeitsstrom in der Nähe der Rohrachse sich mit relativ hoher Geschwindigkeit bewegt, im Vergleich zum Flüssigkeitsstrom nahe den Rohrwandungen. Werden Partikel, wie beispielsweise Erythrocyten, durch die Flüssigkeit mitgerissen, entspricht ihre Geschwindigkeitsverteilung demzufolge ebenfalls dem Poiseuille¹sehen Gesetz, was auch entsprechende Anordnungen der Partikel in dem Rohr zur Folge hat.

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In Fig. 1A ist das Rohr 12 senkrecht ausgerichtet, wobei der Flüssigkeitsstrom abwärts verläuft. Die mitgerissenen Erythrocyten werden durch die Kräfte der Flüssigkeit zur Rohrachse hin gedrängt, wie es bei 13 angedeutet ist. Die Geschwindigkeit der Erythrocyten nahe der Rohrachse entspricht der der Flüssigkeit, wobei die weiter außen liegenden Teilchen langsamer bewegt werden, wie es der Poiseuille¹sehen Geschwindigkeitsparabel 11 entspricht. Zum gleichen Ergebnis gelangt man bei einem senkrechten Rohr gemäß Fig. 1B, welches jedoch in Aufwärtsrichtung durchströmt wird.

In Fig. 1C verläuft nun das Rohr 12 im wesentlichen horizontal, so daß die Gravitationskräfte die Erythrocyten 13 zur unteren Rohrwandung hin bewegen. Sie gelangen dorthin, wo sich die Flüssigkeit infolge des Poiseuille¹sehen Gesetzes nur sehr langsam bewegt. Infolgedessen ist auch die Geschwindigkeit der Erythrocyten im Vergleich zur durchschnittlichen Strömungsgeschwindigkeit im Rohr sehr gering, so daß der größte Anteil der Flüssigkeit mit relativ hoher Geschwindigkeit über die Erythrocyten hinwegströmt.

Durch das Poiseuille'sehe Gesetz zusammen mit der Schwerkraft ergibt sich also eine Verteilung gemäß Fig. 1C, wobei die Erythrocyten, die in eine aufrechtstehende Spule eines Kapillarrohres eingefüllt werden, sich sehr viel langsamer durch das Rohr bewegen, wie die Salzlösung. Erfindungsgemäß werden also die Zellen einer Salzlösung mit abnehmender Konzentration zur Hämolysebestimmung ausgenutzt. Das aus den Zellen austretende Hämoglobin wird schnell weitergespült. Die optische Dichte wird gegen die Zeit bei einer Wellenlänge von 547 nm aufgezeichnet. Die Zellen werden dabei ständig abgespült und frischer,

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hämoglobinfreier Salzlösung ausgesetzt, wobei hier jedoch, im Gegensatz zum Zentrifugenverfahren, das ausgetretene Hämoglobin mit einer einfachen optischen Einrichtung aufgezeichnet werden kann, so daß eine vollständige Hämolysekurve entsteht.

Wie schon gesagt, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Poiseuille'sche Gesetz in Verbindung mit der Schwerkraft und einem horizontalen Kapillarrohr verwendet, um Blutkörperchen darin zurückzuhalten, damit eine Salzlösung mit dem gewünschten Konzentrationsgefälle darüber hinwegströmen kann. Wie oben ausgeführt, hängt die Geschwindigkeit der roten Blutkörperchen von der Richtung des Rohres ab, d.h. bei einem senkrechten Rohr, bei welchem die Schwerkraft in Längsrichtung des Rohres wirkt, wie es in den Fig. 1A und 1B dargestellt ist, sammeln sich die Blutkörperchen in der Mitte des Rohres und erreichen dadurch ziemlich hohe Geschwindigkeiten. Wenn das Rohr jedoch etwa horizontal ausgerichtet ist, wie es in Fig. 1 gezeigt wird, bewegen sich die Blutkörperchen sehr viel langsamer durch das Rohr, als die Salzlösung. Plasma, Blutplättchen, Hämoglobin und anderes, was nicht durch die Schwerkraft beeinflußt wird, strömt relativ schnell durch das Rohr. Das Zrückhalten der roten Blutkörperchen kann also erreicht werden, indem das Kapillarrohr 12 um einen aufrechtstehenden zylindrischen Träger 14, wie er schematisch in Fig. 2 dargestellt ist, gewickelt wird. Je größer der Durchmesser des zylindrischen Trägers 14 relativ zum Durchmesser des Rohres 12 ist, umso horizontaler kann das Rohr verlegt werden. Eine Salzlösung mit abfallender Konzentration, die in das Rohr geleitet wird, spült also das freigesetzte Hämoglobin mit, wohingegen die intakten Zellen zurückbleiben. Eine Hämolysekurve kann ermittelt werden, indem der Ausfluß der Säule mit einem Spektrometer beobachtet wird.

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In Fig. 2 sind schmematisch die Grundelemente der erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt, die im wesentlichen einen Gradientenmischer 15, eine Pumpeneinheit 17, eine Spule 18 aus dem Kapillarrohr 12 zum Zurückhalten der Blutkörperchen und einen Detektor 19 mit einer Aufzeichnungsvorrichtung 30 zur Aufzeichnung der Hämolysekurve umfaßt.

Der Gradientenmischer 15 kann dem LKB Ultrograd 11300 der LKB Produkter Fabriksaktiebolag, Stockholm, Schweden entsprechen, welcher mit einer zeitgesteuerten Doppelventileinheit 20 versehen ist, die über Leitungen am Behälter 21 und 22 angeschlossen ist, welche die Anfangs- und die Endlösung enthalten, wobei die Leitung 29 an den Mischer 23 führt, so daß ein Konzentrationsgefälle von 0,85% bis 0% Kochsalz über eine Zeitdauer von dreißig Minuten erreicht wird.

Die Lösung wird dann aus dem Mischer 23 in die erste Stufe einer Zweistufenpumpe 17, beispielsweise einer Technicon Proportioning Pump der Technicon Chromatography Corp., New York, N.Y., geleitet und gelangt von dort über eine Leitung 24 mit einer lichten Weite von 1,65 mm in eine Blasenfalle 25, in der gleichzeitig überschüssige Flüssigkeit entfernt wird, über die Leitung 26 mit einer lichten Weite von 0,38 mm gelangt die Lösung schließlich in die zweite Stufe der Pumpe 17. Die Ausgangsleitung 27 der zweiten Pumpenstufe führt in die Probenschleuse 28, in welcher die zu untersuchenden Blutproben der Salzlösung zugesetzt werden können. Die Probe wird mit der Salzlösung durch die Spule 18 geführt und wird schließlich durch die Vorrichtung 19 geführt, in welcher die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 547 nm gemessen wird, die mit der Vorrichtung 30 aufgezeichnet wird. Hier kann der

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LKB Unicord II Detektor und Rekorder der oben genannten LKB Produkter Fabriksaktiebolag zum Einsatz gelangen. Die Meßzelle im Detektor 19 hat vorzugsweise eine lichte Weite von 1,8 mm, und die Messung erfolgt über einen 547 nm-Interferenzfliter zur Bestimmung des Hämoglobins.

In einer typischen Vorrichtung gemäß Fig. 2 fällt die Kochsalzkonzentration von 0,85% auf 0% innerhalb von dreißig Minuten, bei einem Pumpvolumen von 6,5 ml/h, wobei sichergestellt ist, daß die roten Blutkörperchen gleichmäßig mit der Salzlösung vermischt werden, so daß die Zellen einer Konzentrationsänderung von 0,03% pro Minute ausgesetzt werden. Die Durchflußgeschwindigkeit der roten Blutkörperchen beträgt etwa 1/10 der Durchflußgeschwindigkeit der Kochsalzlösung bzw. etwa 18 mm/min.

In der typischen Vorrichtung besteht die Spule 18 aus einem 140 cm langen Teflonrohr mit einer lichten Weite von 0,85 mm, was einem Volumen von etwa 0,8 ml entspricht. Größere Rohrdurchmesser ergeben eine ungenügende Spülung der Blutzellen mit der vorbeiströmenden Salzlösung, was sich in einer unzulässigen Verbreiterung der Hämolysekurve äußert. Bei engeren Durchmessern ist die Strömung zu unregelmäßig, und es werden zuviele Blutzellen mitgerissen. Die optimale Länge der Spule wird bestimmt durch die Durchflußgeschwindigkeit und durch den ausgewählten Konzentrationsgradienten.

In Fig. 3 ist der Unterschied der Geschwindigkeit der Salzlösung, dargestellt durch die Linie 31, und der Geschwindigkeit der roten Blutkörperchen, dargestellt durch die schraffierte Fläche 32, gezeigt. Durch die schraffierte Fläche 32 wird angedeutet, daß die Geschwindigkeit der roten Blutkörperchen unterschiedlich ist, so

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daß sie sich im Verlauf der Zeit über die Länge des Rohres hinweg verteilen.

Bei einem typischen Verfahren wird die Salzlösung wie folgt hergestellt:

Eine gepufferte zehnprozentige Kochsalzlösung wird wie folgt angesetzt: 90 g NaCl, 13,65 g Na₂HPO₄ und 2,15 g NaH₂PO₄-H₃O werden in destilliertem Wasser gelöst und die Lösung schließlich auf einen Liter ergänzt. Die O,85prozentige Kochsalzanfangslösung wird aus der oben angesetzten Lösung hergestellt, indem 85 ml der obigen Lösung mit destilliertem Wasser auf einen Liter ergänzt werden. Die so erhaltene Lösung hat einen pH-Wert von 7,4. Als Endlösung wird destilliertes Wasser verwendet. Der lineare Konzentrationsgradient zwischen Anfangs- und Endlösung wird mit dem LKB-Ultrograd 11300 über einen Zeitraum von dreißig Minuten erzeugt.

Ein Test wird nun wie folgt durchgeführt: Die Probenschleuse 28 wird geöffnet und die Pumpeneinheit 17 für etwa eine Minute in Gang gesetzt, so daß die Pumpenschläuche mit der Anfangslösung gefüllt sind. Mit einer Spritze mit etwa 3 ecm Inhalt wird die Anfangslösung über den Ausgang in die Detektorvorrichtung 19, die Spule 18 und schließlich in die Probenschleuse 28 gedrückt, wobei ein etwaiger Überschuß abgesaugt wird. In die Probenschleuse wird dann eine Probe eingeführt und die Schleuse daraufhin geschlossen. Die Pumpeneinheit 17,der Gradientenmischer 15 und die Detektorvorrichtung 19 und 30 werden gleichzeitig in Gang gesetzt.

Die unverdünnten Blutproben werden mit Heparin oder EDTA behandelt und mit einer Micropipette oder einer 10-Microliter-Spritze eingeführt. Bei Vergleichen hat sich

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herausgestellt, daß die Resultate bei mit Heparin oder EDTA behandelten Blutproben gleich sind. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, daß die beiden Antikoagnlantien sofort durch die gepufferte Salzlösung weggespült werden.

Die Aufzeichnungsvorrichtung 30 wird in Prozent Natriumchlorid pro Zeit geeicht, was mit Hilfe eines herkömmlichen geeichten Leitfähigkeitsmessers erfolgt. Die sich ergebende Kurve 33 ist in Fig. 4 dargestellt.

In Fig. 4 sind außerdem Hämolysekurven 34 dargestellt, die vier verschiedenen Blutproben eines gesunden Patienten entsprechen. Die Kurven 34 entsprechen frischen Blutproben. Die gestrichelt dargestellte Kurve 35, die nach links verschoben scheint, stammt von einer inkubierten normalen Blutprobe, was auf eine verringerte osmotische Resistenz schließen läßt.

Nicht normale Proben zeigen im Vergleich zu frischen und inkubierten Proben charakteristische Abweichungen der Resistenz. Eine Verschiebung nach links, relativ zur normalen Probe, zeigt eine verringerte osmotische Resistenz an, wohingegen eine Verschiebung nach rechts eine Erhöhung andeutet.

Bestimmte Typen nicht normaler Proben ergeben Kurven mit zwei Maxima. Dies deutet darauf hin, daß bei einem Teil der Zellen die Resistenz absinkt und bei einem anderen Teil, z.B. nach der Inkubation, zunimmt.

Bei Proben mit einer Sichelzellenanemie zeigen die Kurven bei frischen und inkubierten Proben eine geringe osmotische Resistenz an. In diesem Fall ist die Resistenz der

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Zellen, insbesondere nach der Inkubation, geringer, ähnlich den Ergebnissen bei normalen Blutproben.

Bei Arbeiten mit dem neuen Verfahren hat sich herausgestellt, daß Abweichungen vom Normalen aus der Steigung der Hämolysekurve oder aus den Gipfel- und den Endpunkten ermittelt werden können.

Das oben geschilderte Verfahren ergibt wesentlich genauere Resultate als das Parpart-Verfahren, da mit diesem nur vier oder fünf Punkte zwischen den Endpunkten einer Hämolysekurve ermittelt werden können und aus diesen dann der 50%-Hämolyse-Punkt gefunden werden kann. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit dem kontinuierlich verlaufenden Konzentrationsgradienten treten keine Ungenauigkeiten infolge einer geringen Meßwertanzahl auf, so daß es für weitere Ananlysen anwendbar ist.

Es hat sich herausgestellt, daß die Ergebnisse mit diesem Verfahren in hohem Maße reproduzierbar sind und daß etwaige Abweichungen wesentlich geringer als beim Parpart-Verfahren sind. Das sofortige Aufzeichnen vollständiger Kurven ist insbesondere dann von Vorteil, wenn die Blutproben mehrere verschiedene Zellpopulationen aufweisen, wie es oben bereits erwähnt wurde. In diesen Fällen, bei denen der Patient mindestens zwei verschiedene Populationen roter Blutkörperchen nach der Inkubation aufweist, ist die Fläche unter der Kurve in etwa proportional zum Hämoglobininhalt, die Spitze und die Endpunkte der Kurve bestimmen Veränderungen in der Symmetrie der Kurve, was auf besondere Verteilungen verschiedener Blutkörperchen im Blut hinweist. Das Parpart-Verfahren kann solche Änderungen der Symmetrie und Verschiebungen in der Populationsverteilung nicht nachweisen.

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Wie bereits oben gesagt, ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht auf die Durchlässigkeit von Dialysemembranen angewiesen, wie das Verfahren von Dannon, und es treten keine optischen Schwierigkeiten wie beim Zentrifugenverfahren auf. Abgesehen davon, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren diese Nachteile beseitigt sind, ergeben sich noch zusätzliche Vorteile: 1. die erforderliche Probengröße ist klein, 2. die Ausgabe der Meßwerte erfolgt in nichtintegrierter Form, 3. es ist keine besondere Probenvorbereitung erforderlich, 4. die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Meßwerte ist hoch, 5. das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtung sind sehr flexibel, da die verschiedensten Parameter abgewandelt werden können, wie beispielsweise die Steigung und die Form des Konzentrationsgradienten, die Temperatur, die beobachtete Wellenlänge usw., so daß auch die osmotische Resistenz anderer Zellen als roter Blutkörperchen beobachtbar ist, 6. das Verfahren kann vollständig automatisiert werden, so daß mehrere Proben gleichzeitig oder nacheinander analysiert werden können, und 7. können andere Lösungen für weitere Analysen zur Anwendung gelangen.

Weitere Möglichkeiten sind: a) Verwendung eines Computers zur Bestimmung des 50%-Punktes, des Maximums und der Endpunkte und der Steigungen der integrierten Kurve, b) ein sägezahnförmiger Verlauf der Lösungsmittelkonzentration, was die Trennung verschiedener Gruppen oder Blutkörperchen erleichtert, c) Bestimmung der Korrelation zwischen osmotischer Resistenz und dem Alter der roten Blutkörperchen, d) Bestimmung der Resistenz in Abhängigkeit vom Alter der Blutprobe und e) Forschungen über Sichelzellenanemie, bei denen verschiedene Fraktionen zentrifugierter roter Blutkörperchen untersucht werden.

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Obwohl bereits die verschiedensten Änderungen des Verfahrens und der Vorrichtung zur Bestimmung der osmotischen Resistenz mit dem Kapillarstromverfahren in der obigen Beschreibung erläutert wurden, sind zahlreiche weitere Abwandlungen denkbar, die ebenfalls im Rahmen der Erfindung liegen. Die Erfindung ist daher nicht auf die erläuterten und dargestellten Ausführungsformen begrenzt, sondern Abwandlungen und Anpassungen an bestimmte Anwendungen werden ebenfalls von ihr erfaßt.

Beispielsweise kann das Verfahren auf andere Zellen angewendet werden, beispielsweise auf Leukozyten, die ebenfalls einer Lösung mit einem Konzentrationsgefälle ausgesetzt werden und schließlich mit einer Lichtwellenlänge von 280 nm untersucht werden. Für die verschiedenen Zellen sind natürlich jeweils andere Wellenlängen angebracht und natürlich andere Konzentrationsgefälle und gegebenenfalls andere Lösungen. Der Konzentrationsgradient muß nicht linear sein, sondern kann andere Formen annehmen, beispielsweise kann ein exponentieller Verlauf vorliegen.

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Claims

Yoichiro Ito, 6003 Melvern Drive, Bethesda, Md, 20034, USA Peter Carmeci, 11805 Kim Place, Potomac, Md, 20854, USA

Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der osmotischen Zellresistenz

Patentansprüche;

(J/i Verfahren zur Bestimmung der osmotischen Zellresistenz, insbesondere zur Ermittlung einer Hämolysekurve einer Blutprobe, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Probe in eine, durch ein etwa horizontal verlaufendes Kapillarrohr wirbelfrei hindurchströmende Salzlösung, deren Konzentration während der Durchlaufzeit verändert wird, gebracht wird und die Zellen der Probe der zeitlich sich verändernden Konzentration der Salzlösung ausgesetzt werden, indem sie in dem horizontal verlaufenden Kapillarrohr in den nahe der Rohrinnenwand liegenden Bereich geringer Strömungsgeschwindigkeit gelangen und daß die Veränderungen der optischen Dichte der Flüssigkeit über die Zeit hinweg aufgezeichnet werden.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die die Probe aufnehmende Salzlösung in um eine senkrechte Achse verlaufenden Windungen geführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Salzlösung linear über die Zeit verringert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Salzlösung eine wässrige Lösung von Natriumchlorid verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderungen der optischen Dichte der Salzlösung bei einer Wellenlänge von etwa 547 nm aufgezeichnet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Salzlösung eine wässrige Lösung von Natriumchlorid verwendet wird, deren Konzentration während einer Zeit von 30 min. von etwa 0,85% auf 0% NaC1 herabgesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Durchflußgeschwindigkeit der Salzlösung durch das Kapillarrohr bei einem Rohrinnendurchmesser von etwa 0,85 mm etwa auf 6,7 /h gehalten wird.
8. Vorrichtung zur Bestimmung der osmotischen Zellresistenz zellenthaltender Proben, gekennzeichnet durch eine Quelle für eine Salzlösung (21,22), Mittel (15,20) zum Verändern von deren Konzentration während einer bestimmten Zeitdauer, ein in Schraubenwindungen (18) um eine im wesentlichen senkrechte Achse verlaufendes Kapillarrohr (12) und Mittel zum Fördern (17) der aus der Quelle (21,22) kommenden Salzlösung durch das Kapillarrohr

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(12) sowie weitere Mittel (28) zum Einbringen der Probe in das Kapillarrohr (12) in der Weise, daß die Zellen im wesentlichen in den Windungen des Kapillarrohres zurückgehalten werden und die Salzlösung an ihnen vorbeiströmt und daß schließlich eine Vorrichtung zum kontinuierlichen Messen der optischen Dichte (19,30) des Ausflusses aus dem Kapillarrohr (12) während der genannten Zeit vorgesehen ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Salzlösung eine wässrige Lösung von Natriumchlorid ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zum kontinuierlichen Messen der optischen Dichte (19,30) bei einer Wellenlänge von etwa 547 nm über die Meßzeit hinweg arbeitet, zwecks Festlegung einer Hämolysekurve (34) bei einer Blutprobe.
11. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle für die Salzlösung und die Mittel für deren laufende Konzentrationsänderung aus Behältern (21,22) zur Aufnahme der Natriumchloridlösung und Wasser sowie einem Gradientenmischer (15) mit einer vom Mischer gesteuerten Doppelmischventilanordnung (20) gebildet sind, die über Leitungen untereinander verbunden und mit einem an das Kapillarrohr (12) angeschlossenen Gemischauslaß (29) versehen sind.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zum Einbringen der Probe aus einer zwischen Gemischauslaß (27) und Kapillarrohr (12) eingeschalteten Probeschleuse (28) gebildet sind.

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13. Vorrichtung nach Anspruch 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Kapillarrohr (12) auf einem aufrechtstehenden Zylinder (14) aufgewickelt ist.

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