DE10128978B4

DE10128978B4 - Verfahren zur Analyse von Proben mittels einer Streulichtmessung

Info

Publication number: DE10128978B4
Application number: DE2001128978
Authority: DE
Inventors: Joachim Michael Baumert; Constantin Odefey; Wilfried Dr. Will
Original assignee: HTK HAMBURG GmbH
Current assignee: HTK HAMBURG GmbH
Priority date: 2001-06-11
Filing date: 2001-06-11
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2021-06-12
Also published as: DE10128978A1

Abstract

Verfahren zur Durchführung eines BSE-Tests mittels einer Streulichtmessung, bei dem
1.1 ein Trägerfluid bereitgestellt wird, das im wesentlichen frei von Stoffen ist, deren Partikelgröße einen bestimmten Wert überschreitet,
1.2 dem Trägerfluid eine Probe zugeführt wird, die mit einem Prionen-Proteine verdauenden Enzym versetzt wird und die im wesentlichen frei von Stoffen ist, deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet,
1.3 dem Trägerfluid nach einer ausreichenden Reaktionszeit zum Verdauen des natürlichen Prionen-Proteins (PrP) spezifisch gegen den unverdaulichen Rest (PrP 27-30) des infektiösen Prionen-Proteins (PrP^sc) gerichtete Antikörper zugeführt werden, deren Partikelgröße im wesentlichen den bestimmten Wert nicht überschreitet, wobei die Antikörper in der Lage sind, mit dem unverdaulichen Rest (PrP 27-30) des infektiösen Prionen-Proteins (PrP^sc) zu einem Dimer und/oder Oligomer und/oder Polymer zu reagieren, dessen Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet, und
1.4 das Trägerfluid der Streulichtmessung unterzogen wird, so daß, wenn der unverdauliche Rest (PrP 27-30) des infektiösen Prionen-Proteins (PrP^c) in der Probe enthalten ist und mit den Antikörpern zu dem Dimer und/oder Oligomer und/oder Polymer reagiert, dieses mittels der Streulichtmessung nachgewiesen wird.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Analyse von Proben mittels einer Streulichtmessung.
Die Nephelometrie ist ein optisches Analysenverfahren, mit dem man in Suspensionen, Aerosolen u.a. trüben Dispersionen den Feststoff-Anteil bestimmen kann. Partikel mit Partikelgrößen unterhalb der sichtbaren Lichtwellenlängen lassen sich wegen der intensiven Brownschen Molekularbewegung nicht unter dem Mikroskop messen. Zur Bestimmung solcher Partikel nutzt man den Tyndall-Effekt, bei dem die Beleuchtung eines kleinen Teilchens ein weitwinkliges Streulicht auslöst. Die Streuung des Lichtes kann entweder durch Messung der Intensitätsabnahme des einfallenden Lichtstrahles nach dem Durchgang durch das streuende Medium oder durch Bestim mung der Intensität des seitlich abgelenkten Lichtes ermittelt werden. Im ersten Fall spricht man von der Methode der Turbidimetrie oder Extinktionsmessung und zweiten von der eigentlichen Nephelometrie oder Tyndallometrie.
Bei dem als dynamic-light-scattering (DLS) bezeichneten Verfahren betrachtet man nur einen (oder wenige) Punkte auf der das Teilchen umspannenden Lichtkugel und wertet zusätzlich die durch die Brownsche Molekularbewegung hervorgerufene Helligkeitsmodulation aus. Durch Fokussierung auf ein winziges Beobachtungsvolumen versucht man, die störenden Streulichtüberlagerungen mehrerer Teilchen zu reduzieren. Infolgedessen durchläuft ein Teilchen ein winziges beleuchtetes Volumen sehr schnell, so daß die auswertende Opto-Elektronik erhebliche Fluktuationsfrequenzen erkennen maß. Bei der aufwendigen Signalverarbeitung stehen viele Informationen zur Verfügung, so daß diese Systeme nur bedingt zur quantitativen Analyse einsetzbar sind.
In der Reinstwasseranalytik gestattet die äußerst geringe Konzentration der Teilchen den Einsatz von Optiksystemen, die ein möglichst großes Streulicht-Volumen erfassen. Da die Teilchen verhältnismäßig lange Zeiten benötigen, um dieses Volumen zu durchlaufen, – resultieren verhältnismäßig geringe Fluktuationsfrequenzen. Infolgedessen ist die Signalverarbeitung mit verhältnismäßig geringem Aufwand möglich. Bei einem bekannten System für die Reinstwasseranalytik wird hierzu eine PC-Soundkarte in einem Laptop mit Pentiumprozessor herangezogen. Das System liefert grafische Analysen, die Informationen über die Teilchenanzahl und die Teilchengröße beinhalten. Daraus ist jedoch regelmäßig nicht ersichtlich, aus welchen Stoffen die Teilchen bestehen.

Die EP 0 252 127 B1 bezieht sich auf ein Verfahren zur Analyse einer chemischen Reaktion, bei welchem ein Streusignal überwacht wird, das von durch ein bei der Reaktion gebildetes Präzipitat bzw. Ausfällung sowie durch andere nicht-spezifische Streuquellen gestreutes Licht erzeugt wird, und bei welchem das genannte Streusignal, modifiziert wird, indem man ein von nur durch die genannten nicht-spezifischen Streuquellen gestreutem Licht erzeugtes Leer- bzw. Blindsignal (blanking signal) von dem Streusignal subtrahiert. Das Verfahren ist gekennzeichnet durch das Überwachen des genannten Streusignals als eine Funktion der Zeit während der Reaktionsperiode, das Überwachen des genannten Leer- bzw. Blindsignals als eine Funktion der Zeit während einer der Reaktionsperiode entsprechenden Zeitperiode sowie die dynamische Subtraktion des zeitveränderlichen Leer- bzw. Blindsignals von dem zeitveränderlichen Streusignal, zur Gewinnung eines resultierenden Signals, in welchem die Auswirkungen der genannten nicht-spezifischen Streuquellen reduziert sind.

Die Reaktion kann insbesondere die Reaktion zwischen einem Antigen und einem Antikörper sein. Gemäß einem weiteren Verfahrensschritt kann die Konzentration einer (Antigen-)Probe aus der Änderungsgeschwindigkeit des resultierenden Signals ermittelt werden.

Das Verfahren ist auf die Konzentrationsbestimmung von Proben beschränkt. Außerdem basiert es auf einer aufwendigen Eliminierung von Leer- bzw. Blindsignalen aufgrund nicht-spezifischer Streuquellen. Die Präzipitatbildung kann zudem zur Verschmutzung der lichtführenden Teile eines Streulichtmeßgerätes führen und hierdurch die Messung beeinträchtigen.

Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein mit verringertem Aufwand störungsärmer und genauer durchführbares Verfahren zur Analyse von Proben zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 1, 2 und 3 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens sind in den Unteransprüchen angegeben.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Analyse von Proben mittels einer Streulichtmessung wird

1.1 ein Trägerfluid bereitgestellt, das im wesentlichen frei von Stoffen, ist, deren Partikelgröße einen bestimmten Wert überschreitet,
1.2 dem Trägerfluid eine Probe zugeführt, die im wesentlichen frei von Stoffen ist, deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet,
1.3 dem Trägerfluid ein Monomer zugeführt, dessen Partikelgröße im wesentlichen den bestimmten Wert nicht überschreitet, wobei das Monomer in der Lage ist, mit einem weiteren Monomer zu einem Dimer und/oder Oligomer und/oder Polymer zu reagieren, dessen Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet und
1.4 das Trägerfluid der Streulichtmessung unterzogen, so daß, wenn das weitere Monomer in der Probe enthalten ist und mit dem Monomer zu dem Dimer und/oder Oligomer und/oder Polymer reagiert, dieses mittels der Streulichtmessung nachgewiesen wird.

Dadurch, daß mit einem Trägerfluid, mit einer Probe und mit einem Monomer gearbeitet wird, die jeweils im wesentlichen frei von Stoffen sind, deren Partikelgröße einen bestimmten Wert überschreitet, werden Störungen der Streulichtmessung vermieden bzw. auf ein unschädliches Ausmaß reduziert und wird damit der Nachweis zudem äußerst geringer Stoffmengen erheblich verbessert. Der Nachweis dieser Stoffe basiert darauf, daß es sich dabei um Monomere handelt, die in der Lage sind, mit bestimmten Monomeren zu einem Dimer und/oder Oligomer und/oder Polymer (Reaktionsprodukte) zu reagieren, dessen Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet. Infolgedessen weichen die von diesen Reaktionsprodukten herrührenden Streulichtsignale deutlich von den Streulichtsignalen eventuell noch im Trägerfluid enthaltener Partikel mit einer Größe unterhalb des bestimmten Wertes ab. Hierdurch wird ein eindeutiger Nachweis der Reaktionsprodukte und damit der diesen zugrunde liegenden Monomere in der Probe ermöglicht. Grundsätzlich ist es vorteilhaft, wenn die Partikelgröße der Dimere und/oder Oligomere und/oder Polymere sich möglichst deutlich von dem bestimmten Wert unterscheiden, so daß sich die interessierenden Streulichtsignale möglichst deutlich von den übrigen Streulichtsignalen abheben. Darüber hinaus ist es grundsätzlich von Vorteil, wenn der bestimmte Wert der Partikelgröße, der von den übrigen, nicht nachzuweisenden Partikeln unterschritten wird, möglichst niedrig ist bzw. möglichst wenige solcher Partikel im Trägerfluid vorhanden sind.

Verfahrensgemäß wird so vorgegangen, daß man dem Trägerfluid – grundsätzlich in beliebiger Reihenfolge – eine Probe und ein Monomer zuführt, das in der Lage ist, mit einem in der Probe vermuteten Monomer zu einem Dimer und/oder Oligomer und/oder Polymer zu reagieren. Wenn sich das vermutete Monomer tatsächlich in der Probe befindet, findet die Reaktion statt und wird das Reaktionsprodukt mittels der Streulichtmessung nachgewiesen. Hierdurch ist ein eindeutiger Nachweis dafür möglich, daß sich in der Probe ein bestimmter Stoff befindet. Befindet sich der vermutete Stoff nicht in der Probe, kann der Test mit einem anderen Monomer wiederholt werden. Grundsätzlich sind so viele Wiederholungen möglich, bis der Stoff identifiziert ist, aus dem die Probe besteht. Falls die Probe aus mehreren verschiedenen Stoffen besteht, kann der Test so oft wiederholt werden, bis mehrere oder sämtliche Komponenten der Probe identifiziert sind.

Grundsätzlich ist es mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, eine Probe vollständig zu analysieren, die aus einem oder mehreren Monomeren besteht. Falls keine oder keine vollständige Analyse der Probe gelingt, kann zumindest anhand des oder der durchgeführten Tests ausgeschlossen werden, daß ein bestimmter Stoff oder mehrere bestimmte Stoffe in der Probe enthalten sind, wobei es sich beispielsweise um „verbotene" Stoffe handeln kann.

Die Monomere, die mittels des Verfahrens in der Probe nachgewiesen werden können, können beliebige Monomere sein. Insbesondere können sie Antigene oder Antikörper sein, die über eine Antigen-/Antikörperreaktion nachweisbar sind. Dabei kann es sich ferner um DNA- bzw. RNA-Stränge handeln, die mit komplementären Strängen reagieren. Einbezogen sind insbesondere solche Monomere, die zu einem im Trägerfluid löslichen Dimer und/oder Oligomer und/oder Polymer reagieren. Einbezogen sind aber auch Monomere, die Präzipitate bilden.

Vorzugsweise ist der bestimmte Wert der Partikelgröße, den die im Trägerfluid; in der Probe und im Monomer enthaltenen Stoffe nicht überschreiten, im Nanometerbereich angesiedelt. Vorzugsweise im Bereich von 10 bis 30 Nanometern. Bei Partikeln mit Partikelgrößen unter etwa 10 bis 30 Nanometern ist das Streusignal so gering, daß es nicht mehr eindeutig zugeordnet werden kann. Außerdem werden bei den genannten Partikelgrößen die Grenzen der (Ultra-)Filtration erreicht, d.h. es gibt derzeit keine Filter mehr, die in der Lage sind, kleinere Partikel noch wirksam auszufiltern. Da die Anzahl der Teilchen unterhalb des bestimmten Wertes regelmäßig immens ist, hat man so viel überlagerte Streulichtsignale (durch mehrfache Streuung), daß diese als Summensignal aller dieser Kleinstpartikel erscheinen, dem keine bestimmten Partikel mehr zuordenbar sind. Andererseits kann dieses Summensignal eindeutig von den Streusignalen größerer Partikel unterschieden werden, die somit eindeutig identifizierbar sind.

Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird das Trägerfluid und/oder die Probe und/oder das Monomer gefiltert, um Stoffe auszufiltern, deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet. Der Filter definiert eine scharfe Trennung zwischen besagten Kleinstteilchen und den zu messenden Streuteilchen, die das eindeutige Erkennen des Streusignales eines Reaktionsproduktes möglich macht. Grundsätzlich bezieht die Erfindung ein, zur Entfernung von Stoffen, deren Partikelgröße einen bestimmten Wert überschreitet, aus dem Trägerfluid, der Probe und dem Monomer, andere Techniken als das Filtern einzusetzen.

Nach einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens werden dem Trägerfluid kleine Mengen Probe und des Monomers in der Größenordnung von Mikro-, Nano- oder Picogramm pro Liter zugeführt. Derart geringe Mengen sind ausreichend, da die Streulichtmessung nicht durch störende Streusignale beeinträchtigt wird. Das Arbeiten mit geringen Probenmengen ist grundsätzlich kosten- und aufwandsmindernd außer dem kann bei derart geringen Probenmengen die aus der Reinstwasseranalytik bekannte Streulichtmessung vorteilhaft zum Einsatz kommen.

Grundsätzlich kann es sich bei dem Trägerfluid um ein Gas oder um eine Flüssigkeit handeln. Bevorzugt ist das Trägerfluid eine Flüssigkeit. Vielfach handelt es sich bei der Flüssigkeit um Wasser, beispielsweise wenn dem Analyseverfahren eine biochemische Reaktion zugrunde liegt. Grundsätzlich kann es sich bei der Flüssigkeit aber auch um eine andere transparente Flüssigkeit handeln, beispielsweise um flüssige Kohlenwasserstoffe, Säuren oder Laugen.

Nach einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens wird das Trägerfluid einer kontinuierlichen und/oder mehrfach einer stichprobenartigen Streulichtmessung unterzogen. Hierdurch ist es insbesondere möglich, den Endpunkt der Reaktion festzustellen und Mittelwerte der Streulichtmessung zu bilden. Bevorzugt wird bereits das von Stoffen, deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet, im wesentlichen freie Trägerfluid vor Zugabe des Monomers und/oder vor Zugabe der Probe einer Streulichtmessung unterzogen und das Ergebnis dieser Messung als Bezugswert für die Streulichtmessung des Dimers und/oder Oligomers und/oder Polymers herangezogen.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung wird das Trägerfluid in einen Kreislauf gepumpt, in dem das Trägerfluid einer Streulichtmessung unterzogen wird und in den die Probe und das Monomer eingespeist werden. Hierdurch kommt man mit verhältnismäßig ge ringen Mengen Trägerfluid aus und kann der Aufwand für die Entfernung von Stoffen, deren Partikelgröße einen bestimmten Wert überschreitet, aus dem Trägerfluid gemindert werden. Für die Entfernung solcher Stoffe kann das Trägerfluid durch Umschalten von Ventileinrichtungen durch einen Bypass mit einem Filter geführt werden, der die besagten Stoffe ausfiltert. Das Filtern des Trägerfluids kann vor dem Einspeisen der Probe über eine bestimmte, vorgegebene Zeit durchgeführt werden, um sicherzustellen, daß keine die Streulichtmessung störenden Stoffe mehr enthalten sind. Aus der Probe bzw. dem Monomer können Stoffe; deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet, insbesondere durch Filter entfernt werden, die in die Einspeisestellen integriert bzw. diesen vorgeordnet sind. Auch nach dem Einspeisen der Probe kann das Trägerfluid über eine bestimmte Zeit gefiltert werden, um störende Stoffe, die mit der Probe oder aus dem Leitungssystem in das Trägerfluid gelangen könnten, aus dem Trägerfluid zu entfernen.

Bevorzugt wird jedoch nach Zugabe des Monomers das Trägerfluid nicht mehr gefiltert, damit eventuelle Reaktionsprodukte nachgewiesen werden können.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens wird das Trägerfluid nach Zugabe eines Monomers, die zu einem Nachweis oder nicht zu einem Nachweis des weiteren Monomers geführt hat, erneut gefiltert, bis ein anderes Monomer zugegeben wird. Hierdurch können zwischenzeitlich in das Trägerfluid eingetretene Stoffe, die die Streulichtmessung stören könnten, entfernt werden. Außerdem ist es hierdurch möglich, ein nachgewiesenes Reaktionsprodukt aus dem Trägerfluid zu entfernen, um eventuelle weitere Komponenten der Probe zu analysieren.

Die Durchführung von BSE-Tests ist bislang nur möglich, wenn das infektiöse Material in den Proben in erheblichen Konzentrationen vorliegt. Deshalb wird sie bislang an Rinderhirn-Proben vorgenommen, die nur vom toten Tier genommen werden können. Außerdem erfordert der Test erhebliche Aufwendungen für Analytika und ist zeitaufwendig. Hier schafft die Erfindung gemäß Anspruch 1 Abhilfe:

Das erfindungsgemäße Verfahren wird zur Durchführung eines BSE-Tests in der Weise durchgeführt, daß die Probe mit einem Prionen-Proteine verdauenden Enzym versetzt wird und der Probe nach einer ausreichenden Reaktionszeit zum Verdauen des natürlichen Prionen-Proteins (PrP^c) spezifisch gegen den unverdaulichen Rest (PrP 27–30) des infektiösen Prionen-Proteins (PrP^sc) gerichtete Antikörper zugeführt werden und die Streulichtmessung durchgeführt wird.

Dadurch, daß die Probe (z.B. Hirn oder Blut) mit einem Prionen-Protein verdauenden Enzym (z.B. Proteinase K und ähnliche Enzyme) versetzt wird, ist nach einer ausreichenden Reaktionszeit alles natürliche Prionen-Protein (PrP^c) verdaut, welches nicht infektiös ist und nicht gemessen werden soll. Bei Anwesenheit von infektiösem Prionen-Protein (PrP^sc) bleibt ein – für das Enzym – unverdaulicher Rest eines 27–30 kDa schweren Proteins (PrP 27-30) zurück, welche für die Ausbildung der BSE- Krankheit verantwortlich ist. Es gibt Antikörper, die spezifisch gegen PrP 27-30 gerichtet sind; diese Antikörper reagieren aber auch mit dem natürlichen Prionen-Protein PrPC. Daher muß die Probe zuvor mit dem Enzym versetzt werden, um kein falsch-positives Ergebnis zu erhalten. Nach dieser Vorbehandlung werden die Antikörper zugeführt und wird mittels Streulichtmessung überprüft, ob eine Antigen-Antikörper-Reaktion stattgefunden hat und somit das infektiöse Prionen-Protein in der Probe vorhanden ist.

Da das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse die Feststellung von Substanzen in äußerst geringen Konzentrationen ermöglicht, kann erstmalig das infektiöse. Prionen-Protein auch in anderen Proben als Hirn nachgewiesen werden, beispielsweise im Blut. Somit ist erstmalig auch ein BSE-Test am lebenden Tier möglich, wodurch wiederum die gezielte Bekämpfung der Krankheit gefördert wird.

Bevorzugt wird bei dem Verfahren zuerst die Probe mit dem Prionen-Protein verdauenden Enzym versetzt und die Probe danach dem Trägerfluid zugeführt. Dadurch, daß die Probe vor dem Zuführen zum Trägerfluid mit dem Enzym versetzt wird, wird die Reaktion zum Verdauen des natürlichen Prionen-Proteins gefördert. Bevorzugt wird die Probe dem Trägerfluid erst zugesetzt, wenn eine ausreichende Reaktionszeit zum Verdauen des natürlichen Prionen-Proteins abgelaufen ist. Man kommt mit verhältnismäßig geringen Mengen des Enzyms und geringen Reaktionszeiten aus.

Vielfach ist es von Interesse, das Vorliegen von Haptenen in einer Probe zu ermitteln. Haptene sind nicht-komplette Antigene, d.h. sie sind zu klein, als daß mehr als ein Antikörper an ihnen gebunden werden kann. Haptene können insbesondere Pharmaka, Drogen, Pestizide, Umweltgifte, Steroidhormone oder Mykotoxine sein. Haptene binden spezifisch an Antikörper. Sie blockieren jedoch lediglich die Paratop-Bindungsstelle des Antikörpers, ohne daß eine Kettenreaktion stattfinden kann.

Die Mindestgröße für Immunogene (komplette Antigene) liegt bei 5 bis 10 kDa, d.h. > 30 Aminosäurereste, d.h. > 3 nm Länge, denn ab dieser Größe können mindestens zwei Antikörpermoleküle sich an diese Antigene mit entsprechend vorhandenen Epitop-Bindungsstellen koppeln und eine Kettenreaktion auslösen, die vielfach zu einer Präzipitation führt.

Gemäß dem Verfahren von Anspruch 2 werden für den Nachweis von Haptenen synthetische Hapten-Dimere oder -Oligomere herangezogen. Dabei handelt es sich um mindestens zwei Hapten-Moleküle, die mittels mindestens einer „chemischen Brücke" (Spacer) miteinander verbunden sind. Diese chemische Brücke kann im einfachsten Fall eine C-Kette (Kohlenstoffkette) sein. Da eine C-C-Einfachbindung eine Länge von 0,154 nm hat, kann man beliebig lange chemische Brücken bauen. Ein C-C-Dekamer mit 10 C-C-Bindungen hat also eine Länge von 1,54 nm; 20 C-C-Bindungen sind doppelt so lang.

Im Rahmen der Erfindung werden die innermolekularen Bindungsabstände bei den Hapten-Dimeren bzw. Hapten-Oligomeren so gewählt, daß es zu keiner Doppelreaktion mit einem Antikörper kommt. Das Hapten-Dimer hat also die Form einer Hantel mit jeweils zwei spezifisch an einen Antikörper bindenden Endstücken. Mit Hilfe eines solchen Dimers ist eine Kettenreaktion möglich, d.h. die Bildung von Ketten aus Antikörpern und Dimeren, in denen die Dimere die Antikörper miteinander verbinden. Es ist aber auch möglich, Trimäre, Tetramere etc. herzustellen. Bei Trimären hat das Brückenmolekül die Form eines Dreibeins und bei Tetrameren eine Kreuzform, wobei die Enden dieser Strukturen mit Antikörpern besetzt sind.

Im Gegensatz zu den nachzuweisenden natürlichen Haptenen, die in dieser Anmeldung auch als Hapten-Monomere bezeichnet werden, sind die synthetischen Hapten-Dimere bzw. Hapten-Oligomere immunogen. Sie können mit Antikörpern reagieren und gegebenenfalls präzipitieren. Der Einsatz synthetischer Hapten-Dimere bzw. -Oligomere ermöglicht den Nachweis von Haptenen in einer Probe. Dem Fachmann ist es mit den obigen Informationen möglich, synthetische Hapten-Dimere und -Oligomere herzustellen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Analyse von Proben von Anspruch 2 wird eine Probe mit Antikörpern zusammengebracht, die in der Lage sind, mit spezifischen Haptenen zu reagieren, und wird gemessen, ob die Antikörper mit synthetischen Dimeren und/oder Oligomeren der spezifischen Haptene zu Molekülen reagiert haben, in denen die synthetischen Hapten-Dimere und/oder -Oligomere mehrere Antikörper miteinander verbinden. Durch dieses Verfahren ist es also möglich, festzustellen, ob die synthetischen Hapten-Dimere und/oder -Oligomere in einer Probe vorhanden sind. Dies kann beispielsweise genutzt werden, um die Herstellung der synthetischen Hapten-Dimere und/oder -Oligomere zu kontrollieren oder zur Voruntersuchung einer Probe, die auf das Vorhandensein von natürlichen Haptenen bzw. Hapten-Monomeren untersucht werden soll.

Für die letztgenannte Untersuchung wird nämlich gemäß dem Verfahren von Anspruch 3 zunächst eine Probe, bei der es sich gegebenenfalls um eine gemäß Vorstehendem voruntersuchte Probe handeln kann, mit Antikörpern zusammengebracht, die in der Lage sind, mit spezifischen Haptenen zu reagieren, werden nach einer ausreichenden Zeit für eine Reaktion mit Monomeren der spezifischen Haptene, falls diese in der Probe vorhanden sind, synthetische Dimere und/oder Oligomere derselben spezifischen Haptene zugesetzt und wird gemessen, ob die Antikörper mit den synthetischen Hapten-Dimeren und/oder -Oligomeren zu Molekülen reagiert haben, in denen die synthetischen Hapten-Dimere und/oder -Oligomere mehrere Antikörper miteinander verbinden.

Um festzustellen, ob eine Probe das jeweilige Hapten-Monomer enthält (in der Natur liegen die Haptene nur als Monomere vor), versetzt man diese Probe also mit dem jeweils passenden Antikörper. Nach einer ausreichenden Reaktionszeit gibt man das ebenfalls zum Antikörper passende synthetische Hapten-Dimer bzw. Hapten-Oligomer dazu. Wenn es zu keiner Reaktion der Antikörper mit den synthetischen Hapten-Dimeren bzw. Hapten-Oligomeren kommt, waren Hapten-Monomere in der Probe und haben die Antikörper blockiert. Kommt es hingegen zu einer Reaktion der Antikörper mit den synthetischen Hapten-Dimeren bzw. -Oligomeren, waren keine Hapten-Monomere in der Probe.

Ob die Reaktion der Antikörper mit den Hapten-Dimeren bzw. -Oligomeren stattgefunden hat, läßt sich leicht mittels des obigen Verfahrens durch Streulichtmessung feststellen, da die Reaktionsprodukte durch ihre Größe durch Streulichtmessung leicht feststellbar sind, im Gegensatz zu den Reaktionsprodukten von Antikörpern und Hapten-Monomeren. Ein Nachweis ist aber auch über andere Meßverfahren möglich, beispielsweise über den ELISA-Test.

Wenn man den Test mit unterschiedlichen Mengen von Hapten-Dimeren bzw. -Oligomeren wiederholt durchführt, kann man sogar zu einem quantitativen oder zumindest halb-quantitativen Meßergebnis kommen. Hierfür werden die Messungen mit definierten Mengen eines Antikörpers und eines damit spezifischen bindenden Hapten-Dimers bzw. Hapten-Oligomers wiederholt, wobei die Mengenverhältnisse verändert werden. Eine Eichmessung kann mit einer Probe ohne natürliche Haptene durchgeführt werden. Davon ausgehend vermindert sich die Streulichtintensität bei Proben mit Haptenen in Abhängigkeit von der Konzentration der Haptene in der Probe.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere für die Anwendung in der Wasseranalytik (Nachweis von Inhalts- und Schadstoffen), der Agrar- und Lebensmittelanalytik (Nachweis von Mikroorganismen (z.B. Salmonellen, Mykotoxinen, infektiöse Prionen-BSE), Inhaltsstoffen (z.B. Rindfleisch, Hormone oder Antibiotika in Fleischwaren)), in biologischen oder medizinischen Tests (z.B. Tests von Blutkonserven, HIV, Hepatitis etc., Nachweis bestimmter DNA- oder RNA-Sequenzen, von Allergenen (Allergietests) Hormonen und Schwangerschaftstests) im Gesundheits- und Arbeitsschutz (z.B. Überwachung der Badewasserqualität und Küchenhygiene) geeignet.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der anliegenden Schemazeichnung einer Anlage zum Durchführen des Verfahrens näher erläutert.
Ein Streulichtmeßgerät 1, das nach dem Prinzip des dynamic-light-scattering arbeitet, ist in eine Leitung 2 integriert, durch die ein Trägerfluid im Kreislauf durch das Streulichtmeßgerät 1 geführt wird. In dem Streulichtmeßgerät 1 ist das Trägerfluid durch eine Durchflußküvette geführt, durch die der Strahlengang der Streulichtmessung verläuft. Das Streulichtmeßgerät 1 kann eine einstellbare Nachweisgrenze haben, die Streulichtsignale von Teilchen unterhalb einer bestimmten Größe elektronisch ausblendet. Hierdurch ist es möglich, Streulichtsignale von Partikeln, die nicht nachgewiesen werden sollen, vollständig zu unterdrücken.
In die Leitung 2 ist eine Pumpe 3 integriert, um das Trägerfluid im Kreislauf durch die Leitung 2 und das Streulichtmeßgerät 1 zu pumpen. Die Pumpe 3 kann beispielsweise als Schlauchpumpe ausgeführt sein.
Im Streulichtmeßgerät 1 wird das Trägerfluid durch eine – nicht gezeigte – Durchflußküvette oder einen PTFE-Körper mit einer planparallelen Optik für den Strahlungsdurchgang des Streulichtmeßgerätes geführt. Bei Einsatz des PTFE-Körpers kann das Füllvolumen gegenüber einer herkömmlichen Durchflußküvette erheblich reduziert werden. Die Auswertung der vom Streulichtmeßgerät gelieferten Streulichtsignale kann mittels eines einfach PC mit einer PCMCIA-Karte erfolgen.
Die Leitung 2 hat einen Einspeiseabschnitt 2', in dem Einspeisestellen 4, 5, 6 ausgebildet sind. In die Einspeisestellen 4, 5, 6 können Filter integriert sein, die Partikel ausfiltern, deren Partikelgröße einen bestimmten Wert (z.B. 30 Nanometer) überschreitet. Ferner können die Einspeisestellen 4, 5, 6 jeweils elastische Membranen aufweisen, in die von außen eine Spritzennadel einsteckbar ist, um eine Probe in den Einspeiseabschnitt 2' einzuspeisen. Auch können alle Einspeisestellen 4, 5 oder ein Teil derselben über eine Schalt- bzw. Dosiereinrichtung mit einem Behälter für Probe bzw. ein Reagens verbunden sein.
Ferner hat die Leitung 2 einen Bypass 2'', der den Einspeiseabschnitt 2' überbrückt, in den ein Filter 7 integriert ist. Der Filter 8 vermag Partikel oberhalb einer bestimmten Größe (z.B. 30 Nanometer) aus einem Trägerfluid herauszufiltern. Der Einspeiseabschnitt 2' und der Bypass 2'' sind über einen Dreiwegehahn 8 mit dem Abschnitt der Leitung 2 verbunden, in den die Pumpe 3 integriert ist.
Dieses Analysensystem funktioniert wie folgt:
Das Trägerfluid (z.B. Wasser) wird von der Pumpe 3 durch die Leitung 2 und das Streulichtmeßgerät 1 gepumpt. Dabei ist zunächst der Dreiwegehahn 8 so geschaltet, daß das Trägerfluid durch den Bypass 2'' und damit den Filter 7 gepumpt wird. Auf diese Weise wird das Trägerfluid über eine bestimmte Zeit gefiltert, beispielsweise etwa 100 Sekunden.
Partikel, deren Größe die Nachweisgrenze des Streulichtmeßgerätes 1 überschreiten, werden während dieser Zeit von dem Filter 7 aus dem Trägerfluid herausgefiltert.
Danach wird der Dreiwegehahn 8 umgeschaltet, so daß das Trägerfluid durch den Einspeiseabschnitt 2' im Kreislauf gepumpt wird. In den Einspeiseabschnitt 2' wird dann – z.B. durch die Einspeisestelle 4 – eine Probe eingespeist, z.B. ein Antigen. Die Probe enthält einen zu analysierenden Stoff, dessen Partikelgröße die Nachweisgrenze des Streulichtmeßsystems 1 unterschreitet. Von einem in die Einspeisestelle 4 integrierten Filter können bereits Partikel aus der Probe herausgefiltert werden, deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet.
Nach dem Einspritzen der Probe kann der Dreiwegehahn 8 erneut umgeschaltet werden, um das Trägerfluid erneut über eine gewisse Zeit durch den Filter 7 hindurchzupumpen, wodurch wiederum Partikel herausgefiltert werden, deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet. Derartige Partikel können aus dem System in das Trägerfluid eingetreten oder mit der Probe eingeschleppt worden sein. Nach einer bestimmten Filterzeit (z.B. 100 Sekunden) wird erneut durch Umschalten des Dreiwegehahns 8 auf den Einspeiseabschnitt 2' umgeschaltet. Die vorstehende Nachreinigung ist jedoch nicht obligatorisch.
Während der vorerwähnten Schritte kann permanent oder mehrfach stichprobenartig mittels des Streulichtmeßgerätes 1 eine Streulichtmessung durchgeführt worden sein, um einen Bezugswert der Streulichtmessung zu ermitteln.
Als nächstes wird – beispielsweise durch die Einspeisestelle 5 – ein Monomer in den Einspeiseabschnitt 2' eingespeist. Von einem in die Einspeisestelle 5 integrierten Filter können dabei Partikel aus dem Monomer herausgefiltert werden, deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet. Bei dem Monomer kann es sich beispielsweise um Antikörper handeln.
Falls das eingespeiste Monomer mit einem Monomer aus der Probe reagiert, bilden sich Teilchen mit einer Partikelgröße, die den bestimmten Wert überschreitet. Diese Partikel erzeugen ein Streulichtsignal, das sich deutlich von den Streulichtsignalen eventuell noch im Trägerfluid vorhandener Partikel, deren Partikelgröße den bestimmten Wert unterschreitet. Infolgedessen werden diese Reaktionsprodukte eindeutig durch das Streulichtmeßgerät 1 nachgewiesen. Aus dem Nachweis ergibt sich, daß ein bestimmter Stoff in der Probe enthalten ist.
Aus der Intensität des Streulichtmeßsignals kann überdies die Konzentration des Stoffes in der Probe ermittelt werden.
Falls das Streulichtmeßgerät 1 keine Partikel oberhalb der Nachweisgrenze nachweist oder weitere Monomere in der Probe vermutet werden, kann anschließend ein anderes Monomer eingespeist werden, beispielsweise durch die Einspeisestelle 6. Dabei kann das andere Monomer in der Einspeisestelle 6 ebenfalls einer Filterung unterzogen werden, die dem Monomer Partikel entzieht, deren Größe den bestimmten Wert überschreitet. Zuvor können gegebenenfalls nachgewiesene Partikel durch erneutes Spülen durch das Filter 7 aus dem Trägerfluid entfernt werden.

Claims

Verfahren zur Durchführung eines BSE-Tests mittels einer Streulichtmessung, bei dem 1.1 ein Trägerfluid bereitgestellt wird, das im wesentlichen frei von Stoffen ist, deren Partikelgröße einen bestimmten Wert überschreitet, 1.2 dem Trägerfluid eine Probe zugeführt wird, die mit einem Prionen-Proteine verdauenden Enzym versetzt wird und die im wesentlichen frei von Stoffen ist, deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet, 1.3 dem Trägerfluid nach einer ausreichenden Reaktionszeit zum Verdauen des natürlichen Prionen-Proteins (PrP) spezifisch gegen den unverdaulichen Rest (PrP 27-30) des infektiösen Prionen-Proteins (PrP^sc) gerichtete Antikörper zugeführt werden, deren Partikelgröße im wesentlichen den bestimmten Wert nicht überschreitet, wobei die Antikörper in der Lage sind, mit dem unverdaulichen Rest (PrP 27-30) des infektiösen Prionen-Proteins (PrP^sc) zu einem Dimer und/oder Oligomer und/oder Polymer zu reagieren, dessen Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet, und 1.4 das Trägerfluid der Streulichtmessung unterzogen wird, so daß, wenn der unverdauliche Rest (PrP 27-30) des infektiösen Prionen-Proteins (PrP^c) in der Probe enthalten ist und mit den Antikörpern zu dem Dimer und/oder Oligomer und/oder Polymer reagiert, dieses mittels der Streulichtmessung nachgewiesen wird.
Verfahren zur Analyse von Proben mittels einer Streulichtmessung, bei dem 2.1 ein Trägerfluid bereitgestellt wird, das im wesentlichen frei von Stoffen ist, deren Partikelgröße einen bestimmten Wert überschreitet, 2.2 dem Trägerfluid eine Probe zugeführt wird, in der möglicherweise synthetische Dimere und/oder Oligomere von spezifischen Haptenen enthalten sind und die im wesentlichen frei von Stoffen ist, deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet, 2.3 dem Trägerfluid Antikörper zugeführt werden, deren Partikelgröße im wesentlichen den bestimmten Wert nicht überschreitet, wobei die Antikörper in der Lage sind, mit den spezifischen Haptenen zu reagieren und mit den synthetischen Dimeren und/oder Oligomeren der spezifischen Haptene zu Molekülen zu reagieren, in denen die synthetischen Hapten-Dimere und/oder -Oligomere mehrere Antikörper miteinander verbinden und deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet, und 2.4 das Trägerfluid der Streulichtmessung unterzogen wird, so daß, wenn die Antikörper mit den synthetischen Dimeren und/oder Oligomeren reagiert haben, dieses mittels der Streulichtmessung nachgewiesen wird.
Verfahren zur Analyse von Proben mittels einer Streulichtmessung, bei dem 3.1 ein Trägerfluid bereitgestellt wird, das im wesentlichen frei von Stoffen ist, deren Partikelgröße einen bestimmten Wert überschreitet, 3.2 dem Trägerfluid eine Probe zugeführt wird, die zunächst mit Antikörpern zusammengebracht wird, die in der Lage sind, mit spezifischen Haptenen zu reagieren und die im wesentlichen frei von Stoffen ist, deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet, 3.3 dem Trägerfluid nach einer ausreichenden Zeit für eine Reaktion der Antikörper mit Monomeren der spezifischen Haptene, falls diese in der Probe vorhanden sind, synthetische Dimere und/oder Oligomere derselben spezifischen Haptene zugesetzt werden, deren Partikelgröße im wesentlichen den bestimmten Wert nicht überschreitet, wobei die Antikörper in der Lage sind, mit den synthetischen Dimeren und/oder Oligomeren zu Molekülen zu reagieren, in denen die synthetischen Hapten-Dimere und/oder Oligomere mehrere Antikörper miteinander verbinden und deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet, und 3.4 das Trägerfluid der Streulichtmessung unterzogen wird, so daß, wenn die Antikörper mit den synthetischen Hapten-Dimeren und/oder -Oligomeren zu Molekülen reagiert haben, in denen die synthetischen Hapten-Dimere und/oder Oligomere mehrere Antikörper miteinander verbinden, dieses mittels der Streulichtmessung nachgewiesen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Schritte 1.3 und 1.4 mindestens einmal unter Zuführung eines anderen Monomers zum Trägerfluid wiederholt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem der bestimmte Wert der Partikelgröße im Nanometerbereich angesiedelt ist.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der bestimmte Wert der bestimmten Partikelgröße etwa 10 bis 30 nm beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem das Trägerfluid und/oder die Probe und/oder das Monomer vor der Zugabe des Monomers gefiltert wird/werden, um Stoffe auszufiltern, deren Partikelgröße den bestimmten Wert überschreitet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Dimer und/oder Oligomer und/oder Polymer im Trägerfluid löslich ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem dem Trägerfluid kleine Mengen der Probe und des Monomers in der Größenordnung von Mikro-, Nano- oder Picogramm pro Liter zugeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem das Trägerfluid eine Flüssigkeit ist.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Flüssigkeit Wasser ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem das Monomer mit dem weiteren Monomer eine Antigen-/Antikörperreaktion bildet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem das Trägerfluid einer kontinuierlichen Streulichtmessung und/oder mehrfach einer stichprobenartigen Streu-Lichtmessung unterzogen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem das von Stoffen, deren Partikelgröße einen bestimmten Wert überschreitet, freie Trägerfluid vor Zugabe des Monomers und/oder der Probe einer Streulichtmessung unterzogen und das Ergebnis dieser Messung als Bezugswert für die Streulichtmessung des Dimers und/oder Oligomers und/oder Polymers herangezogen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem das Trägerfluid in einem Kreislauf gepumpt wird, in dem das Trägerfluid einer Streulichtmessung unterzogen wird und in den die Probe und das Monomer eingespeist werden.
Verfahren nach Anspruch 15, bei dem das Trägerfluid durch Umschalten von Ventileinrichtungen durch einen Bypass mit einem Filter geführt wird.
Verfahren nach Anspruch 15 und 16, bei dem das Trägerfluid vor dem Einspeisen der Probe über eine bestimmte Zeit gefiltert wird.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Trägerfluid nach dem Einspeisen der Probe über eine bestimmte Zeit gefiltert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, bei dem das Trägerfluid nach Zugabe des Monomers nicht mehr gefiltert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, bei dem das Trägerfluid nach Zugabe des Monomers, die zu einem Nachweis oder nicht zu einem Nachweis des weiteren Monomers geführt hat, erneut gefiltert wird, bis ein anderes Monomer zugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, bei dem die Probe mit dem Enzym versetzt und die Probe danach dem Trägerfluid zugeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 21, das mit unterschiedlichen Mengen der synthetischen Hapten-Dimere und/oder -Oligomere wiederholt durchgeführt wird und bei dem aus den unterschiedlichen Meßergebnissen die Konzentration der Hapten-Monomere in der Probe ermittelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 22, das mit verschiedenen synthetischen Dimeren und/oder Oligomeren spezifischer Haptene wiederholt wird.