DE102013210953A1

DE102013210953A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Nachweisen von ungelösten Teilchen in einem Fluid

Info

Publication number: DE102013210953A1
Application number: DE102013210953.9A
Authority: DE
Inventors: Michael Bassler; Christian Sommer; Stephan Quint; Peter Spang
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2013-06-12
Filing date: 2013-06-12
Publication date: 2014-12-31
Also published as: WO2014198814A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweisen von in einem strömenden Fluid befindlichen ungelösten Teilchen, welches Fluid die Dichte ρ und die Viskosität μ aufweist. Das Fluid mit den Teilchen wird durch einen Messkanal (60) gefördert wird und durchströmt eine Anregungszone (76), in der es von einer Strahlungsquelle erfasst wird, und eine Messstrecke (80), in der von den Teilchen in Folge der Anregung ausgehende Emission und/oder von den Teilchen ausgehendes Streulicht von einem Detektor (82) aufgenommen wird. Eine zwischen dem Messkanal (60) und dem Detektor (82) angeordnete Maske (84) moduliert die Emission bzw. das Streulicht, und das modulierte Signal wird mittels einer Korrelationsanalyse ausgewertet. Das Fluid wird durch den Messkanal (60) mit einer mittleren Strömungsgeschwindigkeit v gefördert, bei der die Kanal-ReynoldszahlWerte zwischen 0,1 und 500 annimmt, wobei die Teilchen eine Geschwindigkeitsverteilung annehmen, deren Halbwertsbreite weniger als 4% der mittleren Teilchengeschwindigkeit beträgt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweisen von in einem strömenden Fluid befindlichen ungelösten Teilchen, welches Fluid die Dichte ρ und die Viskosität μ aufweist. Das Verfahren sieht vor, dass das Fluid mit den Teilchen durch einen Messkanal gefördert wird, wobei das Fluid mit den Teilchen eine Anregungszone, in der es von einer Strahlungsquelle erfasst wird, und eine Messstrecke durchströmt, in der von den Teilchen in Folge der Anregung ausgehende Emission und/oder von den Teilchen ausgehendes Streulicht von einem Detektor aufgenommen wird, wobei eine im Bereich der Messstrecke zwischen dem Messkanal und dem Detektor angeordnete Maske die Emission bzw. das Streulicht moduliert, und wobei das modulierte Signal mittels einer Korrelationsanalyse ausgewertet wird, um die Teilchen nachzuweisen.
Dementsprechend weist die Vorrichtung einen Messkanal, durch den das Fluid mit den Teilchen förderbar ist und der eine Messstrecke umfasst, eine Pumpeinrichtung zum Fördern des Fluids mit den Teilchen, eine Strahlungsquelle für elektromagnetische Strahlung, die auf eine Anregungszone im Messkanal ausgerichtet ist, einen auf die Messstrecke ausgerichteten Detektor, der eingerichtet ist, von den Teilchen in Folge der elektromagnetischen Einstrahlung ausgehende Emission und/oder von den Teilchen ausgehendes Streulicht zu detektieren, eine im Bereich der Messstrecke zwischen dem Messkanal und dem Detektor angeordnete Maske zur räumlichen Modulation der Emission und/oder des Streulichtes und eine Auswerteeinrichtung mit Mitteln zur Korrelationsanalyse zum Nachweisen der Teilchen anhand des modulierten Signals auf.
Die Erfindung hat ihren Ursprung im Bereich der Durchflusszytometrie. Hierbei handelt es sich vereinfacht gesagt um ein Verfahren, bei dem das Fluid mit den Teilchen, hier biologische Zellen, durch eine Durchflusszelle gepumpt wird, in der diese mittels eingestrahlten Lichts zur fluoreszierenden Emission angeregt werden. Die Zellen werden deshalb zuvor meist mit fluoreszierenden Substanzen markiert. Das emittierte Licht wird von einem Detektor aufgenommen, während das Teilchen die Durchflusszelle passiert. Zwischen dem Messkanal der Durchflusszelle und dem Detektor befindet sich eine Maske, auch Schattenmaske, mit der das emittierte Licht aufgrund der Relativbewegung der Teilchen zu der Maske zeitlich moduliert wird. Ein solches Signal wird mit einer bestimmten Abtastrate aufgezeichnet. Das Ergebnis wird als Sampling bezeichnet.
Die Tastfolge des modulierten Signals bzw. die aufeinanderfolgenden transluzenten oder transparenten und opaken Abschnitte der Maske können im einfachsten Fall periodisch angeordnet sein. Bevorzugt sind sie allerdings als sogenannte „pseudo random binary sequence” angeordnet, das heißt in einer Reihenfolge mit unregelmäßigen Abständen und Längen, um insbesondere beim Messen mehrerer Partikel, die zeitlich überlappend die Messstrecke passieren, eine eindeutige Identifikation zu ermöglichen.
Die Auswertung mithilfe der Korrelationsanalyse erfolgt, indem die Auswerteeinrichtung aus dem bekannten Muster der Maske rechnerisch eine Referenzsequenz bildet. Diese wird in ihrer absoluten Länge festgelegt (skaliert) und mit dem Sampling verglichen bzw. gefaltet, wobei sie über das Signal hinweg verschoben wird. Anschließend wird der Vorgang iterativ bei anderen Skalierungen so lange wiederholt, bis eine Übereinstimmung gefunden ist. Die Übereinstimmung zeigt sich für jedes die Detektionszelle passierende Teilchen in Form eines Korrelationspeaks, anhand dessen die Teilchen beispielsweise gezählt werden können.
Darüber hinaus ist es bekannt, diese Anordnung dazu zu nutzen, die Intensität des emittierten Lichtes und/oder zusätzlich ein Streusignal, das von dem Teilchen ausgeht zu messen, woraus weitere Informationen über das Teilchen gewonnen werden können. Beispielsweise kann so eine Aussage über dessen Größe getroffen werden.
Beispielhaft wird auf die Schriften US 2008/0181827 A1 , US 2008/0183418 A1 und US 7,763,856 B2 verwiesen, die sich mit jener Technologie befassen.
Die vorliegende Erfindung schlägt ein verbessertes Verfahren dieser Gattung und eine Vorrichtung zu dessen Ausführung vor, mit dem Teilcheneigenschaften in einem strömenden Fluid in kürzerer Zeit bzw. mit weniger Rechenaufwand nachgewiesen werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweisen von in einem strömenden Fluid befindlichen ungelösten Teilchen der eingangs beschriebenen Art sieht vor, dass das Fluid durch den gesamten Messkanal mit einer mittleren Strömungsgeschwindigkeit v gefördert wird, bei der die Kanal-Reynoldszahl
Werte zwischen 0,1 und 500 annimmt, wobei d_hyd den hydraulischen Durchmesser des Messkanals bezeichnet und wobei die Teilchen eine Geschwindigkeitsverteilung annehmen, deren Halbwertsbreite weniger als 4% der mittleren Teilchengeschwindigkeit, bevorzugt weniger als 2% und besonders bevorzugt weniger als 1% beträgt.
Die Erfindung sieht weiterhin vor, dass die Vorrichtung der eingangs genannten Art eine der Pumpeinrichtung zugeordnete Steuereinrichtung aufweist, die eingerichtet ist eine Strömungsgeschwindigkeit v für das Fluid durch den gesamten Messkanal einzustellen, bei der die Kanal-Reynoldszahl
Werte zwischen 0,1 und 500 annimmt, wobei d_hyd den hydraulischen Durchmesser des Messkanals bezeichnet und wobei die Teilchen eine Geschwindigkeitsverteilung annehmen, deren Halbwertsbreite weniger als 4% der mittleren Teilchengeschwindigkeit, bevorzugt weniger als 2% und besonders bevorzugt weniger als 1% beträgt.
Der Begriff „Teilchen” schließt im Sinne dieser Schrift ausgedehnte Festkörper wie auch Tröpfchen einer Flüssigkeit ein. Es kann sich demnach bei dem Fluid mit Teilchen um eine Suspension oder auch um eine Emulsion handeln. Darüber hinaus soll der Begriff „Fluid” im weitesten Sinne als fließfähiges Medium verstanden werden und insbesondere Gase und Flüssigkeiten umschreiben.
Die der Erfindung zugrundeliegende Erkenntnis ist, dass gleiche Teilchen nur unter den vorgenannten Bedingungen ein signifikantes Strömungsverhalten in dem Fluid aufweisen, wie nachfolgend anhand der Figuren noch näher erläutert werden wird. Durch Einhaltung vorstehender experimenteller Bedingungen ordnen sich die Teilchen in dem strömenden Fluid nämlich aufgrund einer Wechselwirkung mit dem Fluid auf bestimmten Strömungsbahnen in dem Messkanal an, wodurch sie mit einer signifikant schmaleren Geschwindigkeitsverteilung in dem Fluid mitgeführt werden als dies außerhalb der genannten Bedingungen der Fall ist. Dies wird auf die hydrodynamischen Eigenschaften der Teilchen zurückgeführt, wobei als „hydrodynamische Teilcheneigenschaft” im Sinne dieser Schrift insbesondere die Teilchengröße, die Elastizität, die Form und die Dichte der Teilchen verstanden werden. Der Effekt tritt in Abhängigkeit von den hydrodynamischen Eigenschaften bei eben jener Kanal-Reynoldszahl zwischen 0,1 und 500, bevorzugt zwischen 0,5 und 200 und besonders bevorzugt zwischen 1,0 und 50 auf, die bei gegebenem Fluid und hydraulischem Durchmesser durch die Strömungsgeschwindigkeit v eingestellt wird. Unterhalb von R_K = 0,1 ist das Strömungsprofil des Fluids zu flach, so dass die in der Fluidströmung auf die Teilchen wirkenden Kräfte nicht ausreichen, diese in einer akzeptablen Zeitspanne anzuordnen. In Fällen einiger Teilchen mit besonderen hydrodynamischen Eigenschaften kann eine Untergrenze von R_K = 1,0 bevorzugt sein. Oberhalb der Grenze von R_K = 500 werden andererseits Turbulenzen am Partikel erwartet, so dass mit einem unkontrollierbaren Verhalten der Teilchen zu rechnen ist. In Abhängigkeit von der Form des Messkanals, genauer von dessen Querschnittsdimension, Querschnittsform, und Länge, kann bereits eine Kanal-Reynoldszahl von mehr als 200 oder auch schon von mehr als 50 zu einem sehr hohen Druck in dem Messkanal bzw. dem gesamten Leitungssystem der Vorrichtung führen, dem nicht jedes grundsätzlich geeignete Material (z. B. Kunststoff, Glas oder Stahl) standhält. Außerdem steigt, ebenfalls in Abhängigkeit von der Kanalform, die Strömungsgeschwindigkeit in dem Messkanal über Werte an, die einen erheblichen höheren technischen Aufwand für den Nachweis der Teilchen oder gar eine Messung deren Geschwindigkeit in dem Messkanal erforderlich machen. Aus diesen Gründen ist es vorteilhaft in einigen Fällen die Kanal-Reynoldszahl bei 200 oder auch bei 50 zu beschränken.
Aufgrund der signifikant schmaleren Geschwindigkeitsverteilung der Teilchen kann die Auswertung mittels Korrelationsanalyse erheblich zielgerichteter erfolgen, weil die zuvor beschriebene Skalierung der Referenzsequenz nur noch in einem engen Bereich um einen der mittleren Geschwindigkeit entsprechenden Erwartungswert iterativ verändert werden muss, was den gesamten Auswertevorgang erheblich verkürzt.
Das angesprochene „Strömungsverhalten” kann als Oberbegriff wenigstens eines der Parameter

– mittlere Migrationsgeschwindigkeit einer Teilchenpopulation
– Geschwindigkeitsverteilung einer Teilchenpopulation
– Veränderung der Migrationsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von einer Veränderung der Strömungsbedingungen, d. h. insbesondere der Strömungsgeschwindigkeit und damit der Kanal-Reynoldszahl
– Veränderung der Verteilung der Migrationsgeschwindigkeit der Teilchen in Abhängigkeit von der Veränderung der Strömungsbedingungen

Neben dem bloßen Nachweis der Teilchen kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfindungsgemäßen Vorrichtung deshalb auch Informationen über die hydrodynamischen Eigenschaften der untersuchten Teilchen gewonnen werden und die Teilchen anhand dieser Information bestimmt oder, wenn verschiedene hydrodynamische Teilcheneigenschaften quantitativ zu demselben Effekt, also zu demselben Strömungsverhalten führen, zumindest klassifiziert werden. Dies ist ohne Einhaltung der experimentellen Bedingungen nicht möglich, weil eine breite Geschwindigkeitsverteilung eine Zuordnung der ermittelten Parameter zu den Teilchen nicht erlaubt. Dies soll im Folgenden anhand eines Beispiels verdeutlicht werden.
Beispielweise kann aus der Skalierung des Referenzsignals bei einem kalibrierten Sampling die Verweildauer der Teilchen in dem Messkanal über die Distanz der Messstrecke oder direkt die Migrationsgeschwindigkeit der Teilchen in der Messstrecke ermittelt werden. Aufgrund der engen Geschwindigkeitsverteilung können sich diskrete Verteilungsmaxima für Teilchen mit unterschiedlichen hydrodynamischen Eigenschaften ausbilden, die eine Differenzierung unterschiedlicher Teilchenpopulationen ermöglichen oder anhand einer konkret ermittelten mittleren Migrationsgeschwindigkeit oder deren Veränderung in Folge einer Veränderung der Strömungsbedingungen sogar eine Klassifizierung oder eine Bestimmung der Teilchen erlauben. Zumindest zur Differenzierung bedarf es nicht einmal einer Kalibrierung.
Die Differenzierung, Klassifizierung oder Bestimmung der Teilchen erfolgt vorzugsweise anhand wenigstens eines der oben genannten Parameter. Der oder die Parameter werden aus den Daten der ermittelten Migrationsgeschwindigkeit in einem Analyseschritt gewonnen. Zu diesem Zweck weist die Vorrichtung vorteilhafterweise eine Analyseeinrichtung auf, die eingerichtet ist, das Strömungsverhalten der Teilchen anhand der ermittelten Migrationsgeschwindigkeit zu analysieren und zur Differenzierung, zur Klassifizierung oder zur Bestimmung der Teilchen auszugeben. Zum Analysieren zählt beispielsweise auch das Kalibrieren aufgenommener Sampling-Daten, d. h. die Umrechnung in konkrete physikalische Größen. Das Analysieren kann eine Auswertung einzelner oder einer Vielzahl von Ereignissen bzw. Einzelmessungen umfassen, um beispielsweise eine Verteilung oder einen Mittelwert zu bestimmen. Am Ende der Analyse gibt die Analyseeinrichtung das Ergebnis der Analyse, also den oder die das Strömungsverhalten charakterisierende Parameter je nach Nutzerwunsch zur Bilddarstellung, zum Ausdruck, in tabellarischer Form, als Grafik oder als elektronischer Datensatz aus.
„Klassifizierung” meint, wenn beispielsweise nur einzelne oder mehrere der hydrodynamischen Eigenschaften der Teilchen nicht aber das Teilchen selbst eindeutig bestimmt werden können, das Einordnen des Teilchens in eine Teilchenklasse mit eben jenen hydrodynamischen Eigenschaften.
Insbesondere findet die vorliegende Erfindung Anwendung in der so genannten Mikrofluidik, in der kleinste Volumina einer Flüssigkeit im Bereich von μl gehandhabt und analysiert werden. Insbesondere ist die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Miniaturisierung auf einem so genannten Mikrofluidik-Chip oder Lab-on-a-chip-System geeignet, mit dem beispielsweise Blutproben oder anderes organisches Zellmaterial analysiert werden kann.
Der Begriff „Messstrecke” im Sinne der Patentansprüche ist der Abschnitt des Messkanals, in dem die Ermittlung der Migrationsgeschwindigkeit der Teilchen erfolgt. Darüber hinaus umfasst der Messkanal besagte „Anregungszone” und kann zudem eine „Anlaufstrecke” umfassen. Alle drei Begriffe Messstrecke, Anregungszone und Anlaufstrecke beschreiben funktionale Abschnitte des Messkanals. Während die Anlaufstrecke und die Messstrecke in dieser Reihenfolge in Strömungsrichtung räumlich hintereinander angeordnet sind, können die Anregungszone und die Messstrecke bzw. auch die Anregungszone und die Anlaufstrecke aber räumlich zusammenfallen oder sich überschneiden.
Es ist zu beachten, dass die Einstellung des signifikanten Strömungsverhaltens aufgrund der hydrodynamischen Eigenschaften der Teilchen nicht zwingend einen konstanten Kanalquerschnitt erfordert. Zwingend erforderlich ist lediglich, dass in allen Teilstücken, also der Anlaufstrecke und der Messstrecke des Messkanals die Reynoldszahl R_K in dem beanspruchten Bereich liegt. Gleichwohl ist ein durchgehend konstanter Kanalquerschnitt – und damit ist sowohl die Querschnittsgeometrie als auch die Querschnittsfläche angesprochen – aus Gründen der Einfachheit und der Prozesssicherheit zu bevorzugen, weil sich dann aufgrund gleichbleibender Strömungsverhältnisse über einen längeren Kanalabschnitt ein Strömungsgleichgewicht innerhalb des strömenden Fluids ausbilden kann, welches die Messpräzision erhöht.
Bevorzugt sieht das Verfahren vor, dass die Teilchen einen maximalen Partikeldurchmesser a_p aufweisen und dass das Fluid mit den Teilchen im Messkanal in Strömungsrichtung vor der Messstrecke eine Anlaufstrecke mit einer Länge L von wenigstens
durchströmt, wobei R_K,a die Kanal-Reynoldszahl in der Anlaufstrecke bezeichnet und wobei der Messkanal wenigstens im Bereich der Anlaufstrecke, bevorzugt aber im gesamten Messkanal, eine Höhe h aufweist.
In entsprechender Weise sieht die erfindungsgemäße Vorrichtung vorzugsweise vor, dass der Messkanal in Strömungsrichtung vor der Messstrecke eine Anlaufstrecke mit dieser Länge L aufweist, wobei der Messkanal wenigstens im Bereich der Anlaufstrecke, bevorzugt aber im gesamten Messkanal, eine Höhe h aufweist.
Als Partikeldurchmesser a_p wird bei nicht sphärischen Teilchen deren größte Ausdehnung angenommen, bei einem Rotationsellipsoid also beispielsweise die Hauptachse.
Als „Nähe h” wird bei einem Messkanal mit ungleicher Ausdehnung des Querschnittes in zwei Raumrichtungen das Maß der geringeren Ausdehnung verstanden. Dies ist beispielsweise bei einem Kanal mit Rechteckquerschnitt die Länge der kurzen Seite des Querschnittes. Bei einem Quadrat ist die Höhe h gleich der Breite w. Bei einem Kreis entspricht die Höhe h wie auch die Breite w jeweils dem Durchmesser des Querschnittes. Etwaige Änderungen des Querschnittes sollten generell und im Besonderen in Richtung der Höhe h nicht abrupt sondern nur stetig erfolgen, so dass die Strömung innerhalb des Kanals stets laminar bleibt. Im Allgemeinen aber sind die Höhe h und die Breite w im gesamten Messkanal konstant, um beschleunigende Kräfte zu vermeiden, die die Anordnung der Teilchen auf bestimmten Strömungsbahnen in dem Messkanal stören und somit deren Geschwindigkeitsverteilung verbreitern können.
Die Einhaltung vorstehender Bedingung sorgt dafür, dass sich am Ende der Anlaufstrecke L und damit zu Beginn der Messstrecke eine Gleichgewichtsströmung ausgebildet hat, bei der die Teilchen oder einzelne Teilchenpopulationen mit einheitlichen hydrodynamischen Eigenschaften in dem strömenden Fluid in ihrer Gleichgewichtskonfiguration angeordnet sind und deshalb die Geschwindigkeitsverteilung der Teilchen die angesprochene Signifikanz aufweist.
Das Verfahren und die Vorrichtung sehen vorzugsweise weiterhin vor, dass der Messkanal wenigstens im Bereich der Messstrecke, vorzugsweise aber über die gesamte Länge des Messkanals, einen Querschnitt mit einer Breite w und einer Höhe h aufweist, wobei der Messkanal immer die Grenze für das Aspektverhältnis ∊ = h / w ≤ 0,1 einhält.
Um eine hinreichend hohe Fluidmenge durchsetzen zu können, damit für besondere Fälle in einem vertretbarem Zeitrahmen eine ausreichende statistische Signifikanz erzielt werden kann, muss der Querschnitt des Messkanals in der zweiten Raumrichtung, die Breite w, eine wesentlich größere Ausdehnung als die Höhe h und eben bevorzugt wenigstens die zehnfache Ausdehnung aufweisen.
Die Erfinder haben gefunden, dass eine besonders enge Geschwindigkeitsverteilung der Teilchen sich dann einstellt, wenn seine Höhe h oder geringste Ausdehnung das 200-fache, bevorzugt das 50-fache, des Partikeldurchmessers nicht überschreitet.
Dementsprechend wird für das Verfahren wie auch für die Vorrichtung bevorzugt, wenn die Höhe h des Messkanals wenigstens im Bereich der Messstrecke, bevorzugt aber über die gesamte Länge des Messkanals, das 200-fache, besonders bevorzugt das 50-fache, des maximalen Partikeldurchmessers a_p nicht überschreitet.
Von Vorteil ist es weiterhin, wenn wenigstens im Bereich der Messstrecke, bevorzugt aber über die gesamte Länge des Messkanals das Verhältnis
besonders bevorzugt
beträgt.
Diese Forderung reflektiert den Umstand, dass Teilchen, die größer als der halbe minimale Kanalquerschnitt sind, nicht mehr ausreichend Spielraum haben, um sich in Richtung der Höhe h anzuordnen, was schließlich zu Zweideutigkeiten in der Geschwindigkeitsverteilung führen kann. Während das Verfahren bei verformbaren Teilchen noch bis zu einem γ von 0,75 eindeutige Messwerte liefert, ist dies für starre Teilchen nicht sichergestellt. Deshalb ist die Einhaltung eines γ von höchsten 0,5 zu bevorzugen.
Auch lässt sich die Geschwindigkeitsverteilung der Teilchen einstellen, wenn gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung, die Partikel-Reynoldszahl
Werte zwischen 2,5·10^–6 und 0,1 annimmt, wobei a_p wiederum den maximalen Partikeldurchmesser und h die Höhe des Messkanals wenigstens im Bereich der Messstrecke, bevorzugt aber über seine gesamte Länge, angeben.
In diese Forderung fließt die Erkenntnis ein, dass nicht nur ein vorgegebener Bereich der Kanal-Reynoldszahl und ein bestimmtes Verhältnis aus dem Partikeldurchmesser zur Höhe des Messkanals zu einer signifikanten Teilchenströmung führen, sondern überdies noch ein nicht-linearer Zusammenhang zwischen den Parametern besteht.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung des Verfahrens wird die Geschwindigkeitsverteilung und/oder ein Geschwindigkeitsmittelwert aus der ermittelten Migrationsgeschwindigkeit gewonnen und zur Differenzierung, zur Klassifizierung oder zur Bestimmung der Teilchen herangezogen.
Werden beispielsweise zwei Teilchenpopulationen untersucht, wobei die Teilchenpopulationen aufgrund wenigstens einer unterschiedlichen hydrodynamischen Teilcheneigenschaft jeweils eine andere mittlere Gleichgewichtsgeschwindigkeit einnehmen, so zeigt sich dies in der Geschwindigkeitsverteilung beispielsweise durch zwei Maxima, welche zumindest eine Differenzierung, einer Klassifizierung oder bei einem sodann hinreichend bestimmten System (die Dispersion oder Emulsion bestehend aus Fluid und Teilchen wird auch als System bezeichnet) eben sogar auch einer Bestimmung der beiden Teilchenpopulationen zugrunde gelegt werden können. Dies setzt voraus, dass die Geschwindigkeitsverteilungen der Teilchen jeweils ausreichend eng und weit genug voneinander beabstandet sind, so dass die Maxima eindeutig identifizierbar sind, was insbesondere durch Einhaltung der erfindungsgemäßen Bedingungen sichergestellt wird. Als ausreichend eng wird eine Verteilung nach der Erfahrung der Erfinder dann verstanden, wenn die Halbwertsbreite der Geschwindigkeitsverteilung einer Teilchenpopulation weniger als 4%, bevorzugt weniger als 2% der mittleren Teilchengeschwindigkeit beträgt. Eine bevorzugte Form der Analyse umfasst deshalb insbesondere die Bestimmung der mittleren Teilchengeschwindigkeit und/oder der Verteilungsbreite, besonders bevorzugt der Halbwertsbreite der ermittelten Geschwindigkeitsverteilung.
Dies ist in Verbindung mit einer Weiterbildung des Verfahrens nützlich, bei der eine Veränderung der gemessenen Migrationsgeschwindigkeit und/oder eine Veränderung der Verteilung der Migrationsgeschwindigkeit infolge der Veränderung der Strömungsgeschwindigkeit v analysiert und zur Differenzierung, zur Klassifizierung oder zur Bestimmung der Teilchen herangezogen wird.
Die Erfinder haben nämlich festgestellt, dass nicht nur die absolute oder relative Teilchengeschwindigkeit oder die Geschwindigkeitsverteilung zur Klassifizierung der Teilchen herangezogen werden kann, sondern dass auch die Veränderung eines dieser beiden Parameter eine Aussage über die hydrodynamischen Eigenschaften der Teilchen erlaubt. Durch eine Kombination beider Analysen kann unter Umständen ein weiterer Freiheitsgrad bzw. eine weitere hydrodynamische Teilcheneigenschaft bestimmt werden und damit die Klassifizierung der Teilchen genauer erfolgen oder gar eine Bestimmung der Teilchen möglich werden.
Wie schon diskutiert umfasst das Ermitteln der Migrationsgeschwindigkeit vorzugsweise das Messen der Zeit, die die Teilchen zum Passieren der Messstrecke benötigen.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Vorrichtung ist der Detektor eingerichtet, die Intensität der von den Teilchen ausgehende Emission und/oder des von den Teilchen ausgehendes Streulicht quantitativ zu detektieren. Entsprechend ist die Analyseeinrichtung eingerichtet, die Intensität zur Differenzierung, zur Klassifizierung oder zur Bestimmung der Teilchen auszugeben.
Weitere Grundlagen, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden nachfolgend anhand von Zeichnungen und Ausführungsbeispielen näher erläutert. In den Figuren zeigen:
1 eine schematische Darstellung der Teilchenkonzentration in einem zylindrischen Kanal nach Segré und Silberberg;
2 vier Verteilungen der Teilchen in dem zylindrischen Kanal in radialer Richtung an unterschiedlichen axialen Positionen;
3 Geschwindigkeitsverteilungen gleicher Teilchen in einem Fluid bei unterschiedlichen Flussraten;
4 zwei Geschwindigkeitsverteilungen unterschiedlicher Teichen in demselben Fluid bei konstanter Flussrate;
5 schematische Darstellung der Gruppierung unterschiedlicher Teilchen entlang des Geschwindigkeitsprofils eines Fluids in einem Kanal;
6 schematische Darstellung eines Messkanals mit einer Zeitmesseinrichtung für ein moduliertes Fluoreszenz- oder Streulichtsignal;
7 der Messkanal gemäß 6 in der Draufsicht;
8 ein schematisiertes Messsignal eines einzelnen Teilchens aufgenommen mit der einer Messeinrichtung nach 6;
9 das Signal eines Teilchens nach erfolgter Korrelationsanalyse;
10 Ableitung des Korrelationspeaks aus 9;
11 ein typisches Signal mehrerer Teilchen aufgenommen mit einer Messeinrichtung nach 6;
12 das Messsignal gemäß 11 nach Durchlaufen der Korrelationsanalyse und Ableitung;
13 ein Diagramm dreier Geschwindigkeitsverteilungen unterschiedlicher Teilchen, gemessen bei einer ersten Flussrate;
14 ein Diagramm dreier Geschwindigkeitsverteilungen derselben drei Teilchen, gemessen bei einer zweiten Flussrate;
15 ein zweidimensionales Intensitäts-Geschwindigkeits-Diagramm zweier Teilchenpopulationen; und
16 eine Projektion des Diagramms gemäß 15 auf die Intensitätsachse.
In einer grundlegenden wissenschaftlichen Arbeit von 1961 haben Segré und Silberberg gezeigt, dass Festkörperteilchen in einer eine zylindrische Röhre durchströmenden Dispersion nach einer gewissen Strecke eine inhomogene Verteilung annehmen, siehe G. Segré und A. Silberberg, „Radial particle displacement in poiseuille flow of suspensions", Nature, Vol. 189, 21. Januar 1961. Dieses Verhalten ist in den 1 und 2 schematisch dargestellt.
1 zeigt einen Längsschnitt durch eine solchen zylindrischen Röhre 10 mit der Mittelachse 12 und dem Radius r, in der das Fluid mit den Teilchen, also der Dispersion, in Pfeilrichtung 14 strömt. Es wird angenommen, dass die Teilchen in der Dispersion eingangs der Röhre 10 an der Position a) noch homogen über die gesamte Querschnittfläche verteilt mit dem Fluid strömen. Die konstante Verteilung an der Position a) ist in dem entsprechenden Diagramm a) in 2 schematisch gezeigt und zwar ist dort die Verteilung von der Mittel- oder Symmetrieachse 12 bis zum Radius r aufgetragen.
Mit zunehmender Verweildauer oder auch mit zurückgelegter Strecke in dem Kanal treten Wechselwirkungen zwischen den Kanalwandungen, dem Fluid und den Teilchen auf, die eine Änderung der räumlichen Verteilung in dem Fluid bewirken. Die Verteilung wird demnach stromabwärts radial eingeschnürt, so dass die Partikelkonzentration nahe der Umfangswände rasch auf Null abnimmt. Zugleich treten aber auch Kräfte auf, die die Teilchen aus der Mitte des Kanals zum Rand hin verdrängen. Dieser Effekt ist nur etwas schwächer, so dass die Verteilung von der Mittel- oder Symmetrieachse „0” ausgehend zunächst geringfügig abnimmt. In Folge beider Prozesse bildet sich tendenziell näher zum Kanalrand hin orientiert ein Verteilungsmaximum aus. Diese Entwicklung nimmt mit fortschreitender Zeit bzw. Strecke in Strömungsrichtung zu, bis sich die Verteilung der Teilchen auf einen schmalen ringförmigen Abschnitt in dem Kanal beschränkt. Diese Entwicklung wird für drei weitere Positionen b), c) und d) durch die zugeordneten Diagramme in 2 aufgezeigt.
Das Verhalten kann auch in 1 anhand der Höhenlinien 16 und 18 abgelesen werden. Diese zeigen, dass die Einschnürung der räumlichen Partikelverteilung mit der zurückgelegten Strecke in dem Kanal stetig und parabelförmig von statten geht.
In einer jüngeren Arbeit haben Wissenschaftler festgestellt, dass der mittlere Radius der maximalen Teilchenkonzentration in einer eine Röhre durchströmenden Dispersion unter anderem von dem Durchmesser der Teilchen abhängt, vergl. Bhagat, Kuntaegowdanahalli, Papautsky, „Inertial microfluidics for continuous particle filtration and extraction", Microfluid Nanofluid, Vol. 7, 217–226, 2009. Sie führen zur Parametrisierung dieses Verhaltens die oben schon erwähnte Partikel-Reynoldszahl
ein, der bei einem rechteckigen Kanal h den kleinsten Kanaldurchmesser angibt. Die Wissenschaftler schlagen in Ihrer Arbeit vor, sich diesen Effekt zur Teilchenextraktion und -filtration zu Nutze zu machen.
Diese Erkenntnisse haben die Erfinder veranlasst, die Geschwindigkeit zu untersuchen, mit der sich die Teilchen in einem fließenden Medium in einem Kanal fortbewegen. Ein erster Teil ihrer Erkenntnisse ist in 3 illustriert. Diese zeigt ein dreidimensionales Diagramm, in dem die bei sechs verschiedenen Flussraten in demselben Kanal gemessene Geschwindigkeitsverteilung der Teilchen aufgetragen ist. Genauer ist darin die Teilchengeschwindigkeit in Richtung der x-Achse, die Flussrate in Richtung der y-Achse und die Partikelanzahl in Richtung der z-Achse aufgetragen. Die Teilchengeschwindigkeit ist auf die mittlere Strömungsgeschwindigkeit des Fluids normiert, damit die Veränderung der Flussrate keine Verschiebung der (absoluten) Teilchengeschwindigkeit zur Folge hat und die Ergebnisse einfacher vergleichbar sind.
Es konnte so festgestellt werden, dass sich bei einer Flussrate von 10 μl/min eine Geschwindigkeitsverteilung mit einem Maximum einstellt, die nahe der maximalen Strömungsgeschwindigkeit des Fluids v_max eine steile Flanke und auf der anderen Seite einen kleinen Ausläufer zu einer geringeren Teilchengeschwindigkeit hin aufweist, vergl. Kurve 20. Mit zunehmender Flussrate und damit Strömungsgeschwindigkeit des Fluids nimmt dieses Maximum ab und verschiebt sich geringfügig hin zu einer geringeren Teilchengeschwindigkeit. Gleichzeitig nimmt der zunächst kleine Ausläufer langsamerer Teilchen zu, bis dieser bei einer Flussrate zwischen 40 und 50 μl/min die Höhe der schnelleren Partikel übersteigt, vergl. Kurven 21 und 22. Bei weiter ansteigender Flussrate verschiebt sich die Verteilung immer weiter hin zu langsameren Partikeln, wobei sich ein sehr schmales und hohes Verteilungsmaximum auszubilden beginnt, das sich gleichzeitig mit zunehmender Flussrate immer weiter zu langsameren relativen Geschwindigkeitswerten verschiebt, vergl. Kurven 23 und 24, bis schließlich bei einer Flussrate von 200 μl/min, wie in Kurve 25 zu sehen ist, alle Partikel sehr stark innerhalb eines sehr schmalen, dominanten Geschwindigkeitsverteilungspeaks fokussiert sind, der bei einer relativen Geschwindigkeit knapp oberhalb der mittleren Strömungsgeschwindigkeit v des Fluids liegt. Es ist bemerkenswert, dass die Verteilungsbreite aufgrund dieser Fokussierung signifikant gegenüber der anfänglichen Verteilungsbreite bei einer Flussrate von 10 μl/min abnimmt.
Die Erfinder machten ferner eine weitere Beobachtung, welche in 4 illustriert ist. Während das Diagramm in 3 das Verhalten einer einzelnen Teilchenpopulation in einem Fluid zeigt, haben die Erfinder in einem weiteren Experiment, dessen Ergebnis 4 wiedergibt, das Verhalten zweier unterschiedlicher Teilchenpopulationen in einem Fluid bei gleichen experimentellen Bedingungen (konstanter Kanalquerschnitt und Flussrate/Strömungsgeschwindigkeit) untersucht.
4 zeigt in einem zweidimensionalen Diagramm eine Geschwindigkeitsverteilungen, in der eine Teilchenzählrate in vertikaler Richtung gegen die Teilchengeschwindigkeit in horizontaler Richtung aufgetragen ist. Es bilden sich zwei deutlichen Maxima bei einer mittleren Teilchengeschwindigkeit von etwa 432 bzw. 446 mm/sec aus, wobei das erste Maximum eine Halbwertbreite von etwa 5,1 mm/sec und das zweite Maximum eine Halbwertbreite von etwa 1,9 mm/sec auweisen. Somit sind die beiden Maxima deutlich separiert und können jeweils eindeutig einer der beiden Teilchenpopulationen zugeordnet werden.
Damit wird offenkundig, dass sich unterschiedliche Teilchen aufgrund unterschiedlicher hydrodynamischer Teilcheneigenschaften nicht nur in ihrer rämlichen sondern auch in Ihrer Geschwindigkeitsverteilung in einem strömenden Medium signifikant unterschiedlich anordnen und deshalb differenzierbar, klassifizierbar und bei geeigneter Kalibrierung anhand dieses Verhaltens auch bestimmbar sind.
Ein Erklärungsversuch für das unterschiedliche dynamische Verhalten der Teilchen wird anhand von 5 unternommen. Dargestellt ist ein Querschnitt durch einen flachen Rechteckkanal 30, der um die Mittellinie 32 symmetrisch ausgebildet ist und die Höhe h aufweist, wobei die Höhe h die geringste Ausdehnung des Rechteckkanals bezeichnet. Der Kanal 30 wird von einem Fluid mit zwei unterschiedlichen Teilchenpopulationen in Richtung des Pfeils 34 durchströmt. Dabei bildet sich ein parabelförmiges Strömungsprofil 36 des Fluids aus, das in der Kanalmitte ein Geschwindigkeitsmaximum v_max aufweist und zu den beiden Rändern des Kanals 30 hin symmetrisch abfällt.
Weiterhin sind zwei Teilchenpopulationen vorhanden, von denen die Teilchen einer ersten Population als kleine Kreise 37 und die einer zweiten Population als große Dreiecke 38 schematisiert sind. Es wird angenommen, dass die Teilchen 37 der ersten Population einen kleineren mittleren Partikeldurchmesser aufweisen als die Teilchen 38 der zweiten Population.
Die anhand der 1 und 2 erläuterte räumliche Fokussierung der Teilchen bewirkt, dass diese sich auf unterschiedlichen Gleichgewichtsbahnen in dem Kanal anordnen, wobei die größeren Partikel 38 etwas näher zur der Mitte 32 des Kanals 30 hin orientiert sind als die kleineren Partikel 37. Daraus resultiert, dass die größeren Partikel 42 eine dem Strömungsprofil 36 entsprechende höhere Gleichgewichtsgeschwindigkeit v₂ einnehmen als die kleineren Partikel 40, deren Gleichgewichtsgeschwindigkeit bei v₁ liegt. Somit ist erklärlich, dass Teilchen unterschiedlicher Größe auch anhand ihrer mittleren Geschwindigkeit differenzierbar sind, wenn die Strömungsgeschwindigkeit des Fluids so hoch ist, dass die Geschwindigkeitsverteilung aller Teilchenpopulationen ausreichend fokussiert sind, vgl. 3, und die Unterschiede der hydrodynamischen Eigenschaften signifikant genug sind, damit die Geschwindigkeitsverteilungen Maxima aufweisen, die weit genug voneinander entfernt sind, vgl. 4.
Die Erfinder haben darüber hinaus festgestellt, dass neben der Größe der Teilchen auch deren Elastizität, Form und Dichte als hydrodynamische Eigenschaften einen Einfluss auf die Anordnung in dem Geschwindigkeitsprofil haben. Diese Eigenschaften können sich gegenseitig aufheben, so dass Teilchen mit unterschiedlichen hydrodynamischen Eigenschaften quantitativ dennoch zu sehr ähnlichen oder gleichen mittleren Geschwindigkeiten und ähnlichen oder gleichen Geschwindigkeitsverteilungsprofilen führen. Unter diesen Umständen ist keine eindeutige Bestimmung sondern nur eine Klassifizierung der Teilchen möglich. Beispielsweise findet die hydrodynamische Fokussierung von Bakterien mit einem bestimmten Durchmesser und einer einer elastischen Verformbarkeit schon bei einer kleineren Strömungsgeschwindigkeit statt als die starrer sphärischer Partikel gleicher Größe. Mit anderen Worten kann ein Bakterium die gleiche mittlere Geschwindigkeit annehmen, wie eine wesentlich größere, aber starre Sphäre.
Wie die Erfindung die aufgefundenen Effekte ausnutzt, wird nachfolgend erläutert.
In den 6 und 7 ist schematisch etwas vereinfacht eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung gezeigt, bei der der Messkanal 60 mit einem flachen Rechteckprofil in das Substrat eines Mikrofluidik-Chips 62 eingearbeitet ist. Der Mikrofluidik-Chip ist in 6 in der Seitenansicht im Schnitt und in 7 in der Draufsicht dargestellt. Die Seitenansicht zeigt den Messkanal 60 in der Höhenrichtung, in der eine Ausdehnung oder Höhe h aufweist. In der Breitenrichtung weist er eine Ausdehnung oder Breite w auf. Für das Aspektverhältnis gilt bevorzugt ∊ = h / w ≤ 0,1.
Eingangs weist der Messkanal eine Zuführung 64 und ausgangs eine Abführung 66 für das zu untersuchende Fluid auf. Die Zuführung 64 und/oder die Abführung 66 sind mit einer nicht dargestellten Pumpeinrichtung zum Fördern des Fluids mit den Teilchen (diesmal von rechts nach links) durch den Messkanal 60 verbindbar, mit der eine Druckdifferenz erzeugbar ist, die mittels einer der Pumpeinrichtung zugeordneten Steuereinrichtung so eingestellt werden kann, dass das Fluid durch den Messkanal mit einer Strömungsgeschwindigkeit 1 fließt, bei der die Kanal-Reynoldszahl
Werte zwischen 0,1 und 500, vorzugsweise zwischen 0,1 und 200 und besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 50 annimmt.
In 7 ist zu sehen, dass der Messkanal 60 ferner mit zwei weiteren Anschlüssen 68, 70 versehen ist, durch die eine Hüllflüssigkeit in Breitenrichtung betrachtet von beiden Seiten zugeführt wer den kann. Der durch die Zuführung 64 in den Messkanal 60 eingebrachte Strom des Fluids mit den Teilchen wird in Strömungsrichtung v hinter einer Kreuzung 71 mit den Anschlüssen 68, 70 für die Hüllflüssigkeit hydrodynamisch fokussiert, so dass er den Messkanal 60 in Breitenrichtung w im Wesentlichen im Zentrum durchströmt, während nur die durch die Öffnungen 68, 70 zugegebene Hüllflüssigkeit Kontakt mit der Kanalwandung in Breitenrichtung w aufweist. Hierdurch wird einerseits bewirkt, dass der Strom des Fluids mit den Teilchen auf eine gewünschte Breite so einstellbar ist, dass alle Teilchen den im Folgenden beschriebene Anregungszone durchlaufen. Andererseits stellt dies sicher, dass sich ein im Wesentlichen konstantes Strömungsprofil in Breitenrichtung des Messkanals ausbildet und das Strömungsprofil im Wesentlichen nur in seiner Höhenrichtung gemäß der in 5 gezeigten Parabelform signifikant variiert.
Des Weiteren weist der Mikrofluidikchip 62 ein Eintrittsfenster 72 für einen Laserstrahl 74 auf, welches so zu der Richtung des Laserstrahls angeordnet ist, dass dieser vollständig oder überwiegend in das Substratmedium des Mikrofluidikchips 62, der vorzugsweise aus Kunststoff und besonders bevorzugt aus PMMA besteht, hineingebrochen und darin unter Totalreflexion zwischen den beiden Grenzflächen des Mikrofluidikchips 62 zu dessen Umgebung geleitet wird. Dabei passiert der Laserstrahl den Messkanal 60 und regt die Teilchen in dem Fluid an oder bestrahlt diese. Dementsprechend bildet der Abschnitt 76 im Sinne der Patentansprüche eine Anregungszone im Messkanal, auf die die nicht gezeigte Strahlungsquelle für elektromagnetische Strahlung 74 im Sinne dieser Erfindung ausgerichtet ist.
In Strömungsrichtung v hinter der Kanalkreuzung 71 beginnt eine Anlaufstrecke 78 der Länge L. In diesem Abschnitt haben die in dem Fluid mitströmenden Teilchen Gelegenheit, sich innerhalb des Strömungsprofils gemäß der Illustration in 5 anzuordnen und eine dementsprechende Migrationsgeschwindigkeit anzunehmen. In Strömungsrichtung v hinter der Anlaufstrecke 78 befindet sich die Messstrecke 80, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass hierauf ein Detektor 82 ausgerichtet ist. Im Bereich der Messstrecke 80 befindet sich zwischen dem Messkanal 60 und dem Detektor 82 ferner eine Maske 84. Diese sogenannte Schattenmaske weist in Strömungsrichtung v räumlich aufeinanderfolgende transparente und intransparente Abschnitte auf. Diese Abschnitte blockieren von den Teilchen in Folge der Anregung ausgehende Emission und/oder von den Teilchen ausgehendes Streulicht auf dem Weg zu dem Detektor 82 bzw. lassen dieses passieren. Dies ist beispielhaft an den Wellenlinien 86 bzw. 88 für zwei der Abschnitte illustriert.
Diese Messanordnung erzeugt beim Passieren eines emittierenden oder streuenden Teilchens das in 8 gezeigte zeitmodulierte Detektorsignal. Hierzu ist zu sagen, dass das Diagramm aus 8 eine schematisch idealisierte Darstellung und keine reale Messung wiedergibt. Das Tastverhältnis des Signals gibt die Folge der transparenten und intransparenten Abschnitte der Schattenmaske 84 wieder. Das Signal wird in an sich bekannter Weise mit einer ausreichenden Abtastrate aufgezeichnet. Das modulierte Signal eines Teilchens hat eine zeitliche Länge (Verweilzeit) die sich aus dessen Geschwindigkeit und der Länge des Messkanals ergibt. Zeitdauer und Geschwindigkeit sind äquivalent. Aus der Verweilzeit und der Abtastrate, also der Anzahl der Messpunkte pro Zeiteinheit, ergibt sich Gesamtzahl der Messpunkte aus denen das Signal besteht. Auch diese Gesamtzahl der Messpunkte die das modulierte Signal einnimmt, hängt folglich von der Geschwindigkeit des Teilchens ab.
Die Tastfolge bzw. die aufeinanderfolgenden Abschnitte können im einfachsten Fall in Form einer periodischen Sequenz von transparenten und nicht transparenten Abschnitten bestehen. Bevorzugt sind sie allerdings als sogenannte „pseudo random binary sequence” angeordnet, das heißt in einer Reihenfolge mit unregelmäßigen Abständen und Längen, um insbesondere beim Messen mehrerer Partikel, die zeitlich überlappend die Messstrecke 80 passieren, eine eindeutige Identifikation zu ermöglichen.
Diese Auswertung erfolgt mithilfe einer Korrelationsanalyse. Das Muster der Schattenmaske ist bekannt. Hieraus wird von der Auswerteeinrichtung rechnerisch eine Referenzsequenz gebildet. Diese wird in ihrer absoluten Länge skaliert und mit dem gesampelten Detektorsignal verglichen, wobei sie über das gesamte Sampling hinweg verschoben wird. Anschließend wird der Vorgang bei anderen Skalierungen iterativ wiederholt, bis eine Übereinstimmung gefunden ist. Dieser Prozess kann auch als Abfrage von Geschwindigkeitskanälen oder Filterung bezeichnet werden und erfolgt bei diskreten Werten, wobei auch hier auf eine ausreichende Auflösung zu achten ist.
Das Ergebnis hiervon ist in 9 gezeigt. Das Korrelationssignal wächst stets von beiden Seiten zur Mitte hin näherungsweise linear an, nur exakt in der Mitte bildet sich ein signifikanter Korrelationspeak aus, der die Übereinstimmung signalisiert. Zur exakten Bestimmung der Lage des Korrelationspeaks kann das Korrelationsdiagramm gemäß 9 mathematisch abgeleitet werden, woraus das Diagramm gemäß 10 resultiert. Darin markiert der Nulldurchgang zwischen dem Maximum und dem Minimum des Ableitungssignals den exakten Wert des Korrelationssignals.
Die tatsächliche Länge der Messstrecke ist bekannt. Deshalb kann anhand einer Kalibrationsmessung bei bekannter Lage des Korrelationspeaks, d. h. bei der ermittelten Länge der Referenzsequenz die Geschwindigkeit des Partikels absolut bestimmt werden. Ansonsten wird das Ergebnis zu einem relativen Vergleich mit der Geschwindigkeit anderer Partikel herangezogen.
In der Realität werden mehrere Teilchen die Messstrecke 80 gleichzeitig oder zumindest nacheinander und teilweise in einem überlappenden Zeitintervall passieren, weshalb das zeitlich modulierte Messsignal auf den ersten Blick keine eindeutige Aussage über die Anzahl der Partikel und deren Verweilzeit innerhalb der Messstrecke 80 erlaubt. Eine solche Messung von acht teilweise zeitlich überlappend passierenden Partikeln ist in dem Sample der 11 dargestellt. Gleichzeitig ist darin zu Illustrationszwecken für jedes Identifizierte Teilchen die Schattenmaske 84 dargestellt, anhand der zu sehen ist, dass die Ereignisse passierender Teilchen sich in der rechten Hälfte des Diagramms teilweise überlappen. Dennoch können die Teilchen in der zuvor beschriebenen Weise exakt bestimmt werden, wie in der 12 anhand der Ableitungen der Korrelationspeaks ersichtlich wird, weil die Verwendung einer unperiodischen Schattenmaske trotz teilweiser Überlappung der Verweildauern der Teilchen im Bereich der Messstrecke signifikante diskrete Korrelationsergebnisse sicherstellt.
Weisen die Teilchen keine identische Migrationsgeschwindigkeit auf, was in der Realität grundsätzlich der Fall ist, so liefert die Korrelationsanalyse unterschiedliche Skalierungswerte für die Referenzsequenz. Dem geht ein hoher Rechenaufwand voraus, da das gesamte Sampling mit einer Vielzahl von skalierten Referenzsequenzen korreliert werden muss, je nach der geforderten Auflösung und Breite des abzutastenden Geschwindigkeitsintervalls. Diesen Aufwand zu verringern ermöglichen die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren, indem die Geschwindigkeitsverteilung so schmal gewählt wird, dass das Skalierungsintervall erheblich eingeschränkt werden kann, ohne dass Messdaten dadurch verloren gehen.
Darüber hinaus können sowohl Geschwindigkeitsverteilungen identischer Teilchen als auch Geschwindigkeiten oder deren Äquivalente von Teilchen unterschiedlicher Populationen ermittelt werden. Beides zusammen ist in dem Diagramm gemäß 13 beispielhaft geschehen.
Das Diagramm zeigt die Geschwindigkeitsverteilungen dreier Teilchenpopulationen, die gleichzeitig durch einen Messkanal unter den erfindungsgemäßen experimentellen Bedingungen bei einer Kanal-Reynoldszahl R_K von 14 gefördert wurden. Die durchgezogene Linie zeigt die Geschwindigkeitsverteilung der kleinsten Teilchen mit einem mittleren Partikeldurchmesser a_p = 0,84 μm. Die Geschwindigkeit dieser Teilchen ist von etwa 340 mm/sec bis etwa 620 mm/sec über ein großes Intervall verteilt und weist in etwa die Kurvenform der zweiten Verteilungskurve 21 in dem dreidimensionalen Diagramm gemäß 3 auf.
Die Kurve ist auf den Maximalwert des am rechten Rand gelegenen Peaks normiert.
Weiterhin sind Teilchen mit einem mittleren Partikeldurchmesser a_p von 2,1 μm in dem Fluid enthalten. Diese weisen bei der gleichen Kanal-Reynoldszahl eine sehr scharfe Verteilung im Bereich von etwa 410–415 mm/sec auf, wie anhand der gestrichelten Kurve zu erkennen ist. Schließlich sind noch größere Teilchen mit einem mittleren Partikeldurchmesser a_p von 6,42 μm in dem Fluid enthalten, deren punktiert eingezeichnete Verteilung nochmals enger ist und einen Bereich von etwa 425 bis etwa 428 mm/sec umfasst. Auch die beiden zuletzt genannten Kurven sind auf den Maximalwert der jeweiligen Peaks normiert. Diese weisen beide die Gestalt der Verteilung gemäß Kurve 25 in dem Diagramm in der 3 auf. Das Diagramm bestätigt die vorstehend diskutierten Effekte, dass nämlich Teilchen unterschiedlicher Größe sich in dem Fluid bei unterschiedlichen Gleichgewichtsgeschwindigkeiten konzentrieren, wobei sie bei einer ausreichenden Strömungsgeschwindigkeit eine sehr enge Geschwindigkeitsverteilung aufweisen und somit einfach differenzierbar oder auch identifizierbar sind. 13 zeigt jedoch noch einen weiteren Effekt, der vorstehend noch nicht näher beleuchtet wurde. Die Tatsache, dass die kleinsten Teilchen offenbar ihre Gleichgewichtslage noch nicht eingenommen haben und deshalb eine breite Verteilung zeigen, in der sich an linken Rand erst langsam ein Maximalwert auszubilden beginnt, zeigt, dass die Strömungsgeschwindigkeit und damit das parabelförmige Verteilungsprofil der Fluidgeschwindigkeit, vergl. 5, noch nicht steil genug ist, dass die auf die kleinen Partikel wirkenden Kräfte ausreichen, diese vollständig in eine Gleichgewichtsposition zu bewegen. Dies zeigt, dass die Angabe einer Obergrenze für die Kanal-Reynoldszahl keine Allgemeingültigkeit für das Erreichen einer schmalen, signifikanten Geschwindigkeitsverteilung hat. Deshalb sieht die Erfindung gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung vor, dass bei einem System mit Teilchen mit einem maximalen Partikeldurchmesser a_p und einem Messkanal, der wenigstens im Bereich der Messstrecke, vorzugsweise aber über seine gesamte Länge, eine im Wesentlichen konstante Höhe h aufweist, die Strömungsgeschwindigkeit so einzustellen ist, dass die Partikel-Reynoldszahl
größer ist als 2,5·10^–6.
Die Richtigkeit dieser Annahme bestätigt das Diagramm in 14, welches die Geschwindigkeitsverteilungen derselben drei Partikel in demselben Fluid und in der selben Vorrichtung jedoch bei einer mittleren Strömungsgeschwindigkeit v des Fluids zeigt, die einer Kanal-Reynoldszahl von 0,66 entspricht. Unter diesen Bedingungen ordnen sich weder Teilchen mit einem mittleren Partikeldurchmesser a_p = 0,84 μm noch solche mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 2,1 μm und nicht einmal die größten Teilchen mit einem mittleren Partikeldurchmesser von 6,42 μm in dem Fluid an.
In 15 ist ein zweidimensionales Diagramm gezeigt, in dem die Signalintensität in vertikaler Richtung gegen die Geschwindigkeitsverteilung in horizontaler Richtung aufgetragen ist. Wiederum sind in dieser Messung zwei Teilchenpopulationen enthalten, die sowohl in Projektion auf die Geschwindigkeitsachse als auch Projektion auf die Intensitätsachse deutlich voneinander separiert sind. Wird die Messung also dergestalt ausgeführt, dass neben der Geschwindigkeitsverteilung als weitere Eigenschaft der Partikel die Intensität der emittierten oder gestreuten Strahlung registriert und koinzident gemessen wird, so kann in einer Messung eine weitere Teilcheneigenschaft ermittelt und die Teilchen deshalb genauer klassifiziert oder bestimmt werden. Die Projektion auf die Geschwindigkeitsachse ist in der zuvor beschriebenen 4 gezeigt. Die Projektion auf die Intensitätsachse ist in der 16 dargestellt.
Bezugszeichenliste

10: zylindrischer Kanal
12: Mittellinie
14: Strömungsrichtung
16: Höhenlinie
18: Höhenlinie
20: Geschwindigkeitsverteilungskurve
21: Geschwindigkeitsverteilungskurve
22: Geschwindigkeitsverteilungskurve
23: Geschwindigkeitsverteilungskurve
24: Geschwindigkeitsverteilungskurve
25: Geschwindigkeitsverteilungskurve
30: Messkanal
32: Mittellinie
34: Strömungsrichtung
36: Strömungsprofil des Fluids
37: erste Partikelpopulation
38: zweite Partikelpopulation
60: Messkanal
62: Mikrofluidik-Chip
64: Zugang, Einlass
66: Ausgang, Auslass
68: Anschluss
70: Anschluss
71: Kanalkreuzung
72: Eintrittsfenster
74: Laserstrahl
76: Anregungszone
78: Anlaufstrecke
80: Messstrecke
82: Detektor
84: Maske
86: Lichtemission bzw. -streuung
88: Lichtemission bzw. -streuung
b: Breite des Messkanals
h: Höhe des Messkanals
L: Länge der Anlaufstrecke
r: Radius bzw. halbe Höhe des Kanals
v: Strömungsgeschwindigkeit bzw. -richtung
v: mittlere Strömungsgeschwindigkeit des Fluids
v_max: maximale Strömungsgeschwindigkeit des Fluids
v₁: Partikelgeschwindigkeit der ersten Teilchenpopulation
v₂: Partikelgeschwindigkeit der zweiten Teilchenpopulation

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 2008/0181827 A1 [0007]
US 2008/0183418 A1 [0007]
US 7763856 B2 [0007]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

G. Segré und A. Silberberg, „Radial particle displacement in poiseuille flow of suspensions”, Nature, Vol. 189, 21. Januar 1961 [0060]
Bhagat, Kuntaegowdanahalli, Papautsky, „Inertial microfluidics for continuous particle filtration and extraction”, Microfluid Nanofluid, Vol. 7, 217–226, 2009 [0064]

Claims

Verfahren zum Nachweisen von in einem strömenden Fluid befindlichen ungelösten Teilchen, welches Fluid die Dichte ρ und die Viskosität μ aufweist, bei dem – das Fluid mit den Teilchen durch einen Messkanal (60) gefördert wird, – wobei das Fluid mit den Teilchen eine Anregungszone (76) durchströmt, in der es von einer Strahlungsquelle erfasst wird, – wobei das Fluid mit den Teilchen eine Messstrecke (80) durchströmt, in der von den Teilchen in Folge der Anregung ausgehende Emission und/oder von den Teilchen ausgehendes Streulicht von einem Detektor (82) aufgenommen wird, – wobei eine im Bereich der Messstrecke (80) zwischen dem Messkanal (60) und dem Detektor (82) angeordnete Maske (84) die Emission bzw. das Streulicht moduliert, und – wobei das modulierte Signal mittels einer Korrelationsanalyse ausgewertet wird, um die Teilchen nachzuweisen, dadurch gekennzeichnet, dass das Fluid durch den Messkanal (60) mit einer mittleren Strömungsgeschwindigkeit v gefördert wird, bei der die Kanal-Reynoldszahl
Werte zwischen 0,1 und 500 annimmt, wobei d_hyd den hydraulischen Durchmesser des Messkanals (60) bezeichnet, wobei die Teilchen eine Geschwindigkeitsverteilung annehmen, deren Halbwertsbreite weniger als 4% der mittleren Teilchengeschwindigkeit beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen einen maximalen Partikeldurchmesser a_p aufweisen und dass das Fluid mit den Teilchen im Messkanal (60) in Strömungsrichtung vor der Messstrecke (80) eine Anlaufstrecke (78) mit einer Länge L von wenigstens
durchströmt, wobei R_K,a die Kanal-Reynoldszahl in der Anlaufstrecke (78) bezeichnet und wobei der Messkanal (60) wenigstens im Bereich der Anlaufstrecke (78) eine im Wesentlichen konstante Höhe h aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Messkanal (60) wenigstens im Bereich der Messstrecke einen im Wesentlichen konstanten Querschnitt mit einer Breite w und einer Höhe h aufweist und dass der Messkanal (60) ein Aspektverhältnis ∊ = h / w ≤ 0,1 aufweist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen einen maximalen Partikeldurchmesser a_p aufweisen und dass der Messkanal (60) wenigstens im Bereich der Messstrecke (80) eine im Wesentlichen konstante Höhe h aufweist, wobei das Verhältnis
ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Höhe h des Messkanals (60) wenigstens im Bereich der Messstrecke (80) das 200-fache, bevorzugt 50-fache, des maximalen Partikeldurchmesser a_p nicht überschreitet.
Vorrichtung zum Nachweisen von in einem strömenden Fluid befindlichen ungelösten Teilchen, welches Fluid die Dichte ρ und die Viskosität μ aufweist, mit einem Messkanal (60), durch den das Fluid mit den Teilchen förderbar ist und der eine Messstrecke (80) umfasst, einer Pumpeinrichtung zum Fördern des Fluids mit den Teilchen, einer Strahlungsquelle für elektromagnetische Strahlung, die auf eine Anregungszone (76) im Messkanal (60) ausgerichtet ist, einem auf die Messstrecke (80) ausgerichteten Detektor (82), der eingerichtet ist, von den Teilchen in Folge der elektromagnetischen Einstrahlung ausgehende Emission und/oder von den Teilchen ausgehendes Streulicht zu detektieren, einer im Bereich der Messstrecke (80) zwischen dem Messkanal (60) und dem Detektor (82) angeordneten Maske (84) zur räumlichen Modulation der Emission und/oder des Streulichtes und einer Auswerteeinrichtung mit Mitteln zur Korrelationsanalyse zum Nachweisen der Teilchen anhand des modulierten Signals, gekennzeichnet durch eine der Pumpeinrichtung zugeordnete Steuereinrichtung, die eingerichtet ist, eine Strömungsgeschwindigkeit v für das Fluid durch den gesamten Messkanal (30, 40, 60) einzustellen, bei der die Kanal-Reynoldszahl
Werte zwischen 0,1 und 500 annimmt, wobei d_hyd den hydraulischen Durchmesser des Messkanals (30, 40, 60) bezeichnet, wobei die Teilchen eine Geschwindigkeitsverteilung annehmen, deren Halbwertsbreite weniger als 4% der mittleren Teilchengeschwindigkeit beträgt.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Messkanal (60) in Strömungsrichtung vor der Messstrecke (80) eine Anlaufstrecke (78) mit einer Länge L von wenigstens
aufweist, wobei R_K,a die Kanal-Reynoldszahl in der Anlaufstrecke (78) bezeichnet und wobei der Messkanal (60) wenigstens im Bereich der Anlaufstrecke (78) eine im Wesentlichen konstante Höhe h aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Messkanal (60) wenigstens im Bereich der Messstrecke (80) einen im Wesentlichen konstanten Querschnitt mit einer Breite w und einer Höhe h aufweist und dass der Messkanal (60) ein Aspektverhältnis ∊ = h / w ≤ 0,1 aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor (82) eingerichtet ist, die Intensität der von den Teilchen ausgehende Emission und/oder des von den Teilchen ausgehendes Streulichtes quantitativ zu detektieren und dass die Analyseeinrichtung eingerichtet ist, die Intensität zur Differenzierung, zur Klassifizierung oder zur Bestimmung der Teilchen auszugeben.