-
Die
Erfindung bezieht sich auf ein Mikro- und Nanofluidsystem zur dynamischen
Strukturanalyse von linearen Makromolekülen mit energetisch bevorzugter
Faltstruktur in einem mit einem elektrischen Feld und/oder einem
Förderdruck
beaufschlagten Fluidkanal mit zumindest einer entropischen Barriere zur
Entfaltung der durchströmenden
Makromoleküle und
einem Bestrahlungskanal für
elektromagnetische Strahlung.
-
Mikro-
und nanofluidische Systeme sind, in Analogie zu mikroelektronischen
Systemen, auf Glas- oder Kunststoffträgern oder hochintegriert auch auf
mit den Techniken der Mikroelektronik hergestellten Silizium-Chips
angeordnete Systeme aus feinsten Kanälen, Kavernen, Zu- und Abflüssen und
gegebenenfalls mit Mikroaktoren wie Pumpen, Ventilen und so weiter
ausgestattet. In der Literatur werden Systeme mit Strukturen von
wenigen Mikrometern bis tief in den Nanometerbereich hinab beschrieben. Solche
Systeme, auch mit integrierter Sensorik, wie z. B. miniaturisierte
Analysensysteme, spektroskopische Durchflussmesszellen oder miniaturisierte
Bioreaktoren, werden für
viele neuartige Anwendungen und Messungen in der modernen Biologie,
der Biotechnologie, der Chemie und Biochemie, der pharmazeutischen
Industrie, der analytischen und klinischen Chemie, der Umweltanalytik,
der Prozesskontrolle, der Lebensmittelchemie und überwachung
eingesetzt. Ihre Bedeutung wird mit ihrer Verfügbarkeit erheblich zunehmen,
da sie bei extrem verringertem Probeneinsatz und Prozessenergie
eine um mehrere Größenordnungen
niedrigere Prozesszeit benötigen um
zu einem verwertbaren Ergebnis zu gelangen. Dadurch und durch die
erheblich niedrigeren Geräteaufwendungen
werden nicht nur die Kosten solcher Analysevorgänge, sondern auch Entwicklungs-
und Reihenuntersuchungszeiten für
große
Probenzahlen entscheidend gesenkt. Im Zusammenhang mit mikro- und
nanofluidischen Systemen wird der Begriff Laborchip, oder englisch
Lab-on-a-Chip, genannt, der den Grad der Integration auf einem gemeinsamen Träger verdeutlichen
soll.
-
Insbesondere
in der Analytik von linearen Makromolekülen wie beispielsweise DNA,
RNA, Proteine, Nukleinsäuren,
Peptide, Aminosäureketten, synthetische
Moleküle,
Hormone, Vitamine, Kohlenhydrate, Fette, Fettsäuren usw. oder bei der dynamischen
in vitro Protein-Synthese, der Gewinnung hochreiner Proben der genannten
Stoffe, der Gen- oder Proteinsequenzierung usw. werden nanoskalige fluidische
Systeme eine stark zunehmende Rolle spielen. Dabei kommt es darauf
an, die vielfach gefalteten linearen Makromoleküle zu einer geradlinigen Monomerkette
zu entfalten und diese dann abschnittsweise zu detektieren. Unter
dem Begriff der Faltung sollen in dem hier dargestellten Zusammenhang
auch alle Formen von Verknäuelungen
und helixartige Verwindungen verstanden werden. Zur Siebung und
Entfaltung werden unterschiedliche Konstruktionen verwendet, die
als entropische Barrieren bekannt sind. Im Normalfall werden natürliche Anordnungen,
die Makromoleküle
bei der Synthese an der Faltung hindern, als entropische Barrieren
oder sterische Hinderungen bezeichnet. Im Umkehrfall kann das gefaltete
Makromolekül
durch Aufwand an Beförderungsenergie
an der entropischen Barriere zur Entfaltung veranlasst werden. Entfaltete
Makromoleküle
können
anschließend
in nanoskaligen Strukturen separiert und detektiert werden. Zur
Analyse werden häufig
Durchstrahlungen mit Licht definierter Wellenlänge und optische Detektoren
zur Aufnahme des Lichts der Transmissionsantwort oder nach Markierung
entsprechender Bereiche auf dem Makromolekül auch Fluoreszenzdetektionsmethoden
eingesetzt. Unter Licht zur Detektion ist dabei nicht zwangsläufig sichtbares
oder diesem eng benachbartes Licht zu verstehen, sondern prinzipiell
jede elektromagnetische Strahlung , die sich durch spezifische,
in der Fachliteratur immer Optik genannte Einrichtungen fokussieren
und richten lässt.
-
STAND DER TECHNIK
-
In
der
US 6,635,163 B1 wird
eine nanofluidische Anordnung zum Filtern (Sieben, Sortieren) von Makromolekülen unterschiedlicher
Größe vorgestellt und
als entropische Falle bezeichnet. Im Verlauf eines ausgedehnten
Nanokanals werden Erweiterungs- und Verengungsbereiche vorgesehen.
In den Erweiterungsbereichen können
die Makromoleküle entspannen
und ihre energetisch favorisierte Zustandsform annehmen. Dabei beschreibt
der Gyrationsradius die Ausdehnung der annähernd spherischen Faltungform
eines Makromoleküls
im energetischen Gleichgewicht und ist damit auch ein indirektes
Maß für seine
Länge im
entfalteten Zustand. Zum Durchtritt durch die Verengungsbereiche
muss eine der Größe des Gyrationsradius
angepasste Energie zur Entfaltung oder zumindest zur deutlichen
Abflachung des Makromoleküls
in Form eines Förderdrucks
im fluidischen System und/oder eines elektrischen Feldes aufgebracht
werden. Wird nun der Förderdruck
zunächst
so hoch gewählt,
dass alle bis auf die größten Makromoleküle den ersten
Erweiterungsbereich verlassen können
und anschließend
im zeitlichen Ablauf der Wanderungsgeschwindigkeit der Makromoleküle angepasst
ständig
verringert, werden sich die Makromoleküle entsprechend ihrer Gyrationsradien
in den verschiedenen Erweiterungsbereichen getrennt sammeln und
auf diese Weise sortiert.
-
In
der
US 6,753,200 B2 werden
monolithisch integrierte nanofluidische Siebstrukturen zur DNA-Manipulation
vorgestellt. Darin wird insbesondere in den
7 und
12C eine Anordnung von Nanosäulen als
entropische Barriere gezeigt und deren Verwendung zur Entfaltung
von Makromolekülen (
7).
Auch hier muss ein entsprechender Förderdruck aufgebracht werden,
allerdings kommt eine einfache Abflachung der Makromoleküle aufgrund der
durch die Säulen
bedingten Durchtrittsquerschnitte nicht in Frage, sondern es muss
eine weitgehende bis vollständige
Entfaltung stattfinden.
-
In
der
US 2004/0197843
A1 wird ein Array aus Nanokanälen beschrieben, das in einem
integrierten System (vergleiche
5) entfaltete
Makromoleküle
zur Strukturanalyse aufnehmen kann. Die Kanäle können einen Querschnitt zwischen
einem und hundert Quadratnanometern und Längen bis zu 10 cm aufweisen.
In Kanälen
dieser Länge
soll ein komplettes gestrecktes Chromosom des menschlichen Genoms
mit ca. 250 Millionen Basenpaaren aufgenommen werden können. Die
zu entfaltenden Makromoleküle
werden in einem vor den Nanokanälen
angeordneten Reservoir vorgehalten und z. B. mittels elektrischer
Felder in die Nanokanäle
transportiert. Eine die Entfaltung begünstigende und der Verstopfung
der Nanokanäle
vorbeugende entropische Barriere ist nach der Beschreibung nicht
vorgesehen.
-
Der
nächstliegende
Stand der Technik, von dem die Erfindung ausgeht, wird in der
US 2004/0033515 A1 beschrieben.
Darin wird ein integriertes System von mikro- und nanofluidischen Komponenten
zur direkten Strukturanalyse und Manipulation von Makromolekülen mit
hohem Durchsatz beschrieben. Eine graduell enger werdende, als Schnittstelle
(Interface) bezeichnete Zone verbindet einen mikrofluidischen Bereich
aus einer entropischen Barriere mit einem nanofluidischen Bereich aus
Nanokanälen.
Diese Schnittstelle kann als Rampe oder Abhang von der größeren zur
kleineren Struktur ausgebildet sein, oder eine ebene Anordnung konstanten
Gesamtquerschnitts von immer weiter verzweigenden Mikro- bis Nanokanälen oder von
immer enger stehenden Säulen
unter Bildung von Mikro- bis Nanodurchlässen aufweisen. Die zu analysierenden
Makromoleküle
werden in einem nicht näher
beschriebenen Transportfluid mit Hilfe nicht beschriebener Kräfte durch
das System befördert.
Die Strukturanalyse kann mit Hilfe von Licht, durch eine Strom-
oder Widerstandsmessung oder durch Messung der Änderung von Ladungszuständen erfolgen.
Im Weiteren wird die Detektion mit Hilfe eines fokussierten Laserstrahls
beschrieben. Nach der Beschreibung in der Druckschrift wird das
zu analysierende Makromolekül
durch die entropische Barriere geführt, in der es sich zunehmend
entfaltet, bis es schließlich
vollständig
gestreckt in den seinem Durchmesser angepassten Nanokanal eintritt
und dort in voller Länge
Platz findet. Anschließend
wird es mit dem Laserstrahl beleuchtet und das von ihm aufgrund
seiner Struktur veränderte
Licht in einem Detektor, hier eine mit einem CCD-Chip ausgestattete Kamera,
verarbeitet. Entfaltung und Detektion finden also an zwei benachbarten
Orten, der entropischen Barriere und den Nanokanälen statt. Darüber ist
es fraglich, dass das beschriebene Detektionssystem mit fokussiertem
Laserstrahl und CCD-Kamera oder alternativ anderen Aufnahmeeinrichtung
die in der Druckschrift erwähnte
potentielle Möglichkeit
der aufgrund der vollständigen
Streckung des Makromoleküls
erreichbar erscheinende Auflösung
einzelner Basenpaare leisten kann.
-
Aus
der
DE 101 16 500
A1 sind photonische Kristalle bekannt, die als dreidimensionale
dielektrische Strukturen beschrieben werden, die für elektromagnetische
Strahlung in einem bestimmten Wellenlängenbereich unabhängig von
der Einfallsrichtung undurchlässig
sind. Der entsprechende Wellenlängenbereich
wird dabei wesentlich durch die Anordnung, Form und Größenverhältnisse
der Struktur bestimmt. Eine wichtige Form photonischer Kristalle wird
durch eine regelmäßige matrixartige
Anordnung von Mikrosäulen
oder -zylindern gebildet. Durch die hier beschriebenen Eigenschaften
eignen sich photonische Kristalle zur Herstellung optischer Bauelemente
wie schmalbandigen Filtern, modulierbaren Filtern, Add-Drop-Filtern
oder integriert optischen Strukturen mit 90°-Umlenkung, z. B. für die optische Daten übertragung
in Lichtwellenleitern mit verschiedenen Lichtwellenlängen in
DWMD-Technik (Dense Wavelength Division Multiplexing). In dieser
Druckschrift wird eine Anwendung photonischer Kristalle als Hauptbestandteil
optischer Detektoren unter Ausnutzung der Änderung ihrer Transmissionseigenschaften
beim Durchtritt eines Analyten nicht beschrieben.
-
Die
EP 1 729 111 A1 beschreibt
ein System zur Analyse, insbesondere Dichtebestimmung, für einen
nicht näher
beschriebenen Analyten (Ziel-Substanz)
mit einer Quelle elektromagnetischer Strahlung, einem photonischen
Kristall als Sensorelement und einem Detektor, wobei Quelle und
Detektor über Wellenleiterstrukturen
mit dem photonischen Kristall verbunden sind. Dieser weist eine
zweidimensionale Anordnung von kreisförmigen Öffnungen (Poren) mit einem
Durchmesser von 240 nm bei einer Maschenweite von 420 nm und porenfreie
Zonen, so genannte Resonatorstrecken, auf. Der Analyt wird durch
die kreisförmigen Öffnungen
senkrecht zur Ebene des zweidimensionalen photonischen Kristalls
geleitet und ändert
dabei dessen Transmissionseigenschaften für die elektromagnetische Strahlung.
Die Beaufschlagung damit und die Abnahme der transmittierten Strahlung
erfolgt in der Ebene des photonischen Kristalls. Eine Entfaltung
und Analyse linearer Makromoleküle
ist mit dieser Anordnung nicht möglich.
-
Ein
weiterer photonischer Kristall wird in der
WO 2004/001465 A1 vorgeschlagen.
In Form eines lang gestreckten photonischen Wellenleiterabschnitts
mit kreisförmigem
Gesamtquerschnitt dient er zur Untersuchung wasserbasierter Analyten.
Dabei ist um einen zentralen Kanal eine Anzahl ebenfalls über die
gesamte Länge
des photonischen Wellenleiterabschnitts ausgedehnter Mikrokanäle angeordnet.
Deren Anordnung, Durchmesser und Querschnittsform kann zur Parametrierung
der Eigenschaften beliebig gewählt
sein. Die Mikrokanäle
sind luftgefüllt
oder evakuiert, der Analyt fließt
durch den zentralen Kanal. Zur Analyse wird der zentrale Kanal eines
entsprechend gewählten
gestreckten photonischen Wellenleiterabschnitts durchströmt und ebenfalls
der Länge
nach von einem Ende her mit einer elektromagnetischen Strahlung
beaufschlagt. Das Transmissionsergebnis wird am anderen Ende abgegriffen
und einem Detektor zugeleitet. Das durch vielfältige Reflexionen in den Mikrokanälen geprägte Transmissionsverhalten
des photonischen Wellenleiterabschnitts für die elektromagnetische Strahlung wird
durch den Analyten verändert
und erlaubt damit Rückschlüsse auf
dessen Struktur. Eine Entfaltung und Analyse linearer Makromoleküle ist mit
dieser Anordnung ebenfalls nicht möglich.
-
Weiterhin
zeigt die Veröffentlichung
von Chang, E. Y: u. a.: „DNA
Mapping Using Microfluidic Stretching an Single-Molecule Detection
of Fluorescent Site-Specific
Tags" (Genome Res.
(2004) 14 (6) 1137–1146)
in
1A, beschrieben in der Legende zu
1,
Seite 1139, das Entfalten von DNA-Molekülen in einem Nanosäulenfeld,
des jedoch kein Teil eines photonischen Kristalls ist, im Elongationsfluss (Direct
Linear Analysis, DLA). Die gefaltete DNA gelangt erst nach Verlassen
des Nanosäulenfeldes
in den Bestrahlungsbereich. Der Fluidkanal und die Bestrahlungsrichtung
sind quer zueinander angeordnet. Die
US 2006/0233481 A1 beschreibt
eine Vorrichtung, die eine konstruktive Vereinigung einer fluidischen
Struktur mit einem photonischen Kristall darstellt, gezeigt in
1.
Fluid wird hierbei durch Kanäle
114,
118 des
photonischen Kristalls geleitet, und Strahlung IN wird quer zur
Flussrichtung des Fluids eingestrahlt. Die
US 2007/0127019 A1 zeigt
in
3 Platten
32 eines photonischen Kristalls
30,
die mit Fluid durchströmt
werden. Die Bestrahlungsebene liegt gleichfalls quer zur Ebene der
Kristalle. Schließlich
zeigt die Veröffentlichung
von Psaltis, D. u. a.: „Developing
optofluidic technology through the fusion of microfluids and optics" (Nature („006) 442
(7101) 381-6) in
2, Seite 382 ein biologisches
Objekt in gestrecktem Zustand, das in einem optofluidischen Mikroskop
(OFM) betrachtet wird. Die Flussrichtung ist auch hier quer zur
Bestrahlungsrichtung. Keine der genannten optofluidischen Vorrichtungen
legt jedoch eine konstruktive Vereinigung mit einem Nanosäulenfeld
zur Entfaltung von DNA nahe.
-
AUFGABENSTELLUNG
-
Die
Aufgabe für
die vorliegende Erfindung ist daher darin zu sehen, ausgehend vom
gattungsbildenden nächstgelegenen
Stand der Technik, ein Mikro- und
Nanofluidsystem zu beschreiben, bei dem unter weiterer Integration
die Elemente zur Entfaltung der Makromoleküle und der Strukturanalyse
in einem gemeinsamen Element zusammengefasst sind und die Auflösung bis
zum Einzelbaustein der linearen Makromoleküle, z. B. einem einzelnen Basenpaar, gesteigert
werden kann.
-
Die
erfindungsgemäße Lösung für diese
Aufgabe ist dem Hauptanspruch zu entnehmen, vorteilhafte Weiterbildungen
der Erfindung werden in den Unteransprüchen aufgezeigt und im Folgenden
im Zusammenhang mit der Erfindung näher erläutert.
-
Durch
Strukturanordnungen im Mikro- und Nanometerbereich fluidischer Systeme
und unter Aufbringung der notwendigen Transportenergie ist es entsprechend
dem beschriebenen Stand der Technik möglich, lineare Makromoleküle wie DNA,
RNA, Proteine, Nukleinsäuren,
Peptide, Aminosäureketten, synthetische
Moleküle,
Hormone, Vitamine, Kohlenhydrate, Fette, Fettsäuren usw. aus ihrer energetisch favorisierten
Zustandsform der charakteristischen Faltung in einen weitgehend
geradlinigen entfalteten Zustand zu versetzen. Eine dazu geeignete
Anordnung stellt die entropische Barriere in Form einer periodischen
Gitterstruktur dar. Während
des Durchtritts durch die entropische Barriere werden die linearen
Makromoleküle
zur Analyse der chemische Zusammensetzung und anderer Eigenschaften
mit elektromagnetischer Strahlung bestrahlt. Die Öffnungen
in der periodischen Gitterstruktur sind so dimensioniert, dass sowohl
deren Funktion als entropische Barriere zur Entfaltung der linearen
Makromoleküle als
auch die zur Detektion durch Bestrahlung notwendigen optischen Eigenschaften
gewährleistet
sind. In dem erfinderischen Mikro- und Nanofluidsystem handelt es
sich bei der entropischen Barriere mit der periodischen Gitterstruktur
um einen photonischen Kristall mit Transmissionseigenschaften für elektromagnetische
Strahlung, wobei die geometrischen Parameter der periodischen Gitterstruktur
des photonischen Kristalls an die Vereinzelung und Entfaltung der
durchströmenden
linearen Makromoleküle
und den Spektralbereich der elektromagnetischen Strahlung gebunden
sind. Der Begriff des photonischen Kristalls beschreibt eine räumlich periodische
Anordnung von Mikro- bzw. Nanostrukturen. Durch die Wahl der Anordnung
und der Strukturgeometrie werden bestimmbare Transmissionseigenschaften
für elektromagnetische
Strahlung realisiert. In der Natur werden photonische Kristalle
z. B. in Form von regelmäßigen Anordnungen
von Mikro- bzw. Nanoöffnungen
in den Schalen von Kieselalgen zur optimalen Ausnutzung des Lichts
für die
im Inneren befindlichen Chloroplasten eingesetzt.
-
Bei
der Erfindung handelt es sich um ein Mikro- und Nanofluidsystem
mit einer konstruktiven Vereinigung der entropischen Barriere und
des Bestrahlungskanals in einem photonischen Kristall mit räumlich periodischer
Gitterstruktur und ohne oder mit gezielt angeordneten Gitterdefekten
und einer Queranordnung des Fluidkanals zum Bestrahlungskanal, wobei
die periodische Gitterstruktur des photonischen Kristalls Gitteröffnungen
aufweist, deren Ausdehnung an die Vereinzelung und Entfaltung der durchströmenden linearen
Makromoleküle
und den Spektralbereich der elektromagnetischen Strahlung gebunden
ist. In der Richtung des Fluidkanals wirkt die periodische Gitterstruktur
des photonischen Kristalls wie eine entropische Barriere, die bei
Aufbringung der Entfaltungenergie durch das angelegte elektrische
Feld und/oder den Förderdruck
für die Entfaltung
der linearen Makromoleküle
sorgt. Quer zu dem Fluidkanal bildet der photonische Kristall den Bestrahlungskanal
zur Bestrahlung der entfalteten linearen Makromoleküle. Durch
das Hindurchtreten des linearen Moleküls werden Änderungen im Transmissionsverhalten
des photonischen Kristalls bewirkt, die mit Hilfe der spektralen
Analyse der transmittierten elektromagnetischen Strahlung erfasst werden
und somit Rückschlüsse auf
die Struktureigenschaften des zu analysierenden Moleküls ermöglichen.
-
Eine
vorteilhafte Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems nach
der Erfindung ist gekennzeichnet durch eine Ausdehnung der Gitteröffnungen
der periodischen Gitterstruktur des photonischen Kristalls zwischen
5 nm und 1000 nm. Die Durchmesser entfalteter linearer Makromoleküle können je
nach Art variieren. Die Bausteine können jeweils aus einzelnen
bis mehreren Molekülen
unterschiedlicher Zusammensetzung bestehen und der größte Durchmesser
kann dabei gegebenenfalls nur wenige Nanometer betragen. Die Eigenschaften
des photonischen Kristalls hinsichtlich Transmission und Konzentrierung
der elektromagnetischen Strahlung auf Objekte mit Größenordnungen
unterhalb der eingesetzten Wellenlänge werden unter Anderem durch die
Abmessungen der periodischen Gitterstruktur bestimmt. Diese und
damit auch die Ausdehnung der Gitteröffnungen kann bei der Herstellung
an die vorgesehene Aufgabe angepasst werden.
-
Eine
vorteilhafte Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems nach
der Erfindung ist gekennzeichnet durch eine Ausbildung der periodischen
Gitterstruktur des photonischen Kristalls als Nanosäulenfeld.
Im Stand der Technik wird ein Mikrosäulenfeld beschrieben, das Nanokanälen vorgelagert
ist, die wiederum zur Aufnahme der entfalteten linearen Makromoleküle dienen.
Auf diese zweiteilige Anordnung kann verzichtet werden, da das lineare Makromolekül nicht
erst in seiner Gesamtheit entfaltet vorliegen muss, um es zu analysieren.
Es kann ebenso in einem von vornherein als Nanosäulenfeld ausgelegten photonischen
Kristall als entropische Barriere zumindest abschnittsweise entfaltet
und gleichzeitig analysiert werden.
-
Eine
besonders vorteilhafte Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems
nach der Erfindung ist gekennzeichnet durch eine Ausbildung des
photonischen Kristalls mit einer sich ändernden periodischen Gitterstruktur
entlang der Richtung des Fluikanals oder des Bestrahlungskanals
oder einer Kombination davon. Durch eine derartige Anordnung wird
z. B. eine schrittweise Entfaltung des linearen Makromoleküls erreicht,
die einer Verstopfung des Eintrittsbereichs vorbeugt, oder es kann
nach der Entfaltung durch eine Vergrößerung der Abstände der
Nanosäulen
ein zur Analyse günstigerer
Spektralbereich angesprochen werden.
-
Eine
andere vorteilhafte Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems
nach der Erfindung ist gekennzeichnet durch eine Blende vor dem
Eingang des photonischen Kristalls. Durch eine solche Maßnahme kann
verhindert werden, dass mehrere lineare Makromoleküle gleichzeitig
oder zumindest überlappend
nebeneinander in den photonischen Kristall eintreten. Eine Detektion
des molekularen Aufbaus durch die Bestrahlung und Auswertung des
Transmissionsergebnisses kann durch die gleichzeitige Anwesenheit
mehrerer linearer Makromoleküle
zumindest erschwert werden.
-
Eine
weitere vorteilhafte Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems
nach der Erfindung ist gekennzeichnet durch Wellenleiter zur Zuleitung
der elektromagnetischen Strahlung an den Bestrahlungskanal des photonischen
Kristalls und zur Ableitung der transmittierten elektromagnetischen
Strahlung von dem Bestrahlungskanal des photonischen Kristalls.
Die Einkopplung der elektromagnetischen Strahlung und die Auskopplung
der transmittierten Strahlung durch Wellenleiter bietet den Vorteil
der räumlichen
Unabhängigkeit
der Anordnung von Komponenten zur Strahlungserzeugung und Detektion.
-
Darüber hinaus
ist eine Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems nach der
Erfindung gekennzeichnet durch eine Auflösung des Querschnitts der in
den Bestrahlungskanal des photonischen Kristalls einfallenden elektromagnetischen
Strahlung im Bereich einzelner oder weniger Einzelkomponenten des
linearen Makromoleküls.
Die physikalischen Eigenschaften eines photonischen Kristalls erlauben es,
elektromagnetische Strahlung auf Dimensionen unterhalb von deren
Wellenlänge
zu führen,
zu leiten oder zu konzentrieren. Erreicht wird dies durch die Einbindung
von Defekten in die periodische Struktur der photonischen Kristalle.
Als Defekt wird eine beliebige Störung der sonst regelmäßigen Kristallstruktur bezeichnet.
Defekte sind einzelne oder Kombinationen von zusamenhängenden
oder nicht zusamenhängenden,
hintereinander angeordneten Ketten von Strukturen oder einzelne
Strukturen, die sich von den restlichen, in der Gitterstruktur befindlichenden Strukturen
durch ihre Geometrie unterscheiden. Dies schließt auch einzelne oder Kombinationen
von zusamenhängenden
oder nicht zusamenhängenden hintereinander
angeordnete fehlende Strukturen im photonischen Kristall mit ein.
Durch den Einbau solcher Defekte in den photonischen Kristall kann
die elektromagnetische Strahlung gezielt geführt werden. Dadurch wird es
ermöglicht,
Abschnitte der linearen Makromoleküle bis hinab zu einzelnen Bausteinen
zu detektieren.
-
Schließlich ist
eine Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems nach der Erfindung
gekennzeichnet durch eine Steuerungseinrichtung für das elektrische
Feld zur Ausrichtung in horizontaler und vertikaler Richtung und
zur Intensitätsänderung.
Bei einem räumlich
so ausgedehnten photonischen Kristall, dass mehrere lineare Makromoleküle sich
unabhängig
voneinander darin bewegen können,
kann ein in allen Richtungen und bezüglich seiner Intensität steuerbares
elektrisches Feld dafür
sorgen, dass sich nicht mehrere lineare Makromoleküle auf der Projektionsfläche für die elektromagnetische
Strahlung überdecken.
-
Eine
andere vorteilhafte Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems
nach der Erfindung ist gekennzeichnet durch eine Mikrobioreaktoreinheit zumindest
aus je einem photonischen Kristall vor und hinter einem Reaktionsraum,
in dem Komponenten zur Nutzung der analysierten linearen Makromoleküle am Ausgang
des vorgelagerten photonischen Kristalls vorgesehen sind. Eine solche
Mikrobioreaktoreinheit kann in das Mikro- und Nanofluidsystem eingespeiste
lineare Makromoleküle
dynamisch, d. h. unmittelbar im Durchfluss im ersten photonischen Kristall
entfalten und bausteingenau analysieren, im Reaktionsraum durch
dort anwesende Reaktionsstoffe bearbeiten und die Bearbeitungserzeugnisse in
dem zweiten photonischen Kristall ebenfalls bausteingenau detektieren.
Damit wird eine besonders schnelle Beprobung und Bearbeitung bei
extrem geringen Probenmengen möglich.
-
Eine
weitere vorteilhafte Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems
nach der Erfindung ist gekennzeichnet durch einen modularen Aufbau
der Mikrobioreaktoreinheit. Durch die getrennte Betrachtung einzelner
Bauelemente des Mikro- und Nanofluidsystem wie photonischer Kristall
mit entropischer Barriere und Reaktionsraum, ist ein modularer Aufbau
mit paralleler und/oder serieller Anordnung solcher Bauelemente
möglich.
-
Eine
besonders vorteilhafte Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems
nach der Erfindung ist gekennzeichnet durch eine Integration der
Mikrobioreaktoreinheit in einem Schichtaufbau auf einem gemeinsamen
Substrat. Dadurch wird eine rationelle Fertigung wie bei den bekannten
Herstellungsverfahren der Mikroelektronik ermöglicht.
-
Eine
weitere vorteilhafte Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems
nach der Erfindung ist gekennzeichnet durch eine Anordnung von Mikro- bzw.
Nanobehältern
hinter dem ersten und/oder dem zweiten photonischen Kristall zum
Auffangen der analysierten linearen Makromoleküle. Nach der Analyse und gegebenenfalls
erfolgten Expression oder anderen Bearbeitungsschritten können die
separierten und entfalteten Makromoleküle in solchen Mikro- bzw.
-
Nanobehälter zur
weiteren Verwendung zwischengelagert und gegebenenfalls bei entsprechenden
Abmessungen der Mikro- bzw. Nanobehälter an der Wiederfaltung gehindert
werden.
-
Weitere
vorteilhafte Weiterbildungen des Mikro- und Nanofluidsystems nach
der Erfindung sind gekennzeichnet durch Vereinzelungs- und/oder Schneid- und/oder Sieb- bzw.
Filter- und/oder weitere Bearbeitungsmittel vor und/oder in und/oder
hinter dem ersten und/oder zweiten photonischen Kristall bzw. durch
eine Reihenanordnung von mehreren Mikrobioreaktoren. Durch entsprechende
Gestaltung der entropischen Barrieren können Selektionen linearer Makromoleküle voneinander
oder von Fremdstoffen durch Sieb- oder Filterfunktionen, aber auch Separationen
von Teilen linearer Makromoleküle durch
zielgenaues Schneiden, z. B. mittels kurzzeitig erhöhter Energie
der zur Detektion verwendeten elektromagnetischen Strahlung durchgeführt werden.
Durch modulare Anordnung solcher Funktionsbaugruppen zu Gesamtsystemen
und Integration auf einem gemeinsamen Substrat können ganze Prozessabläufe zu einem
Laborchip („Lab-on-a-chip") komprimiert werden.
-
Eine
weitere vorteilhafte Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems
nach der Erfindung ist gekennzeichnet durch eine Nährstofflösung zur Strukturanalyse
als Transportfluid für
die zu analysierenden linearen Makromoleküle durch das Mikro- und Nanofluidsystem.
Als neutrales Transportfluid für lineare
Makromoleküle
kommt normalerweise eine einfache physiologische Kochsalzlösung in
Betracht. Bei Verwendung von Bausteinen zur Biosynthese müssen darüber hinaus
Nährstoffe
zur Verfügung
gestellt werden, die dem Stoffaufbau dienen können. Diese Nährstoffe
können
bereits in ausreichender Menge dem Transportfluid beigegeben werden.
-
Eine
andere vorteilhafte Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems
nach der Erfindung ist gekennzeichnet durch eine gesonderte Zufuhr
der Nährstofflösung in
den Reaktionsraum des Mikrobiorektors unabhängig von dem Transportfluid.
In diesem Fall können
Nährstoffe
gezielt auf den im Mikrobioreaktor ablaufenden Stoffaufbauprozess
abgestimmt und in einem gesteuerten zeitlichen Ablauf zugefügt werden.
-
Eine
weitere vorteilhafte Weiterbildung des Mikro- und Nanofluidsystems
nach der Erfindung ist gekennzeichnet durch eine gesonderte Abfuhr
von mit den weiteren Bearbeitungsmitteln separierten unerwünschten
Bestandteile aus der Nährstofflösung und/oder
dem Transportfluid. Nach einer Separation durch Sortierungs- oder
Filtervorgänge
können
die entropische Barriere oder andere Funktionsbausteine zusätzliche
Ausgänge
aufweisen, die der Abfuhr unerwünschter
Stoffe dienen können.
-
Die
zuvor beschriebenen einzelnen Weiterbildungen des Mikro- und Nanofluidsystems
nach der Erfindung sind als Beispiele zu verstehen. Andere Weiterbildungen
und beliebige Kombinationen aus allen sind nach Maßgabe der
jeweiligen Aufgabe ebenfalls bereitstellbar.
-
Eine
Anwendung des Mikro- und Nanofluidsystems nach der Erfindung ist
gekennzeichnet durch die Expression von auf den linearen Makromolekülen oder
Abschnitten davon vorhandenen genetischen Information als dynamische
in vitro Expression. Bei Einspeisung von linearen Makromolekülen als
DNA oder RNA oder einzelnen Genen oder Gensequenzen kann in dem
Reaktionsraum bei Anwesenheit von aktiven Ribosomen und einer entsprechenden
Nährstoffzufuhr
in Form eines Gemisches der notwendigen Reaktionsbestandteile wie
z. B. t-RNA mit Aminosäuren
eine dynamische Expression von Peptiden bzw. Proteinen erfolgen.
Mit entsprechend vorgeschalteten Sortierungs- und Filterschritten
kann eine gesteuerte Proteinsynthese im Durchflussverfahren stattfinden.
Da diese Abläufe
bei geringsten Probenmengen sehr schnell sind, besteht damit die
Möglichkeit,
eine Vielzahl solcher Ergebnisse in kürzester Zeit zu erhalten.
-
Eine
weitere Anwendung des Mikro- und Nanofluidsystems nach der Erfindung
ist gekennzeichnet durch die Gewinnung hochreiner Proben von linearen
Makromolekülen
oder deren Expressionsergebnissen oder jeweiligen Abschnitten davon.
Bei Untersuchungen der linearen Makromoleküle in den photonischen Kristallen
und anschließenden
Filterschritten können
die bestimmten linearen Makromoleküle oder deren Expressionsergebnisse
oder jeweils Teile davon nach Trennschritten direkt an entsprechenden Ausgängen abgezogen
oder in anderen Bauelementen des Mikro- und Nanofluidsystem in Mikro-
bzw. Nanobehältern
gespeichert werden.
-
Eine
andere Anwendung des Mikro- und Nanofluidsystems nach der Erfindung
ist gekennzeichnet durch Sequenzierung von Nukleinsäuren. Bei Einspeisung
von linearen Makromolekülen
als DNA oder RNA kann deren genetische Struktur im vorgelagerten
photonischen Kristall sequenziert und aufgeklärt werden. Die Konzentrierung
der zur Bestrahlung eingesetzten elektromagnetischen Strahlung auf
Spots unterhalb der verwendeten Wellenlänge und die entsprechend sensible
Auswertung der nach dem Eintritt des linearen Makromoleküls veränderten Transmissionseigenschaften
des photonischen Kristalls macht eine Sequenzierung der Makromoleküle beliebiger
Länge in
einem dynamischen Durchflussverfahren bei hoher Sequenziergeschwindigkeit möglich. Damit
werden bekannte Verfahren wie das Standardverfahren auf Basis der
Polymerasekettenreaktion (PCR) und andere Ansätze in der Prozessgeschwindigkeit
und dem apparativen und Kostenaufwand deutlich unterschritten.
-
Schließlich ist
eine Anwendung des Mikro- und Nanofluidsystems nach der Erfindung
gekennzeichnet durch Manipulation von linearen Makromolekülen (LM)
wie zu Markierungsreaktionen von deren Bestandteilen, zum enzymatischen
bzw. chemischen Schneiden und zur Durchführung von Designschritten.
Mit der Möglichkeit
der sehr schnellen dynamischen Sequenzierung bis hinab zu den chemischen
Grundstoffen der linearen Makromoleküle wie DNA, RNA, Proteine,
Nukleinsäuren,
Peptide, Aminosäureketten,
synthetische Moleküle,
Hormone, Vitamine, Kohlenhydrate, Fette, Fettsäuren usw. und den integrierten
Filter-, Schneide-, Expressions-, Lagerungs- und sonstigen Bearbeitungsschritten
wird ein schnelles und damit wirtschaftliches Design von linearen
Makromolekülen
möglich,
weil in kurzer Zeit eine Vielzahl von Versuchen mit schrittweise
veränderten
Ausgangsstoffen und/oder schrittweise veränderten Expressionsergebnissen
gemacht werden können.
So können
z. B. Zusammenhänge
zwischen Gensequenzen und kleinen bis kleinsten Veränderungen
daran und ihren daraus exprimierten Proteinen aufgeklärt werden.
Damit werden neue Anwendungsfelder zur schnellen Analytik und Manipulation linearer
Makromoleküle
eröffnet.
-
AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
-
Ausbildungsformen
des Mikro- und Nanofluidsystems zur dynamischen Strukturanalyse
von linearen Makromolekülen
nach der Erfindung werden nachfolgend anhand der schematischen Figuren
zum weiteren Verständnis
der Erfindung näher
erläutert. Dabei
zeigt:
-
1 ein
Mikro- und Nanofluidsystem mit einer Vereinigung einer entropischen
Barriere und einem Bestrahlungskanal in einem photonischen Kristall,
-
1A eine
perspektivische Ansicht des photonischen Kristalls gemäß 1,
-
2 ein
Mikro- und Nanofluidsystem mit einem Nanosäulenfeld als photonischen Kristall,
-
2A eine
perspektivische Ansicht des photonischen Kristalls gemäß 2,
-
3 ein
Mikro- und Nanofluidsystem mit einer Blende vor der räumlich periodischen
Gitterstruktur,
-
4 ein
Mikro- und Nanofluidsystem mit einer sich verengenden räumlich periodischen
Gitterstruktur,
-
5 ein
Mikro- und Nanofluidsystem mit Wellenleiteranschlüssen,
-
6 ein
Mikro- und Nanofluidsystem als Mikrobioreaktor,
-
7 ein
Mikro- und Nanofluidsystem als Mikrobioreaktor mit Mikro- bzw. Nanobehälter,
-
8 ein
Mikro- und Nanofluidsystem als Reihenschaltung mehrerer Mikrobioreaktoren
und
-
9 ein
Mikro- und Nanofluidsystem mit gesonderter Zufuhr von Nährlösung und
gesonderter Abfuhr von Reaktionsprodukten und nicht benötigten Bestandteilen.
-
Die 1 zeigt
ein Mikro- und Nanofluidsystem NS zur dynamischen Strukturanalyse
von linearen Makromolekülen
LM, deren energetisch favorisierte Zustände durch komplexe Faltstrukturen
KF, unter die auch Knäuel-
oder Helixstrukturen subsummieren, beschrieben werden, in einem
mit einem elektrischen Feld EF und/oder einem Förderdruck FD beaufschlagten
Fluidkanal FK mit einer konstruktiven Vereinigung einer entropischen
Barriere EB und einem Bestrahlungskanal BK in einem photonischen Kristall
PK, der eine räumlich
periodische Gitterstruktur PG, hier z. B. mit gezielt angeordneten
Gitterdefekten GD, mit Gitteröffnungen
GO zur vollständigen Entfaltung
der gefalteten linearen Makromoleküle LM mit einer detektierbaren
Beeinflussung der optischen Transmissionseigenschaften des photonischen
Kristalls PK aufweist, wobei die Bestrahlung der durchströmenden linearen
Makromoleküle
LM in dem Bestrahlungskanal BK des photonischen Kristalls PK in einer
Queranordnung QA zur Durchströmungsrichtung
DR im Fluidkanal FK erfolgt. Das charakteristisch gefaltete lineare
Makromolekül
LM tritt an einem Eingang EG in die entropische Barriere EB ein,
indem es durch das elektrische Feld EF und/oder den Förderdruck
FD zur Entfaltung an den Gitteröffnungen
GO der periodischen Gitterstruktur PG gezwungen wird. Es tritt an
einem Ausgang AG wieder aus der entropischen Barriere EB aus und
stellt unmittelbar anschließend
die durch den günstigsten
Energiezustand beschriebene charakteristische Faltung wieder her.
Die zur Detektion erforderliche elektromagnetische Strahlung ES
wird in den Bestrahlungskanal BK des photonischen Kristalls PK geleitet.
Durch die Anwesenheit des linearen Makromoleküls LM wird die transmittierte
elektromagnetische Strahlung TS veränderte. Die in den folgenden
Figuren fehlenden Bezugszeichen sind der 1 zu entnehmen. 1A zeigt
als einen Ausschnitt aus 1 in perspektivischer Darstellung
einen photonischen Kristall PK als Vereinigung der entropischen
Barriere EB im Fluidkanal FK mit dem Bestrahlungskanal BK. Der Fluidkanal
FK und der Bestrahlungskanal BK liegen dabei in einer Queranordnung
QA vor.
-
2 zeigt
ein Mikro- und Nanofluidsystem NS wie in 1, jedoch
mit einem Nanosäulenfeld NF
als Vereinigung der entropischen Barriere EB mit dem Bestrahlungskanal
BK in dem photonischen Kristall PK, hier ebenfalls mit beispielhaft
angeordneten Gitterdefekten GD. Im Gegensatz zu einer entropischen
Barriere EB mit beliebig geformten Hindernissen zur Entfaltung des
linaren Makromoleküls
LM hat das Nanosäulenfeld
NF den Vorteil, dass die abgerundeten Strukturen einer Verstopfung
durch Verhaken der Molekülbausteine
vorbeugt ohne die Entfaltungswirkung zu verschlechtern und besonders einfach
herstellbar ist. 2A zeigt als einen Ausschnitt
aus 2 in perspektivischer Darstellung einen photonischen
Kristall PK als Vereinigung der entropischen Barriere EB im Fluidkanal
FK mit dem Bestrahlungskanal BK in Form eines Nanosäulenfeldes NF.
Der Fluidkanal FK und der Bestrahlungskanal BK liegen dabei in einer
Queranordnung QA vor.
-
3 zeigt
ein Mikro- und Nanofluidsystem NS wie in 2, jedoch
mit einer Blende KB vor dem Eingang EG der räumlich periodischen Gitterstruktur PG,
hier als Nanosäulenfeld
NF dargestellt.
-
4 zeigt
ein Mikro- und Nanofluidsystem NS wie in 2, jedoch
mit einer sich kontinuierlich verengenden räumlich periodischen Gitterstruktur PG,
hier als Nanosäulenfeld
VN dargestellt, als Vereinigung der entropischen Barriere EB mit
dem Bestrahlungskanal BK in dem photonischen Kristall PK. Auch diese
Maßnahme
beugt weiter der Verstopfung am Eingang EG vor.
-
5 zeigt
ein Mikro- und Nanofluidsystem NS wie in 4, jedoch
mit Wellenleitern WL zur Leitung der elektromagnetischen Strahlung
ES in den photonischen Kristall PK einerseits und zur Leitung der
transmittierten elektromagnetischen Strahlung TS aus dem photonischen
Kristall PK andererseits. Mit den Wellenleitern WL können Einrichtungen
zur Erzeugung und Auswertung der elektromagnetischen Strahlung ES
von dem Mikro- und Nanofluidsystem NS räumlich entkoppelt werden.
-
6 zeigt
ein Mikro- und Nanofluidsystem NS als Mikrobioreaktor MB mit zwei
photonischen Kristallen PK1, PK2 und einem Reaktionsraum RR dazwischen.
Im ersten photonischen Kristall PK1 werden die linearen Makromoleküle LM, hier
z. B. Ribonukleinsäure
RNA, nach der Entfaltung in der sich kontinuierlich verengenden
räumlich
periodischen Gitterstruktur PG, hier als Nanosäulenfeld VN dargestellt, detektiert
und nach dem Eintritt in den Reaktionsraum RR von dort vorhandenen
Biomolekülen, hier
z. B. Ribosomen RS übernommen
und unmittelbar in vitro exprimiert. Das die linearen Makromoleküle LM transportierende
Transportfluid FL, z. B. eine physiologische Kochsalzlösung, kann
dabei die zur zellfreien Proteinsynthese benötigten Nährstoffe NE bereits enthalten,
da sie von so geringer Größe sind, dass
sie den Fluidkanal FK ungehindert passieren können. Die von den Ribosomen
RS erzeugten Peptide PD bzw. Proteine, ebenfalls lineare Makromoleküle LM, werden
durch den Förderdruck
FD und das elektrische Feld EF ohne sich spontan charakteristisch
falten zu können,
unmittelbar in den zweiten photonischen Kristall PK2 getrieben und
dort detektiert. Mit dieser Anordnung kann den im ersten photonischen
Kristall PK1 detektierten DNA oder RNA durch Detektion im zweiten
photonischen Kristall PK2 eine bestimmtes Aminosäurekette, z. B. ein Peptid
PD oder ein Protein, zugeordnet werden.
-
7 zeigt
ebenfalls ein Mikro- und Nanofluidsystem NS als Mikrobioreaktor
MB, hier jedoch mit Mikro- bzw. Nanobehälter NR am Ausgang des zweiten
photonischen Kristalls PK2. Durch die Anordnung von Mikro- bzw.
Nanobehälter
NR verschiedener Durchmesser können
die durch die Proteinsynthese in den Ribosomen RS im Reaktionsraum
RR des Mikrobioreaktors MB erzeugten Aminosäureketten, z. B. Peptide PD
oder Proteine, nach ihrer Größe sortiert
gesammelt und für
weitere Analyseschritte gelagert werden.
-
8 zeigt
ein Mikro- und Nanofluidsystem NS als Reihenschaltung mehrerer Mikrobioreaktoren MB.
Wenn in dem Transportfluid FL ein Gemisch unterschiedlicher linearer
Makromoleküle
LM vorhanden ist, kann durch eine Reihenschaltung mehrerer Mikrobioreaktoren,
hier MB1, MB2, MB3, eine individualisierte Bearbeitung, z. B. die
Prozessierung von DNA über
RNA in Aminosäureketten,
z. B. Peptide PD oder Proteine, oder die Proteinsynthese mit spezialisierten
Ribosomen RS, durchgeführt
werden.
-
9 zeigt
ein Mikro- und Nanofluidsystem NS mit gesonderter Zufuhr von Nährstoffen
NE in den Reaktionsraum RR des Mikrobiorektors MB unabhängig von
dem Transportfluid FL und gesonderter Abfuhr von Reaktionsprodukten
und nicht benötigten Bestandteilen
UB. Damit können
einerseits Nährstoffe
NE gezielt auf den im Mikrobioreaktor MB ablaufenden Stoffumsetzungsprozess
abgestimmt und in einem gesteuerten zeitlichen Ablauf zugefügt und andererseits
Reaktionsprodukte und nicht benötigte
Bestandteile UB nach einer Separation durch Sortierungs- oder Filtervorgänge in den
entropischen Barrieren EB abgeführt
werden. Dazu kann das Mikro- und Nanofluidsystem NS Zugänge ZU,
z. B. vor und/oder in und/oder nach den photonischen Kristallen
PK1, PK2 und/oder im Reaktionsraum RR des Mikrobioreaktors MB, und/oder
Abgänge
AB, z. B. vor und/oder in und/oder nach den photonischen Kristallen
PK1, PK2 und/oder im Reaktionsraum RR des Mikrobioreaktors MB, aufweisen.
-
- AB
- Abgänge
- AG
- Ausgang
- BK
- Bestrahlungskanal
- DNA
- Desoxyribonukleinsäure
- DR
- Durchströmungsrichtung
- EB
- entropische
Barriere
- EF
- elektrisches
Feld
- EG
- Eingang
- ES
- elektromagnetische
Strahlung
- FD
- Förderdruck
- FK
- Fluidkanal
- FL
- Transportfluid
- GD
- Gitterdefekt
- GO
- Gitteröffnung
- KB
- Blende
- KF
- komplexe
Faltstruktur
- LM
- lineares
Makromolekül
- MB
- Mikrobioreaktor
- NE
- Nährstoffe
- NF
- Nanosäulenfeld
- NR
- Nanobehälter
- NS
- Mikro-
und Nanofluidsystem
- PD
- Aminosäurekette
(Peptid, Protein)
- PG
- periodische
Gitterstruktur
- PK
- photonischer
Kristall
- QA
- Queranordnung
- RR
- Reaktionsraum
- RS
- Ribosomen
- TS
- transmittierte
Strahlung
- UB
- nicht
benötigte
Bestandteile, Reaktionsprodukte
- VN
- sich
verengendes Nanosäulenfeld
- WL
- Wellenleiter
- ZU
- Zugänge