DE102017122718A1

DE102017122718A1 - Verfahren und Vorrichtung zur optischen Untersuchung einer Vielzahl mikroskopischer Proben

Info

Publication number: DE102017122718A1
Application number: DE102017122718.0A
Authority: DE
Inventors: Thomas KALKBRENNER; Jörg Siebenmorgen; Thomas Ohrt
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2019-04-04
Also published as: JP7309698B2; WO2019063539A1; JP2020535421A; CN111164485B; US20200284715A1; CN111164485A; US11371927B2

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur optischen Untersuchung einer Vielzahl mikroskopischer Proben (1), bei dem die Proben (1) aus der Vielzahl kanalisiert und nacheinander mittels einer Strömung in mindestens einen Durchflusskanal (3) geleitet werden, in dem sie sich entlang einer Strömungsrichtung (23) fortbewegen. Die Proben (1) werden beleuchtet, von den Proben (1) abgestrahltes Licht wird detektiert und analysiert. Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.Erfindungsgemäß werden die Proben (1) beleuchtet, indem mindestens ein Lichtblatt (19) mit einer Lichtblattebene (22) auf den mindestens einen Durchflusskanal (3) gerichtet wird, wobei das Lichtblatt (19) so ausgerichtet wird, dass es den mindestens einen Durchflusskanal (3) in einem Schnittbereich (20) schneidet und die Normale (21) der Lichtblattebene (22) mit der Strömungsrichtung (23) im Schnittbereich (20) einen von Null verschiedenen Winkel einschließt. Das von der Probe (1) abgestrahlte Licht wird von einer abbildenden Detektionsoptik (10) registriert, die Fokusebene dieser Detektionsoptik (10) liegt im Schnittbereich (20).

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur optischen Untersuchung, insbesondere zur Manipulation, zur Abbildung und zur Analyse einer Vielzahl mikroskopischer, insbesondere biologischer Proben, bei dem die Proben aus der Vielzahl kanalisiert und nacheinander mittels einer Strömung in mindestens einen Durchflusskanal geleitet werden, und sich darin entlang einer vorgegebenen Strömungsrichtung fortbewegen. Die Proben werden im Durchflusskanal beleuchtet und das von den Proben abgestrahlte Licht wird detektiert und analysiert.
Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur optischen Untersuchung einer Vielzahl mikroskopischer Proben, die insbesondere auch zur Durchführung des oben genannten Verfahrens geeignet ist. Eine solche Vorrichtung umfasst eine Kanalisierungseinrichtung zum Kanalisieren und zur Zuführung der Proben nacheinander in mindestens einen Durchflusskanal, in welchem sich die Proben entlang einer - beispielsweise durch eine Pump- und Ablaufvorrichtung - vorgegebenen Strömungsrichtung fortbewegen. Die Vorrichtung umfasst außerdem Beleuchtungsmittel zur Beleuchtung der Proben im Durchflusskanal zur Abstrahlung von Detektionslicht; sie umfasst weiterhin Detektionsmittel zur Detektion des von der Probe abgestrahlten Detektionslichts und Analysemittel zur Analyse des Detektionslichts.
Zur Untersuchung von Zell-Populationen in hoher Zahl, um quantitative Aussagen über die Art und Anzahl der Zellen zu erhalten, hat sich im Laufe der letzten fünfzig Jahre die Durchflusszytometrie als eines der wesentlichen Messverfahren etabliert. Dabei werden Zellen mit vergleichsweise hoher Geschwindigkeit im Wesentlichen einzeln an einem Lichtstrahl zur Beleuchtung oder einem Mittel zur Probenmanipulation, beispielsweise einer elektrischen Spannung, vorbeigeführt. In Abhängigkeit von den Zelleigenschaften wie Struktur, Form oder einer Färbung der Zellen beispielsweise mit Fluoreszenzmarkern führt die Manipulation zu unterschiedlichen Ergebnissen, die detektiert werden und Rückschlüsse auf die Eigenschaften der Zellen zulassen. Unter dem Begriff der Manipulation soll dabei neben mechanischen oder quasi-mechanischen Eingriffen beispielsweise mittels optischer Pinzetten auch die Änderung einer Eigenschaft der Probe durch einen Eingriff von außen verstanden werden. Auch ein Lichtstrahl kann die Probe manipulieren, wenn die Probe beispielsweise mit Fluoreszenzmarkern markiert ist und durch den Lichtstrahl zur Emission von Fluoreszenzlicht angeregt wird. In der klassischen Durchflusszytometrie werden dabei nur Signale detektiert, jedoch lassen sich keine zwei- oder dreidimensionalen Bildinformationen sammeln, was für eine noch genauere Analyse und/oder eine weiter diversifizierte Katalogisierung wünschenswert ist.
Bei der Durchflusszytometrie werden aus einem Probengemenge, welches eine Vielzahl von mikroskopischen Proben - darunter werden einzelne Objekte, beispielsweise Zellen verstanden - in der Regel in einer Trägerflüssigkeit enthält, Proben mittels einer Kanalisierungseinrichtung vereinzelt und in einem Mikrokanal gelenkt, in der Regel mit Hilfe eines sogenannten Hüllstroms. Die Vereinzelung kann beispielsweise mithilfe einer - ggf. im Durchmesser einstellbaren - trichterförmigen Öffnung zum Mikrokanal erfolgen. Der - heutzutage in der Regel auf einem Mikrofluidik-Chip ausgebildete Mikrokanal weist in der Regel einen Durchmesser auf, der so groß gewählt ist, dass Zellen typischer Größen - zwischen 1 µm und 30 µm - nicht darin stecken bleiben, und ist andererseits so klein gewählt, dass alle Zellen, die durch den Mikrokanal treten, auch von dem Manipulationsmedium, beispielsweise einem Laserstrahl erfasst werden, sofern keine strömungstechnische Fokussierung in dem Kanal auf die Schnittlinie mit dem Laserstrahl erfolgt. Eine mit einem Fluoreszenzmarker markierte Probe wird beim Durchtritt durch den Laserstrahl, sofern dessen Frequenz auf den Marker abgestimmt ist, zur Emission eines Fluoreszenzsignals angeregt, welches von einem auf den Schnittbereich zwischen Laserstrahl und Durchflusskanal ausgerichteten Detektor registriert wird. Hier reichen in der Regel einfache Photodetektoren, da eine Bildgebung mit einer abbildenden Optik für die quantitative Analyse nicht notwendig ist. Für nicht mit Fluoreszenzmarkern markierte Proben oder zusätzlich zur Fluoreszenz kann deren Streulicht in verschiedenen Richtungen registriert werden.
Die detektierten Messwerte werden in einer Analyseeinheit ausgewertet und man erhält quantitative Informationen über jede analysierte Zelle. Die Anzahl der Proben, die pro Sekunde analysiert werden können, liegt in der Größenordnung von 10⁴, so dass man innerhalb kürzester Zeit repräsentative Informationen über die einzelnen Proben, beispielsweise Zell-Populationen, die in der Vielzahl von Proben vorkommen, erhält. Dabei ist es möglich, am Durchflusskanal mehrere Laser, die Licht in jeweils unterschiedlichen Wellenlängen abstrahlen, zu positionieren und mit entsprechenden Detektoren zu koppeln, was die Analyse einer Vielzahl verschiedener Proben zulässt. Neben der Analyse von Fluoreszenzsignalen ist auch die Analyse von Streulicht eine Option.
An die durchflusszytometrische Messung kann sich eine Sortierung mittels einer Sortiereinrichtung anschließen. Anhand der Analyseergebnisse werden die Proben in verschiedene Kanäle sortiert. Die Proben werden, sofern dies nicht schon vor der Analyse erfolgte, vereinzelt, beispielsweise mit Hilfe eines in Durchflussrichtung hinter den Beleuchtungsmitteln, welche im Falle einer Anregung zur Fluoreszenz auch als Anregungsmittel bezeichnet werden, angeordneten Vibrators, welcher den Flüssigkeitsstrom in kleine Tröpfchen, die in der Regel nur eine Zelle enthalten, unterteilt, und anschließender elektrostatischer Sortierung. Einen Überblick über durchflusszytometrische Verfahren einschließlich Sortiermechanismen gibt beispielsweise der Artikel „Microfluidic Cell Sorting: A Review of the Advances in the Separation of Cells from Debulking to Rare Cell Isolation" von C. W. Shields IV et al., erschienen in Lab Chip. 15(5), S. 1230-1249 im Jahr 2015.
Mit diesen Verfahren lässt sich zwar ein hoher Probendurchsatz erzielen, eine Bildgebung erfolgt jedoch in der Regel nicht, da eine Fokussierung bei diesen Geschwindigkeiten nicht vorgenommen werden kann. Einen Ausweg bietet die Verwendung einer Optik mit fester Brennweite und kleiner Apertur, was zu einer erhöhten Schärfentiefe führt, jedoch auch zu einem dunkleren Bild. Dieser Nachteil wird durch eine spezielle Bildverarbeitung mindestens teilweise wieder ausgeglichen. Dieser sogenannte „Extended-Depth-of-Field“-Ansatz (EDOF) erhöht jedoch den technischen Aufwand und damit die Kosten, zudem ist aufgrund der geringen Apertur die erzielbare Auflösung im Bild gering. Ein Durchflusszytometer mit kombinierter Bildgebung ist beispielsweise das ImageStreamX Mark II Imaging Flow Zytometer der Firma Merck KGaA.
Moderne Durchflusszytometer verwenden oft den „Lab-On-Chip“-Ansatz, dabei handelt es sich um Mikrofluidik-Systeme, bei denen speziellen Probenträger verwendet werden, die mit mikrostrukturierten Kanälen versehen sind, welche über Zu- und Abflüsse verfügen. Je nach Anwendung können die mikrostrukturierten Kanäle verschieden ausgebildet sein. Um beispielsweise Reaktionen zu erzeugen, können sich mehrere mikrostrukturierte Kanäle kreuzen, für eine einfache durchflusszytometrische Analyse reicht ein einfacher Kanal aus. Die Probenträger mit den mikrostrukturierten Kanälen - auch als Kanalträger bezeichnet - können auf entsprechenden Probenhalterungen oder Probentischen eines inversen Mikroskops angeordnet werden, so dass die Kanäle auch mittels inverser Mikroskopie beobachtet werden können, wie beispielsweise in einer Artikel von F.-U. Gast et al., „The microscopy cell (MicCell), a versatile modular flowthrough system for cell biology, biomaterial research, and nanotechnology", erschienen in MicrofluidNanofluid 2, S. 21-36 im Jahr 2006, beschrieben. Die Beobachtung erfolgt meist konfokal und ist somit auf kleine Gebiete beschränkt.
Des Weiteren sind im Stand der Technik mittlerweile lichtblattmikroskopische Verfahren und Vorrichtungen zur Untersuchung von biologischen Proben etabliert. Dabei erfolgt die Beleuchtung der Proben mit einem Lichtblatt, d.h. im Wesentlichen nur in einer Ebene, der Lichtblattebene. Das Lichtblatt schließt mit der Detektionsrichtung, die in der Regel der optischen Achse eines Detektionsobjektivs entspricht, einen von Null verschiedenen, meist rechten Winkel ein. Mit dieser auch als SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) bezeichneten Technik lassen sich in relativ kurzer Zeit räumliche Aufnahmen auch dickerer Proben erzeugen. Auf der Basis von optischen Schnitten kombiniert mit einer Relativbewegung der Probe in einer Richtung senkrecht zur Schnittebene ist mit lichtblattmikroskopischen Verfahren eine bildliche, räumlich ausgedehnte Darstellung der Proben möglich.
Die SPIM-Technik wird bevorzugt in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, wo sie dann auch als LSFM (Light Sheet Fluorescence Microscopy) bezeichnet wird. Gegenüber anderen etablierten Verfahren wie der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie oder der Zwei-Photonen-Mikroskopie weist die LSFM-Technik mehrere Vorzüge auf. Da die Detektion im Weitfeld erfolgen kann, lassen sich größere Probenbereiche schneller erfassen. Zwar ist die Auflösung etwas geringer als bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, jedoch lassen sich bei statischen Proben mit der LSFM-Technik dickere Proben analysieren, weil die Eindringtiefe höher ist. Darüber hinaus ist die Lichtbelastung der Proben bei diesem Verfahren am geringsten, was die Gefahr des Ausbleichens und vor allem der Photoschädigung einer Probe reduziert, da die Probe nur durch ein dünnes Lichtblatt in einem von Null verschiedenen Winkel zur Detektionsrichtung beleuchtet wird.
Das Lichtblatt kann sowohl statisch erzeugt werden, beispielsweise mit Hilfe von Zylinderlinsen, oder quasi-statisch, in dem die Probe mit einem Lichtstrahl in einer Ebene schnell abgetastet wird. Die lichtblattartige Beleuchtung entsteht, in dem der Lichtstrahl einer sehr schnellen Relativbewegung zu der beobachteten Probe unterworfen wird und dabei zeitlich aufeinanderfolgend mehrfach aneinandergereiht wird. Für die Formung des Lichtblatts gibt es verschiedene Verfahren, so lassen sich sogenannte Sinc³-Lichtblätter, auf Basis von Mathieu-Strahlen oder Bessel-Strahlen erzeugte Lichtblätter, oder auch Lichtblätter, die mit Hilfe von Gittern erzeugt werden, wie dies beispielsweise in der US 2013/286181 A1 beschrieben ist, verwenden.
Die Integrationszeit einer angeschlossenen Kamera, auf deren Sensor die Probe letztendlich abgebildet wird, wählt man bei der Verwendung quasi-statischer Lichtblätter dabei so, dass die Abtastung innerhalb der Integrationszeit abgeschlossen wird. Anstelle einer Kamera mit einem zweidimensionalen Sensor kann auch ein Zeilensensor in Kombination mit einer erneuten Abtastung in der Detektionsoptik verwendet werden. Die SPIM-Technik ist in der Literatur inzwischen vielfach beschrieben, beispielsweise in der DE 102 57 423 A1 und in der darauf aufbauenden WO 2004/053558 A1 , oder in dem Übersichtsartikel „Selective Plane Illumination Microscopy Techniques in Developmental Biology" von J. Huisken et al., erschienen im Jahr 2009 in der Zeitschrift Development Bd. 136, S. 1963 ff. In der WO 2012/110488 A2 und in der WO 2012/122027 A2 sind Aufbauten beschrieben, bei denen das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv senkrecht zueinander stehen und jeweils unter einem Winkel von 45° von oben auf die Probe gerichtet sind. Die Probe befindet sich dann beispielsweise in einer Petrischale. Auch inverse lichtblattmikroskopische Anordnungen sind im Stand der Technik bekannt, beispielsweise aus der DE 10 2013 107 297 A1 , der DE 10 2013 107 298 A1 , der DE 10 2013 112 596 A1 oder der DE 10 2013 112 600 A1 . Da das Licht bei den Lichtblattmikroskopen mit inverser Anordnung schräg durch den Probenträger tritt, ist die Verwendung von Korrekturelementen zum Ausgleich von durch diesen schrägen Lichtdurchtritt verursachten Aberrationen mittels Korrekturelementen, wie sie in den genannten Schriften offenbart sind, notwendig.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art dahingehend weiterzuentwickeln, dass einerseits die Empfindlichkeit und Flexibilität gegenüber den im Stand der Technik bekannten durchflusszytometrischen Verfahren und Vorrichtungen erhöht wird und andererseits gleichzeitig möglichst detaillierte Bildinformationen zur Verfügung gestellt werden.
Diese Aufgabe wird für ein Verfahren der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, dass die Proben beleuchtet werden, indem mindestens ein Lichtblatt mit einer Lichtblattebene auf den mindestens einen Durchflusskanal gerichtet wird, und das Lichtblatt so ausgerichtet wird, dass es den mindestens einen Durchflusskanal in einem Schnittbereich schneidet und die Normale der Lichtblattebene mit der Strömungsrichtung im Schnittbereich einen von Null verschiedenen Winkel einschließt. Das von den Proben abgestrahlte Licht wird von einer abbildenden - d.h. bildgebenden und flächig detektierenden - Detektionsoptik registriert, deren Fokusebene im Schnittbereich liegt.
Bei dem abgestrahlten Licht handelt es sich beispielsweise um Streulicht oder um reflektiertes Licht, die Proben strahlen in diesem Fall passiv Licht ab, ohne dazu angeregt zu sein. Besonders bevorzugt lässt sich das Verfahren auch für Proben anwenden, die vor der Untersuchung mit Fluoreszenzmarkern markiert werden, was die Identifizierung beispielsweise von Zellen erleichtert. Die Proben werden durch das mindestens eine Lichtblatt zur Aussendung von Fluoreszenzsignalen angeregt, welche von der Detektionsoptik registriert werden. In diesem Fall strahlen die Proben aktiv Licht ab.
Die Beleuchtung bzw. Anregung der mit Fluoreszenzmarkern versehenen Proben erfolgt hier also nicht mittels eines einfachen Laserstrahls, sondern mit Hilfe eines - ebenfalls mit Laserlicht erzeugten - Lichtblatts, welches so ausgerichtet ist, dass es den mindestens einen Durchflusskanal in einem Schnittbereich schneidet. Unter dem Begriff des Schnittbereichs ist dabei folgendes zu verstehen: Bei einem idealen Lichtblatt mit infinitesimaler Dicke entlang der Richtung der Normalen der Lichtblattebene ist der Schnittbereich eine zweidimensionale Schnittfläche in der Lichtblattebene aus einem Schnitt des Lichtblatts durch das Volumen des Durchflusskanals, die Schnittfläche wird durch den Kanalrand begrenzt. In der Realität besitzt das Lichtblatt jedoch entlang der Normalen der Lichtblattebene eine endliche Ausdehnung, die zwar im Vergleich zur Ausdehnung in der Lichtblattebene wesentlich geringer ist, jedoch dafür sorgt, dass es sich bei dem Schnittbereich um ein Schnittvolumen handelt, dessen Dicke entlang der Normalen der Lichtblattebene im Bereich der bestmöglichen Fokussierung etwa 0,4 µm - 3 µm einschließlich dieser Werte beträgt. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung eines Lichtblatts liegt - bei entsprechender Fokussierung - in seiner flächigen Ausdehnung, die es ermöglicht, dass auch mehrere Kanäle gleichzeitig analysiert werden können, wenn beispielsweise Kanalträger mit einer Vielzahl parallel angeordneter Durchflusskanäle verwendet werden.
Grundsätzlich kann das Lichtblatt, wenn nur eine quantitative Analyse benötigt wird, zur Beleuchtung und insbesondere zur Erzeugung von Fluoreszenzsignalen auch senkrecht in Bezug auf die Strömungsrichtung ausgerichtet werden, die Fluoreszenzsignale können dann auf übliche Weise beispielsweise mittels Photodetektoren, d.h. ohne abbildende Detektionsoptik detektiert und analysiert werden, wobei gegenüber der Verwendung eines einzelnen Laserstrahls vorteilhaft mehrere Durchflusskanäle gleichzeitig analysiert werden können. Von einer SPIM-Anordnung wird dann nur das Lichtblatt übernommen, jedoch auf die abbildende, d.h. ein Bild erzeugende Detektionsoptik verzichtet.
Ein besonders vorteilhafter Aspekt der Erfindung besteht jedoch in der geneigten Ausrichtung des Lichtblatts, worunter verstanden wird, dass die Normale der Lichtblattebene mit der Strömungsrichtung einen von Null verschiedenen Winkel einschließt. Die Strömungsrichtung in dem in der Regel im wesentlichen rohrförmigen Durchflusskanal ist dabei entlang der Längsausdehnung des Kanals ausgerichtet, also senkrecht zu dessen Querschnitt und hängt außerdem davon ab, in welcher Richtung der Durchflusskanal durchströmt wird. Die Strömungsrichtung und insbesondere der Betrag der Strömungsgeschwindigkeit lassen sich von außen, beispielsweise mit entsprechenden Pumpvorrichtungen, steuern.
Durch den von Null verschiedenen Winkel ist es möglich, eine Detektionsoptik, wie sie in der Lichtblattmikroskopie üblicherweise verwendet wird, einzusetzen und so zu positionieren, dass die Fokusebene im Schnittbereich liegt, idealerweise direkt in der Lichtblattebene oder zumindest parallel zu dieser, so dass der gesamte - schräge - Querschnitt des Durchflusskanals im Schnittbereich in der Fokusebene liegt. Da der gesamte Querschnitt des Durchflusskanals erfasst wird, können auch größere Kanäle verwendet werden, d.h. die Kanalgröße kann unabhängig von der Probengröße gewählt werden. Auf diese Weise lassen sich in Momentaufnahmen die für die Lichtblattmikroskopie typischen Schnittbilder der Proben im Schnittbereich aufnehmen, d.h. zweidimensionale Bilder der durch den Schnittbereich tretenden Proben. Die Detektionsoptik kann nicht nur für die Erzeugung von Bildern, sondern auch zur Registrierung der Fluoreszenzsignale für die quantitative Analyse, wie sie bei durchflusszytometrischen Untersuchungen vorgenommen werden, verwendet werden, zusätzliche Detektionseinrichtungen werden dann nicht benötigt. Die abbildende Detektionsoptik registriert also nicht nur die Fluoreszenzsignale, sondern bildet gleichzeitig die den Schnittbereich in der Fokusebene durchtretende Probe zumindest in einer Momentaufnahme auf einen entsprechenden Flächensensor ab, so dass man mindestens eine zweidimensionale Aufnahme der Probe beim Durchtritt durch den Schnittbereich erzeugen kann.
Aufgrund der geneigten Ausrichtung des Lichtblattes in Bezug auf die Strömungsrichtung erhält man selbst für eine Momentaufnahme ein Schnittbild durch die gesamte Probe. Im Zusammenspiel mit der Strömungsgeschwindigkeit und Strömungsrichtung lässt sich jedoch zeitlich sequentiell ein Bildstapel aus Einzelbildern der durch den Schnittbereich fließenden Proben aufnehmen, die Einzelbilder eines Bildstapels können dann optional zu einer räumlichen Darstellung zusammengesetzt werden.
Die Detektionsoptik ist zudem ohne weitere Maßnahmen immer auf die Lichtblattebene bzw. eine Ebene im Schnittbereich fokussiert, auf zusätzliche Maßnahmen beispielsweise zur Erhöhung der Schärfentiefe (EDOF) kann daher verzichtet werden. Während bei der Durchflusszytometrie mit Laserstrahlen der Laserstrahl in der Regel nur einen Teilbereich des Durchflusskanals überdeckt und die Partikel mittels entsprechender Strömungsfokussierung auf diesen Teilbereich fokussiert werden müssen, deckt das Lichtblatt in der Regel den gesamten Durchflusskanal im Querschnitt bzw. im Schnittbereich ab, oder doch mindestens einen großen Teil, so dass auf eine Partikelfokussierung hier verzichtet werden kann. Grundsätzlich ist es aufgrund der Bildgebung daher auch möglich, in einem Durchflusskanal mit größerem Querschnitt mehrere Proben - insbesondere Zellen -, die sich in einer Momentaufnahme gleichzeitig im Schnittbereich befinden, zu manipulieren und zu analysieren. Im Gegensatz zur klassischen Durchflusszytometrie muss der anregende Laserstrahl nicht zur Erzeugung eines maximalen Signals fokussiert werden, was dort eine Partikelfokussierung notwendig macht, da sich der Durchmesser des Durchflusskanals nicht auf den Durchmesser des fokussierten Laserstrahls reduzieren lässt.
Während im Stand der Technik in der Durchflusszytometrie die Bildgebung nur über einen Extended-Depth-of-Field-Ansatz (EDOF-Ansatz) möglich ist, was die Verwendung kleiner Aperturen für die Bildgebung notwendig macht, kann auf solche Maßnahmen bei der Verwendung einer lichtblattmikroskopischen Anordnung für die Beleuchtung und Detektion verzichtet werden: Das Detektionsobjektiv ist auf die Lichtblattebene fokussiert, die Schärfentiefe korrespondiert zu der Dicke des Schnittbereichs entlang der Richtung der Normalen der Lichtblattebene und ist wesentlich kleiner als die Ausdehnung der Proben. Es ist daher möglich, in der Detektionsoptik Objektive mit einem großen Öffnungswinkel zu verwenden, was in einem hohen Auflösungsvermögen resultiert, welches grundsätzlich mit dem Öffnungswinkel des Objektivs wächst. Durch die Verwendung von Immersionsmedien kann die numerische Apertur des Objektivs weiter vergrößert und die Auflösung kann weiter gesteigert werden.
Das Verfahren lässt sich auch mit dem Verfahren der verdeckten oder außeraxialen Beleuchtung (Oblique Illumination) zur Kontrasterhöhung verbinden. Die außeraxiale Beleuchtung wird dabei beispielsweise in einer anderen Farbe in das Beleuchtungsobjektiv eingekoppelt, alternativ kann auch ein getrenntes Objektiv verwendet werden. Auf diese Weise lässt sich eine Kontrastaufnahme der Probe erstellen, wozu ein spektral separater Kanal für die Beleuchtung und Detektion verwendet wird. Ein Zusammenführen der Bilddaten zu einem Gesamtbild der Probe mit höherem Kontrast ist möglich.
Mit Maßnahmen, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, kann im Anschluss an die Analyse der Fluoreszenzsignale anhand dieser Signale eine Sortierung der Proben vorgenommen werden.
Da das Lichtblatt im Vergleich zum Durchmesser eines Durchflusskanals für die Mikrofluidik eine wesentlich größere Fläche abdecken kann, ist es ohne weiteres möglich das Lichtblatt so ausrichten, dass es eine Vielzahl von Durchflusskanälen schneidet. Auf diese Weise lässt sich der Durchsatz wesentlich erhöhen, die Effizienz der Methode für durchflusszytometrische und bildgebende Analysen wird gesteigert.
Darüber hinaus ist es auch möglich, die Proben mit mehreren Lichtblättern zu beleuchten, wobei die Lichtblattebenen bevorzugt parallel zueinander liegen. Dabei können beispielsweise mehrere gleichartige Lichtblätter in Strömungsrichtung hintereinander angeordnet sein, was eine wiederholte Beobachtung ein- und desselben Objekts, d.h. der aus dem Probengemenge vereinzelten Probe ermöglicht. Es können auch mehrere Lichtblätter mit unterschiedlichen spektralen Eigenschaften verwendet werden, um beispielsweise Mehrfarben-Anregungen zu beobachten. Diese Lichtblätter können dann einander auch überlagern, die Mehrfarben-Anregung erfolgt dann simultan. Bei einer Anordnung der gleichartigen oder unterschiedlichen Lichtblätter hintereinander lassen sich auch optische Manipulationen im zeitlichen Ablauf beobachten. Beispielsweise kann ein erstes Lichtblatt eine Manipulation vornehmen, die in der Probe zu einer Reaktion führt. Das zweite Lichtblatt wird zur Beobachtung einer ersten Eigenschaft verwendet, gegebenenfalls können weitere Lichtblätter zur Beobachtung weiterer Eigenschaften verwendet werden, diese können auch überlagert werden. Über eine Einstellung der Strömungsgeschwindigkeit, beispielsweise über Ventile, kann die Zeit, die die Probe für den Weg zwischen erstem und zweitem Lichtblatt benötigt, eingestellt werden.
Je nach Art der zur untersuchenden Eigenschaften können das zweite und ggf. weitere Lichtblätter einander überlagern oder in Strömungsrichtung zueinander beabstandet angeordnet sein. Zwischen dem ersten und dem zweiten Lichtblatt befindet sich ein räumlicher Abstand. Bei entsprechender Ausgestaltung des mindestens einen Durchflusskanals ist es darüber hinaus möglich, dass das Lichtblatt den mindestens einen Durchflusskanal mehrfach in Schnittbereichen schneidet, auf diese Weise lässt sich das zeitliche Verhalten der Proben untersuchen. Dies kann beispielsweise durch mäanderförmige Durchflusskanäle erreicht werden, auch bogenförmige Anordnungen der Durchflusskanäle sind denkbar.
Bei der Verwendung vieler Durchflusskanäle kann außerdem jedem der parallelen Kanäle oder Kanalgruppen eine individuelle Spektraleigenschaft zugeordnet werden, indem man spezielle Filteranordnungen bzw. Verlaufs-Emissionsfilter verwendet.
Die Aufgabe wird außerdem für eine Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art dadurch gelöst, dass die Beleuchtungsmittel eine Beleuchtungsoptik zur Erzeugung mindestens eines Lichtblatts mit einer Lichtebene umfassen, wobei das Lichtblatt in Bezug auf den Durchflusskanal so ausgerichtet ist, dass es den Durchflusskanal in einem Schnittbereich schneidet und die Normale der Lichtblattebene mit Strömungsrichtung im Schnittbereich einen von Null verschiedenen Winkel einschließt, wodurch im Schnittbereich die Proben beleuchtet werden. Die Detektionsmittel umfassen eine abbildende Detektionsoptik, deren Fokusebene im Schnittbereich liegt.
Eine auf Vorrichtungsmerkmale bezogene Beschreibung gilt bezüglich dieser Merkmale analog für das entsprechende Verfahren, während Verfahrensmerkmale entsprechend funktionelle Merkmale der beschriebenen Vorrichtung darstellen.
Zweckmäßig sind die Beleuchtungsmittel Licht spezieller Wellenlängen oder Wellenlängenbereiche zur Anregung von mit Fluoreszenzmarkern markierten Proben abstrahlend ausgebildet, die Proben emittieren dann Fluoreszenzsignale. Die Fluoreszenzsignale können dann von der abbildenden Detektionsoptik flächig detektiert werden. Die Detektionsmittel können aber auch weitere Detektoren, beispielsweise reine Photodetektoren umfassen, mit denen sich Fluoreszenzsignale und/oder Streulicht detektieren lassen, wenn eine quantitative Analyse im Vordergrund steht.
Vorteilhaft ist bei einer erfindungsgemäßen Vorrichtung der mindestens eine Durchflusskanal an einem auswechselbaren Kanalträger, beispielsweise einem Mikrofluidik-Chip ausgebildet. Dies ermöglicht eine gezielte Anpassung an verschiedene Proben und Analysemethoden. Beispielsweise können auf dem Kanalträger eine Vielzahl paralleler Durchflusskanäle angeordnet sein, welche vom Lichtblatt geschnitten werden, d.h. jeder der Durchflusskanäle weist einen Schnittbereich mit den Lichtblatt auf. Dies ermöglicht einen höheren Durchsatz an Proben aufgrund der Parallelisierung und lässt sich insbesondere dann anwenden, wenn eine Vielzahl von Proben analysiert werden soll und eine bildgebende Darstellung nicht im Vordergrund steht, welche sich mit einem Flächendetektor allerdings ebenfalls ohne Weiteres integrieren lässt: Mit der Detektionsoptik und einer daran angeschlossenen Kamera lassen sich auf einem Flächendetektor der Kamera jeweils bestimmte Bereiche auf dem Detektor bestimmten Kanälen eineindeutig zuordnen, so dass jeder der Durchflusskanäle getrennt ausgewertet werden kann. Kommt es nur auf eine quantitative Analyse an, so können sämtliche Durchflusskanäle auf dem Kanalträger über eine gemeinsame Zuleitung und eine gemeinsame Ableitung verfügen. Es ist jedoch ebenfalls möglich, für jeden der Kanäle eine eigene Zu- und / oder Ableitung vorzusehen, oder die Kanäle gruppenweise zusammenzufassen, in Abhängigkeit von den durchzuführenden Analysen.
Im mindestens einen Durchflusskanal kann in Strömungsrichtung dem Lichtblatt eine Sortiereinheit nachgeordnet sein, mit der die Proben in Abhängigkeit vom Ergebnis der Analyse auf einen von mehreren sich an den Durchflusskanal anschließenden Zweigkanälen geleitet werden. Diese Sortierung kann mit Methoden erfolgen, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, beispielsweise auf optische, akustische oder elektrophoretische Weise.
Um das zeitliche Verhalten von markierten oder manipulierten Proben zu beobachten, ist es notwendig, die Probe mehrfach zu beobachten. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfassen die Beleuchtungsmittel daher eine Beleuchtungsoptik oder mehrere Beleuchtungsoptiken zur Erzeugung mehrerer Lichtblätter. Die Lichtblätter liegen mit Ihren Lichtblattebenen parallel zueinander. Je nach Art des Experiments erzeugen die Beleuchtungsoptiken Lichtblätter jeweils voneinander verschiedener Farben, oder Lichtblätter derselben Farbe. Mehrfarbige Lichtblätter können auch zur Erzeugung einer Mehrfachanregung im mindestens einen Durchflusskanal kongruent ausgebildet sein. Andernfalls wird im Schnittbereich des ersten Lichtblatts mit dem mindestens einen Durchflusskanal eine Manipulation vorgenommen, beispielsweise eine Reaktion erzeugt oder eine Fluoreszenz angeregt, welche mit dem zweiten Lichtblatt beobachtet wird. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung werden die mehreren Lichtblätter von derselben Beleuchtungsoptik erzeugt. Für zwei Lichtblätter kann dies beispielsweise mit Hilfe eines angesteuerten Scanners erfolgen, der zwischen zwei parallel angeordneten Lichtblattebenen umschaltet. Der Scanner ist dabei über eine Steuerung mit einer Schaltvorrichtung gekoppelt, die dafür sorgt, dass das Lichtblatt während des Umschaltvorgangs ausgeschaltet wird.
Alternativ oder ergänzend ist es auch möglich, den Durchflusskanal auf dem Kanalträger so auszubilden, dass er mit dem Lichtblatt mehrere Schnittbereiche ausbildet, was beispielsweise erfolgen kann, indem der mindestens eine Durchflusskanal mäanderförmig ausgebildet ist. In diesem Falle benötigt man für die Beobachtung der zeitlichen Abfolge einer Reaktion nur ein Lichtblatt, sofern der Spektralbereich des Lichtblatts für Anregung und Detektion gleichermaßen geeignet ist, andernfalls lassen sich mehrere Lichtblätter verschiedener Farben überlagern.
In einer anderen Ausgestaltung ist der Durchflusskanal in Strömungsrichtung seinen Durchmesser ändernd ausgebildet, was mechanische Manipulationen der Proben im Sinne einer Deformation ermöglicht. Die Probe wird dann beispielsweise einmal vor der Deformation und einmal während des deformierten Zustandes beobachtet, wozu entweder zwei Lichtblätter verwendet werden können, wenn sich die Strömungsrichtung nicht ändert, oder ein einziges Lichtblatt, wenn der mindestens eine Durchflusskanal so ausgebildet ist, dass sich die Strömungsrichtung in Bezug auf ein übergeordnetes Koordinatensystem ändert, wie es bei der mäanderförmigen Ausführung des Durchflusskanals der Fall ist.
Vorteilhaft lässt sich auch der Betrag der Strömungsgeschwindigkeit in den mindestens einen Durchflusskanal mittels einer Geschwindigkeitsregelungseinrichtung variabel einstellen und an die experimentellen Bedingungen anpassen. Die Geschwindigkeit kann beispielsweise über Ventile an der Zu- und / oder Ableitung geregelt werden.
Mittels sogenannter Phase-Retrieval-Algorithmen wie beispielsweise der Transport of Intensity Equation (TIE) lassen sich darüber hinaus auch Phaseninformationen in Bezug auf das detektierte Licht bestimmen, wenn ein Bildstapel aus mindestens drei Bildern innerhalb eines Objekts an verschiedenen Positionen erzeugt wird. Da sich die Probe - das Objekt - mit der Strömung durch die Fokusebene der Detektionsoptik bewegt, müssen nur mindestens 3 Bilder in geeignetem zeitlichen Abstand aufgenommen werden, im Gegensatz zur klassischen Mikroskopie, wo man die Probe oder das Objektiv entlang der optischen Achse verfahren muss. Die Vorrichtung kann außerdem mit weiteren Detektionseinrichtungen und Kameras, wie beispielsweise normalen Auflichtmikroskopen oder weiteren lichtblattmikroskopischen Anordnungen kombiniert werden.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:

1 den schematischen Aufbau einer Vorrichtung zur optischen Manipulation einer Vielzahl von Proben,
2 ein Detail eines Kanalträgers und der Lage eines Lichtblatts,
3 eine zweite Ausgestaltung einer solchen Vorrichtung,
4 eine dritte Ausgestaltung einer solchen Vorrichtung,
5 eine Ausgestaltung eines Kanalträgers,
6 eine zweite Ausgestaltung eines Kanalträgers,
7 eine dritte Ausgestaltung eines Kanalträgers und
8a, b zwei weitere Ausgestaltungen eines Kanalträgers.

1 zeigt zunächst den grundlegenden Aufbau einer Vorrichtung zur optischen Manipulation einer Vielzahl biologischer, mit Fluoreszenzmarkern markierter Proben 1. Die sich in der Regel in einem Probengemenge in einer Trägerflüssigkeit befindenden Proben 1, beispielsweise aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Zellen aus einer Gewebeprobe werden zunächst vorbereitet, d.h. mit Fluoreszenzmarkern markiert und sodann einer Kanalisierungseinrichtung 2 zugeführt, in welcher die Proben 1 kanalisiert und mindestens einem Durchflusskanal 3 zugeführt werden. Die Kanalisierungseinrichtung 2, die auch als Vereinzelungseinrichtung bezeichnet wird, kann beispielsweise eine trichterförmige Öffnung in Richtung des Durchflusskanals 3 aufweisen, die so bemessen ist, dass die Proben nur einzeln hindurchtreten können. Dies kann mit strömungstechnischen Maßnahmen unterstützt werden, wobei vorteilhaft auch der Durchmesser der Öffnung variiert werden kann. Typische Proben sind Zellen, diese haben in der Regel Größen zwischen 1 µm und 30 µm, der Durchmesser des mindestens einen, in der Regel rohrförmig ausgestalteten Durchflusskanals 3 ist an diese Zellgrößen angepasst und oft nur etwas größer als der maximale Durchmesser der zu untersuchenden Proben 1, damit diese den Durchflusskanal 3 nicht verstopfen. Dabei lassen sich Durchflusskanäle 3 mit größeren Durchmesser von beispielsweise 40 µm und mehr auch für kleinere Proben mit Durchmessern von weniger als 5 µm verwenden, wenn durch entsprechende Maßnahmen sichergestellt ist, dass die Proben 1 möglichst nacheinander in den mindestens einen Durchflusskanal 3 treten, was beispielsweise durch Eintrittsöffnungen variabler Größe am Übergang von der Kanalisierungseinheit 2 zum Durchflusskanal 3 erreicht werden kann. Aufgrund der speziellen Beleuchtung und Detektion, die weiter unten näher erläutert werden, ist es jedoch unschädlich, wenn sich mehrere Proben 1 gleichzeitig bzw. nebeneinander in einem Durchflusskanal 3 befinden. Der mindestens eine Durchflusskanal 3 ist außerdem mit einer - hier nicht gezeigten Pumpeinrichtung - gekoppelt, die der Herstellung einer Strömung dient, was hier durch eine Strömungsrichtung 23 gekennzeichnet ist. Durch eine entsprechende Steuerung und unter Zuhilfenahme von Ventilen kann die Strömungsgeschwindigkeit und/oder auch die -richtung in Abhängigkeit von der vorzunehmenden Analyse variiert werden.
Der mindestens eine Durchflusskanal 3 ist an oder in einem Kanalträger 4 ausgebildet, bei dem es sich beispielsweise um einen Mikrofluidik-Chip handeln kann. Solche Mikrofluidik-Chips lassen sich für eine Vielzahl von Analysen und/oder Experimenten gezielt konfigurieren bzw. herstellen, der Kanalträger 4 ist daher bevorzugt auswechselbar. Der Durchflusskanal 3 ist mit der Kanalisierungseinrichtung 2 über eine Schlauchleitung 5 verbunden, auch am anderen Ende des Durchflusskanals 3 im Kanalträger 4 kann eine Schlauchleitung 5 zum Abführen der Proben 1 angebracht sein, die Proben können dann gegebenenfalls auch sortiert, weiteren Analysen oder Experimenten zugeführt oder alternativ entsorgt werden.
Der Kanalträger 4 ist in allen drei Raumrichtungen verfahrbar, wozu er hier auf einem entsprechend verfahrbaren Probentisch 6 angeordnet ist, welcher zusätzlich in einer Ebene, die durch eine Auflagefläche 7 des Probentischs 6 definiert wird, rotierbar sein kann. Auch die Strömungsrichtung 23 im mindestens einen Durchflusskanal 3 liegt zumindest in demjenigen Bereich, in welchem die Analyse erfolgt, in dieser Ebene.
In dem mindestens einen Durchflusskanal 3 bewegen sich die Proben 1 entlang der Strömungsrichtung 23 mit einer mittleren vektoriellen Strömungsgeschwindigkeit zwischen Zu- und Ableitung, wobei nicht ausgeschlossen ist, dass die Proben 1 für einen kurzen Zeitraum bei Manipulation der Geschwindigkeit auch an Ort und Stelle verharren. Bei einem Durchflusskanal 3 mit röhrenförmigen Querschnitt liegt die Strömungsrichtung 23 in jedem Falle entlang des Kanals, d.h. parallel zur Längsachse des röhrenförmigen Kanals.
Zur Durchführung der Analyse verfügt die Vorrichtung über Beleuchtungsmittel, mit denen die Proben 1 beleuchtet werden, und die hier bevorzugt auch als Anregungsmittel zur Anregung der Proben 1 in dem mindestens einen Durchflusskanal 3 zur Emission von Fluoreszenzsignalen ausgestaltet sind. Die Proben strahlen Detektionslicht ab, dies kann passiv in Form von Streulicht erfolgen, aber auch aktiv in Form von emittierten Fluoreszenzsignalen. Das Detektionslicht wird mit Detektionsmitteln, die ebenfalls Teil der Vorrichtung sind, detektiert. Die Vorrichtung verfügt außerdem über Analysemittel zur Analyse des detektierten Detektionslichts wie z.B. der detektierten Fluoreszenzsignale. Dabei kann es sich beispielsweise um einen entsprechend programmierten Computer als Auswerteeinheit mit einer Ausgabeeinheit, beispielsweise einem Bildschirm, handeln.
Bei der in 1 gezeigten Vorrichtung werden die Beleuchtungs- bzw. Anregungsmittel und die Detektionsmittel durch ein Lichtblattmikroskop 8 realisiert, welches hier in einer inversen Konfiguration gezeigt ist. Eine solche inverse Konfiguration bietet sich an, wenn die Aufbauten oberhalb des Probentisches 6, beispielsweise aufgrund der Schlauchleitungen 5 und daran angeschlossener Apparaturen zu viel Platz benötigen, ist aber nicht zwingend - auch eine Anordnung des Lichtblattmikroskops oberhalb des Kanalträgers 4 ist denkbar. Das hier gezeigte Lichtblattmikroskop 8 umfasst eine Beleuchtungsoptik 9 und eine Detektionsoptik 10. Die Beleuchtungsoptik 9 ist auf der linken Seite von 1 gezeigt. Licht aus einem Lasermodul 11 - hier können beispielsweise mehrere Laser verschiedener Wellenlängen untergebracht sein und es kann zwischen verschiedenen Wellenlängen ausgewählt werden, wobei auch mehrere Wellenlängen gleichzeitig ausgewählt werden können - wird über ein Strahlformungsmodul 12 und ein Scanmodul 13 - welches beispielsweise zur Erzeugung eines quasi-statischen Lichtblatts und / oder zu einer Winkeleinstellung verwendet werden kann - auf ein Beleuchtungsobjektiv 14 gelenkt, welches das Lichtblatt in die Lichtblattebene, die hier der optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 14 entspricht, in den Kanalträger 4 und den Durchflusskanal 3 abbildet. Der Fokus des Beleuchtungsobjektivs 14, d.h. die Stelle, an welche das Lichtblatt die dünnste Ausdehnung hat, lässt sich mit Hilfe eines Antriebs, beispielsweise mit Hilfe eines Piezoantriebs 15, steuern, so dass er beispielsweise bei der Verwendung nur eines Durchflusskanals in diesem liegt. Alternativ oder ergänzend kann auch der Probentisch 6 verstellt werden.
Auf der rechten Seite ist eine beispielhafte Detektionsoptik 10 abgebildet, diese umfasst ein Detektionsobjektiv 16, welches analog zum Beleuchtungsobjektiv 14 mittels eines Antriebs, hier ebenfalls mittels eines Piezoantriebs 17 verstellt werden kann. Die optische Achse des Detektionsobjektivs 16 schließt mit der Lichtblattebene, in der die optische Achse des Beleuchtungsobjektivs 14 liegt, einen von Null verschiedenen, hier einen rechten Winkel ein. Dies ist jedoch nicht zwingend notwendig: Damit das Verfahren funktioniert, reicht ein von Null verschiedener Winkel zwischen der Ebene des Lichtblatts und der optischen Achse des Detektionsobjektivs 16 aus. Die Anordnung der beiden optischen Achsen der Objektive zueinander in einem Winkel von 90° bietet jedoch den Vorteil, dass dann die Fokusebene des Detektionsobjektivs 16 mit der Lichtblattebene identisch ist und daher sämtliche Bereiche der Lichtblattebene, sofern sie vom Detektionsobjektiv 16 erfasst werden, scharf abgebildet werden können, hier also der gesamte, schräge Querschnitt durch den Durchflusskanal 3. Durch das Detektionsobjektiv 16 wird von der Probe 1 abgestrahltes Detektionslicht, beispielsweise von ihr nach entsprechender Anregung emittiertes Fluoreszenzlicht auf ein Detektionsmodul 18 gelenkt, mit Hilfe von Strahlteilern können hier auch mehrere Detektionsmodule verwendet werden. Bei der Beleuchtung der Probe simultan oder quasi-simultan mit einem mehrere Wellenlängen umfassenden Lichtblatt kann beispielsweise die Detektion nach Wellenlängen unterschiedlich vorgenommen werden. Im Detektionsmodul 18 befindet sich in der Regel ein flächenförmiger Detektor, der die Intensität und gegebenenfalls die Farbe registriert und in ein entsprechendes elektrisches Signal umwandelt, welches dann an eine Analyseeinheit und eine Bildverarbeitungseinheit übermittelt und dort verarbeitet wird.
2 zeigt einen Kanalträger 4 im Detail. Der mindestens eine Durchflusskanal 3 ist im Kanalträger 4, beispielsweise einem Mikrofluidik-Chip ausgebildet, dabei handelt es sich in der Regel um einen transparenten, plattenförmigen Körper mit zwei einander parallelen Großflächen und Randflächen, die die beiden Großflächen verbinden. Der mindestens eine Durchflusskanal 3 ist als ein zu zwei Seiten offener Hohlraum in dem transparenten, plattenförmigen Körper ausgebildet. Bei der gezeigten Vorrichtung ist ein Lichtblatt 19 so ausgerichtet, dass es den mindestens einen Durchflusskanal 3 in einen Schnittbereich 20 schneidet und die Normale 21 der Lichtblattebene 22 mit der Strömungsrichtung 23 im Schnittbereich 20 einen von Null verschiedenen Winkel einschließt; im Schnittbereich 20 werden die Proben 1 hier beispielsweise zur Emission von Fluoreszenzsignalen angeregt. Zwischen dem Schnittbereich 20 und dem Beleuchtungsobjektiv 14 bzw. dem Detektionsobjektiv 16 befindet sich transparentes Material des Kanalträgers 4, und aufgrund der gewählten Anordnung sind die optischen Achsen des Detektionsobjektivs 16 und des Beleuchtungsobjektivs 14 nicht in einem rechten Winkel, sondern schräg zu den Grenzflächen zwischen Kanalträger 4 und Durchflusskanal 3 und zwischen der Unterseite des Kanalträgers 4 und einem darunter befindlichen Medium angeordnet. Dies resultiert in Abbildungsfehlern. Um diese Aberrationen zu korrigieren, kann das Lichtblattmikroskop 8 verschiedene, in 1 beispielhaft gezeigte Korrekturmittel aufweisen, die einzeln oder in Kombination eingesetzt werden können. Beispielsweise können den Objektiven spezielle Linsen vorgeschaltet werden, sogenannte „virtuelle Relays“. Dabei handelt es sich um Freiformlinsen, welche zur Korrektur der Aberrationen bei einer vorgegebenen Dicke des Kanalträgers 4 - hier zwischen Durchflusskanal 3 und dem Boden, d.h. der Unterseite des Kanalträgers 4 - und bei einem vorgegebenen Medium, welches sich zwischen der Freiformlinse und dem Kanalträger befindetbeispielsweise Luft oder ein Immersionsmedium - ausgelegt sind. Mit Hilfe von Meniskuslinsen lassen sich von Immersionsmedien hervorgerufene Aberrationen korrigieren, wobei hier mit einer Meniskuslinse je nach Auslegung auch Korrekturen für mehrere Immersionsmedien vorgenommen werden können. Aberrationen aufgrund des schiefen Durchtritts von Licht durch den Kanalträger 4 zwischen dessen Unterseite und Durchflusskanal 3 lassen sich mit Meniskuslinsen jedoch nicht korrigieren. Schließlich lassen sich auch Wellenfrontmanipulatoren, sogenannte Alvarez-Platten, für die Korrektur beider Arten von Aberrationen verwenden. Mit Hilfe von Wellenfrontmanipulatoren kann beispielsweise der Dickenbereich eines virtuellen Relays erweitert werden.
In der hier gezeigten Ausführung sind zum einen im Beleuchtungsobjektiv 14 und im Detektionsobjektiv 16 beispielhaft jeweils - einstellbare - Wellenfrontmanipulatoren 24 angeordnet. Zum anderen befindet sich zwischen den Objektiven des Lichtblattmikroskops 8 und dem Kanalträger 4 ein virtuelles Relay 25, welches hier als eine Linse dargestellt ist, jedoch auch mehrere Linsen umfassen kann. Zwischen dem virtuellen Relay 25 und der Unterseite des Kanalträgers 4 befindet sich als Medium beispielsweise Luft 26 oder eine Immersionsflüssigkeit 27. Die Korrekturmittel - virtuelles Relay 25 oder eine Meniskuslinse 28 und Wellenfrontmanipulatoren 24 - können in Kombination, aber auch einzeln eingesetzt werden, gegebenenfalls in Abhängigkeit von dem Medium, was sich an der Unterseite des Kanalträgers 4 befindet. Darüber hinaus lassen sich selbstverständlich auch weitere Korrekturmechanismen wie weitere Vorschaltlinsen oder Freiformlinsen, die in die Objektive integriert sind, verwenden.
Proben 1, die sich in dem mindestens einen Durchflusskanal 3 entlang der Strömungsrichtung 23 wie in 2 gezeigt fortbewegen, werden im Schnittbereich 20 vom Lichtblatt 19 zur Fluoreszenz angeregt, sofern sie vorher entsprechend markiert wurden. Bei dem Schnittbereich 19 handelt es sich um ein kleines Volumen, da das Lichtblatt auch in den Bereichen größter Fokussierung senkrecht zur Lichtblattebene eine endliche Ausdehnung besitzt, die allerdings im Vergleich zur Ausdehnung des Lichtblattes in der Ebene wesentlich geringer gegenüber dieser vernachlässigbar ist. Der Anschaulichkeit halber wurde der Schnittbereich hier jedoch etwas vergrößert dargestellt. Die Fluoreszenzsignale werden von der Detektionsoptik 10 detektiert und durch nicht gezeigte Analysemittel quantitativ ausgewertet, wie dies auch im Stand der Technik üblich ist. Zusätzlich zu den Fluoreszenzsignalen kann jedoch auch ein vollständiges Bild der Probe 1 aufgenommen werden, es können darüber hinaus auch Bildstapel aufgenommen werden, ohne eine der Komponenten mechanisch bewegen zu müssen, da sich aufgrund der Strömungsgeschwindigkeit die Probe 1 entlang der Strömungsrichtung 23 durch die Fokusebene des Detektionsobjektivs 16, die in der Regel der Lichtblattebene 22 entspricht, bewegt. Die aufgenommenen Bilddaten, beispielsweise Form, Morphologie, räumliche Struktur, die hier in höherer Auflösung vorliegen, als im Stand der Technik möglich, können zur weiteren Analyse und gegebenenfalls auch für eine entsprechende Sortierung der Proben anhand weiterer Parameter zusätzlich zur Fluoreszenz herangezogen werden. Eine gesonderte Fokussierung auf die Probe ist nicht notwendig. Auch müssen die Proben nicht strömungstechnisch im Durchflusskanal 3 fokussiert werden, da das Lichtblatt 19 den Durchflusskanal 3 in seinem Querschnitt abdeckt. Dies hat den Vorteil, dass auch größere Durchflusskanäle 3 verwendet werden können und höhere Zelldichten vermessen werden können, insbesondere wenn die räumliche Bildgebung verwendet wird.
Eine Kombination der Vorrichtung mit weiteren Detektionseinrichtungen ist möglich, Beispiele dafür sind in den 3 und 4 gezeigt. 3 zeigt zusätzlich zu dem hier vereinfacht dargestellten Lichtblattmikroskop 8 ein klassisch angeordnetes Mikroskopobjektiv 29, welches mit einer Kamera 30 verbunden ist. Es ist in Bezug auf den Durchflusskanal 3 bzw. den transparenten, plattenförmigen Kanalträger 4 so ausgerichtet, dass es senkrecht zu den Grenzflächen orientiert ist, so dass hier keine Korrektur von durch schrägen Lichteinfall entstehenden Aberrationen notwendig ist. Mit Hilfe eines in den Strahlengang einbringbaren und wieder aus diesem entfernbaren Elements zur Erhöhung der Schärfentiefe (EDOF-Element) 31 können auf diese Weise auch zweidimensionale Bilder mit geringerer Auflösung erzeugt werden. 4 zeigt zusätzlich zu dem inversen Lichtblattmikroskop 8 ein oberhalb des Durchflusskanals 3 angeordnetes weiteres Lichtblattmikroskop 32, die Lichtblätter kreuzen sich. Für beide Lichtblattmikroskope 8, 32 kann dieselbe Konfiguration verwendet werden, es ist aber durchaus möglich, auch unterschiedliche Konfigurationen zu verwenden. Im vorliegenden Fall unterscheiden sich die Korrekturmittel und die Medien zwischen den Objektiven und dem Durchflusskanal 3. Die Lichtblätter 19 können verschiedene Farben aufweisen, sie können auch auf verschiedene Weisen erzeugt werden. Beispielsweise ist es möglich, statische Lichtblätter, die mit Hilfe von Zylinderlinsen erzeugt werden, zu verwenden, oder auch auf anderen Formen basierende Lichtblätter, sogenannte Sinc³-Lichtblätter, mit Hilfe von Mathieu-Strahlen oder Bessel-Strahlen erzeugte Lichtblätter, oder auch Gitter-Lichtblätter, die mit Hilfe von Gittern erzeugt werden.
Im Folgenden werden verschiedene Kanalträger bzw. Mikrofluidik-Chips beschrieben, die besonders für die Verwendung mit einer flächig ausgedehnten Lichtblattbeleuchtung geeignet sind. Solche Kanalträger sind in 5-8 dargestellt.
Da das Lichtblatt in der Ebene eine im Vergleich zum Durchmesser der Durchflusskanäle 3 eine große Ausdehnung besitzt - abhängig von der gewählten Beleuchtungsoptik beispielsweise eine Breite von 400 µm und mehr sowie eine Länge im Bereich zwischen 20 µm und 200 µm - und da die Fokusebene des Detektionsobjektivs 16 in der Lichtblattebene 22 liegt, können Kanalträger 4 verwendet werden, auf denen eine Vielzahl paralleler Durchflusskanäle 3 angeordnet sind. Ein solches Beispiel ist in 5 dargestellt. Dabei können die Durchflusskanäle 3 gemeinsame Zuleitungen und Ableitungen umfassen, wenn die Proben 1 alle aus einer einzigen Großprobe stammen. Es ist aber ebenfalls möglich, die Durchflusskanäle 3 in mehrere Gruppen zusammenzufassen, wobei die Gruppen in sich die gleichen Zu- und Ableitungen aufweisen, jedoch jede Gruppe über eigene Zu- und Ableitungen verfügt. Dies ermöglicht die parallele Untersuchung von Proben 1 aus verschiedenen Probengemengen. Darüber hinaus kann auch jeder Durchflusskanal 3 mit einer eigenen Zuleitung und einer eigenen Ableitung versehen sein. Auch kann die Ableitung für alle Durchflusskanäle 3 gemeinsam sein, selbst wenn sie unterschiedlich gruppiert sind, z.B. für den Fall, dass die Proben 1 anschließend nicht mehr verwendet werden, sondern einen gemeinsamen Entsorgungsbehälter zugeführt werden sollen.
Bei dem Lichtblatt 19 kann es sich um ein mehrfarbiges Lichtblatt handeln, was insbesondere dann von Vorteil ist, wenn parallel Proben 1 aus verschiedenen, unterschiedlich markierten Probengemengen untersucht werden sollen, oder wenn eine einzelne Probe 1, beispielsweise eine Zelle, mit mehreren Farbstoffen markiert wurde, die je nach Anregungswellenlänge bei unterschiedlichen Wellenlängen Fluoreszenz emittieren; auch können gleichartige oder verschiedenfarbige Lichtblätter in vorgegebenen Abständen voneinander parallel zueinander angeordnet sein, sie lassen sich bei entsprechender Ausgestaltung mit einer gemeinsamen Detektionsoptik detektieren.
Die Ergebnisse der Analyse der von der Detektionsoptik 10 detektierten Daten kann auch dazu verwendet werden, die Proben 1 im Anschluss mittels einer Sortiereinheit zu sortieren, nachdem sie durch das Lichtblatt hindurchgetreten sind. Ein Beispiel für einen solchen Kanalträger 4 ist in 6 dargestellt. Die Sortiereinheit umfasst einen Sortiermechanismus 33 und Zweigkanäle 34. Der Sortiermechanismus 33 kann auf im Stand der Technik bekannte Weise ausgestaltet sein, er kann beispielsweise die Proben 1 auf elektrophoretische, akustische oder optische Weise manipulieren bzw. aus ihrer Flussrichtung ablenken, so dass sie in einen von mehreren Zweigkanälen 34 gelenkt werden. Auch dies kann wieder für mehrere Kanäle gleichzeitig erfolgen, da das Lichtblatt eine große Fläche aufweist.
Die Tatsache, dass das Lichtblatt eine im Vergleich zum Kanalquerschnitt große flächige Ausdehnung hat, kann auch dazu genutzt werden, das zeitliche Verhalten von Proben 1 zu untersuchen, wenn beispielsweise Kanalträger 4 verwendet werden, die einen mäandernden Durchflusskanal 3 aufweisen, der vom Lichtblatt 19 mehrfach geschnitten wird, so dass im Durchflusskanal 3 eine gewisse Anzahl von in Strömungsrichtung 23 hintereinander angeordneten Schnittbereichen 20 entsteht. Dies ist beispielhaft in 7 dargestellt. Die Schnittbereiche 20 sind schraffiert. Eine solche Ausgestaltung eines Kanalträgers 4 ist in Zusammenwirkung mit der beschriebenen Vorrichtung besonders dazu geeignet, den zeitlichen Ablauf des Verhaltens einer Probe nach einer Manipulation zu untersuchen. Dazu kann es vorteilhaft sein, Lichtblätter verschiedener Farben zu überlagern und gegebenenfalls zeitlich anzusteuern, falls dies von der Art des Experiments beziehungsweise der Analyse her erforderlich sein sollte. Eine Probe 1 tritt dann bei dem in 7 gezeigten Aufbau zunächst von links in den Durchflusskanal 3 ein und durchläuft den ersten der Schnittbereiche 20. Dort wird eine Manipulation vorgenommen, die beispielsweise einfach in der Anregung von Fluoreszenzemissionen bestehen kann. Andere mögliche Manipulationsmethoden sind beispielsweise die Photoaktivierung - d.h. die Versetzung einer Probe 1 in einen fluoreszenzfähigen Zustand - ebenso wie Uncaging, die Photokonversion - eine Probe 1 wird von einem ersten Zustand, in welchem Fluoreszenzsignale einer ersten Wellenlänge emittiert werden, in einen zweiten Zustand, in welchem die Probe 1 Fluoreszenzsignale einer zweiten Wellenlänge emittiert, überführt -, oder FRAP (fluorescence recovery after photobleaching): Dabei wird innerhalb einer Probe 1, beispielsweise einer Zelle, lokal hohe Intensität eingestrahlt, was lokal an dieser Stelle einen Photobleichungsprozess bzgl. der Fluoreszenz auslöst. Kurze Zeit danach wird an einer weiteren Position schwach angeregt und es werden Bilder aufgenommen, die dahingehend analysiert werden, wie weit die Fluoreszenz durch lokale Diffusion wieder hergestellt wurde. Gegebenenfalls kann mit einem weiteren, überlagerten Lichtblatt eine weitere Reaktion ausgelöst werden. Die Probe 1 verlässt den Schnittbereich 20 wieder und wird durch die Strömung weiter im Durchflusskanal 3 geführt, bis sie auf den nächsten der Schnittbereiche 20 trifft. Dort kann dann die erste Beobachtung oder eine weitere Manipulation mit Hilfe desselben oder eines anderen Lichtblatts erfolgen. In einem weiteren Schnittbereich 20 kann eine weitere Beobachtung gegebenenfalls wieder mit einem anderen Lichtblatt erfolgen. Grundsätzlich ist es möglich, die Lichtblätter aller Farben, die überlagert werden, permanent angeschaltet zu lassen, in Abhängigkeit von der Strömungsgeschwindigkeit und der Länge der Abschnitte des Durchflusskanals 3 zwischen je zwei Schnittbereichen 20 kann jedoch auch eine zeitliche Steuerung der Lichtblätter derart erfolgen, dass zum Zeitpunkt des Durchtritts einer Probe 1 durch einen Schnittbereich 20 nur das dort benötige Lichtblatt eingeschaltet ist. Diese Vorgehensweise lässt sich insbesondere bei der Untersuchung weniger Proben, die mit nicht allzu hoher Geschwindigkeit durch den Durchflusskanal 3 fließen, einsetzen.
Zwei weitere Ausgestaltungen für Kanalträger 4 sind in den 8a und 8b gezeigt. Hier ändert der mindestens eine Durchflusskanal 3 in Strömungsrichtung 23 seinen Durchmesser, hier verengt er sich. Diese Verengung kann dazu genutzt werden, die Proben 1, insbesondere Zellen mechanisch zu deformieren. Durch entsprechende Positionierung der Lichtblätter - wie beispielhaft in 8a gezeigt - kann dann ein Bild der Probe vor der Deformierung und ein Bild während der Deformierung aufgenommen werden, durch die Strömung lassen sich dabei ohne weiteres räumliche Bilder der deformierten Zelle erzeugen. Alternativ kann der Durchflusskanal 3 nach der Verengung umgelenkt und zurückgeführt werden, so dass die deformierte Probe dasselbe Lichtblatt noch einmal durchläuft. Verbreitert sich der Durchflusskanal 3 wieder, kann ein weiteres Bild aufgenommen werden, mit dem analysiert werden kann, ob permanente Deformationen aufgetreten sind.
Die vorangehend beschriebene Vorrichtung lässt sich für die optische Manipulation und Analyse biologischer, mit Fluoreszenzmarkern markierter Proben, insbesondere für eine Vielzahl von Proben in kurzer Zeit verwenden. Zusätzlich zu einer quantitativen Analyse ist es möglich, Bilddaten sowohl in zweidimensionaler als auch in räumlicher Darstellung in hoher Auflösung zu generieren, so dass auch Bilder in hoher Auflösung für detailliertere Analysen zur Verfügung stehen. Dadurch ist es möglich, weitere Parameter für eine mögliche Sortierung von Proben zu generieren. Dabei sind sowohl ein hoher Probendurchsatz für die Analyse als auch eine detaillierte Analyse jeder einzelnen Probe möglich.
Bezugszeichenliste

1: Probe
2: Kanalisierungseinrichtung
3: Durchflusskanal
4: Kanalträger
5: Schlauchleitung
6: Probentisch
7: Auflagefläche
8: Lichtblattmikroskop
9: Beleuchtungsoptik
10: Detektionsoptik
11: Lasermodul
12: Strahlformungsmodul
13: Scanmodul
14: Beleuchtungsobjektiv
15: Piezoantrieb
16: Detektionsobjektiv
17: Piezoantrieb
18: Detektionsmodul
19: Lichtblatt
20: Schnittbereich
21: Normale der Lichtblattebene
22: Lichtblattebene
23: Strömungsrichtung
24: Wellenfrontmanipulator
25: virtuelles Relay
26: Luft
27: Immersionsflüssigkeit
28: Meniskuslinse
29: Mikroskopobjektiv
30: Kamera
31: EDOF-Element
32: weiteres Lichtblattmikroskop
33: Sortiermechanismus
34: Zweigkanal

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 2013286181 A1 [0011]
DE 10257423 A1 [0012]
WO 2004/053558 A1 [0012]
WO 2012/110488 A2 [0012]
WO 2012/122027 A2 [0012]
DE 102013107297 A1 [0012]
DE 102013107298 A1 [0012]
DE 102013112596 A1 [0012]
DE 102013112600 A1 [0012]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

„Microfluidic Cell Sorting: A Review of the Advances in the Separation of Cells from Debulking to Rare Cell Isolation“ von C. W. Shields IV et al., erschienen in Lab Chip. 15(5), S. 1230-1249 im Jahr 2015 [0006]
F.-U. Gast et al., „The microscopy cell (MicCell), a versatile modular flowthrough system for cell biology, biomaterial research, and nanotechnology“, erschienen in MicrofluidNanofluid 2, S. 21-36 im Jahr 2006 [0008]
„Selective Plane Illumination Microscopy Techniques in Developmental Biology“ von J. Huisken et al., erschienen im Jahr 2009 in der Zeitschrift Development Bd. 136, S. 1963 [0012]

Claims

Verfahren zur optischen Untersuchung einer Vielzahl mikroskopischer Proben (1), bei dem - die Proben (1) aus der Vielzahl kanalisiert und nacheinander mittels einer Strömung in mindestens einen Durchflusskanal (3) geleitet werden, in dem sie sich entlang einer vorgegebenen Strömungsrichtung (23) fortbewegen, - die Proben (1) beleuchtet werden, - von den Proben (1) abgestrahltes Licht detektiert und analysiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass - die Proben (1) beleuchtet werden, indem mindestens ein Lichtblatt (19) mit einer Lichtblattebene (22) auf den mindestens einen Durchflusskanal (3) gerichtet wird, und das Lichtblatt (19) so ausgerichtet wird, dass es den Durchflusskanal (3) in einem Schnittbereich (20) schneidet und die Normale (21) der Lichtblattebene (22) mit der Strömungsrichtung (23) im Schnittbereich (20) einen von Null verschiedenen Winkel einschließt, und - das von den Proben (1) abgestrahlte Licht von einer abbildenden Detektionsoptik (10) registriert wird, deren Fokusebene im Schnittbereich (20) liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsoptik (10) ein Bild oder zeitlich sequentiell einen Bildstapel aus Einzelbildern jeweils einer durch den Schnittbereich (20) strömenden Probe (1) detektiert.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Einzelbilder des Bildstapels zu einer räumlichen Darstellung zusammengesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben (1) vor der Untersuchung mit Fluoreszenzmarkern markiert werden, durch das mindestens eine Lichtblatt (19) zur Aussendung von Fluoreszenzsignalen angeregt werden, und die Fluoreszenzsignale detektiert und analysiert werden.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass anhand der Analyse des von der Detektionsoptik detektierten Lichts, ggf. von Informationen aus Bildern und/oder von Fluoreszenzsignalen eine Sortierung der Proben (1) erfolgt.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Untersuchung des zeitlichen Verhaltens der Proben das mindestens eine Lichtblatt (19) den mindestens einen Durchflusskanal (3) mehrfach in Schnittbereichen (20) schneidet.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Lichtblatt (19) eine Vielzahl von Durchflusskanälen (3) schneidet.
Verfahren nach einem der vorgenannten Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben (1) mit mehreren Lichtblättern (19), bevorzugt verschiedener Wellenlängen, beleuchtet werden.
Vorrichtung zur optischen Untersuchung einer Vielzahl mikroskopischer Proben (1), umfassend - eine Kanalisierungseinrichtung (2) zum Kanalisieren und zur Zuführung der Proben (1) nacheinander in - mindestens einen Durchflusskanal (3), in welchem sich die Proben (1) entlang einer vorgegebenen Strömungsrichtung fortbewegen, - Beleuchtungsmittel zur Beleuchtung der Proben (1) im mindestens einen Durchflusskanal (3) zur Abstrahlung von Detektionslicht, - Detektionsmittel zur Detektion des von den Proben (1) abgestrahlten Detektionslichts, - Analysemittel zur Analyse des Detektionslichts, dadurch gekennzeichnet, dass - die Beleuchtungsmittel eine Beleuchtungsoptik (9) zur Erzeugung mindestens eines Lichtblatts (19) mit einer Lichtblattebene (22) umfassen, wobei das Lichtblatt (19) in Bezug auf den Durchflusskanal (3) so ausgerichtet ist, dass es den Durchflusskanal (3) in einem Schnittbereich (20) schneidet und die Normale (21) der Lichtblattebene (22) mit der Strömungsrichtung (23) im Schnittbereich (20) einen von Null verschiedenen Winkel einschließt, wodurch im Schnittbereich (20) die Proben (1) beleuchtet werden, und - die Detektionsmittel eine abbildende Detektionsoptik (10) umfassen, deren Fokusebene im Schnittbereich (20) liegt.
Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Durchflusskanal (3) an einem auswechselbaren Kanalträger (4) ausgebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Kanalträger (4) eine Vielzahl paralleler Durchflusskanäle (3) angeordnet ist, welche bevorzugt voneinander getrennte Zu- und / oder Ableitungen und jeweils einen Schnittbereich (20) mit dem Lichtblatt (19) aufweisen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass dem Lichtblatt (19) in Strömungsrichtung (23) eine Sortiereinheit nachgeordnet ist und / oder eine Manipulationseinheit vor- oder nachgeordnet ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsmittel Licht zur Anregung von mit Fluoreszenzmarkern markierten Proben (1) zur Emission von Fluoreszenzsignalen abstrahlend ausgebildet sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsmittel weitere Detektoren zur Detektion der Fluoreszenzsignale und/oder von Streulicht umfassen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsmittel eine Beleuchtungsoptik (9) oder mehrere Beleuchtungsoptiken (9) zur Erzeugung mehrerer Lichtblätter (19) umfassen, deren Lichtblattebenen parallel zueinander liegen, wobei bevorzugt jedes der Lichtblätter eine andere Farbe aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Durchflusskanal (3) in Strömungsrichtung (23) seinen Durchmesser ändernd und / oder in Bezug auf die Lage des Lichtblatts (19) zur Ausbildung mehrerer Schnittbereiche (20) mit diesem mäandernd ausgebildet ist.