WO2015032868A1 - Vorrichtung und verfahren zur messung an membranen und zellen - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur messung an membranen und zellen Download PDF

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WO2015032868A1
WO2015032868A1 PCT/EP2014/068859 EP2014068859W WO2015032868A1 WO 2015032868 A1 WO2015032868 A1 WO 2015032868A1 EP 2014068859 W EP2014068859 W EP 2014068859W WO 2015032868 A1 WO2015032868 A1 WO 2015032868A1
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WO
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opening
substrate
cell
membrane
transparent material
Prior art date
Application number
PCT/EP2014/068859
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English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Knott
Michael Huber
Peter VAN STIPHOUT
Original Assignee
Cytocentrics Bioscience Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cytocentrics Bioscience Gmbh filed Critical Cytocentrics Bioscience Gmbh
Publication of WO2015032868A1 publication Critical patent/WO2015032868A1/de

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp

Definitions

  • the invention relates to a device in the manner of a patch clamp chip for determining preferably biologically relevant measured variables on membranes and cells as well as methods for determining such measured variables.
  • patch-clamp technique is an electrophysiology measuring method known from the works of Neher and Sakmann since the second half of the 1970s. By this method, currents can be represented by individual ion channels in biological membranes and cell membranes.
  • a glass capillary which is usually freshly prepared, is filled with a conductive solution, into which a metal electrode dips, and contacted, usually under optical control, with an intact cell. Then a seal between the biological membrane and the pipette is created by an applied negative pressure, ideally to form a so-called gigaseal, i. forming an electrical resistance of the order of at least one gigaohm.
  • patch-clamp techniques have been developed - - which are carried out on planar, ie flat, substrates.
  • a cell suspension is applied to a flat substrate, also referred to as a chip, and the membranes / cells are positioned on openings or recesses provided in that chip.
  • microfluidic structures which are necessary or advantageous for the corresponding measurement are ideally already integrated in the so-called patch clamp chip.
  • the invention has the task of further improving the already known planar patch clamp systems.
  • the aim is to purposefully vary the factors which influence the measured variables in the patch-clamp measurement, and - - Their better to detect and evaluate the measured quantities obtained.
  • the device according to the invention is provided in the manner of a patch clamp chip for determining preferably biologically relevant measured variables on membranes and cells.
  • these membranes and cells have membrane proteins, such as ion channels, or are capable of forming such membrane proteins.
  • the claimed device has at least one, preferably flat, substrate which has microfluidic components and / or microfluidic structures and at least one opening on which the membrane or cell can be immobilized, at least during a measurement with electrical contact.
  • This immobilization is preferably carried out at the top of the opening.
  • the device according to the invention has at least one optical path which is assigned to the substrate and / or is part of the substrate. This optical path serves in the broadest sense for the passage or transmission of electromagnetic radiation.
  • the invention can also be described in such a way that in the case of a planar patch clamp system which has at least one, preferably flat, substrate and with which the automated method for patch clamp - -
  • At least one optical path is available. This optical path is either part of the substrate itself, or it is associated with the substrate.
  • substrate is to be understood according to the invention comprehensively, ie, it should be a material such as a carrier, a base plate or the like, on which the necessary structures for carrying out the patch clamp measurements, components and the like This is intended to mean that such substrates generally have a greater width or length, in particular a substantially greater width or length than the thickness (FIG. As a rule, the thickness of a film-like substrate, which may also be flexible, is less than the thickness of a plate-like substrate.
  • Microfluidic components or “microfluidic structures” are components, structures, components and the like which enable storage, movement, mixing, separation or other handling of liquid media in the smallest and smallest spaces.
  • the membranes or cells to be examined are generally handled in the form of suspensions in suitable solvents, and in the process u.a. brought to the appropriate patch clamp opening or transported away from this. Such suspensions are passed through said microfluidic components and structures.
  • the corresponding field is known to the person skilled in the art under the term of microfluidics.
  • membranes are to be understood as meaning all separating layers or even layers having a different function, which can be investigated with the aid of the patch-clamp technique - -
  • Lipid bilayers are feasible.
  • the so-called biomembranes which are preferably investigated according to the invention, are usually separating layers between different regions within a living cell (intracellularly) or else between the interior of a cell and the cell outer space. Accordingly, it is possible according to the invention to study both individual membrane fragments, complete membranes or even complete cells. Also cell composites should be included in this regard of the invention.
  • an "optical path" is means which are suitable for the passage or transmission of electromagnetic radiation, and such means may also optionally contain further means for generating the electromagnetic radiation itself.
  • the optical path is not limited to the passage or the transmission of certain wavelengths of the electromagnetic radiation.
  • the most varied wavelengths in particular from the field of ultraviolet radiation to the field of infrared radiation, can be transmitted.
  • the term "optical” is to be understood broadly, and not limited only to the range of visible light.
  • the optical path is used in the invention in the broadest sense to make available the electromagnetic radiation transmitted through it for the patch clamp measurement, in particular the automated patch clamp measurement. As long as this purpose is fulfilled, it basically does not matter in which way the optical path is provided in the device according to the invention.
  • the optical path may be associated with the substrate in any manner or may constitute part of the substrate.
  • the optical path may be associated with the substrate in any manner or may constitute part of the substrate.
  • Various preferred embodiments will be discussed below. - -
  • the substrate there is at least one opening in the substrate at which the membrane or cell is immobilized to form the seal.
  • This opening will usually be formed on a channel, a pore, a bore or the like, which represents the patch clamp pipette in the broadest sense.
  • the immobilization is preferably carried out on the "top" of the patch clamp pipette and thus also on the "top” of the opening formed by this pipette. This will be explained in more detail in connection with the drawings.
  • optical path provided according to the invention can now basically be provided at arbitrary locations on the substrate or assigned to it. If this is referred to the embodiment just described, that the immobilization of the membrane or cell takes place at the "top" of the opening, the optical path can accordingly be assigned to possible side surfaces of the substrate or also to the side (upper side) at which the immobilization of the Membrane / cell takes place.
  • the optical path is assigned to that side of the substrate or is located on that side of the substrate which faces away from the side of the opening at which the membrane / cell is immobilized.
  • the immobilization of the membrane / cell is then preferably at the top of the opening (functional state), while the optical path is then provided on the substrate on the side facing away from the membrane / cell Page of the opening or the patch clamp pipette heard.
  • the optical path is used, for example, for a direct optical observation of the membrane / cell during the measuring process or, for example, for optical excitation of the membrane / cell or for optical excitation of reactions taking place at the membrane / cell, this is also possible so describe that this observation / excitation is done "from below”.
  • the optical path in the invention can be realized in various ways.
  • the optical path is formed at least partially, preferably completely, as a recess in the substrate itself.
  • the recess may preferably have a rounded cross-sectional area. The radius of this cross-sectional area may decrease in stages or conically from the bottom of the substrate.
  • the substrate in the invention at least partially made of material that is transparent to at least a portion of the electromagnetic spectrum (ie, at least partially, preferably substantially completely transparent), so at the locations where the optical path is to be formed, either this Material itself or other material surrounding this material, are removed, in order to allow in this way the "access" of the corresponding electromagnetic radiation towards the immobilized membrane / cell and thus the corresponding observation / excitation and the like.
  • the optical path comprises a transparent material which is transparent (at least in part) at least for part of the electromagnetic spectrum.
  • a transparent material which is transparent (at least in part) at least for part of the electromagnetic spectrum.
  • This may also be, for example, corresponding plastic materials.
  • the optical path in such cases comprises (transparent) glass or quartz glass (S1O 2 ) or consists entirely of such materials.
  • viewing openings or so-called windows made of transparent glass or quartz glass can then be provided in these cases.
  • the substrate itself consists at least partially, preferably completely, of transparent material, in particular of glass or quartz glass.
  • the substrate may in particular be composed of at least two, preferably a plurality of layers, wherein in particular at least - - At least one of these layers of the transparent material, and preferably consists of glass or quartz glass.
  • a device according to the invention comprising a substrate constructed of layers, at least one lower first layer of non-transparent material, in particular of silicon, and at least one upper second layer of transparent material, in particular of glass or quartz glass.
  • the existing lower layer of non-transparent material can impart to the substrate as a whole the necessary stability, in particular mechanical strength, for handling the device.
  • this lower layer can consist of a material that is mechanically more stable than glass / quartz glass, such as silicon. Or it is (additionally or alternatively) possible to make this lower layer of non-transparent material substantially thicker than the upper layer of transparent material. Both measures (individually or in combination) then give the substrate the stability necessary for its handling.
  • the substrate consists at least partially of transparent material
  • the microfluidic components and / or structures or the opening for immobilizing the membrane or cell are provided individually or in combination in the transparent material itself. This facilitates, for example, the observability or influenceability of the processes taking place in these components or structures.
  • this material may be at least partially removed or removed to form a corresponding optical path. This can be done, for example, by (physical or chemical) etching - - of the material until the (next) layer of transparent material in the substrate comes to light.
  • the layer of transparent material may represent a physico-chemical etch stop for the etching process.
  • An optical path formed by etching in the substrate or a corresponding optical window usually has a (circular) round or rounded cross-sectional area whose diameter or radius changes over the thickness of the remaining non-transparent layer, preferably in the direction of the transparent layer can reduce.
  • the diameters of the circular recess are generally below 1 .000 ⁇ m, preferably below 300 ⁇ m.
  • the (upper) transparent layer which has the microfluidic components and structures and the like, usually has a thickness of ⁇ 100 ⁇ , wherein the thickness is preferably ⁇ 50 ⁇ , preferably ⁇ 35 ⁇ .
  • Individual partial layers of the transparent layer have a thickness between 1 ⁇ and 100 ⁇ .
  • the optical path comprises at least one glass fiber optic or at least one microscope optic.
  • Such optics are then also suitably associated with the substrate, or they form a component of the substrate.
  • such optics may be provided in corresponding recesses on the substrate.
  • optics should be understood comprehensively and mean that in principle any type of electromagnetic radiation can be transmitted through the corresponding optics.
  • a material with a higher refractive index than that of the material of the optical path can be arranged below the transparent substrate, in particular below the (lowest) layer of the substrate of non-transparent material.
  • This higher refractive index material may also be integrated into the corresponding fiber optic / glass optics / microscope optics.
  • the electromagnetic radiation entering the optical path or into the optical window is made of a material of higher refractive index into a material of lower refractive index (for example in air in the recess).
  • the so-called aperture of the existing optical system is then optimized.
  • microfluidic components or micro-fluidic structures in the device according to the invention can be embodied in different ways, in particular with regard to the fact that automated patch clamp measurements can be carried out.
  • embodiments of the device according to the invention are preferred in which at least one (further) separate channel is provided in addition to the opening at which the membrane / cell is immobilized, and optionally in addition to the channel on which this opening is formed.
  • This separate channel is not in direct communication with said opening and is intended to position the membrane or cell by applying a negative pressure to said opening.
  • the (additional) separate channel may have any cross-sectional shape or cross-sectional area. Preferably, they are cross-sectional areas which are circular, oval, rectangular or square. However, there are also other n-cornered (n> 3) cross-sectional areas u.a. possible. The diameter D of all these cross-sectional areas should be defined as the largest dimension existing between two points on the outer circumference of the cross-sectional area.
  • said separate channel opens in a separate port, i. in an opening that does not communicate with the opening where the membrane / cell is immobilized.
  • the separate opening surrounds the opening at which the membrane / cell is immobilized, at least partially, preferably completely concentrically. This too will be explained in more detail in connection with the drawings.
  • the diameter (D) of the separate channel over the course of this channel is not constant.
  • the diameter of the separate channel increases in the direction of its separate opening, preferably continuously.
  • the function of the separate channel namely the membrane / cell (before the formation of the actual seal / gigaseal at the opening), for example, from the suspension in which the membrane / cell is located to select, position or re-closed remove in a controllable way even better.
  • the feature of the separate channel which is provided for positioning / fixing the membrane / cell to the actual patch-clamp opening, can be realized in different ways.
  • a separate channel which opens into the associated separate opening, may be provided.
  • a separate channel may also be present, - - which communicates with at least two, preferably a plurality of separate openings.
  • embodiments are possible in which at least two, preferably a plurality of separate channels are provided, which in turn may each open into a separate opening or in at least two, preferably a plurality of openings.
  • the separate openings in which the separate channels open open the actual (patch clamp) opening at which the membrane / cell is immobilized to form a seal / gigaseal, surrounded at least partially concentrically.
  • the cell can be positioned or fixed in a particularly favorable manner along its outer circumference at or above the actual patch clamp opening.
  • the device according to the invention is formed as follows by further defining the intended microfluidic components or structures. She points out:
  • an optical path for the transmission of electromagnetic radiation is present.
  • This optical path is preferably located on the side of the substrate facing away from the top of the opening.
  • the channel thus has the opening in the manner of a patch clamp pipette, at which the immobilization of the membrane / cell takes place with formation of the seal / gigaseal for the patch clamp measurement.
  • This opening opens into the perfusion chamber, in which the immobilized membrane / cell is immobilized during patch clamp measurement.
  • the further liquid channel which may communicate with said channel, serves to apply at the opening a defined, adjustable liquid pressure to the membrane / cell to form the seal / gigaseal. This is also apparent from the drawings.
  • the separate channel which is not in (direct) connection with said opening on which the seal / gigaseal is formed, opens in one or more separate openings.
  • These separate openings serve, for example, to position the membrane / cell by applying a negative pressure to the opening at which the seal / gigaseal is later formed.
  • the separate opening or the separate openings at least partially concentric, preferably completely concentric, surrounds or surrounds the opening on which (later) the seal / gigaseal is formed.
  • the one or more separate openings may be configured to allow flow past the cell through the separate opening, whereby the solution change or suspension change on the cell in the longitudinal flow in the perfusion chamber (ie in the longitudinal direction of the chamber from inlet to drain ) can additionally be accelerated by exposing the cell to a transverse flow (ie transversely, in particular perpendicular to the longitudinal direction (in the direction of the substrate) in addition to a laminar longitudinal flow).
  • Both the channel in the manner of a patch clamp pipette and the separate channel are preferably controllable and controllable in such a way that these channels can be acted upon specifically with liquid, in particular with liquid pressure, and this bidirectional. This means that targeted overpressures and underpressures of the corresponding liquids can be introduced into these channels, so that they fulfill the functions described.
  • the latter functions can be provided according to the invention in that at least two, preferably two, further liquid channels are provided, which are connected to the channel in the manner of a patch clamp pipette.
  • at least two separate channels preferably two (further) separate channels, which are in communication with the separate opening may be provided.
  • the respective additional (second) channels can take over a bypass function for the respectively associated (first) channels.
  • the channel in the manner of a patch clamp pipette or the separate channel with the aid of the respective bypass channel.
  • the two mutually associated channels are used as a feed channel (inflow direction of the liquid) or as a discharge channel (return direction of the liquid).
  • the actual patch-clamp channel (pipette) or the actual separate channel assigned to the separate opening is thus in the manner of a disconnection.
  • - - filled branch since the actual filling flow of the liquid is guided past the respective openings. This is particularly of practical importance, since in this way, for example, air or generally gases that are in these microfluidic structures, better controlled or regulated flow and possibly can be replaced by the corresponding liquid.
  • a fluid exchange in the microfluidic structures is better possible in this way, since such a liquid exchange then does not have to be made via the actual patch clamp opening or via the separate opening.
  • Such a fluid exchange is necessary, for example, after the mechanical breakdown of a cell membrane for an intracellular solution change or for the introduction of perforating substances, if a mechanical breakdown of the cell membrane is not provided.
  • the opening formed by the channel in the manner of a patch clamp pipette and / or the separate opening formed by the separate channel project into the perfusion chamber, ie, as it were located inside the perfusion chamber.
  • This can also be described in such a way that the corresponding openings in these cases are not located in the boundary surface or wall of the perfusion chamber, but project beyond this boundary surface into the interior of the perfusion chamber.
  • a cell contacted on the opening can be washed around more rapidly with another solution or suspension, for example in order to flush a ligand faster to a ligand-controlled ion channel than this ion channel deactivates by desensitization.
  • the last-described design of the openings (inches) can be realized for example by a corresponding micromechanical structuring in the substrate.
  • the substrate may at least partially consist of glass or quartz glass, preferably completely of glass or quartz glass.
  • partially or completely transparent materials such as partially or completely transparent plastics can be used.
  • materials which have a specific transmission spectrum are useful for e.g. certain frequency components of electromagnetic radiation (for example, with unwanted biological activity) hide.
  • the invention also includes devices in which not only one opening, but at least two, preferably a plurality of openings are provided in a substrate, preferably a flat substrate, on which a seal / gigaseal is formed by immobilizing a membrane / cell.
  • a substrate preferably a flat substrate
  • separate openings may then optionally be provided for all openings, at which a prior positioning of the membranes / cells before the formation of the seal / gigaseal is possible.
  • such separate openings may surround these openings at least partially, preferably completely, concentrically.
  • a device according to the invention comprises a plurality of preferably flat substrates (with one or more openings).
  • a suitable support which can be arranged, for example, in a grid or grid-like manner.
  • the device according to the invention may advantageously be associated with at least one stop.
  • this stop is meant any device which is capable of mechanically fixing the device according to the invention, i. to prevent their (further) movement.
  • the corresponding device can be positioned using the stop for the determination of the relevant measured variables, in particular reversibly positioned.
  • the stop provided in the device can be provided on the device itself, or the device can be brought into contact with such a stop.
  • at least one stop of a generally shorter end face of the substrate and at least two stops are assigned to a generally longer longitudinal side of the substrate.
  • stops has the advantage that the device according to the invention can be automatically placed and positioned at certain points of a measuring device or devices, in particular for the cases in which the corresponding devices in the manner of a patch-clamp chip after use, i. replaced after at least one measurement by unused chips and replaced accordingly.
  • a further aspect of the present invention resides in that at least one covering element of preferably elastic material is advantageously provided on the side of the device which is opposite the opening for immobilizing the membrane or cell.
  • the cover element closes off the substrate from this side opposite the opening and accordingly fulfills a protective and optionally also a sealing function for the substrate and the microfluidic components and structures provided thereon.
  • the attachment of the cover can basically be done in any way, for example by gluing, clamping and any other procedures. Due to the elasticity of the material of the cover, the attachment can preferably also be achieved by the existing residual stress after pressing the cover on the chip. To maintain the sealing function of the cover, additional sealing elements may be provided between the substrate and the cover.
  • an elastic material for the cover element also has the advantage that liquids or gases can be introduced into the microfluidic components or structures through the cover element or removed from these components or structures. This can be done for example by means of suitable hollow cannulas, which are pierced through the elastic material. To facilitate this process and to - -
  • Positioning of the hollow cannulas may be provided on the top of the cover corresponding markings and the like.
  • the elastic material of the cover which may be made of silicone or polyimide, for example (not exhaustive list), also with regard to the running measuring operations.
  • the material of the covering element can be deliberately chosen to be at least partially transparent, for example to allow radiation of electromagnetic radiation (incident light), i. from above to allow the substrate. This can deliberately trigger and / or influence processes on the cells or membranes on the substrate.
  • the invention comprises novel methods, which are described below.
  • a method for determining preferably biologically relevant measured quantities on membranes and cells which in particular have or form membrane proteins such as ion channels in which either an optically triggered immobilization of the membrane or of the cell is provided on an opening provided in a preferably flat substrate an optically triggered measurement on a membrane or cell, which is immobilized on an opening provided in a preferably flat substrate, takes place.
  • a stimulation in particular an optical stimulation of the membrane or the cell takes place while the cell is attached to an in a preferably flat substrate provided opening is immobilized.
  • this is preferably a mechanical, a chemical, a biochemical and / or a thermal stimulation.
  • the membrane / cell is accordingly stimulated mechanically, by a chemical or biochemical substance or by the action of heat / heat in order to investigate a possible reaction of the membrane / cell to the corresponding stimulus (stimulation).
  • an optically induced immobilization of the membrane / cell can be realized, for example, in such a way that, based on an optical signal, membranes / cells are caught and immobilized at the patch clamp opening. A release of the membrane / cell from this opening can be effected due to optical signals.
  • An optically triggered measurement on the membrane / cell can be carried out in other embodiments of the method according to the invention by properties, compositions, concentrations of non-organic or organic / biological substances on the immobilized membranes or cells.
  • optically triggered measurement is possible, e.g. a start of the measurement after exceeding a predetermined threshold of an optical or electrophysiological measurement.
  • the most varied measured variables can be determined, such as volume, size, mass, density, electrophysiological activity, vitality, morphology and the like.
  • detection of fluorescent substances such as molecules whose interaction with the membrane / cell according to the invention can be investigated.
  • patch clamp measurements can be combined with imaging microscopy, with fluorescence measurements, with polarization filters, frequency and other filters, with confocal microscopy, with FRET (fluorescence resonance energy transfer), with other (biological / Chemo-) Lumineszenzflop, with photometric or colorimetric measurements, with optical detection of gas bubbles and macroscopic particles, with the use of contrast agents, also in conjunction with the aforementioned methods.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • photometric or colorimetric measurements with optical detection of gas bubbles and macroscopic particles, with the use of contrast agents, also in conjunction with the aforementioned methods.
  • the time-dependent optical measurement of the protein localization and the so-called protein trafficking is also possible according to the invention.
  • the application differs.
  • Most stimuli are possible, namely on the outside of the cells or in the interior of the cells or even in the cell composite or tissue composite. These stimuli are typically applied via the microfluidic structures in the substrate during the measurement.
  • the mechanical stimuli may be a change in the flow rate of the flow, a change of direction of the flow, pressure changes in the various microfluidic structures (patch-clamp channel, suction channel, perfusion chamber and the like).
  • Chemical / biochemical stimulation may be effected via, preferably rapid, substance changes on the cell during its immobilization in the gaseous, e.g. Ligand-controlled ion channels, via a transverse flow flow in the perfusion chamber (so-called cross flow), and the like.
  • This cross flow can take place, for example, with the aid of the intake opening already described.
  • Optical stimulation of light-sensitive proteins for example ion channels or receptors coupled to such ion channels
  • measurement of the light emission in the dark
  • the invention comprises methods in which an optical measurement and / or optical stimulation is combined with patch clamp measurements and / or a change of solution to cells or membranes.
  • a cell or membrane is reversibly placed on the patch clamp opening and visually measured by means of the separate opening. If the cell does not have the desired properties on the basis of the optical measurements, the cell with the separate opening and / or the flow in the perfusion chamber can be rinsed off again and another cell aspirated and, if appropriate, at the patch clamp opening contacted irreversibly after the patch-clamp method and then optically measured and stimulated.
  • intracellular or extracellular solution change can be carried out, e.g. to change the ion concentration or to bring biologically active substances to the membrane or cell.
  • mechanical stimulation can take place via pressures or currents at the opening, separate opening or perfusion chamber.
  • Examples of the method are automated patch clamp in combination with intracellular perfusion, with fluorescence-based detection and cell selection in transient transfection (eg GFP expression), with fluorescence-based detection and cell selection of antibody-labeled cells, with fluorescence detection for intracellular calcium or pH Measurement (Fura-2 or, BCECF dyes and the like), with FRET, in combination with patch clamp to investigate functional relationships of ion channels, with the possibility of optically induced release of cell stimulators and so-called second messengers ("caged compounds").
  • mechanosensitive cells with mechanosensitive cells, with primary cells, stem cells and expression systems, with ligand-controlled ion channels, with lipid membrane preparations (such as liposomes, vesicles, bilayers), with the detection of particle flow, eg nanoparticle density or number of cells - - per volume for cell counting, or for the detection of contamination in liquids, such as drug residues in drinking water and others
  • the invention also encompasses a method for producing a device according to the invention, in which a substrate having a structure of at least two layers is provided or manufactured, wherein at least one lower first layer of non-transparent material, in particular silicon, and at least one upper second layer made of transparent material, in particular of glass or quartz glass. Then, the lower layer of non-transparent material for forming an optical path for the passage or transmission of electromagnetic radiation is at least partially removed, in particular by chemical or physical etching.
  • the dimensions of the substrate which represents an essential component of the device according to the invention, may be of the order of a few mm. Manufacturing technology, the dimensions may be about 1 mm, with dimensions of, for example, 2 mm x 3 mm are common.
  • the diameter of the opening at which the actual patch clamp measurement takes place is between 0.1 ⁇ to a maximum of some 10 ⁇ . This upper limit will usually be about 1/10 of the diameter of the cells to be examined.
  • the diameter of said opening is about 1 to about 5 ⁇ , in particular about 2 to 3 ⁇ .
  • the (total) diameter of the separate opening (of the intake channel) is preferably between 0.5 ⁇ to also a few 10 ⁇ .
  • As upper limit - - for example, twice the diameter of the cells to be examined can be selected.
  • the diameter of the separate opening between about 2 ⁇ and about 20 ⁇ , wherein within this range diameter between about 9 ⁇ and about 12 ⁇ are further preferred.
  • the thickness (height) of the substrate is on the order of a few 10 ⁇ .
  • This substrate usually consists of a support of silicon (Si) with a quartz layer (S1O2) on it.
  • Si silicon
  • S1O2 quartz layer
  • the microfluidic structures channels, openings and the like
  • the pressures that are used in the inventive method in the microfluidic structures are usually between 150 mbar to 4 bar, with pressure changes over the full range of pressure within a short time, for example, within 10 ms, can be made. Shock waves can also be generated in a corresponding manner.
  • the flow velocities within the microfluidic structures, in particular within the perfusion chamber, are preferably between a few ⁇ / s and some 100 mm / s, in which case flow rates between about 2 mm / s to about 400 mm / s are more preferred.
  • stimuli are applied to the immobilized membranes / cells or to the liquids located within the microfluidic structures, they can in principle last as long as the corresponding measurement configuration exists.
  • the duration of the stimuli is between 1 ms and 1 h, with stimuli being more preferred over periods of between 10 ms to 15 min.
  • Fig. 1 shows an embodiment of the device according to the invention
  • Fig. 2 shows another embodiment of the device according to the invention in the manner of a patch clamp chip with additional functional components.
  • the inventive device 1 according to FIG. 1 is provided in the manner already described for determining preferably biologically relevant measured variables on membranes and cells (12), these membranes / cells in particular having or forming membrane proteins such as ion channels.
  • further components of the device 1 such as electrode (s), counter-electrode (s), pump (s), valve (s), liquid reservoir (s), measuring and control device (e) and the like are shown in FIG. not shown.
  • the substrate 2 which is not shown in detail in accordance with FIG. 1, generally comprises a support of silicon (Si) coated with quartz (S1O2).
  • the microfluidic structures (channels, openings and the like) shown in FIG. 1 are usually provided in the quartz layer.
  • the substrate 2 is several 10 ⁇ thick.
  • the substrate 2 according to FIG. 1 has two inlets 3, 4, through which solutions / suspensions, in particular suspensions containing the membranes / cells to be examined, can flow, in a perfusion chamber 6, at their (outlet) end there is a sequence 5.
  • a cell 12 is immobilized on the (upper side) of the opening 8, to form a seal / gigaseal. - -
  • the opening 8 is therefore the actual patch clamp opening at which the patch clamp measurement takes place.
  • the channel 7 with opening 8 is connected to a further channel 9, with the aid of solutions / suspensions in the channel 7 and thus to the opening 8 (and optionally to the immobilized cell 12) can be brought (or discharged again).
  • two channels 9 may be provided, both of which are in communication with the channel 7.
  • the second channel is used, for example, in the manner of a bypass for filling the channel 7 or for liquid exchange in the channel 7.
  • Fig. 1 shows a separate channel 10 with a separate opening 1 1, wherein the opening 1 1 with the channel 7 and the opening 8 is not (directly) connected.
  • a second channel 10 may be provided with bypass function, as already described in connection with channel 9.
  • the diameter of the separate channel 10 increases in the direction of the opening 11. Further, the separate opening 1 1 surrounds the opening 8 concentrically, i. in the manner of a ring enclosing the opening 8, so that with the aid of the separate opening 1 1, a cell 12 can be captured and positioned above the opening 8 (for example by applying a negative pressure / suction pressure). Once the cell 12 is selected and optionally positioned, the actual seal / gigaseal can be formed at the opening 8.
  • FIG. 1 shows a formed as a recess or viewing window 13 optical path, which is provided in the substrate 2.
  • the cell 12 is immobilized on the upper side of the opening 8 or of the channel 7, while the recess 13 or the viewing window 13 is provided on the underside of the substrate , which accordingly is located on the side of the opening 8 or the channel 7 facing away from the cell.
  • An observation or stimulation - - The cell 12 by means of the recess 13 and the viewing window 13 as an optical path is accordingly in the embodiment of FIG. 1 "from below".
  • FIG. 2 shows a further device 21 according to the invention which has additional functional components which have already been described.
  • the actual device according to the invention consists of the substrate 22 which is constructed in two layers as shown, namely the (lower) layer 23 and the (upper) layer 24 arranged above the layer 23.
  • the (lower) layer 23 consists of non-transparent material namely silicon.
  • the (upper) layer 24 is made of transparent material, namely quartz glass (SiO 2 ).
  • the opening 25 is the opening at which the seal / gigaseal is formed between the membrane / cell and the opening.
  • the corresponding cell is not shown in FIG.
  • reference numeral 26 denotes the separate opening which concentrically surrounds the patch-clamp opening 25 (see opening 11 of FIG.
  • Reference numerals 27 and 28 in Fig. 2 denote the channels leading to the patch clamp opening 25 and the separate opening 26 (see channels 7 and 10 in Fig. 1, respectively).
  • all structures described within the layer 24 are made of quartz glass (transparent material).
  • the actual, already functional device 21 according to the invention as shown in FIG. 2 consists of the substrate 22 of (lower) layer 23 and (upper) layer 24.
  • FIG. 2 shows further preferred functional elements in the present invention, which advantageously cooperate with the actual device.
  • cover 29 shown in Fig. 2 which is made according to the invention of an elastic material, for example made of silicone.
  • This cover member 29 closes the substrate 22 on the opposite side of the opening 25, i. in the case shown upwards.
  • the cover member 29 is fixed by means of suitable fasteners, which are not shown in Fig. 2, on the substrate 22 or pressed onto the substrate, wherein between the substrate 22 and cover 29 sealing elements 30 are provided.
  • suitable fasteners which are not shown in Fig. 2, on the substrate 22 or pressed onto the substrate, wherein between the substrate 22 and cover 29 sealing elements 30 are provided.
  • these are three O-rings, which are wrapped around the corresponding three upper openings in the substrate 22.
  • the number of contact points is limited only for the graphical representation, but not within the scope of the invention.
  • a stop 31 which is assigned to the substrate 22, in particular in the present case attached or formed on the lower layer 23.
  • this stop 31 serves to position the substrate and thus the device as a whole within a measuring device or measuring system.
  • a device 21, which is provided for replacement or replacement of an already used device optionally be positioned exactly at the same location as the previous device.
  • a plurality of stops 31 can be provided on the device or on the substrate, for example a stop 31 on a (shorter) front or narrow side and two stops 31 on a (longer) longitudinal side of the device or of the substrate.
  • electromagnetic radiation can be radiated from below in the direction of the transparent layer 24. This takes place in the case of FIG. 2 with the aid of the opening 32 provided in the layer 23, which, as a result, together with the transparent material of the layer 24 forms the optical path provided according to the invention.
  • the recess 32 has, in particular, a rounded cross-sectional area whose diameter or radius decreases stepwise or continuously in the direction of the layer 24, so that the recess 32 is a tapered recess.
  • the recess 32 can be formed by etching away the material of the layer 23 in the desired manner after forming a full-surface layer structure of layer 23 and layer 24. In this way, it is then possible that the electromagnetic radiation enters the layer 24 from below via the recess 32 and is passed through this layer.
  • the elastic material of the cover 29 can also be deliberately assigned an optical function. If this is at least partially transparent material, either radiated from below electromagnetic radiation can escape through this elastic material, or it can also electromagnetic radiation (from above) are introduced to the substrate. As described, it is also possible to deliberately use the material of the cover member 29 for shielding electromagnetic radiation or impart reflection properties to this material.
  • Fig. 2 still shows the holder 33 with hollow cannulas 34, which is also not necessarily part of the device 21 according to the invention.
  • the illustration of the holder 33 with cannulas 34 is merely intended to illustrate how liquids or gases are applied to the substrate 22 with the aid of the hollow cannulas 34 - - or can be removed from this again.
  • the hollow cannulas 34 are thereby passed through the elastic material of the cover 29, wherein the elasticity of the material automatically ensures a seal on the outer circumference of the hollow cannulas. Possible positioning and holding devices for placing and removing the holder 33 on or from the cover 29 are not shown in Fig. 2.
  • FIG. 2 also shows no further components of a device which are necessary for carrying out patch-clamp investigations, such as electrodes, counterelectrodes, pumps, valves, liquid reservoirs, measuring and control devices and the like.

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Abstract

Bei einer Vorrichtung (1) nach Art eines Patch-Clamp-Chips zur Bestimmung von biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen (12) ist mindestens ein, vorzugsweise flaches Substrat (2) vorgesehen, das mikrofluidische Komponenten und/oder mikrofluidische Strukturen (3-7, 9-11) sowie mindestens eine Öffnung (8), an der die Membran oder Zelle (12) zumindest während einer Messung unter elektrischer Kontaktierung immobilisierbar ist, vorgesehen. Weiter umfasst die Vorrichtung (1) mindestens einen optischen Pfad (13) zur Übertragung elektromagnetischer Strahlung, der dem Substrat (2) zugeordnet ist und/oder Teil des Substrats (2) ist.

Description

Beschreibung
Vorrichtung und Verfahren zur Messung an Membranen und Zellen
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung nach Art eines Patch-Clamp-Chips zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen sowie Verfahren zur Bestimmung solcher Messgrößen.
Bei der sogenannten Patch-Clamp-Technik handelt es sich um eine Messmethode aus der Elektrophysiologie, die seit der zweiten Hälfte der 70er Jahre des vergangenen Jahrhunderts durch die Arbeiten von Neher und Sakmann bekannt ist. Durch diese Methode lassen sich Ströme durch einzelne lonenkanäle in biologischen Membranen und Zellmembranen darstellen.
Das Funktionsprinzip der Patch-Clamp-Technik ist in vielen Übersichtsartikeln als Stand der Technik beschrieben.
Bei der sogenannten manuellen Patch-Clamp-Technik wird eine Glaskapillare, die in der Regel frisch bereitgestellt wird, mit einer leitfähigen Lösung, in die eine Metallelektrode taucht, befüllt und, meist unter optischer Kontrolle, mit einer intakten Zelle kontaktiert. Dann wird durch einen angelegten Unterdruck eine Versiegelung zwischen biologischer Membran und Pipette erzeugt, idealerweise unter Ausbildung eines sogenannten Gigaseals, d.h. unter Ausbildung eines elektrischen Widerstands in der Größenordnung von mindestens einem Gigaohm.
Eine solche manuelle Patch-Clamp-Technik ist jedoch für den wachsenden Bedarf an Patch-Clamp-Messungen in der Forschung, insbesondere in der Phar- maforschung, nicht geeignet, da die Durchführung einer einzelnen Messung viel Zeit in Anspruch nimmt. Es wurden deshalb Patch-Clamp-Techniken entwickelt, - - die an planaren, d.h. flachen, Substraten durchgeführt werden. Hier wird dann keine Pipette auf einer Zelle positioniert, sondern eine Zell-Suspension wird auf ein flaches Substrat, das auch als Chip bezeichnet wird, aufgebracht, und die Membranen/Zellen werden auf Öffnungen oder Vertiefungen positioniert, die in diesem Chip vorgesehen sind.
Mit diesen zuletzt beschriebenen Techniken lassen sich automatisierte Verfahren für Patch-Clamp-Messungen realisieren. Dabei sind mikrofluidische Strukturen, die für die entsprechende Messung notwendig oder von Vorteil sind, idealerweise bereits in den sogenannten Patch-Clamp-Chip integriert.
Bei den beschriebenen planaren Systemen gibt es solche, bei denen es nicht notwendig ist, dass an jeder der vorhandenen Öffnungen tatsächlich eine Membran oder Zelle immobilisiert ist. Ein solches System ist beispielsweise in der EP-B1 -1 802 752 bzw. der parallelen US-A1 -2006/0194255 beschrieben. Allerdings lassen sich mit solchen Systemen sogenannte Gigaseals nur schwer realisieren, so dass zur Bereitstellung von Gigaseals beispielsweise sogenannte seal enhancer (Pufferlösungen basierend auf reaktionsfreudigen Elementen wie beispielsweise Fluor) zur Hilfe genommen werden müssen.
Ein anderes planares Patch-Clamp-System ist in der EP-B1 -1 31 1 655 dargestellt. Hier ist es durch einen separaten Ansaugkanal möglich, dass eine einzelne Membran oder Zelle über der eigentlichen Patch-Clamp-Öffnung positioniert wird, bevor das eigentliche Seal an dieser Öffnung ausgebildet wird. Hierbei sind auch ohne weiteres sogenannte Gigaseals realisierbar.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, die bereits bekannten planaren Patch- Clamp-Systeme weiter zu verbessern. Insbesondere soll es ermöglicht werden, die Positionierung und Immobilisierung von Membranen oder Zellen an einer Öffnung, an der das entsprechende Seal ausgebildet wird, noch besser zu kontrollieren. Weiter wird zum einen angestrebt, die Faktoren, die die Messgrößen bei der Patch-Clamp-Messung beeinflussen, gezielt zu variieren, und zum an- - - deren, die erhaltenen Messgrößen besser zu detektieren und auszuwerten. Schließlich soll es ermöglicht werden, die Membranen und Zellen gezielt zu stimulieren.
Diese Aufgaben werden gelöst durch die Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und durch die Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 16 bis 18. Bevorzugte Ausführungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 15 beschrieben. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
Wie eingangs erläutert, ist die erfindungsgemäße Vorrichtung nach Art eines Patch-Clamp-Chips zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen vorgesehen. Insbesondere weisen diese Membranen und Zellen Membranproteine wie beispielsweise lonenkanäle auf oder sind in der Lage, solche Membranproteine auszubilden.
Nach der Erfindung weist die beanspruchte Vorrichtung mindestens ein, vorzugsweise flaches Substrat auf, das mikrofluidische Komponenten und/oder mikrofluidische Strukturen sowie mindestens eine Öffnung besitzt, an der die Membran oder Zelle zumindest während einer Messung unter elektrischer Kon- taktierung immobilisierbar ist. Dieses Immobilisieren erfolgt vorzugsweise an der Oberseite der Öffnung. Erfindungsgemäß können vorzugsweise auch mehrere oder eine Vielzahl von Öffnungen vorgesehen sein.
Weiter besitzt die erfindungsgemäße Vorrichtung mindestens einen optischen Pfad, der dem Substrat zugeordnet ist und/oder Teil des Substrats ist. Dieser optische Pfad dient im weitesten Sinne zum Durchtritt oder zur Übertragung elektromagnetischer Strahlung.
Mit anderen Worten lässt sich die Erfindung auch so beschreiben, dass bei einem planaren Patch-Clamp-System, das mindestens ein, vorzugsweise flaches Substrat aufweist und mit dem sich automatisierte Verfahren für Patch-Clamp- - -
Messungen realisieren lassen, insbesondere bei einem sogenannten Patch- Clamp-Chip, mindestens ein optischer Pfad vorhanden ist. Dieser optische Pfad ist entweder Teil des Substrats selbst, oder er ist dem Substrat zugeordnet.
Der Ausdruck„Substrat" soll nach der Erfindung umfassend verstanden werden, d.h. es soll sich hier um ein Material nach Art eines Trägers, einer Grundplatte oder dergleichen handeln, an dem die zur Durchführung der Patch- Clamp-Messungen notwendigen Strukturen, Komponenten und dergleichen ausgebildet oder vorgesehen sind. Vorzugsweise handelt es sich hierbei um ein flaches Substrat nach Art einer Platte oder Folie. Dies soll bedeuten, dass derartige Substrate in der Regel eine größere Breite bzw. Länge, insbesondere eine wesentlich größere Breite bzw. Länge, gegenüber der Dicke (oder Höhe) eines solchen flachen Substrats aufweisen. Dabei wird in der Regel die Dicke eines folienartigen Substrats, das auch flexibel ausgestaltet sein kann, geringer sein als die Dicke eines plattenartigen Substrats.
„Mikrofluidische Komponenten" oder„mikrofluidische Strukturen" sind Komponenten, Strukturen, Bauteile und dergleichen, die eine Bevorratung, Bewegung, Mischung, Trennung oder sonstige Handhabung von flüssigen Medien auf kleinem und kleinstem Raum ermöglichen. Wie eingangs erläutert, werden bei den entsprechenden Patch-Clamp-Messungen die zu untersuchenden Membranen oder Zellen in der Regel in Form von Suspensionen in geeigneten Lösungsmitteln gehandhabt, und dabei u.a. an die entsprechende Patch-Clamp-Öffnung herangeführt oder von dieser abtransportiert. Derartige Suspensionen werden durch die genannten mikrofluidischen Komponenten und Strukturen hindurchgeführt. Das entsprechende Fachgebiet ist dem Fachmann unter dem Begriff der Mikrofluidik bekannt.
Unter„Membranen" im Sinne der Erfindung sollen alle Trennschichten oder auch Schichten mit anderer Funktion verstanden werden, die mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik untersucht werden können. Es kann sich hier ohne weiteres auch um künstliche Membranen handeln, die beispielsweise in Form von - -
Lipid-Doppelschichten realisierbar sind. Bei den sogenannten Biomembranen, die erfindungsgemäß bevorzugt untersucht werden, handelt es sich in der Regel um Trennschichten zwischen verschiedenen Bereichen innerhalb einer lebenden Zelle (intrazellulär) oder auch zwischen dem Inneren einer Zelle und dem Zellaußenraum. Dementsprechend ist es erfindungsgemäß möglich, sowohl einzelne Membranfragmente, vollständige Membranen oder auch vollständige Zellen zu untersuchen. Auch Zellverbunde sollen diesbezüglich von der Erfindung mit umfasst sein.
Bei einem„optischen Pfad" handelt es sich erfindungsgemäß um Mittel, die zum Durchtritt oder zur Übertragung elektromagnetischer Strahlung vorgesehen o- der geeignet sind. Derartige Mittel können auch gegebenenfalls weitere Mittel zur Erzeugung der elektromagnetischen Strahlung selbst enthalten.
Erfindungsgemäß ist der optische Pfad nicht auf den Durchtritt oder auf die Übertragung bestimmter Wellenlängen der elektromagnetischen Strahlung beschränkt. Es können die unterschiedlichsten Wellenlängen, insbesondere von dem Gebiet der ultravioletten Strahlung bis zum Gebiet der Infrarotstrahlung übertragen werden. Insoweit ist der Begriff „optisch" breit zu verstehen, und nicht nur auf den Bereich des sichtbaren Lichts beschränkt.
Der optische Pfad dient bei der Erfindung im weitesten Sinne dazu, die durch ihn übertragene elektromagnetische Strahlung für die Patch-Clamp-Messung, insbesondere die automatisierte Patch-Clamp-Messung nutzbar zu machen. Solange dieser Zweck erfüllt ist, spielt es grundsätzlich keine Rolle, in welcher Weise der optische Pfad bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgesehen ist.
Dementsprechend kann der optische Pfad dem Substrat in beliebiger Weise zugeordnet sein oder einen Teil des Substrates darstellen. Verschiedene bevorzugte Ausgestaltungen werden im Folgenden noch diskutiert. - -
Wie bereits erläutert, befindet sich erfindungsgemäß im Substrat mindestens eine Öffnung, an der die Membran oder Zelle unter Ausbildung des Seals immobilisiert wird. Diese Öffnung wird in der Regel an einem Kanal, einer Pore, einer Bohrung oder dergleichen gebildet sein, die im weitesten Sinne die Patch- Clamp-Pipette darstellt. Bezogen auf den Funktionszustand der Vorrichtung, d.h. auf den Zustand, in dem die Zelle an der Öffnung immobilisiert ist und eine Messung durchgeführt werden kann, erfolgt die Immobilisierung bevorzugt an der„Oberseite" der Patch-Clamp-Pipette und damit auch an der„Oberseite" der durch diese Pipette gebildeten Öffnung. Dies wird im Zusammenhang mit den Zeichnungen noch näher erläutert.
Der erfindungsgemäß vorgesehene optische Pfad kann nun grundsätzlich an beliebigen Stellen am Substrat vorgesehen oder diesem zugeordnet sein. Bezieht man dies auf die soeben beschriebene Ausgestaltung, dass die Immobilisierung der Membran oder Zelle an der„Oberseite" der Öffnung erfolgt, so kann der optische Pfad dementsprechend möglichen Seitenflächen des Substrats zugeordnet sein oder auch der Seite (Oberseite), an der die Immobilisierung der Membran/Zelle erfolgt.
Es ist erfindungsgemäß jedoch bevorzugt, wenn der optische Pfad derjenigen Seite des Substrats zugeordnet ist oder sich an derjenigen Seite des Substrats befindet, die zu der Seite der Öffnung abgewandt ist, an der die Membran/Zelle immobilisiert wird. Wie im Zusammenhang mit den Zeichnungen ebenfalls noch erläutert wird, erfolgt die Immobilisierung der Membran/Zelle dann vorzugsweise an der Oberseite der Öffnung (Funktionszustand), während der optische Pfad dann am Substrat an der Seite vorgesehen ist, die zu der der Membran/Zelle abgewandten Seite der Öffnung bzw. der Patch-Clamp-Pipette gehört. Wird der optische Pfad in diesem Zusammenhang beispielsweise zu einer direkten optischen Beobachtung der Membran/Zelle während des Messvorgangs eingesetzt oder beispielsweise zur optischen Anregung der Membran/Zelle oder zur optischen Anregung von Reaktionen, die an der Membran/Zelle ablaufen, so kann man dies auch so beschreiben, dass diese Beobachtung/Anregung „von unten her" erfolgt. - -
Wie bereits dargestellt, kann der optische Pfad bei der Erfindung in verschiedener Weise realisiert werden. So ist es vorzugsweise möglich, dass der optische Pfad mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig, als Ausnehmung im Substrat selbst ausgebildet ist. Die Ausnehmung kann dabei vorzugsweise eine abgerundete Querschnittsfläche besitzen. Der Radius dieser Querschnittsfläche kann sich ausgehend von der Unterseite des Substrats in Stufen oder konisch verringern.
Besteht das Substrat bei der Erfindung mindestens teilweise aus Material , das für mindestens einen Teil des elektromagnetischen Spektrums transparent (d.h. also zumindest teilweise, vorzugsweise weitgehend vollständig durchlässig) ist, so kann an den Stellen, an denen der optische Pfad ausgebildet sein soll, entweder dieses Material selbst oder ein anderes Material, das dieses Material umgibt, entfernt werden, um auf diese Weise den„Zugang" der entsprechenden elektromagnetischen Strahlung hin zur immobilisierten Membran/Zelle und damit die entsprechende Beobachtung/Anregung und dergleichen zu ermöglichen.
In Weiterbildung ist es bei der Erfindung möglich, dass der optische Pfad ein transparentes Material umfasst, das zumindest für einen Teil des elektromagnetischen Spektrums (mindestens teilweise) transparent ist. Hierbei kann es sich beispielsweise auch um entsprechende Kunststoffmaterialien handeln. Vorzugsweise umfasst der optische Pfad jedoch in solchen Fällen (transparentes) Glas oder Quarzglas (S1O2) oder besteht vollständig aus solchen Materialien. Insbesondere können in diesen Fällen dann Sichtöffnungen oder sogenannte Fenster aus transparentem Glas oder Quarzglas vorgesehen sein.
Bei bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht das Substrat selbst mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig aus transparentem Material, insbesondere aus Glas oder Quarzglas. Bei solchen Ausführungsformen kann das Substrat insbesondere aus mindestens zwei, vorzugsweise mehreren Schichten aufgebaut sein, wobei insbesondere mindes- - - tens eine dieser Schichten aus dem transparenten Material, und dabei vorzugsweise aus Glas oder Quarzglas besteht.
In Weiterbildung kann bei einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem aus Schichten aufgebauten Substrat mindestens eine untere erste Schicht aus nicht-transparentem Material, insbesondere aus Silicium bestehen, und mindestens eine obere zweite Schicht aus transparentem Material, insbesondere aus Glas oder Quarzglas.
Die zuletzt genannten Ausführungsformen haben dabei den Vorteil, dass die vorhandene untere Schicht aus nicht-transparentem Material dem Substrat insgesamt die für die Handhabung der Vorrichtung notwendige Stabilität, insbesondere mechanische Festigkeit verleihen kann. So kann diese untere Schicht beispielsweise aus einem gegenüber Glas/Quarzglas mechanisch stabileren Material, wie beispielsweise Silicium bestehen. Oder es ist (zusätzlich oder alternativ) möglich, diese untere Schicht aus nicht-transparentem Material wesentlich dicker auszubilden als die obere Schicht aus transparentem Material. Durch beide Maßnahmen (einzeln oder in Kombination) wird dann dem Substrat die für seine Handhabung notwendige Stabilität gegeben.
Bei allen Ausführungsformen, bei denen das Substrat mindestens teilweise aus transparentem Material besteht, ist es von Vorteil, wenn die mikrofluidischen Komponenten und/oder Strukturen oder die Öffnung zur Immobilisierung der Membran oder Zelle einzeln oder in Kombination im transparenten Material selbst vorgesehen sind. Dies erleichtert beispielsweise die Beobachtbarkeit oder Beeinflussbarkeit der in diesen Komponenten oder Strukturen ablaufenden Vorgänge.
Besteht bei den genannten Ausführungsformen eine untere Schicht aus nichttransparentem Material, so kann dieses Material zur Ausbildung eines entsprechenden optischen Pfads mindestens teilweise entfernt sein oder entfernt werden. Dies kann beispielsweise durch (physikalisches oder chemisches) Abätzen - - des Materials erfolgen, bis die (nächste) Schicht aus transparentem Material im Substrat zum Vorschein kommt. Die Schicht aus transparentem Material kann dabei einen physiko-chemischen Ätzstop für das Ätzverfahren darstellen.
Diese Vorgehensweise wird später im Zusammenhang mit den Zeichnungen noch näher erläutert.
Ein durch Ätzen im Substrat ausgebildeter optischer Pfad bzw. ein entsprechendes optisches Fenster besitzt üblicherweise eine (kreis-)runde oder abgerundete Querschnittsfläche, deren Durchmesser bzw. Radius sich über die Dicke der verbleibenden nicht-transparenten Schicht ändern, vorzugsweise in Richtung auf die transparente Schicht verringern kann.
Die Durchmesser der kreisrunden Ausnehmung liegen in der Regel unter 1 .000 μιτι, vorzugsweise unter 300 μιτι.
Die (obere) transparente Schicht, die die mikrofluidischen Komponenten und Strukturen und dergleichen aufweist, besitzt in der Regel eine Dicke von < 100 μιτι, wobei die Dicke vorzugsweise <50 μιτι, vorzugsweise <35 μιτι beträgt. Einzelne Teil-Schichten der transparenten Schicht besitzen ein Dicke zwischen 1 μιτι und 100 μιτι.
Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst der optische Pfad mindestens eine Glasfaseroptik oder mindestens eine Mikroskopoptik. Derartige Optiken sind dann dem Substrat ebenfalls in geeigneter Weise zugeordnet, oder sie bilden ein Bauteil des Substrats. Insbesondere können solche Optiken in entsprechenden Ausnehmungen am Substrat vorgesehen sein.
In gleicher Weise ist es möglich, eine Schnittstelle für eine Glasfaseroptik oder eine Mikroskopoptik vorzusehen, mit deren Hilfe dann die eigentliche Glasfaseroptik oder Mikroskopoptik an das Substrat bzw. die Vorrichtung angeschlossen werden kann. - -
Auch hier soll der Begriff der Optik umfassend verstanden werden und bedeuten, dass grundsätzlich jede Art von elektromagnetischer Strahlung durch die entsprechenden Optiken hindurch übertragen werden kann.
In Weiterbildung kann unterhalb des transparenten Substrats, insbesondere unterhalb der (untersten) Schicht des Substrats aus nicht-transparentem Material ein Material mit einem höheren Brechungsindex als demjenigen des Materials des optischen Pfads angeordnet sein. Dieses Material mit höherem Brechungsindex kann auch in die entsprechenden Lichtleiter/Glasfaseroptiken/Mikroskopoptiken integriert sein.
Auf diese Weise wird erreicht, dass die in den optischen Pfad bzw. in das optische Fenster eintretende elektromagnetische Strahlung aus einem Material mit höherem Brechungsindex in ein Material mit niedrigerem Brechungsindex (bspw. in Luft in der Ausnehmung) übertritt. Auf diese Weise wird dann die sogenannte Apertur des vorhandenen optischen Systems optimiert.
Wie bereits ausgeführt, können die mikrofluidischen Komponenten oder mikro- fluidischen Strukturen bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung in unterschiedlicher Weise ausgebildet sein, insbesondere im Hinblick darauf, dass automatisierte Patch-Clamp-Messungen durchführbar sind. In diesem Zusammenhang sind Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung bevorzugt, bei denen zusätzlich zu der Öffnung, an der die Membran/Zelle immobilisiert wird, und gegebenenfalls zusätzlich zu dem Kanal, an dem diese Öffnung ausgebildet ist, mindestens ein (weiterer) separater Kanal vorgesehen ist. Dieser separate Kanal steht mit der genannten Öffnung nicht in (direkter) Verbindung und ist dazu vorgesehen, die Membran oder Zelle durch Anlegen eines Unterdrucks an der genannten Öffnung zu positionieren bzw. festzulegen.
Dieses Merkmal des separaten Kanals, der gegebenenfalls auch als Ansaugkanal bezeichnet werden kann, sowie dessen Funktion ist in der oben bereits genannten EP-B1 -1 31 1 655 beschrieben. Auf den Inhalt dieser Patentschrift wird Bezug genommen und verwiesen. Die insoweit notwendige Offenbarung wird hiermit durch diese Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. - -
Der (zusätzliche) separate Kanal kann eine beliebige Querschnittsform bzw. Querschnittsfläche besitzen. Bevorzugt handelt es sich um Querschnittsflächen, die kreisförmig, oval, rechteckförmig oder quadratisch sind. Es sind jedoch auch andere n-eckförmige (n > 3) Querschnittsflächen u.a. möglich. Der Durchmesser D all dieser Querschnittsflächen soll dabei als die größte Abmessung definiert sein, die zwischen zwei Punkten auf dem Außenumfang der Querschnittsfläche existiert.
Vorzugsweise mündet der genannte separate Kanal in einer separaten Öffnung, d.h. in einer Öffnung, die mit der Öffnung, an der die Membran/Zelle immobilisiert wird, nicht in Verbindung steht. Vorzugsweise umgibt die separate Öffnung die Öffnung, an der die Membran/Zelle immobilisiert wird, mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig konzentrisch. Auch dies wird im Zusammenhang mit den Zeichnungen noch näher erläutert.
Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der Durchmesser (D) des separaten Kanals über den Verlauf dieses Kanals nicht konstant. Insbesondere vergrößert sich der Durchmesser des separaten Kanals in Richtung auf seine separate Öffnung, vorzugsweise kontinuierlich. Auf diese Weise lässt sich die Funktion des separaten Kanals, nämlich die Membran/Zelle (vor Ausbildung des eigentlichen Seals/Gigaseals an der Öffnung) beispielsweise aus der Suspension, in der sich die Membran/Zelle befindet, zu selektieren, zu positionieren oder wieder zu entfernen in steuerbarer Weise noch besser zu erfüllen.
Wie aus den bisherigen Ausführungen bereits hervorgeht, kann das Merkmal des separaten Kanals, der zur Positionierung/Festlegung der Membran/Zelle an der eigentlichen Patch-Clamp-Öffnung vorgesehen ist, auf unterschiedliche Weise realisiert werden. So kann zu dem entsprechenden Zweck ein separater Kanal, der in der zugehörigen separaten Öffnung mündet, vorgesehen sein. Bei anderen Ausführungsformen kann auch ein separater Kanal vorhanden sein, - - der mit mindestens zwei, vorzugsweise mehreren separaten Öffnungen in Verbindung steht.
Schließlich sind Ausführungsformen möglich, bei denen mindestens zwei, vorzugsweise mehrere separate Kanäle vorgesehen sind, die wiederum jeweils in einer separaten Öffnung oder auch in mindestens zwei, vorzugsweise mehreren Öffnungen münden können.
Bei allen genannten Ausführungsformen mit mindestens einem separaten Kanal ist es bevorzugt, wenn die separaten Öffnungen, in denen die separaten Kanäle münden, die eigentliche (Patch-Clamp-)Öffnung, an der die Membran/Zelle unter Ausbildung eines Seals/Gigaseals immobilisiert wird, mindestens teilweise konzentrisch umgeben. Durch eine derartige (mindestens teilweise) konzentrische Anordnung kann die Zelle in besonders günstiger Weise entlang ihres Aussenumfangs an bzw. über der eigentlichen Patch-Clamp-Öffnung positioniert bzw. festgelegt werden.
Besonders bevorzugt ist die erfindungsgemäße Vorrichtung unter näherer Definition der vorgesehenen mikrofluidischen Komponenten oder Strukturen wie folgt ausgebildet. Sie weist auf:
- ein Substrat mit den folgenden mikrofluidischen Strukturen:
o mindestens einen Flüssigkeitszulauf, vorzugsweise zwei Flüssigkeitszuläufe,
o mindestens einen Flüssigkeitsablauf,
o mindestens eine zwischen dem Flüssigkeitszulauf und dem Flüssigkeitsablauf angeordnete Perfusionskammer,
o mindestens einen Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette mit einer Öffnung, die in der Perfusionskammer mündet, wobei der Kanal vorzugsweise mit mindestens einem weiteren Flüssigkeitskanal in direkter Verbindung steht, und - - o mindestens einen separaten Kanal, der mit der Öffnung nicht in direkter Verbindung steht und der in mindestens einer separaten Öffnung mündet, die insbesondere die Öffnung mindestens teilweise konzentrisch umgibt.
Weiterhin ist bei den zuletzt genannten Ausführungsformen ebenfalls ein optischer Pfad zur Übertragung von elektromagnetischer Strahlung vorhanden. Dieser optische Pfad befindet sich vorzugsweise auf der zur Oberseite der Öffnung abgewandten Seite des Substrats.
Bei den zuletzt beschriebenen Ausführungsformen besitzt also der Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette diejenige Öffnung, an der die Immobilisierung der Membran/Zelle unter Ausbildung des Seals/Gigaseals für die Patch-Clamp- Messung erfolgt. Diese Öffnung mündet in der Perfusionskammer, in der sich also die immobilisierte Membran/Zelle während der Patch-Clamp-Messung in immobilisiertem Zustand befindet.
Der weitere Flüssigkeitskanal, der mit dem genannten Kanal in Verbindung stehen kann, dient dazu, an der Öffnung einen definierten, einstellbaren Flüssigkeitsdruck auf die Membran/Zelle zur Ausbildung des Seals/Gigaseals aufzubringen. Dies geht auch aus den Zeichnungen hervor.
Der separate Kanal, der mit der genannten Öffnung, an der das Seal/Gigaseal ausgebildet wird, nicht in (direkter) Verbindung steht, mündet in einer oder mehreren separaten Öffnungen. Diese separaten Öffnungen dienen beispielsweise dazu, die Membran/Zelle durch Anlegen eines Unterdrucks an der Öffnung, an der später das Seal/Gigaseal ausgebildet wird, zu positionieren. Zu diesem Zweck ist es von Vorteil, wenn die separate Öffnung bzw. die separaten Öffnungen die Öffnung, an der (später) das Seal/Gigaseal ausgebildet wird, mindestens teilweise konzentrisch, vorzugsweise vollständig konzentrisch, umgibt oder umgeben. - -
Die eine oder mehrere separate Öffnungen können so ausgelegt sein, dass eine Strömung durch die separate Öffnung hindurch an der Zelle vorbei möglich ist, wodurch der Lösungswechsel oder Suspensionswechsel an der Zelle bei longitudinaler Strömung in der Perfusionskammer (d.h. in Längsrichtung der Kammer vom Zulauf zum Ablauf) zusätzlich beschleunigt werden kann, indem die Zelle zusätzlich zu einer laminaren longitudinalen Strömung einer transversalen Strömung (d.h. quer, insbesondere senkrecht zur Längsrichtung (quasi in Richtung Substrat)) ausgesetzt wird.
Sowohl der Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette als auch der separate Kanal sind vorzugsweise in der Weise Steuer- und regelbar, dass diese Kanäle gezielt mit Flüssigkeit, insbesondere mit Flüssigkeitsdruck, beaufschlagbar sind, und dies bidirektional. Dies bedeutet, dass gezielt Überdrucke und Unterdrucke der entsprechenden Flüssigkeiten in diese Kanäle eingebracht werden können, damit diese die beschriebenen Funktionen erfüllen.
Insbesondere können die letztgenannten Funktionen erfindungsgemäß dadurch bereitgestellt werden, dass mindestens zwei, vorzugsweise zwei weitere Flüssigkeitskanäle vorgesehen sind, die mit dem Kanal nach Art einer Patch-Clamp- Pipette in Verbindung stehen. In gleicher weise können vorzugsweise mindestens zwei separate Kanäle, vorzugsweise zwei (weitere) separate Kanäle, die mit der separaten Öffnung in Verbindung stehen, vorgesehen sein. Auf diese Weise ist es möglich, dass die jeweils zusätzlichen (zweiten) Kanäle eine By- pass-Funktion für die jeweils zugehörigen (ersten) Kanäle übernehmen können.
Bei den zuletzt beschriebenen Ausführungsformen ist es dann beispielsweise möglich, den Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette bzw. den separaten Kanal mit Hilfe des jeweiligen Bypass-Kanals zu befüllen. Dabei sind die beiden jeweils einander zugehörigen Kanäle als Zuführkanal (Einfließrichtung der Flüssigkeit) bzw. als Abführkanal (Rückflussrichtung der Flüssigkeit) genutzt. Der eigentliche Patch-Clamp-Kanal (Pipette) bzw. der der separaten Öffnung zugeordnete eigentliche separate Kanal wird auf diese Weise nach Art einer Ab- - - zweigung befüllt, da der eigentliche Füllstrom der Flüssigkeit an den jeweiligen Öffnungen vorbeigeführt wird. Dies ist insbesondere deshalb von praktischer Bedeutung, da auf diese Weise bspw. Luft oder allgemein Gase, die sich in diesen mikrofluidischen Strukturen befinden, besser kontrolliert oder geregelt strömen und ggf. durch die entsprechende Flüssigkeit ersetzt werden können. Auch ein Flüssigkeitsaustausch in den mikrofluidischen Strukturen ist auf diese Weise besser möglich, da ein solcher Flüssigkeitsaustausch dann nicht über die eigentliche Patch-Clamp-Öffnung bzw. über die separate Öffnung erfolgen muss. Ein solcher Flüssigkeitsaustausch ist beispielsweise nach dem mechanischen Durchbrechen einer Zellmembran für einen intrazellulären Lösungswechsel nötig oder für das Einbringen perforierender Substanzen, wenn ein mechanisches Durchbrechen der Zellmembran nicht vorgesehen ist.
Schließlich ist es bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung bevorzugt, dass die von dem Kanal nach Art einer Patch-Clamp-Pipette gebildete Öffnung und/oder die von dem separaten Kanal gebildete separate Öffnung in die Perfusionskammer hineinragt, d.h. sich sozusagen im Inneren der Perfusionskammer befindet. Man kann dies auch so beschreiben, dass sich die entsprechenden Öffnungen in diesen Fällen nicht in der Begrenzungsfläche oder Wand der Perfusionskammer befinden, sondern über diese Begrenzungsfläche hinaus in das Innere der Perfusionskammer ragen. Dies hat Vorteile im Hinblick auf die Durchströmung der Perfusionskammer mit der Suspension, die die Membranen/Zellen enthält, und damit einen Einfluss auf die Positionierbarkeit bzw. auf die tatsächliche Immobilisierung der Membranen/Zellen mit Hilfe der und an den entsprechenden Öffnungen. Des Weiteren kann eine auf der Öffnung kontaktierte Zelle bei solchen Ausführungsformen so schneller mit einer weiteren Lösung oder Suspension umspült werden, z.B. um einen Liganden schneller an einen ligandengesteuerten lonenkanal anzuspülen, als dieser lonenkanal durch Desensitivierung inaktiviert. - -
Die zuletzt beschriebene Ausbildung der Öffnungen (Hineinragen) kann beispielsweise durch eine entsprechende mikromechanische Strukturierung im Substrat realisiert werden.
Bei allen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann das Substrat mindestens teilweise aus Glas oder Quarzglas, vorzugsweise vollständig aus Glas oder Quarzglas, bestehen. Auch andere teilweise oder völlig transparente Materialien wie teilweise oder völlig transparente Kunststoffe können eingesetzt werden. Auch Materialien, die ein spezifisches Transmissionsspektrum aufweisen, sind verwendbar, um z.B. bestimmte Frequenzanteile elektromagnetischer Strahlung (beispielsweise mit unerwünschter biologischer Aktivität) auszublenden.
In diesem Zusammenhang ist es insbesondere auch möglich, bestimmte Stellen des Substrats bewusst nicht aus teilweise oder völlig transparentem Material zu fertigen, beispielsweise um einen Einfall von elektromagnetischer Strahlung an bestimmten Stellen zu verhindern. Dies kann beispielsweise dazu dienen, eine Einstreuung unerwünschter elektromagnetischer Strahlung (Streulicht) zu verhindern.
Außerdem sollen von der Erfindung auch Vorrichtungen umfasst sein, bei denen in einem Substrat, vorzugsweise flachen Substrat, nicht nur eine Öffnung, sondern mindestens zwei, vorzugsweise mehrere Öffnungen vorgesehen sind, an denen unter Immobilisierung einer Membran/Zelle ein Seal/Gigaseal ausgebildet ist. Zusätzlich zu diesen Öffnungen können dann gegebenenfalls für alle Öffnungen separate Öffnungen vorgesehen sein, an denen eine vorherige Positionierung der Membranen/Zellen vor Ausbildung des Seals/Gigaseals möglich ist. In der beschriebenen Weise können solche separaten Öffnungen diese Öffnungen mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig, konzentrisch umgeben. Vorzugsweise können dabei 2 bis 5 solcher Öffnungspaare (Patch-Clamp- Öffnung mit zugehöriger separater Öffnung) oder auch mehr Paare bis hin zu - - mehreren Hundert oder sogar mehreren Tausend (z.B. 4000-5000) Öffnungspaaren, insbesondere pro optischem Pfad, vorgesehen sein.
Weiter ist es erfindungsgemäß möglich, dass eine erfindungsgemäße Vorrichtung mehrere vorzugsweise flache Substrate (mit einer Öffnung oder mehreren Öffnungen) umfasst. Dabei können mindestens zwei, insbesondere mehrere solcher Substrate über einen geeigneten Träger, der beispielsweise gitter- oder rasterartig angeordnet sein kann, zu einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zu- sammengefasst werden.
Schließlich ist es auch möglich, mehrere der zuletzt beschriebenen Vorrichtungen zu einer (größeren) erfindungsgemäßen Vorrichtung zusammenzufassen. Man kann dies auch so beschreiben, dass in den zuletzt genannten Fällen mehrere Patch-Clamp-Chips (mit einem oder mehreren Substraten, die wiederum eine oder mehrere Öffnungen für das Seal/Gigaseal aufweisen können) zu einer größeren Einheit mit mehreren Chips zusammengefasst werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Vorteil mindestens ein Anschlag zugeordnet sein kann. Unter diesem Anschlag ist jede Einrichtung zu verstehen, die in der Lage ist, die erfindungsgemäße Vorrichtung mechanisch festzulegen, d.h. deren (Weiter)Bewegung zu verhindern. Erfindungsgemäß ist die entsprechende Vorrichtung mit Hilfe des Anschlags für die Bestimmung der relevanten Messgrößen positionierbar, insbesondere reversibel positionierbar.
Grundsätzlich kann der bei der Vorrichtung vorgesehene Anschlag an der Vorrichtung selbst vorgesehen sein, oder die Vorrichtung kann mit einem solchen Anschlag in Kontakt gebracht werden. Vorzugsweise sind erfindungsgemäß mindestens ein Anschlag einer in der Regel kürzeren Stirnseite des Substrats und mindestens zwei Anschläge einer in der Regel längeren Längsseite des Substrats zugeordnet. - -
Das Vorsehen von Anschlägen hat den Vorteil, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung automatisch an bestimmten Stellen einer Messeinrichtung oder -anläge platziert und positioniert werden kann, insbesondere für die Fälle, dass die entsprechenden Vorrichtungen nach Art eines Patch-Clamp-Chips nach Gebrauch, d.h. nach Durchführung mindestens einer Messung durch nicht gebrauchte Chips ersetzt und dementsprechend ausgetauscht werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass mit Vorteil auf der Seite der Vorrichtung, die der Öffnung zur Immobilisierung der Membran oder Zelle gegenüberliegt, mindestens ein Abdeckelement aus vorzugsweise elastischem Material vorgesehen ist. Auch dieser Aspekt der Erfindung wird im Zusammenhang mit den Zeichnungen noch näher erläutert.
Erfindungsgemäß schließt das Abdeckelement das Substrat zu dieser der Öffnung gegenüberliegenden Seite ab und erfüllt dementsprechend eine Schutz- und gegebenenfalls auch Abdichtfunktion für das Substrat und die darauf vorgesehenen mikrofluidischen Komponenten und Strukturen. Die Befestigung des Abdeckelements kann dabei grundsätzlich auf beliebige Weise erfolgen, beispielsweise durch Verkleben, Verspannen und beliebige andere Verfahrensweisen. Aufgrund der Elastizität des Materials des Abdeckelements kann die Befestigung vorzugsweise auch bereits durch die vorhandene Eigenspannung nach einem Aufdrücken des Abdeckelements auf den Chip erreicht werden. Zur Aufrechterhaltung der dichtenden Funktion des Abdeckelements können zwischen dem Substrat und dem Abdeckelement zusätzlich Dichtelemente vorgesehen sein.
Die Verwendung eines elastischen Materials für das Abdeckelement hat auch den Vorteil, dass durch das Abdeckelement hindurch Flüssigkeiten oder Gase in die mikrofluidischen Komponenten oder Strukturen eingebracht oder aus diesen Komponenten oder Strukturen entnommen werden können. Dies kann beispielsweise mit Hilfe geeigneter Hohlkanülen erfolgen, die durch das elastische Material hindurchgestochen werden. Zur Erleichterung dieses Vorgangs und zur - -
Positionierung der Hohlkanülen können auf der Oberseite des Abdeckelements entsprechende Markierungen und dergleichen vorgesehen sein.
Darüber hinaus ist es möglich, das elastische Material des Abdeckelements, das beispielsweise (Aufzählung nicht abschließend) aus Silikon oder Polyimid bestehen kann, auch im Hinblick auf die ablaufenden Messvorgänge auszuwählen. So kann beispielsweise das Material des Abdeckelements bewusst zumindest teilweise transparent gewählt werden, um beispielsweise eine Einstrahlung elektromagnetischer Strahlung (Auflicht), d.h. von oben her auf das Substrat zu ermöglichen. Damit können bewusst Vorgänge an den Zellen oder Membranen auf dem Substrat ausgelöst und/oder beeinflusst werden.
In gleicher Weise ist es möglich, das elastische Material des Abdeckelements dunkel auszugestalten oder bewusst„einzuschwärzen", um auf diese Weise einen Einfall von elektromagnetischer Strahlung/Licht„von oben her" zu verhindern. Unter Umständen können im Abdeckelement sogar reflektierende Materialien eingesetzt werden, um beispielsweise eine Reflexion von Strahlung, die von unten her auf das Substrat fällt, zu ermöglichen.
Neben der beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst die Erfindung neue Verfahren, die im Folgenden beschrieben werden.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist zunächst ein Verfahren zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen, die insbesondere Membranproteine wie beispielsweise lonenkanäle aufweisen oder ausbilden, bei dem entweder eine optisch ausgelöste Immobilisierung der Membran oder der Zelle an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung oder eine optisch ausgelöste Messung an einer Membran oder Zelle, die an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung immobilisiert ist, erfolgt.
Solche Verfahren können vorzugsweise mit der bereits beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden. - -
Weiter bevorzugt ist erfindungsgemäß ein Verfahren zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen, die insbesondere Membranproteine wie beispielsweise lonenkanäle aufweisen oder ausbilden, bei dem eine Stimulation, insbesondere eine optische Stimulation der Membran oder der Zelle erfolgt, während die Zelle an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung immobilisiert ist.
Auch bei den zuletzt genannten bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann dieses insbesondere mit der bereits beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden.
Erfolgt bei den zuletzt genannten Verfahren (alternativ zu oder zusätzlich zu einer optischen Stimulation) eine andere Stimulation der Membran oder Zelle, so handelt es sich hierbei vorzugsweise um eine mechanische, eine chemische, eine biochemische und/oder eine thermale Stimulation. In diesen Fällen wird die Membran/Zelle dementsprechend mechanisch, durch einen chemischen oder biochemischen Stoff oder durch die Einwirkung von Wärme/Hitze stimuliert, um eine mögliche Reaktion der Membran/Zelle auf den entsprechenden Reiz (Stimulation) zu untersuchen.
Im Rahmen der genannten erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich eine optisch ausgelöste Immobilisierung der Membran/Zelle beispielsweise in der Weise realisieren, dass basierend auf einem optischen Signal Membranen/Zellen an der Patch-Clamp-Öffnung gefangen und immobilisiert werden. Auch eine Freigabe der Membran/Zelle von dieser Öffnung kann aufgrund optischer Signale bewirkt werden. Man kann hier auch von einer optisch getriggerten Selektion der Membranen/Zellen sprechen.
Eine optisch ausgelöste Messung an der Membran/Zelle kann bei anderen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen, indem Eigenschaften, Zusammensetzungen, Konzentrationen u.a. von nicht-organischen - - oder organischen/biologischen Substanzen an den immobilisierten Membranen oder Zellen bestimmt werden.
Auch hier ist eine optisch getriggerte Messung möglich, z.B. ein Start der Messung nach Überschreitung einer vorgegebenen Schwelle eines optischen oder elektrophysiologischen Messwerts.
Grundsätzlich können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die unterschiedlichsten Messgrößen bestimmt werden wie Volumen, Größe, Masse, Dichte, elektrophysiologische Aktivität, Vitalität, Morphologie und dergleichen. In diesem Zusammenhang ist es auch möglich, emittierte elektromagnetische Strahlung beliebiger Frequenzen zu detektieren, um molekulare Veränderungen, insbesondere Konzentrationsänderungen ausgewählter Stoffe zu detektieren, entweder in der beschriebenen mikrofluidischen Struktur oder in der entsprechenden Membran/Zelle. Besonders hervorzuheben ist hier die Detektion fluoreszierender Stoffe, beispielsweise Moleküle, deren Wechselwirkung mit der Membran/Zelle erfindungsgemäß untersucht werden kann.
Erfindungsgemäß können hier über den erfindungsgemäß vorgesehenen optischen Pfad Patch-Clamp-Messungen kombiniert werden mit abbildender Mikroskopie, mit Fluoreszenzmessungen, mit Polarisationsfiltern, Frequenz- und anderen Filtern, mit konfokaler Mikroskopie, mit FRET (Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer), mit anderer (Bio-/Chemo-)Lumineszenzmessung, mit photometrischen oder kolorimetrischen Messungen, mit optischer Detektion von Gasblasen und makroskopischen Teilchen, mit dem Einsatz von Kontrastmitteln, auch in Verbindung mit den zuvor genannten Verfahren. Auch die zeitabhängige optische Messung der Proteinlokalisation und des sogenannten Pro- teintrafficking (gegebenenfalls im Zeitraum von Stunden oder Tagen) ist erfindungsgemäß möglich.
Wie bereits angesprochen, ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem eine Stimulation der Membran oder Zelle erfolgt, die Applikation unterschied- - - lichster Stimuli möglich, und zwar am Äußeren der Zellen oder im Inneren der Zellen oder sogar im Zellverbund oder Gewebsverbund. Diese Stimuli werden in der Regel über die mikrofluidischen Strukturen im Substrat während der Messung aufgebracht.
Bei den mechanischen Stimuli kann es sich hier um eine Änderung des Durchflusses der Strömung, um einen Richtungswechsel der Strömung, um Druckveränderungen in den verschiedenen mikrofluidischen Strukturen (Patch- Clamp-Kanal, Ansaugkanal, Perfusionskammer und dergleichen) handeln.
Eine chemische/biochemische Stimulation kann erfolgen über, vorzugsweise schnelle Substanzwechsel an der Zelle während deren Immobilisierung im Gi- gaseal, z.B. an Liganden gesteuerten lonenkanälen, über einen transversalen Strömungsfluss in der Perfusionskammer (sogenannter Cross Flow), und dergleichen. Dieser Cross Flow kann beispielsweise mit Hilfe der bereits beschriebenen Ansaugöffnung erfolgen.
Weiter können lichtaktivierbare Substanzen appliziert werden, die durch Belichtung in gleichbleibender oder veränderlicher Frequenz und/oder Lichtstärke und/oder über Lichtpulse freigesetzt werden, und so die jeweiligen Rezeptoren gegebenenfalls schneller ansprechen, als dies durch einen Lösungswechsel/Substanzwechsel möglich wäre.
Weitere Stimuli können direkt oder indirekt erzeugt werden durch
- Applikation von elektromagnetischer Strahlung jeglicher Frequenz zur Modifikation von Membranen, Zellen oder vorhandenen Substanzen während der Messung,
- Transfektion von positionierten Einzelzellen oder eines Zellverbunds oder eines Gewebsverbunds während der Messung,
- Zellwachstum von positionierten Einzelzellen oder eines Zellverbunds oder Gewebsverbunds während der Messung,
- Kultivierung von zellulären Netzwerken während der Messung, - -
- optische Stimulation lichtsensitiver Proteine (beispielsweise lonenkanä- len bzw. von an solchen lonenkanälen gekoppelten Rezeptoren) und Vermessung der Lichtemission (im Dunkeln).
Insbesondere umfasst die Erfindung Verfahren, bei denen eine optische Messung und/oder optische Stimulation mit Patch-Clamp-Messungen und/oder einem Lösungswechsel an Zellen oder Membranen kombiniert wird. Dazu wird eine Zelle oder Membran mittels der separaten Öffnung auf der Patch-Clamp- Öffnung reversibel platziert und optisch vermessen. Weist die Zelle auf Basis der optischen Messungen nicht die gewünschten Eigenschaften auf, so kann die Zelle mit der separaten Öffnung und/oder der Strömung in der Perfusionskammer wieder abgespült werden und eine weitere Zelle angesaugt und, falls geeignet, an der Patch-Clamp-Öffnung irreversibel nach dem Patch-Clamp- Verfahren kontaktiert und dann optisch vermessen und stimuliert werden. Dabei kann intrazellulärer oder extrazellulärer Lösungswechsel erfolgen, um z.B. die lonenkonzentration zu verändern oder biologisch aktive Substanzen an die Membran oder Zelle zu bringen. Parallel kann eine mechanische Stimulation über Drucke oder Strömungen an Öffnung, separater Öffnung oder Perfusion- kammer erfolgen.
Beispiele für das Verfahren sind automatisiertes Patch Clamp in Kombination mit intrazellulärer Perfusion, mit fluoreszenzbasierter Detektion und Zellselektion bei transienter Transfektion (z.B. GFP-Expression), mit fluoreszenzbasierter Detektion und Zellselektion von Antikörper-markierten Zellen, mit Fluoreszenz Detektion für intrazelluläre Calcium- oder pH-Messung (Fura-2 bzw.,BCECF- Farbstoffe u.ä), mit FRET, um in Kombination mit Patch Clamp Funktionsbeziehungen von lonenkanälen zu untersuchen, mit der Möglichkeit der optisch induzierten Freisetzung von Zellstimulatoren und sog. Second Messenger ("caged Compounds", z.B. Ca2+, NO,) mit mechanosensitiven Zellen, mit Primärzellen, Stammzellen und Expressionssystemen, mit ligandengesteuerten lonenkanälen, mit Lipidmembranpräparationen (wie Liposomen, Vesikel, Bilayer), mit der Erfassung von Teilchenströmung, z.B. Nanoteilchendichte oder Anzahl Zellen - - pro Volumen für Zellzählung, oder für die Erfassung von Verschmutzungen in Flüssigkeiten, wie z.B. Medikamentenrückständen im Trinkwasser u.a.
Schließlich umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei dem ein Substrat mit einem Aufbau aus mindestens zwei Schichten bereitgestellt oder hergestellt wird, wobei mindestens eine untere erste Schicht aus nicht-transparentem Material, insbesondere Silicium, und mindestens eine obere zweite Schicht aus transparentem Material, insbesondere aus Glas oder Quarzglas, besteht. Dann wird die untere Schicht aus nicht-transparentem Material zur Ausbildung eines optischen Pfads zum Durchtritt oder zur Übertragung elektromagnetischer Strahlung mindestens teilweise entfernt, insbesondere durch chemisches oder physikalisches Ätzen.
Zur weiteren Definition der erfindungsgemäßen Vorrichtung und der erfindungsgemäßen Verfahren werden noch die folgenden Angaben gemacht, die die Erfindung in keiner Weise einschränken sollen. Diese Angaben nennen lediglich Größen, die für die Erfindung bevorzugt, jedoch nicht zwingend sind.
So können die Abmessungen des Substrats, welches ein wesentliches Bauteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung darstellt, in der Größenordnung von wenigen mm liegen. Fertigungstechnisch können die Abmessungen ca. 1 mm betragen, wobei Abmessungen von beispielsweise 2 mm x 3 mm üblich sind.
Der Durchmesser der Öffnung, an der die eigentliche Patch-Clamp-Messung stattfindet (Öffnung der Patch-Clamp-Pipette) beträgt zwischen 0,1 μιτι bis maximal einige 10 μιτι. Diese Obergrenze wird in der Regel ca. 1/10 des Durchmessers der zu untersuchenden Zellen betragen. Vorzugsweise beträgt der Durchmesser der genannten Öffnung ca. 1 bis ca. 5 μιτι, insbesondere ca. 2 bis 3 μιτι.
Der (Gesamt-)Durchmesser der separaten Öffnung (des Ansaugkanals) liegt vorzugsweise zwischen 0,5 μιτι bis ebenfalls einigen 10 μιτι. Als Obergrenze - - kann hier beispielsweise das Zweifache des Durchmessers der zu untersuchenden Zellen gewählt werden. Vorzugsweise liegt der Durchmesser der separaten Öffnung zwischen ca. 2 μιτι und ca. 20 μιτι, wobei innerhalb dieses Bereichs Durchmesser zwischen ca. 9 μιτι und ca. 12 μιτι weiter bevorzugt sind.
Die Dicke (Höhe) des Substrats liegt in der Größenordnung von einigen 10 μιτι. Dieses Substrat besteht üblicherweise aus einem Träger aus Silizium (Si) mit einer sich darauf befindenden Quarzschicht (S1O2). In diese Quarzschicht sind üblicherweise die mikrofluidischen Strukturen (Kanäle, Öffnungen und dergleichen) eingebracht, in der Regel durch mikromechanische Bearbeitung, Ätzen oder dergleichen.
Die Drucke, die bei den erfindungsgemäßen Verfahren in den mikrofluidischen Strukturen zur Anwendung kommen, liegen in der Regel zwischen 150 mbar bis 4 bar, wobei Druckänderungen über den genannten vollen Druckbereich innerhalb kurzer Zeiträume, beispielsweise innerhalb von 10 ms, vorgenommen werden können. Auch Stoßwellen können in entsprechender Weise erzeugt werden.
Die Strömungsgeschwindigkeiten innerhalb der mikrofluidischen Strukturen, insbesondere innerhalb der Perfusionskammer, liegen vorzugsweise zwischen einigen μιτι/s und einigen 100 mm/s, wobei hier Strömungsgeschwindigkeiten zwischen ca. 2 mm/s bis ca. 400 mm/s weiter bevorzugt sind.
Sofern nach den erfindungsgemäßen Verfahren Stimuli auf die immobilisierten Membranen/Zellen oder auf die sich innerhalb der mikrofluidischen Strukturen befindenden Flüssigkeiten aufgebracht werden, so können diese grundsätzlich so lange andauern wie die entsprechende Messkonfiguration besteht. In der Regel beträgt die Dauer der Stimuli zwischen 1 ms und 1 h, wobei Stimuli über Zeiträume zwischen 10 ms bis 15 min, weiter bevorzugt sind.
In den Zeichnungen zeigen - -
Fig. 1 eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung nach
Art eines Patch-Clamp-Chips, und
Fig. 2 eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung nach Art eines Patch-Clamp-Chips mit zusätzlichen Funktionsbauteilen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung 1 nach Fig. 1 ist in der bereits beschriebenen Weise zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen (12) vorgesehen, wobei diese Membranen/Zellen insbesondere Membranproteine wie beispielsweise lonenkanäle aufweisen oder ausbilden. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind in Fig. 1 weitere Komponenten der Vorrichtung 1 wie Elektrode(n), Gegenelektrode(n), Pumpe(n), Ventil(e), Flüssigkeitsreservoir(s), Mess- und Steuergerät(e) u.a. nicht dargestellt.
Das gemäß Fig. 1 nicht in allen Einzelheiten dargestellte Substrat 2 umfasst in der Regel einen Träger aus Silicium (Si), der mit Quarz (S1O2) beschichtet ist. Die in Fig. 1 dargestellten mikrofluidischen Strukturen (Kanäle, Öffnungen und dergleichen) sind in der Regel in der Quarzschicht vorgesehen. Insgesamt ist das Substrat 2 mehrere 10 μιτι dick.
Das Substrat 2 gemäß Fig. 1 weist zwei Zuläufe 3, 4 auf, durch die Lösungen/Suspensionen, insbesondere Suspensionen, die die zu untersuchenden Membranen/Zellen enthalten, einströmen können, und zwar in eine Perfusionskammer 6, an deren (Austritts-)Ende sich ein Ablauf 5 befindet.
In die Perfusionskammer 6 hinein ragt die Öffnung 8 eines Kanals 7 nach Art einer Patch-Clamp-Pipette. Gemäß Fig. 1 ist an der (Oberseite) der Öffnung 8 eine Zelle 12 immobilisiert, und zwar unter Ausbildung eines Seals/Gigaseals. - -
Bei der Öffnung 8 handelt es sich also um die eigentliche Patch-Clamp- Öffnung, an der die Patch-Clamp-Messung stattfindet.
Der Kanal 7 mit Öffnung 8 ist mit einem weiteren Kanal 9 verbunden, mit dessen Hilfe Lösungen/Suspensionen in den Kanal 7 und damit an die Öffnung 8 (und gegebenenfalls an die immobilisierte Zelle 12) herangeführt werden können (oder wieder abgeführt). Gegebenenfalls können auch zwei Kanäle 9 vorgesehen sein, die beide mit dem Kanal 7 in Verbindung stehen. Der zweite Kanal dient bspw. nach Art eines Bypass zur Befüllung des Kanals 7 oder zum Flüssigkeitsaustausch im Kanal 7.
Weiter zeigt Fig. 1 einen separaten Kanal 10 mit einer separaten Öffnung 1 1 , wobei die Öffnung 1 1 mit dem Kanal 7 und der Öffnung 8 nicht (direkt) verbunden ist. Auch hier kann ggf. ein zweiter Kanal 10 mit Bypass-Funktion vorgesehen sein, wie im Zusammenhang mit Kanal 9 bereits beschrieben.
Der Durchmesser des separaten Kanals 10 vergrößert sich in Richtung auf die Öffnung 1 1 . Weiter umgibt die separate Öffnung 1 1 die Öffnung 8 konzentrisch, d.h. nach Art eines die Öffnung 8 umschließenden Rings, so dass mit Hilfe der separaten Öffnung 1 1 eine Zelle 12 über der Öffnung 8 eingefangen und positioniert werden kann (beispielsweise durch Anlegen eines Unterdrucks/Ansaugdrucks). Sobald die Zelle 12 selektiert und gegebenenfalls positioniert ist, kann das eigentliche Seal/Gigaseal an der Öffnung 8 ausgebildet werden.
Schließlich zeigt Fig. 1 einen als Ausnehmung bzw. Sichtfenster 13 ausgebildeten optischen Pfad, der im Substrat 2 vorgesehen ist. Wenn Fig. 1 den Funktionszustand der Vorrichtung 1 wiedergibt, so ist in dargestellten Fall die Zelle 12 an der Oberseite der Öffnung 8 bzw. des Kanals 7 immobilisiert, während die Ausnehmung 13 bzw. das Sichtfenster 13 an der Unterseite des Substrats vor- geseheen ist, die sich dementsprechend an der der Zelle abgewandten Seite der Öffnung 8 bzw. des Kanals 7 befindet. Eine Beobachtung oder Stimulation - - der Zelle 12 mit Hilfe der Ausnehmung 13 bzw. des Sichtfensters 13 als optischem Pfad erfolgt dementsprechend in der Ausführung gemäß Fig. 1„von unten".
Fig. 2 zeigt eine weitere erfindungsgemäße Vorrichtung 21 , die zusätzliche Funktionsbauteile, die bereits beschrieben wurden, aufweist.
Die eigentliche erfindungsgemäße Vorrichtung besteht aus dem Substrat 22, das wie dargestellt zweischichtig aufgebaut ist, nämlich aus der (unteren) Schicht 23 und der über der Schicht 23 angeordneten (oberen) Schicht 24. Die (untere) Schicht 23 besteht aus nicht-transparentem Material, nämlich Silicium. Die (obere) Schicht 24 besteht aus transparentem Material, nämlich Quarzglas (SiO2).
In der (oberen) Schicht 24 sind alle mikrofluidischen Strukturen (Kanäle, Öffnungen und dergleichen) ausgebildet, die für die Funktion des entsprechenden Patch-Clamp-Chips erforderlich sind. Diese Strukturen sind in ähnlicher Weise dargestellt, wie dies in Fig. 1 erfolgt ist, so dass insoweit im Wesentlichen auf die Figurenbeschreibung zu Fig. 1 verwiesen werden soll. Es sei hier lediglich angemerkt, dass es sich gemäß Fig. 2 bei der Öffnung 25 um diejenige Öffnung handelt, an der das Seal/Gigaseal zwischen Membran/Zelle und Öffnung ausgebildet wird. Die entsprechende Zelle ist in Fig. 2 nicht dargestellt.
Gemäß Fig. 2 kennzeichnet Bezugszeichen 26 die separate Öffnung, die die Patch-Clamp-Öffnung 25 konzentrisch umgibt (vgl. Öffnung 1 1 gemäß Fig. 1 ). Bezugszeichen 27 bzw. 28 bezeichnen in Fig. 2 die Kanäle, die zur Patch- Clamp-Öffnung 25 und zur separaten Öffnung 26 führen (vgl. Kanäle 7 bzw. 10 in Fig. 1 ). Wie bereits erläutert, sind alle beschriebenen Strukturen innerhalb der Schicht 24 aus Quarzglas (transparentes Material) ausgebildet. - -
Wie bereits beschrieben, besteht die eigentliche, bereits funktionsfähige erfin- dungsgemäße Vorrichtung 21 gemäß Fig. 2 aus dem Substrat 22 aus (unterer) Schicht 23 und (oberer) Schicht 24.
Des Weiteren zeigt Fig. 2 weitere bevorzugte Funktionselemente bei der vorliegenden Erfindung, die mit der eigentlichen Vorrichtung mit Vorteil zusammenwirken.
Hierbei handelt es sich zum einen um das in Fig. 2 dargestellte Abdeckelement 29, das erfindungsgemäß aus einem elastischen Material, beispielsweise aus Silikon gefertigt ist. Dieses Abdeckelement 29 schließt das Substrat 22 auf der der Öffnung 25 gegenüberliegenden Seite, d.h. im dargestellten Fall nach oben ab. Das Abdeckelement 29 ist mit Hilfe geeigneter Befestigungselemente, die in Fig. 2 nicht dargestellt sind, auf dem Substrat 22 befestigt oder auf das Substrat aufgedrückt, wobei zwischen Substrat 22 und Abdeckelement 29 Dichtelemente 30 vorgesehen sind. Hierbei handelt es sich im dargestellten Fall um drei O- Ringe, die um die entsprechenden drei oberen Öffnungen im Substrat 22 herumgelegt sind. Die Anzahl der Kontaktstellen ist nur für die zeichnerische Darstellung begrenzt, nicht aber im Umfang der Erfindung.
Weiter zeigt Fig. 2 einen Anschlag 31 , der dem Substrat 22 zugeordnet, insbesondere im vorliegenden Fall an der unteren Schicht 23 befestigt oder ausgebildet ist. Wie bereits erläutert, dient dieser Anschlag 31 dazu, das Substrat und damit die Vorrichtung insgesamt innerhalb einer Messeinrichtung bzw. Messanlage zu positionieren. Dabei kann eine Vorrichtung 21 , die zum Ersatz oder Austausch einer bereits benutzten Vorrichtung vorgesehen ist, gegebenenfalls exakt an der gleichen Stelle positioniert werden wie die vorherige Vorrichtung. Wie bereits erläutert, können an der Vorrichtung bzw. am Substrat mehrere Anschläge 31 vorgesehen sein, beispielsweise ein Anschlag 31 an einer (kürzeren) Stirn- oder Schmalseite und zwei Anschläge 31 an einer (längeren) Längsseite der Vorrichtung bzw. des Substrats. - -
Wie ebenfalls bereits in der Beschreibung erläutert, kann bei der Vorrichtung 21 elektromagnetische Strahlung von unten her in Richtung auf die transparente Schicht 24 eingestrahlt werden. Dies erfolgt im Falle der Fig. 2 mit Hilfe der in der Schicht 23 vorgesehenen Öffnung 32, die im Ergebnis zusammen mit dem transparenten Material der Schicht 24 den erfindungsgemäß vorgesehenen optischen Pfad bildet.
Wie bereits erläutert, besitzt die Ausnehmung 32 insbesondere eine abgerundete Querschnittsfläche, deren Durchmesser bzw. Radius sich in Richtung auf die Schicht 24 stufenweise oder kontinuierlich verringert, so dass es sich bei der Ausnehmung 32 um eine sich verjüngende Ausnehmung handelt. Wie bereits erläutert, kann die Ausnehmung 32 dadurch ausgebildet werden, dass nach Ausbildung eines vollflächigen Schichtaufbaus aus Schicht 23 und Schicht 24 das Material der Schicht 23 in der gewünschten Weise weggeätzt wird. Auf diese Weise ist es dann möglich, dass die elektromagnetische Strahlung von unten her über die Ausnehmung 32 in die Schicht 24 eintritt und durch diese Schicht hindurchgeführt wird.
Wie ebenfalls bereits erläutert, kann auch dem elastischen Material des Abdeckelements 29 bewusst eine optische Funktion zugeordnet werden. Sofern es sich hier mindestens teilweise um transparentes Material handelt, kann entweder von unten eingestrahlte elektromagnetische Strahlung durch dieses elastische Material austreten, oder es kann auch elektromagnetische Strahlung (von oben) auf das Substrat eingebracht werden. Wie beschrieben, ist es auch möglich, das Material des Abdeckelements 29 bewusst zur Abschirmung von elektromagnetischer Strahlung einzusetzen oder diesem Material Reflexionseigenschaften zu verleihen.
Schließlich zeigt Fig. 2 noch den Halter 33 mit Hohlkanülen 34, der ebenfalls nicht zwingend Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung 21 ist. Die Darstellung des Halters 33 mit Kanülen 34 soll lediglich verdeutlichen, wie Flüssigkeiten oder Gase mit Hilfe der Hohlkanülen 34 auf das Substrat 22 aufgebracht - - oder aus diesem wieder entfernt werden können. Die Hohlkanülen 34 werden dabei durch das elastische Material des Abdeckelements 29 hindurchgeführt, wobei durch die Elastizität des Materials automatisch eine Abdichtung am Außenumfang der Hohlkanülen gewährleistet ist. Mögliche Positioniereinrichtungen und Halteeinrichtungen für das Aufsetzen und Entfernen des Halters 33 auf oder vom Abdeckelement 29 sind in Fig. 2 nicht dargestellt.
Wie in Fig. 1 zeigt Fig. 2 im Übrigen auch keine weiteren Komponenten einer Einrichtung, die für die Durchführung von Patch-Clamp-Untersuchungen notwendig sind, wie Elektroden, Gegenelektroden, Pumpen, Ventile, Flüssigkeitsreservoirs, Mess- und Steuergeräte und dergleichen.

Claims

Patentansprüche
Vorrichtung (1 ; 21 ) nach Art eines Patch-Clamp-Chips zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen (12), die insbesondere Membranproteine wie beispielsweise lo- nenkanäle aufweisen oder ausbilden, mit
mindestens einem, vorzugsweise flachen Substrat (2; 22), das mikrofluidische Komponenten und/oder mikrofluidische Strukturen (3-7, 9-1 1 ; 26-28) sowie mindestens eine Öffnung (8; 25), insbesondere eine Vielzahl von Öffnungen, an der die Membran oder Zelle (12) zumindest während einer Messung unter elektrischer Kontaktierung immobilisierbar ist, vorzugsweise an der Oberseite der Öffnung (8; 25), aufweist, und
mindestens einem optischen Pfad (13; 32) zum Durchtritt oder zur Übertragung elektromagnetischer Strahlung, der dem Substrat (2; 22) zugeordnet ist und/oder Teil des Substrats (2; 22) ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der optische Pfad (13; 32) auf der Seite des Substrats (2; 22) vorgesehen ist, die zu der Seite der Öffnung (8; 25), an der die Membran oder Zelle (12) immobilisiert ist, abgewandt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Pfad (13; 32) mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig als Ausnehmung im Substrat ausgebildet ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Pfad (13) mindestens ein transparentes Material, vorzugsweise Glas oder Quarzglas, insbesondere mindestens ein Fenster aus mindestens einem transparenten Material, vorzugsweise aus Glas oder Quarzglas umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (2; 22) mindestens teilweise, vorzugsweise vollständig aus transparentem Material, insbesondere aus Glas oder Quarzglas besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (22) aus mindestens zwei, vorzugsweise mehreren Schichten (23, 24) aufgebaut ist, wobei insbesondere mindestens eine Schicht aus transparentem Material, vorzugsweise aus Glas oder Quarzglas besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine untere erste Schicht (23) aus nicht-transparentem Material, insbesondere aus Silicium besteht, und eine obere zweite Schicht (24) aus transparentem Material, insbesondere aus Glas oder Quarzglas besteht.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die mikrofluidischen Komponenten und/oder mikrofluidischen Strukturen (26-28) und/oder die Öffnung (25) zur Immobilisierung der Membran oder Zelle im transparenten Material vorgesehen sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Pfad mindestens eine Glasfaseroptik oder mindestens eine Mikroskopoptik oder mindestens eine Schnittstelle für eine Glasfaseroptik oder eine Mikroskopoptik umfasst.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein separater Kanal (10; 28) vorgesehen ist, der mit der Öffnung (8; 25) nicht in direkter Verbindung steht und mit dessen Hilfe die Membran oder Zelle (12) durch Anlegen eines Unterdrucks an der Öffnung (8; 25) positionierbar und/oder festlegbar ist, wobei vorzugsweise dieser separate Kanal (10; 28) in mindestens einer se- paraten Öffnung (1 1 ; 26) mündet, welche insbesondere die Öffnung (8; 25) mindestens teilweise konzentrisch umgibt.
1 1 . Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Durchmesser des separaten Kanals (10) in Richtung seiner separaten Öffnung (1 1 ) vergrößert.
12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit
einem Substrat (2), das als mikrofluidische Strukturen aufweist: mindestens einen Flüssigkeitszulauf, vorzugsweise zwei Flüssigkeitszuläufe (3, 4),
mindestens einen Flüssigkeitsablauf (5), mindestens eine zwischen dem Flüssigkeitszulauf (3, 4) und dem Flüssigkeitsablauf (5) angeordnete Perfusionskammer (6),
mindestens einen Kanal (7) nach Art einer Patch-Clamp- Pipette mit einer Öffnung (8), die in der Perfusionskammer (6) mündet, und der mit mindestens einem weiteren Flüssigkeitskanal (9) in Verbindung steht, und mindestens einen separaten Kanal (10), der mit der Öffnung (8) nicht in direkter Verbindung steht und der in min- des einer separaten Öffnung (1 1 ) mündet, die insbesondere die Öffnung (8) mindestens teilweise konzentrisch umgibt, einem optischen Pfad (13) zur Übertragung von elektromagnetischer Strahlung, der vorzugsweise auf der zur Oberseite der Öffnung (8) abgewandten Seite des Substrats (2) vorgesehen ist.
13. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die von dem Kanal (7) nach Art einer Patch-Clamp-Pipette gebildete Öffnung (8) und/oder die von dem separaten Kanal (10) gebildete separate Öffnung (1 1 ) in die Perfusionskammer (6) hineinragt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Vorrichtung mindestens ein Anschlag (31 ) zugeordnet ist, mit dessen Hilfe die Vorrichtung für die Bestimmung der relevanten Messgrößen, insbesondere reversibel, positionierbar ist, wobei vorzugsweise mindestens ein Anschlag einer, insbesondere kürzeren Stirnseite des Substrats und mindestens zwei Anschläge einer, insbesondere längeren Längsseite des Substrats zugeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Seite der Vorrichtung, die der Öffnung zur Immobilisierung der Membran oder Zelle gegenüberliegt, mindestens ein Abdeckelement (29) aus vorzugsweise elastischem Material vorgesehen ist, das das Substrat zu dieser Seite hin abschließt, wobei durch das Abdeckelement hindurch Flüssigkeiten oder Gase in die mikrofluidischen Komponenten oder Strukturen einbringbar oder aus diesen entnehmbar sind.
Verfahren zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen, die insbesondere Membranproteine wie beispielsweise lonenkanäle aufweisen oder ausbilden, wobei das Verfahren vorzugsweise durchgeführt wird mit der Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine optisch ausgelöste Immobilisierung der Membran oder der Zelle an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung erfolgt, oder dass eine optisch ausgelöste Messung an der Membran oder der Zelle, die an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung immobilisiert ist, erfolgt.
Verfahren zur Bestimmung von vorzugsweise biologisch relevanten Messgrößen an Membranen und Zellen, die insbesondere Membranproteine wie beispielsweise lonenkanäle aufweisen oder ausbilden, wobei das Verfahren vorzugsweise durchgeführt wird mit einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine Stimulation, insbesondere eine optische Stimulation der Membran oder der Zelle erfolgt, während die Zelle an einer in einem vorzugsweise flachen Substrat vorgesehenen Öffnung immobilisiert ist.
18. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Substrat mit einem Aufbau aus mindestens zwei Schichten bereitgestellt oder hergestellt wird, wobei mindestens eine untere erste Schicht aus nicht-transparentem Material, insbesondere Silicium, und mindestens eine obere zweite Schicht aus transparentem Material, insbesondere aus Glas oder Quarzglas, besteht, und dann die untere Schicht aus nicht-transparentem Material zur Ausbildung eines optischen Pfads zum Durchtritt oder zur Übertragung elektromagnetischer Strahlung mindestens teilweise entfernt wird, insbesondere durch chemisches oder physikalisches Ätzen, vorzugsweise mit einem Ätzstop durch das transparente Material.
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