DE602004005681T2

DE602004005681T2 - Kapillarsperre

Info

Publication number: DE602004005681T2
Application number: DE602004005681T
Authority: DE
Inventors: Rafael Taboryski; Jonatan Kutchinsky
Original assignee: Sophion Bioscience AS
Current assignee: Sophion Bioscience AS
Priority date: 2003-02-21
Filing date: 2004-02-23
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2024-02-24
Also published as: CN1774629B; US8268260B2; CA2516724A1; DE602004005681D1; ATE358823T1; DK1597576T3; JP2006518851A; EP1597576B1; CA2516724C; CN1774629A; WO2004074829A1; US20060251544A1; GB0303920D0; EP1597576A1

Description

Die Erfindung betrifft ein System, das einen oder mehrere Fluidkanäle aufweist, deren Abmessungen im Sub-Millimeter-Bereich liegen. Solche Systeme werden im Bereich der Chemie, der Biochemie, der Molekular- und Zell-Biologie verwendet und werden häufig als Mikrofluidsysteme bezeichnet.
Systeme, auf welche sich die vorliegende Erfindung bezieht, können verwendet werden, um elektrophysiologische Eigenschaften von Ionenkanälen in Ionenkanäle enthaltenden Strukturen, typischerweise Lipidmembranen enthaltenden Strukturen, wie z.B. Zellen, dadurch zu messen bzw. zu überwachen, dass eine elektrophysiologische Messkonfiguration aufgebaut wird, in welcher eine Zellmembran eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand um die Messelektrode herum bildet, wodurch es möglich wird, einen Stromfluss durch die Zellmembran zu ermitteln und messend zu überwachen. Solche Systeme können einen Teil einer Vorrichtung zur Durchführung von Patch-Clamp-Verfahren bilden, die verwendet werden, um Ionen-Transferkanäle und biologische Membranen beispielsweise zu untersuchen.
Die grundlegende Idee, einen Flecken einer Membran elektrisch zu isolieren und die Ionenkanäle in diesem Flecken (Patch) unter Spannungs-Klemm-Bedingungen zu untersuchen, wird in dem Artikel von Neher, Sakmann und Steinback (1978) „The Extracellular Patch Clamp, A Method For Resolving Currents Through Individual Open Channels In Biological Membranes", Pflüger Arch. 375; Seiten 21 bis 278 beschrieben. Es wurde gefunden, dass man dadurch, dass man eine Pipette, die Acetylcholin (ACh) enthielt, gegen die Oberfläche einer Muskelzellenmembran drückte, einzelne Sprünge im elektrischen Strom sehen konnte, die dem Öffnen und Schließen von ACh-aktivierten Ionenkanälen zugeordnet werden konnten. Die Forscher waren bei ihrer Arbeit jedoch durch die Tatsache eingeschränkt, dass der Widerstand der Dichtung zwischen dem Glas der Pipette und der Membran (10 MΩ bis 50 MΩ) sehr klein im Vergleich zum Widerstand des Kanals (10 GΩ) war. Das elektrische Rauschen, das sich aus einer solchen Dichtung ergibt, steht im umgekehrten Verhältnis zum Widerstandswert und war somit groß genug, um die Ströme zu verdecken, welche durch die Ionenkanäle flossen, deren Leitfähigkeit geringer ist als die des ACh-Kanals. Es verhinderte aufgrund der sich ergebenden großen Ströme durch die Dichtung hindurch auch das Festklemmen der Spannung in der Pipette auf Werte, die von denen des Bades verschieden waren.
Es wurde dann entdeckt, dass dadurch, dass man die Glaspipetten feuerpolierte und eine Saugwirkung an das Innere der Pipette anlegte, eine Dichtung mit sehr hohem Widerstandswert (1 GΩ bis 100 GΩ) mit der Oberfläche der Zelle erzielt werden konnte, wodurch das Rauschen um eine Größenordnung auf Pegel vermindert wurde, bei denen die meisten biologisch interessierenden Kanäle untersucht werden können, und dass dadurch der Spannungsbereich stark erweitert wurde, über den hinweg diese Untersuchungen durchgeführt werden können. Diese verbesserte Dichtung wurde als „Giga-Dichtung" bezeichnet und die Pipette wird als „Patch-Pipette" bezeichnet. Eine genauere Beschrei bung der Giga-Dichtung findet sich bei O.P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann & F.J. Sigworth (1981) „Improved patch-clamp techniques for high resolution current recordings from cells and cell-free membrane patches". Pflügers Arch. 391, Seiten 85 bis 100. Für ihre Arbeit bei der Entwicklung des Patch-Clamp-Verfahrens erhielten Neher und Sakmann 1991 den Nobelpreis in Physiologie und Medizin.
Ionenkanäle sind durch die Membran hindurchgehende Proteine, welche den Transport von anorganischen Ionen über die Zellmembranen hinweg katalysieren. Die Ionenkanäle sind bei so unterschiedlichen Vorgängen wie der Erzeugung und der zeitlichen Steuetung von Aktionspotentialen, der synaptischen Transmission, der Ausscheidung von Hormonen, der Kontraktion von Muskeln usw. beteiligt. Viele pharmakologische Wirkstoffe üben ihre speziellen Wirkungen durch eine Modulation von Ionenkanälen aus. Beispiele hierzu sind anti-epileptische Verbindungen wie z.B. Phenytoin und Lamotrigin, welche die spannungsabhängigen Na⁺-Kanäle im Gehirn blockieren, Anti-Bluthochdruck-Medikamente wie z.B. Nifedipin und Diltiazem, welche die spannungsabhängigen Ca²⁺-Kanäle in glatten Muskelzellen blockieren, und Stimulatoren für eine Insulinfreisetzung wie z.B. Glibenclamid und Tolbutamid, welche einen ATP-regulierten K⁺-Kanal in der Bauchspeicheldrüse blockieren. Zusätzlich zur klinisch induzierten Modulation der Ionenkanal-Aktivität hat das Patch-Clamp-Verfahren die Wissenschaftler in die Lage versetzt, Manipulationen mit spannungsabhängigen Kanälen durchzuführen. Diese Verfahren umfassen das Einstellen der Polarität der Elektroden in der Patch-Pipette und eine Änderung der Salzlösungszusammensetzung um die freien Ionenpegel in der Badlösung zu moderieren.
Das Patch-Clamp-Verfahren stellt eine bedeutende Entwicklung in der Biologie und der Medizin dar, da es die Messung von Ionenströmen durch einzelne Ionenkanal-Proteine ebenso ermöglicht, wie die Untersuchung der Aktivität eines einzelnen Ionenkanals in Reaktion darauf, dass er einem medizinischen Wirkstoff ausgesetzt wird. Kurz gesagt wird bei herkömmlichen Patch-Clamp-Verfahren eine dünne Glaspipette (mit einem Durchmesser von ungefähr 0,5 μm bis 2 μm) verwendet. Die Spitze dieser Patch-Pipette wird gegen die Oberfläche der Zellmembran gedrückt. Die Pipettenspitze bildet eine enge Dichtung mit der Zellmembran und isoliert eine kleine Gruppe von Ionenkanal-Proteinen in dem winzigen Membranfleck, der durch die Pipettenöffnung begrenzt ist. Die Aktivität dieser Kanäle kann einzeln gemessen werden („Einzelkanal-Aufzeichnung") oder, alternativ, kann der Fleck aufgerissen werden, wodurch eine Messung der Kanalaktivität der gesamten Zellmembran ermöglicht wird („Gesamtzellen-Konfiguration"). Ein Zugang mit hoher Leitfähigkeit zum Inneren der Zelle zur Durchführung von Gesamtzellen-Messungen kann dadurch erreicht werden, dass man die Membran durch das Anlegen eines Unterdrucks in der Pipette aufreißt.
Wie oben erläutert, ist ein wichtiges Erfordernis für Patch-Clamp-Messungen von Einzelkanal-Strömen die Ausbildung einer Dichtung mit hohem Widerstandswert zwischen der Zellmembran und der Glasmikro-Pipettenspitze, um Ionen daran zu hindern, sich in dem Raum zwischen den beiden Oberflächen zu bewegen. Typischerweise sind Widerstandswerte von mehr als 1 GΩ erforderlich, und somit wird die physikalische Berührungszone als „Giga-Dichtung" bezeichnet.
Die Ausbildung einer Giga-Dichtung erfordert, dass die Zellmembran und das Pipettenglas in enge Nachbarschaft zueinander gebracht werden. Während der Abstand zwischen benachbarten Zellen in Geweben oder zwischen in einer Kultur gezogenen Zellen und ihren Substraten im Allgemeinen in der Größenordnung von 20 nm bis 40 nm liegt (Neher, 2001) wird vorhergesagt, dass der Abstand zwischen der Zellmembran und dem Pipettenglas in der Giga-Dichtung im Angström-Bereich (d.h. 10^-10m) liegt. Die physiochemische Es können jedoch Giga-Dichtungen zwischen Zellmembranen und einer Vielzahl von Glasarten ausgebildet werden, zu denen Quarz, Aluminiumsilikat und Borsilikat gehören (Rae und Levis, 1992), was darauf hindeutet, dass die spezielle chemische Zusammensetzung des Glases nicht kritisch ist.
Zellmembranen bestehen aus einer Phospholipid-Doppelschicht mit dazwischen eingefügten Glykoproteinen, wobei letztere eine Vielzahl von Funktionen besitzen, einschließlich ihrer Wirkung als Rezeptoren für verschiedene Wirkstoffe. Diese Membran überspannenden Glykoproteine umfassen typischerweise Peptid- und Glyko-Bestandteile, die sich aus der Membran heraus in den extrazellulären Raum hinein erstrecken und eine so genannte „Glycocalix"-Schicht um die Phospholipid-Doppelschicht herum bilden, die eine Höhe von 20 nm bis 50 nm erreicht und einen mit Elektrolyt gefüllten Raum in der Nachbarschaft der Phospholipid-Doppelschicht erzeugt. Somit bildet die Glycocalyx einen hydrophilen und negativ geladenen Bereich, der den Grenzraum zwischen der Zelle und ihrer wässrigen Umgebung bildet.
Jüngste Entwicklungen bei der Patch-Clamp-Methode haben zur Einführung von ebenen Substraten (beispielsweise eines Silizium-Chips) anstelle der herkömmlichen Glas-Mikropipette geführt (siehe beispielsweise WO 01/25769 und Mayer, 2000).
Ein typisches Mikrofluid-System umfasst eine Pumpe und eine Messvorrichtung, die über einen Fluidkanal mit der Pumpe verbunden ist. In manchen Systemen haben sowohl die Pumpe als auch die Messvorrichtung Abmessungen in der Größenordnung von einigen Mikrometern. Es ist bekannt, dass es bei solchen Systemen erforderlich ist, einen externen Druck in der Größenordnung von bis zu mehreren Atmosphären anzulegen, um das System vorzubereiten bzw. zu starten bzw. zu füllen.
Als Vorbereiten wird der Vorgang bezeichnet, bei dem die zunächst in dem System vorhandene Luft durch Flüssigkeit ersetzt wird. Wegen der Submillimeter-Abmessungen der Fluidkanäle werden die Kräfte, die aufgrund der Oberflächenspannung des Fluids in den Kanälen ausgeübt werden, werden in zunehmendem Maße signifikant und können während des Initialisierungsvorganges zu Problemen führen.
Einige bekannte Mikrofluidsysteme umfasst eine externe Pumpe, die den auf die Systeme ausgeübten Druck steuert.
Bei manchen bekannten Mikrofluidsystemen ist die Pumpe mit dem Mikrofluidsystem integral ausgebildet oder diesem eng zugeordnet. Solche Pumpen sind als Mikropumpen bekannt.
In manchen Situationen ist der Luftströmungswiderstand in der Messvorrichtung groß im Vergleich mit dem Volumen der verbindenden Fluidkanäle. Dies bedeutet, dass ein übermäßig langer Zeitraum benötigt wird, um den Initialisierungsvorgang durchzuführen, insbesondere um die Luft auszutreiben, die zunächst in den Fluidkanälen vorhanden ist.
Die US-Offenlegungsschrift 2002/144905 beschreibt ein System zum Positionieren und/oder Analysieren von Proben wie z.B. Zellen, Vesikeln, Zellorganellen und Fragmenten, Derivaten und Mischungen hiervon, für eine elektrische und/oder optische Analyse, insbesondere in Bezug auf das Vorhandensein und/oder die Aktivität von Ionenkanälen.
EP 0 672 834 beschreibt einen Mikrofluid-Manipulator für das gesteuerte Fördern, Dosieren, Vorbereiten und Mischen von Fluiden, vorzugsweise von hochkonzentrierten Medikamenten im Sub-Mikroliter-Bereich ohne mikromechanische Diaphragma-Pumpen und Ventile.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt schafft die vorliegende Erfindung ein Mikrofluid-System zum Ermitteln bzw. Messen und/oder überwachen von elektrophysiologischen Eigenschaften von Ionenkanälen in Ionenkanäle enthaltenden Strukturen, das folgendes umfasst:
einen Kanal mit einem Einlass und einem Auslass,
eine erste Membran, die zwischen dem Einlass und dem Auslass angeordnet ist und eine Öffnung aufweist, die einen Radius im Bereich von 0,1 μm bis 50 μm besitzt, wobei der Einlass und der Auslass derart miteinander in hydraulischer Verbindung stehen, dass sich ein Fluid längs des Kanals vom Einlass zum Auslass bewegen kann, und
Druckeinrichtungen zum Erzeugen einer Druckdifferenz zwischen dem Einlass und dem Auslass, wobei in Betrieb die Bewegung eines Fluids im Kanal an der ersten Membran aufgrund der Oberflächenspannung gestoppt wird, die im Fluid an der Öffnung erzeugt wird, bis die Druckeinrichtungen eine Druckdifferenz zwischen dem Einlass und dem Auslass erzeugen, welche die an der Öffnung erzeugte Oberflächenspannung übersteigt.
Die vorliegende Erfindung verwendet den Druck, der durch die Oberflächenspannung einer Flüssigkeitsoberfläche in einer kleinen Öffnung oder einem kleinen Loch ausgeübt wird.
Die vorliegende Erfindung löst oder vermindert somit die Probleme, die beim Initialisierungsvorgang der meisten Mikrofluidsysteme auftreten, dadurch, dass im Fluidweg ein Flüssigkeitsstopp eingeführt wird, der auf Kapillarkräften beruht.
Günstigerweise umfasst die erste Membran eine Vielzahl von Öffnungen, obwohl es bei bestimmten Ausführungsformen möglich ist, dass die erste Membran nur eine einzige Öffnung aufweist.
Vorteilhafterweise umfassen die Druckeinrichtungen eine Pumpvorrichtung und umfasst das System weiterhin ein umschlossenes erstes Volumen, das zwischen dem Einlass und dem Auslass angeordnet ist, und ein zweites Volumen, das mit dem ersten Volumen in hydraulischer Verbindung steht, wobei die Pumpeinrichtung mit dem ersten und dem zweiten Volumen in hydraulischer Verbindung steht, um Fluid durch das System zu pumpen oder eine hydraulische Druckdifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Volumen auszubilden, wobei die erste Membran zwischen dem Auslass und dem ersten Volumen angeordnet ist.
In manchen Fällen kann es vorteilhaft sein, ein System zu haben, das mehr als eine Membran umfasst. Günstigerweise umfasst das System weiterhin eine zweite Membran, die eine Öffnung aufweist, die einen Radius im Bereich von 0,1 μm bis 50 μm besitzt und zwischen dem Einlass und dem ersten Volumen angeordnet ist.
Bevorzugte und vorteilhafte Merkmale der Erfindung ergeben sich unmittelbar aus den beigefügten abhängigen Ansprüchen.
Gemäß einem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird eine Membran geschaffen, die ein Mikrofluid-System zum Messen bzw. Ermitteln und/oder Überwachen von elektrophysiologischen Eigenschaften von Ionenkanälen in einer Ionenkanäle enthaltenden Struktur umfasst, wobei das System einen Kanal aufweist, der einen Einlass und einen Auslass besitzt, wobei
eine erste Membran zwischen dem Einlass und dem Auslass angeordnet ist und eine Öffnung mit einem Radius im Bereich von 0,1 μm bis 50 μm umfasst und wobei der Einlass und der Auslass miteinander in hydraulischer Verbindung stehen, so dass sich ein Fluid längs des Kanals vom Einlass zum Auslass bewegen kann.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zur Durchführung von elektrophysiologischen Messungen geschaffen, wobei die Vorrichtung ein Mikrofluid-System umfasst, das einen Kanal mit einem Einlass und einem Auslass aufweist und
wobei eine erste Membran zwischen dem Einlass und dem Auslass angeordnet ist und eine Öffnung besitzt, die einen Radius im Bereich von 0,1 μm bis 50 μm aufweist, wobei der Einlass und der Auslass miteinander in hydraulischer Verbindung stehen, so dass sich ein Fluid längs des Kanals vom Einlass zum Auslass bewegen kann.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Starten bzw. Vorbereiten eines Systems geschaffen, das ein Mikrofluid-System umfasst, welches folgende Bestandteile aufweist:
einen Kanal mit einem Einlass und einem Auslass,
eine erste Membran, die zwischen dem Einlass und dem Auslass angeordnet ist und eine Öffnung mit einem Radius im Bereich von 0,1 μm bis 50 μm aufweist, wobei der Einlass und der Auslass miteinander in hydraulischer Verbindung stehen, so dass sich ein Fluid längs des Kanals vom Einlass zum Auslass bewegen kann.
Die 1a und 1c zeigen den Querschnitt durch eine einzelne Öffnung, die in einer Silizium-Membran 12 gebildet ist, wobei die Dicke L der Membran 12 wesentlich kleiner als der Radius r der Öffnung ist. In 1 ist der Bereich unterhalb der Membran mit Flüssigkeit durchflutet, während der Bereich oberhalb der Membran mit Luft gefüllt ist. Die Flüssigkeit und die Luft werden durch eine Flüssigkeitsoberfläche 13 voneinander getrennt, welche die Form einer kugelförmigen Kappe besitzt. Der Winkel θ ist zwischen der Membranoberfläche und der Tangente der Flüssigkeitsoberfläche an ihrem Berührungspunkt mit der Membran gebildet.
Die freie Energie einer Flüssigkeitsoberfläche wird durch die Gleichung F = σ S gegeben, wobei σ die Oberflächenspannungskonstante und S der Oberflächenbereich ist. Insbesondere gilt σ = 0,073 J/m² für Wasser. Der Druck, der durch die Oberflächenspannung ausgeübt wird, wird durch die Ableitung der freien Energie F bezüglich des Volumens V gegeben.
Die Wasseroberfläche, die aus einer Öffnung mit einem Durchmesser r austritt, nimmt die Form einer kugeligen Kappe an, da dies die Form ist, welche die kleinste Oberfläche für ein gegebenes Volumen besitzt. Das Volumen der Kappe ist
Die Oberfläche der Kappe ist
wobei x = cos(θ) ist. Der durch das Tröpfchen ausgeübte Druck ist p = σ dS/dV, was zu
führt, wobei der dimensionslose vom Winkel abhängige Faktor P(θ) definiert ist als
Ein charakteristischer Druck p₀ = 2 σ/r kann ebenfalls definiert werden.
Die Funktion P(θ), die graphisch in 2 dargestellt ist, hat ein Maximum bei ungefähr θ = 37° und ein Minimum bei ungefähr θ = –37°. Die Winkel ± 180°, bei denen der Druck gleich Null ist, entsprechend Situationen, in denen die Öffnung und die am nächsten liegende Membranoberfläche entweder vollständig benetzt oder vollständig trocken sind. In diesen Situationen spielt die Oberflächenspannung für die Fluidströmumg um die Öffnung herum keine Rolle und die Flüssigkeitsströmung wird nicht behindert. Dieser Zustand wird als der „offene Zustand" der Öffnung bezeichnet.
In anderen Situationen befindet sich ein Wassermeniskus am Rand der Öffnung (oder Pore). Dies entspricht einem Winkelintervall um θ = 0° herum. In diesem Fall wird die Flüssigkeitsströmung gehemmt und die Öffnung wirkt als Dichtung zwischen der Ober- und der Unterseite der Membran. Dieser Zustand wird als der „Dichtungszustand" der Öffnung bezeichnet. Wenn am Anfang die Vorrichtung trocken ist und dann der Raum auf der einen Seite der Membran zunehmend mit Flüssigkeit mit einem Druck gefüllt wird, der wesentlich kleiner ist als p₀, erreicht die Öffnung automatisch den Dichtungszustand und stoppt die Strömung, wenn eine innere Oberfläche der Membran, welche die Öffnung bildet, hydrophil ist.
Es ist wichtig, die Situation zu analysieren, in welcher der Bereich unterhalb der Membran mit Flüssigkeit gefüllt ist und der Bereich oberhalb der Membran mit Luft gefüllt ist, wobei sich die Öffnung im Dichtungszustand befindet. Wenn der Druck vom Druck Null zunehmend erhöht wird, wird die Dichtung in zwei Situationen aufgebrochen. Im ersten Fall ist der Kontaktwinkelparameter der Flüssigkeit/Membran-Oberfläche τ größer als 37°. Der Meniskus wird dann stabil sein, bis θ einen Wert von 37° erreicht, entsprechend einem Druck von p₀. Zu diesem Zeitpunkt wird der Meniskus instabil und wird weiter anwachsen, bis die Oberseite der Membran überspült ist.
Im zweiten Fall τ > 37°, der einem sehr hydrophilen Material entspricht, wird die Dichtung solange halten, bis θ den Wert τ erreicht was einem Druck p₀P(τ) entspricht. Zu diesem Zeitpunkt befindet sich der Meniskus nicht mehr am Rand der Öffnung und der Meniskus beginnt, sich über die obere Membranoberfläche auszubreiten.
Wenn der Druck vom Druck gleich Null zunehmend vermindert wird, wird die Dichtung in zwei ähnlichen Situationen aufgebrochen. Im ersten Fall 180° – τ > 37°. Die Flüssigkeitsoberfläche wird dann stabil sein, bis θ einen Wert von –37° erreicht, was einem Druck von –p₀ entspricht. Zu diesem Zeitpunkt wird die Oberfläche instabil und eine Luftblase wird ihre Größe unterhalb der Öffnung ständig vergrößern. Im zweiten Fall 180° – τ < 37°, der einem sehr hydrophoben Material entspricht, wird die Dichtung solange halten, bis θ einen Wert von 180° – τ erreicht, was einem Druck von –p₀P(180° – τ) entspricht. Zu diesem Zeitpunkt wird die Oberfläche instabil und die Luft wird sich über die untere Membranobertläche ausbreiten.
Die Maximaldrücke, denen die Dichtung widerstehen kann, werden als der positive bzw. der negative Haltedruck bezeichnet. Der positive Haltedruck ist somit p₀ für τ > 37° und p₀P(τ) für τ < 37°, und der negative Haltedruck ist p₀ für 180 – τ > 37° und p₀P(180 – τ) für 180 – τ < 37°. Typische berechnete Haltedrücke sind in den folgenden Tabellen zusammengestellt, wenn die Flüssigkeit Wasser und die Membran Glas (τ = 14°) oder Polymethyl-Methacrylat (PMMA τ = 70°) ist. Die Kontaktwinkelwerte sind der Literaturstelle 1 entnommen.
Tabelle 1. Haltedrücke für Wasser an einer Glasmembran
Tabelle 2. Haltedrücke für Wasser an einer PMMA-Membran
Die Berechnungen können für andere Öffnungsformen wiederholt werden, doch kommen sie zu den gleichen grundlegenden Ergebnissen. Eine Erhöhung der Membrandicke L ändert den Haltedruck der Öffnung nicht. Ein stärker abgerundeter Öffnungsquerschnitt führt ebenfalls zu dem gleichen grundlegenden Ergebnis, doch mit einem effektiven Öffnungsradius, der größer ist als am engsten Punkt der Öffnung. Die Größe des effektiven Radius hängt vom Berührungswinkel des Membranoberflächenmaterials ab.
Eine Gruppe von identischen Öffnungen in der Membran hat die gleichen Haltedrücke wie eine einzelne Öffnung doch mit dem Vorteil, dass eine größere Strömungsleitfähigkeit für Luft und Flüssigkeit gegeben ist. Eine Gruppe ist daher bevorzugt, weil sie zu einem weniger stark gehemmten Strom im offenen Zustand führt und daher zu einem größeren Kontrast zwischen dem offenen und dem verschlossenen Zustand. Wenn die Öffnungsdurchmesser in der Gruppe von Öffnungen unterschiedlich sind, wird der Haltedruck durch die größte der Öffnungen festgelegt.
Die 3a bis 3d zeigen einen Querschnitt einer Membran 30 gemäß der Erfindung in verschiedenen Konfigurationen des Verschlusszustandes. In diesen Konfigurationen ist der Raum 32 unterhalb der Membran benetzt, während der Raum 34 oberhalb der Membran mit Luft gefüllt ist. Die Flüssigkeit und die Luft werden von der durch die dünne Linie 36 gekennzeichneten Flüssigkeitsoberfläche voneinander getrennt. In den 3a und 3b ist die Oberseite 38 der Membran trocken. In 3a ist ein positiver Druck von der Rückseite her vorhanden und in 3b ist ein negativer Druck auf der Rückseite vorhanden. In diesen Fällen ist die Vorrichtung in der Lage, Drücken standzuhalten, wie sie in den Tabellen 1 und 2 dargestellt sind.
In den 3c und 3d ist die Oberseite 38 der Membran benetzt. Diese Situation kann auftreten, wenn der Verschlusszustand zuvor durchbrochen worden ist und Flüssigkeit durch die Vorrichtung hindurch getreten ist. In 3c ist auf der Rückseite ein negativer Druck vorhanden und die Vorrichtung ist in der Lage, dem gleichen Druck standzuhalten, wie im Zustand von 3b. Dies ist in 3d nicht der Fall, in der von der Rückseite her ein positiver Druck angelegt wird. An der Oberseite 38 der Membran ist ein Tröpfchen vorhanden, das einen Durchmesser besitzt, der der Gesamtgröße der Öffnungen in der Anordnung entspricht. Die Oberflächenspannung des Tröpfchens ist weiterhin in der Lage, einem gewissen positiven Druck standzuhalten, der dem Radius des Tröpfchens entspricht. Wenn die Öffnungsgruppe beispielsweise eine Fläche von 100 × 100 μm bedeckt, hat das Tröpfchen einen Radius in der Größenordnung von 50 μm und ist bei einer Glasoberfläche in der Lage, einen positiven Druck von ungefähr 20 mbar standzuhalten.
Vorteilhafterweise wird das Membranmaterial von einem hydrophilen Material gebildet, das die Ausbildung von Mikromustern erlaubt, wie z.B. oxidiertem Silizium, Siliziumnitrid, Glas, Siliziumoxid, Aluminium, oxidiertem Aluminium oder Acryl.
Diese Verminderung der Funktionalität der Vorrichtung durch das Benetzen von beiden Seiten kann dadurch überwunden werden, dass wahlweise die Seite der Membran, die trocken sein soll, mit einem hydrophoben Material, beispielsweise mit PTFE oder PDMS (ohne hierauf beschränkt zu sein) beschichtet wird, während die Seite, die nasse sein soll, hydrophil gehalten wird.
Vorzugsweise liegt die Dicke der Membran in einem Bereich von 50 nm bis 400 nm, wenn die Membran aus Siliziumnitrid hergestellt ist, in einem Bereich von 1 μm bis 20 μm, wenn die Membran aus oxidiertem Silizium hergestellt ist, in einem Bereich von 2 μm bis 200 μm bei Glas oder Silizium und in einem Beriech von 5 μm bis 500 μm für Aluminium oder einem Kunststoffmaterial.
Vorteilhafterweise liegt der Radius der Öffnungen in einem Bereich von 0,1 μm bis 50 μm. In Systemen, die Drücke im Bereich von 100 mbar bis 1000 mbar benötigen, kann der Öffnungsradius in einem Bereich von 1 μm bis 50 μm liegen.
Vorzugsweise liegt bei einer Membran, die aus oxidiertem Silizium gebildet ist, der Radius im Bereich von 1 μm bis 3 μm. Wenn die Membran aus einem Kunststoffmaterial hergestellt ist, liegt der Radius der Öffnung in einem Bereich von 25 μm bis 100 μm.
Die Erfindung wird nun noch weiter anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung beschrieben; in dieser zeigen:
1a eine schematische Darstellung einer Membran gemäß der vorliegenden Erfindung, die einen eine Öffnung bildenden Teil der Membran wiedergibt,
1b und 1c schematische Darstellungen, die verschiedene mögliche Formen der in 1a gezeigten Öffnung wiedergeben,
2 ein Diagramm, das den dimensionslosen, winkelabhängigen Faktor P(θ) für die in 1a gezeigte Membran wiedergibt,
3a bis 3d schematische Darstellungen der Membran gemäß der vorliegenden Erfindung in verschiedenen Konfigurationen des Dichtungsraumes,
4 ein Mikrofluid-System gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
5 eine schematische Darstellung eines Mikrofluid-Systems gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
6a, 6b und 6c schematische Darstellungen eines eine Membran bildenden Teils eines Mikrofluid-Systems gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Membran eine Gruppe von Öffnungen aufweist,
7 eine schematische Darstellung eines Mikrofluid-Systems gemäß der vorliegenden Erfindung, das einen Einlass und einen Auslass aufweist,
8a und 8b schematische Darstellungen von weiteren Ausführungsformen eines Mikrofluid-Systems gemäß der vorliegenden Erfindung,
9 eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform eines Mikrofluid-Systems gemäß der vorliegenden Erfindung, bei dem die Membran aus Silizium hergestellt ist,
10 eine schematische Darstellung, welche eine integrale Anordnung mit einer Öffnung während einer elektrophysiologischen Messung, sowie mit einer elektroosmotischen Strömungspumpe und zwei Membranen gemäß der vorliegenden Erfindung wiedergibt, die monolithisch an einem Silizium-Chip ausgebildet sind, und
11 eine Rasterelektronen-Mikroskopaufnahme einer gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Membran.
In 4 ist ein Mikrofluid-System gemäß der vorliegenden Erfindung allgemein durch das Bezugszeichen 40 bezeichnet. Das System ist besonders geeignet für eine Verwendung mit einer externen Pumpe. Das System 40 umfasst eine Messvorrichtung 1 und eine Pumpe 2, bei der es sich in diesem Beispiel um eine externe Gasdruckpumpe handelt. Die Messvorrichtung 1 und die Pumpe 2 sind durch einen Fluidkanal 4 miteinander verbunden. Das System 40 umfasst weiterhin eine Membran 3 gemäß der vorliegenden Erfindung. Das Vorhandensein der Membran 3 bedeutet, dass Flüssigkeit durch die Membran 3 zugeführt werden kann, doch dichtet die Membran bei der Vervollständigung des Initüerungs- oder Startprozesses den Einlass des Systems ab. Dies ist erforderlich, um ein einwandfreies Arbeiten der Pumpe sicherzustellen, die ansonsten kurzgeschlossen würde.
In manchen Fällen ist der Luftströmungswiderstand der Pumpe 2 und der Messvorrichtung 1 groß im Vergleich mit dem Volumen des Verbindungskanals 4, was zu einem übermäßigen Zeitbedarf für das Vorbereiten bzw. Starten der Vorrichtung führt.
Eine zweite Ausführungsform eines Systems gemäß der vorliegenden Erfindung ist in 5 allgemein durch das Bezugszeichen 50 bezeichnet. In diesem Beispiel umfasst das System 50 eine Membran 5 zum Einführen von Flüssigkeit in das System 50. Das System 50 umfasst weiterhin eine Pumpe 6, beispielsweise eine elektroosmotische Pumpvorrichtung, und eine Messvorrichtung 7, die mit der Pumpe 6 mit Hilfe eines Verbindungskanals 8 verbunden ist. Das System 50 umfasst weiterhin eine zweite Membran 9 gemäß der vorliegenden Erfindung, die als Auslass für Luft dient, die in dem System 50 enthalten ist, und es ermöglicht, Luft aus dem System abzuführen. Nach Vervollständigung des Vorbereitungs- bzw. Startprozesses dichten die beiden Membranen 5, 9 das System 50 ab, und ermöglichen es der Mikropumpe 6 Druck auf das Messsystem auszuüben.
In den 6a, 6b und 6c ist eine Membran gemäß der vorliegenden Erfindung allgemein durch das Bezugszeichen 10 bezeichnet. Die Membran 10 umfasst eine Gruppe von durch sie hindurch gehenden Öffnungen 11. Die Positionierung der Öffnungen in der Membran kann solange willkürlich sein, als die Membran ihre mechanische Stabilität beibehält. Es besteht daher keine Notwendigkeit, die Öffnungen 11 in der Membran 10 exakt an bestimmten Stellen zu positionieren.
Die Membrandicke ist für das Arbeiten der Membran nicht kritisch, doch sollte sie im allgemeinen so klein wie möglich sein, um einen niederen Strömungswiderstand durch die Membran sicherzustellen, während gleichzeitig ihre mechanische Stabilität und eine einfache Herstellbarkeit gewährleistet sind.
Da der Haltedruck durch den Radius der größten Öffnung festgelegt wird, sollten die Radien der Öffnungen so gewählt werden, dass sie zu den hydrostatischen Drücken passen, die in dem speziellen Mikrofluid-System benötigt werden, in welches die Membranen eingebaut ist.
7 zeigt eine Membran 15 gemäß der vorliegenden Erfindung, die in eine Kanalstruktur mit einem Einlass 14 und einem Auslass 16 eingebettet ist. Flüssigkeit kann in den Einlass 14 mit einem Überdruck eingeführt werden, der kleiner ist als der positive Haltedruck der Vorrichtung, wodurch die Luft vor der Flüssigkeit durch die Membranöffnungen hinausgedrückt wird. Wenn die Flüssigkeitsoberfläche die Membran erreicht, verschließt sich die Vorrichtung, wodurch druckbetriebene Anwendungen laufen können, ohne mit Luftvolumina verbunden zu sein, was in manchen Fällen den Erfolg der Anwendung beeinflussen kann.
Das Anlegen eines kurzen Druckimpulses an dem Einlass 14 (für 0,1 bis 10 Sekunden) mit einer Größe, die höher ist als der positive Haltedruck, wird die Dichtung aufgebrochen und das Hindurchtreten von Flüssigkeit durch die Membran ermöglicht. Wenn ein begrenztes Volumen von Flüssigkeit in den Einlass 14 angetrieben durch einen externen Gasdruck oder durch andere Luftströmungsmittel eingeführt worden ist, strömt die Flüssigkeit weiterhin durch die Vorrichtung, bis das gesamte zur Verfügung stehende Flüssigkeitsvolumen durch die Membran in den Auslass geströmt ist. Wenn Luft wieder die Membran erreicht, kehrt die Vorrichtung in den Dichtungs- bzw. Verschlusszustand zurück, wodurch es möglich wird, dass druckgetriebene Anwendungen im Auslassbereich 16 arbeiten.
8a zeigt ein etwas komplizierteres Fluid-System mit einem Einlass 17, einem eingeschlossenen Volumen 18, einem Auslass 19, einer ersten Membran 20, einer zweiten Membran 21, einer Pumpvorrichtung 22 und einer Messvorrichtung oder einem anderen Fluid-System 23, bei dem ein Pumpen erforderlich ist. Eine derartige Konfiguration wird bevorzugt, wenn die körperlichen Abmessungen der Vorrichtungen 22 und 23 so klein sind, dass die in ihnen auftretenden Oberflächenspannungskräfte und der in ihnen vorhandene hohe Strömungswiderstand es schwierig machen, durch sie hindurch das eingeschlossene Volumen 18 vorzubereiten. Nach dem Vorbereiten ist es erforderlich, dass die beiden Membranen 20 und 19 in den Verschlusszustand eintreten, damit die Pumpe 22 auf die Messvorrichtung 23 einwirken kann.
Um das eingeschlossene Volumen 18 vorzubereiten, sollte eine Menge von Flüssigkeit in den Einlass 17 eingeführt werden, welche das gleiche Volumen besitzt, wie das eingeschlossene Volumen 18 und zusätzlich ein gewisser Überschuss, um den Toleranzen in dem System Rechnung zu tragen und in allen Fällen ausreichend Flüssigkeit für das Vorbereiten bzw. Starten sicherzustellen. Ein Gasdruck, der niedriger ist als der positive Haltedruck der Membran 20 sollte an den Einlass 17 für eine ausreichend lange Zeit angelegt werden, um es der Flüssigkeit zu ermöglichen, die Membranen 21, 20 zu erreichen. Danach sollte ein kurzer Druckimpuls (0,1 bis 10 Sekunden) angelegt werden, der größer ist, als der positive Haltedruck der Membran 20, um Flüssigkeit durch die Öffnungen der Membran 20 hindurch zu drücken. Dann sollte ein positiver Druck, der niedriger ist, als der negative Haltedruck der Membran 20 am Einlass 17 aufrechterhalten werden, um die Flüssigkeit in das eingeschlossene Volumen 18 überzuführen. Die Luft im Volumen 18 wird durch die zweite Membran 21 abgeführt. Zu einem gewissen Zeitpunkt erreicht die Flüssigkeit die zweite Membran 21, was diese veranlasst, in ihren Dichtungs- bzw. Verschlusszustand einzutreten.
Zu diesem Zeitpunkt wird eine überschüssige Flüssigkeitsmenge im Einlasskanal 17 vorhanden sein. Der Gasdruck sollte an diesem Einlass nach dem Vorbereiten der anderen Teile des Flüssigkeitssystems in der Pumpe 22 und der Messvorrichtung 23 aufrechterhalten werden. Dies stellt sicher, dass die überschüssige Flüssigkeit im Einlass 17 zur Pumpe 22 und zur Vorrichtung 23 übergeführt wird. Wenn diese Überführung abgeschlossen ist, tritt die Vorrichtung 20 in ihren Verschlusszustand ein, wodurch der Vorbereitungsvorgang abgeschlossen wird.
In 8b ist ein weiteres Beispiel dargestellt, bei dem ein Fluid-System einen Einlass 17, ein eingeschlossenes Volumen 18, einen Auslass 19, eine Membran 21, eine Pumpvorrichtung 24 und eine Messvorrichtung oder ein anderes Fluid-System 23 umfasst, bei dem ein Pumpen erforderlich ist.
Um das eingeschlossene Volumen 18 vorzubereiten, sollte eine Flüssigkeitsmenge in den Einlass 17 eingeführt werden, bevor dieser mit der Pumpvorrichtung verbunden wird. Die Flüssigkeit sollte das gleiche Volumen besitzen, wie das eingeschlossene Volumen 18, zuzüglich eines gewissen Überschusses, um den Toleranzen im System Rechnung zu tragen und in allen Fällen ausreichend Flüssigkeit für den Startvorgang sicherzustellen. Die Pumpvorrichtung sollte dann angeschlossen werden und ein Gasdruck im Bereich im negativen und positiven Haltedruck der Membran 21 kann nun durch die Pumpvorrichtung auf die Messvorrichtung 23 ausgeübt werden.
Das Membranmaterial kann im Allgemeinen irgendein hydrophiles Material sein, das für die Aufbringung von Mikromustern geeignet ist, wie z.B. oxidiertes Silizium, Siliziumnitrid, Glas, Siliziumdioxid, Aluminium, oxidiertes Aluminium und Acryl. Die Öffnungen in der Membran können unter Verwendung eines Laser-Schleifvorganges, durch Mikrobohren, durch Sandstrahlen, mit einem Hochdruck-Wasserstrahl, durch fotolithographische Verfahren oder durch andere für eine Mikro-Herstellung geeignete Verfahren erzeugt werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist in 9 dargestellt, in der eine Membran mit Löchern auf einem Siliziumsubstrat unter Verwendung von Standard-MEMS-Verfahren ausgebildet wird (siehe Literaturstelle 2). Die Struktur besteht aus einem Siliziumsubstrat 46, einer Membran 25 und lithographisch definierten und in die Membran 26 geätzten Poren. Dies kann beispielsweise durch das folgende Verfahren durchgeführt werden:

1) Das Ausgangsmaterial ist ein Silizium-Wafer mit einer 100-Oberfläche.
2) Eine Oberfläche des Siliziums wird mit Fotolack beschichtet und das die Stellen und Durchmesser enthaltende Muster wird auf den Fotolack durch eine UV-Licht-Exposition übertragen.
3) Das Öffnungsmuster wird auf das Silizium mit einer tiefen reaktiven Ionen-Ätzung (Deep Reactive Ion Etch (DRIE) oder durch Advanced Silicon Etching (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas (ICP) übertragen, was zu tiefen vertikalen Poren mit einer Tiefe von 1 μm bis 50 μm führt.
4) Die Siliziumoberfläche wird mit Siliziumnitrid unter Verwendung chemischer Niederdruck-Dampfabscheidung (LPCVD) beschichtet.
5) Die gegenüberliegende Seite des Wafers (die Bodenseite) wird mit Fotolack beschichtet, und ein Muster, das die die Membran definierenden Öffnungen im Siliziumnitrid enthält, wird durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
6) Das Siliziumnitrid wird auf der Bodenseite des Wafers in den durch die Öffnungen im Fotolack definierten Bereichen unter Verwendung von reaktiver Ionen-Ätzung (RIE) abgeätzt.
7) Der Wafer wird in einer KOH-Lösung anisotrop geätzt, was zu einer pyramidenförmigen Öffnung in der Bodenseite des Wafers führt. Die zeitliche Steuerung des Ätzvorganges definiert die Dicke der verbleibenden Membran aus Silizium an der Oberseite des Wafers. Alternativ kann eine Bohr-Dotierung verwendet werden, um einen Ätz-Stopp zu definieren, was zu einer besseren Kontrolle der Dicke führt.
8) Das Siliziumnitrid wird durch nasse chemische Ätzung beispielsweise in Phosphorsäure bei 160°C entfernt.
9) Das Silizium wird mit Siliziumoxid entweder durch thermische Oxidation oder mit LPCVD beschichtet.

Alternativ kann das Substrat durch das folgende Verfahren hergestellt werden:

1) Das Ausgangsmaterial ist ein Silizium-Wafer mit einer 100-Oberfläche.
2) Die Siliziumoberfläche wird mit Siliziumnitrid unter Verwendung von chemischer Niederdruck-Dampfabscheidung (LPCVD) beschichtet.
3) Die Bodenseite des Wafers wird mit Fotolack beschichtet und ein Muster, das die Membran definierenden Öffnungen im Siliziumnitrid enthält, wird durch eine UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
4) Das Siliziumnitrid wird auf der Bodenseite des Wafers in den durch die Öffnungen im Fotolack definierten Bereichen unter Verwendung von reaktiver Ionen-Ätzung (RIE) weggeätzt.
5) Der Wafer wird in einer KOH-Lösung anisotrop geätzt, was zu einer pyramidenförmigen Öffnung in der Bodenseite des Wafers führt. Die zeitliche Steuerung des Ätzvorganges legt die Dicke der verbleibenden Membran aus Silizium an der Oberseite des Wafers fest. Alternativ kann eine Vordotierung verwendet werden, um einen Ätz-Stopp zu definieren, was zu einer besseren Kontrolle der Dicke führt. Alternativ kann das Silizium durch die Gesamtdicke des Wafers hindurch abgeätzt werden, so dass nur das Siliziumnitrid auf der oberen Oberfläche als dünne Membran zurückbleibt.
6) Die obere Oberfläche des Wafers wird mit Fotolack beschichtet und das Muster, das die Poren stellen und Durchmesser definiert, wird auf den Fotolack durch UV-Licht-Exposition übertragen.
7) Das Porenmuster wird auf das Silizium durch tiefe reaktive Ionen-Ätzung (DRIE) oder Advanced Silicon Etching (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas (ICP) übertragen, was zu tiefen vertikalen Poren mit einer Tiefe von 1 μm bis 50 μm führt.
8) Das Silizium wird mit Siliziumoxid entweder durch thermische Oxidation, durch Plasma verstärkte chemische Dampfabscheidung (PECVD) oder durch LPCVD beschichtet.

Alternativ kann das Substrat durch den folgenden Prozess hergestellt werden:

1) Das Ausgangsmaterial ist ein Silizium-Auf-Isolator-Wafer (SOI) mit einer 100-Oberfläche und einer vergrabenen Oxidschicht, die sich 1 μm bis 50 μm unter der oberen Oberfläche befindet.
2) Die Wafer-Oberfläche wird unter Verwendung von chemischer Niederdruck-Dampfabscheidung (LPCVD) mit Siliziumnitrid beschichtet.
3) Die Bodenseite des Wafers wird mit Fotolack beschichtet und ein Muster, das die die Membran definierenden Öffnungen im Siliziumnitrid enthält, wird durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
4) Das Siliziumnitrid wird auf der Bodenseite des Wafers in den durch die Öffnungen im Fotolack definierten Bereichen unter Verwendung von reaktiver Ionen-Ätzung (RIE) weggeätzt.
5) Der Wafer wird in einer KOH-Lösung anisotrop geätzt, was zu einer pyramidenförmigen Öffnung auf der Bodenseite des Wafers führt. Die vergrabene Oxidschicht dient als Ätz-Stopp für die anisotrope Ätzung, was zu einer Membrandicke führt, die durch die Tiefe der Oxidschicht definiert ist.
6) Die obere Oberfläche des Wafers wird mit einem Fotolack beschichtet und das die Porenstellen und Porendurchmesser enthaltende Muster wird durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
7) Das Porenmuster wird durch tiefe reaktive Ionen-Ätzung (DRIE) oder Advanced Silicon Etching (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas (ICP) auf das Silizium übertragen, was zu tiefen vertikalen Poren nach unten bis zur Tiefe der vergrabenen Oxidschicht führt.
8) Die exponierten Bereiche der vergrabenen Oxidschicht werden durch RIE, nasse Hydrofluorsäure (HF-Ätzung) oder HF-Dampf-Ätzung entfernt. Dies stellt einen Kontakt zwischen den oberen und den unteren Öffnungen im Wafer her.
9) Das Silizium wird mit Siliziumoxid entweder durch thermische Oxidation, durch Plasma verstärkte chemische Dampfabscheidung (PECVD) oder durch LPCVD beschichtet.

Alternativ kann das Substrat durch das folgende Verfahren hergestellt werden:

1) Das Ausgangsmaterial ist ein Silizium-Auf-Isolator-Wafer (SOI) mit einer vergrabenen Oxidschicht, die sich 1 μm bis 50 μm unter der oberen Oberfläche befindet.
2) Die Bodenseite des Wafers wird mit Fotolack beschichtet und ein Muster, das die die Membran definierenden Öffnungen im Silizium enthält, wird durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
3) Das Membranmuster wird durch tiefe reaktive Ionen-Ätzung (DRIE) oder Advanced Silicon Etching (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas (ICP) auf das Silizium übertragen, was zu vertikalen Hohlräumen nach unten bis zur Tiefe der vergrabenen Oxidschicht führt.
4) Die obere Oberfläche des Wafers wird mit Fotolack beschichtet und das Muster, das die Porenstellen und Porendurchmesser enthält, wird durch eine UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
5) Das Porenmuster wird auf das Silizium durch tiefe reaktive Ionen-Ätzung (DRIE) oder Advanced Silicon Etching (ASE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas (ICP) übertragen, was zu tiefen vertikalen Poren nach unten bis zur Tiefe der vergrabenen Oxidschicht führt.
6) Die exponierten Bereiche der vergrabenen Oxidschicht werden durch RIE, nasse Flusssäure-Ätzung (HF) oder HF-Dampf-Ätzung entfernt. Dies stellt einen Kontakt zwischen den oberen und unteren Öffnungen im Wafer sicher.
7) Das Silizium wird mit Siliziumoxid entweder durch thermische Oxidation, durch mit Plasma verstärkte chemische Dampfabscheidung (PECVD) oder mit LPCVD beschichtet.

Alternativ kann das Substrat durch das folgende Verfahren hergestellt werden:

1) Das Ausgangsmaterial ist eine dünne Polymerschicht, die beispielsweise aus Polymethyl-methacrylat, Polyester, Polyimid, Polypropylen, Epoxy oder Polyethylen hergestellt ist und eine Dicke von 5 μm bis 100 μm besitzt.
2) Das Foliensubstrat sollte auf einem Rahmen aus Kunststoff oder einem anderen geeigneten Material aufgespannt sein.
3) Poren in dem Substrat werden unter Verwendung von Laser-Schleifen, Mikrobohren, Sandstrahlen oder mit einem Hochdruck-Wasserstrahl hergestellt.
4) Das Substrat wird mit Siliziumoxid, Glas oder Siliziumdioxid zumindest in einem Bereich um die Poren herum mit Hilfe eines niederenergetischen plasmaverstärkten, chemischen Dampfabscheide-Verfahrens beschichtet.

Alternativ kann das Substrat durch das folgende Verfahren hergestellt werden:

1) Das Ausgangsmaterial ist eine dünne Folie aus unter UV-Licht härtendem Epoxy oder Acryl, beispielsweise SU-8. Die Folie sollte eine Dicke von 5 μm bis 100 μm besitzen.
2) Das Foliensubstrat sollte an einem Rahmen aus Kunststoff oder einem anderen geeigneten Material aufgespannt sein.
3) Das Substrat wird durch eine standardmäßige Fotolithographie-Glasmaske hindurch mit dem Muster, das die Porenstellen und Durchmesser aufweist, UV-Licht ausgesetzt.
4) Das Substrat wird in ein Entwickler-Lösemittel eingetaucht, welches das Substratpolymer in den Bereichen entfernt, die dem UV-Licht nicht ausgesetzt waren, was zu Poren führt, die sich durch die dünne Folie hindurch erstrecken.
5) Das Substrat wird mit Siliziumoxid, Glas oder Siliziumdioxid zumindest in einem Bereich um die Poren herum mit Hilfe eines niederenergetischen, plasmaverstärkten, chemischen Dampfabscheide-Verfahrens beschichtet.

Alternativ kann das Substrat durch das folgende Verfahren hergestellt werden:

1) Das Ausgangsmaterial ist ein Glas-Wafer, beispielsweise Pyrex oder Borsilikat.
2) Die Bodenseite des Wafers wird mit Fotolack beschichtet und ein Muster, welches die die Membran definierenden Öffnungen enthält, wird durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
3) Das Glas wird auf der Bodenseite mit HF-Dampf oder mit HF in einer wässrigen Lösung abgeätzt, während die Vorderseite geschützt wird, wodurch die Dicke des Wafers in ausgewählten Bereichen auf 2 μm bis 50 μm vermindert wird.
4) Die obere Oberfläche des Wafers wird mit Fotolack beschichtet und das die Poren stellen und Porendurchmesser enthaltende Muster wird durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
5) Das Porenmuster wird durch tiefe reaktive Ionen-Ätzung (DRIE) oder Advanced Oxide Etching (AOE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas (ICP) auf das Silizium übertragen. Dies sollte zu tiefen vertikalen Poren bis zur Tiefe des von der Bodenseite her geöffneten Hohlraumes führen, wodurch ein Kontakt zwischen den beiden Seiten des Wafers sichergestellt wird.

Alternativ kann das Substrat mit Hilfe des folgenden Verfahrens hergestellt werden:

1) Das Ausgangsmaterial ist ein Glas-Wafer, beispielsweise Pyrex oder Borsilikat.
2) Die Bodenseite des Wafers wird mit Fotolack beschichtet und ein Muster, welches die die Membran definierenden Öffnungen enthält, wird durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
3) Das Glas wird auf der Bodenseite mit HF-Dampf oder mit HF in einer wässrigen Lösung abgeätzt, während die Frontseite geschützt wird, wodurch die Dicke des Wafers in ausgewählten Bereichen auf 2 μm bis 50 μm reduziert wird.
4) Die obere Oberfläche des Wafers wird mit einem fokussierten Ionen-Strahl in einem Muster beschossen, welches die Porenstellen und Porendurchmesser definiert, wodurch das Glasmaterial in diesen Bereichen geschwächt wird.
5) Der Wafer wird mit HF-Dampf oder mit HF in wässriger Lösung geätzt. Die Bereiche, die den fokussierten Ionen-Strahl ausgesetzt waren, ätzen signifikant schneller ab als der Rest des Wafers, was dazu führt, dass sich zwischen der oberen Oberfläche und dem von der Bodenseite her geöffneten Hohlraum Poren bilden, wodurch ein Kontakt zwischen den beiden Seiten des Wafers sichergestellt wird.

Alternativ kann das Substrat durch das folgende Verfahren hergestellt werden:

1) Das Ausgangsmaterial ist ein Glas-Wafer, beispielsweise Pyrex oder Borsilikat.
2) Die Bodenseite des Wafers wird mit Fotolack beschichtet und ein die die Membran definierenden Öffnungen enthaltendes Muster wird durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
3) Das Muster wird durch tiefe reaktive Ionen-Ätzung (DRIE) oder Advanced Oxide Etching (AOE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas (ICP) auf das Glas übertragen. Dies definiert Membranen in der oberen Oberfläche des Wafers, die eine Dicke von 2 μm bis 100 μm haben sollten.
4) Die obere Oberfläche des Wafers wird mit Fotolack beschichtet und das Muster, das die Porenstellen und Porendurchmesser enthält, wird durch UV-Licht-Exposition auf den Fotolack übertragen.
5) Das Porenmuster wird auf das Silizium mit tiefer reaktiver Ionen-Ätzung (DRIE) oder Advanced Oxide Etching (AOE) unter Verwendung eines induktiv gekoppelten Plasmas (ICP) auf das Silizium übertragen. Dies sollte zu tiefen vertikalen Poren bis zur Tiefe des Hohlraumes führen, der von der Bodenseite her geöffnet worden ist, wodurch ein Kontakt zwischen den beiden Seiten des Wafers sichergestellt wird.

Alternativ kann eine Membran nur in Siliziumnitrid unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens ausgebildet werden.
Der Hauptvorteil der Herstellung der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der oben beschriebenen Silizium-Technologie besteht darin, dass sie eine Integration mit Silizium-Mikrofluid-Systemen möglich macht. Als Beispiel zeigen wir hier, wie die Erfindung in eine auf Silizium basierende Vorrichtung zur Durchführung von elektrophysiologischen Messungen zu dem Zweck integriert werden kann, den Start- bzw. Vorbereitungsvorgang zu vereinfachen.
In der Literaturstelle 3 wird eine Vorrichtung beschrieben, die aus einer Öffnung zur Erzielung einer Dichtung mit hohem Widerstand mit einer Zelle und einer elektroosmotischen Strömungspumpe besteht, die verwendet wird, um an die Öffnung einen Unterdruck anzulegen, um die Zelle einzufangen und zu manipulieren. Die Öffnung kann in einer Siliziummembran in der gleichen Weise wie bei der vorliegenden Erfindung ausgebildet werden.
In der Literaturstelle 4 wird eine elektroosmotische Pumpvorrichtung basierend auf Siliziumtechnologie beschrieben. Diese Vorrichtung kann als eine Gruppe von Öffnungen in einer Siliziummembran in der gleichen Weise wie bei der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
10 zeigt die integrale Ausbildung einer Öffnung zur Durchführung von elektrophysiologischen Messungen mit einer elektroosmotischen Strömungspumpe und zwei Systemen gemäß der vorliegenden Erfindung, die monolithisch auf einen Siliziumchip 27 integriert sind. Dieses Chip-System ist eine Ausführungsform des in 9 dargestellten Systems. Die Bodenseite des Siliziums wird unter Verwendung einer Kanal definierenden Schicht 28 und einer Bodenplatte abgedichtet, die eine elektrochemische Elektrode 29 umfasst. Die Elemente 28 und 29 können alternativ aus einem Stück hergestellt sein. Die Elemente 27, 28 und 29 können im Wafer-Maßstab miteinander verbunden oder verklebt oder als einstückige Vorrichtung hergestellt werden.
Damit der Chip korrekt arbeitet, sollte das umschlossene Volumen 60 mit Flüssigkeit gefüllt werden; ein Vorbereitungseinlass, der von einer Membran 31 gebildet wird und ein Entlüftungsauslass, der von der Membran 37 gebildet wird, sollten abgedichtet werden. Die Membran 31 hat einen Einlasskanal 62, durch den zunächst Flüssigkeit eingeführt wird. Die Öffnungen der Membran 31 haben einen Radius von 1,5 μm bis 4 μm. Die Membran kann optional mit einem hydrophoben Material beschichtet sein.
Die elektroosmotische Strömungspumpe 33 hat ein Oberseiten-Fluid-System 64, das einen Flüssigkeitseinlass und eine elektrochemische Elektrode umfasst. Die Öffnungen der Pumpe 33 haben einen Radius von 0,2 μm bis 0,7 μm. Die Öffnung zur Durchführung der elektrophysiologischen Messungen 35 ist eine einzige Öffnung mit einem Radius von 0,3 μm bis 1,0 μm in einer Membran. Es ist ein Fluid-System 36 vorhanden, das einen Einlass für Zellen und wenigstens eine elektrochemische Elektrode umfasst.
Die Membran 37 besitzt einen Entlüftungskanal 68, durch den die ursprünglich in dem umschlossenen Volumen enthaltene Luft ausgestoßen werden kann. Die Sieböffnungen der Membran 37 besitzen einen Radius von 1,5 μm bis 4 μm. Die Membran kann optional mit einem hydrophoben Material beschichtet sein.
Die Membranen 31, 37, die Pumpe 33 und die die Membran definierende Öffnung 35 können mit der gleichen Membrandicke von 1 μm bis 50 μm hergestellt werden. Elektrochemische Elektroden 39 und 41 können in dem umschlossenen Volumen 60 enthalten und über durchgehende Löche in der Bodenplatte 29 mit Kontaktflecken 44 und 42 elektrisch leitend verbunden sein.
11 zeigt eine Rasterelektronen-Mikroskop-Aufnahme einer gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Membran 110. Die Membran ist eine 14 μm dicke Siliziummembran, die auf einem 380 μm dicken Silizium-Wafer mit Hilfe anisotroper Ätzung hergestellt worden ist. Die einen Radius von 3,5 μm aufweisenden Öffnungen wurden mit tiefer reaktiver Ionen-Ätzung (DRIE) geätzt. Die Siliziumoberflächen einschließlich den Inneren der Löcher wurden mit einer dünnen Schicht aus Siliziumoxid (Quarz) beschichtet.
Die Vorrichtungen wurden in Kunststoffgehäuse mit Fluidkanälen auf der Oberseite und der Unterseite in einer in 7 dargestellten Konfiguration gepackt. Die Vorrichtungen wurden unter Zugabe von 20 μl Wasser mit einer kleinen Menge von Malachitgrün-Färbemittel zum Kanal auf der Oberseite der Vorrichtung getestet. Es wurde ein Gasdruck von +50 mbar für 10 Sekunden angelegt, um den Kanal zu füllen, bis die Flüssigkeit die Membran erreichte. Zunehmende Saug- oder Druckwirkung wurde in Perioden von entweder 30 oder 60 Sekunden angelegt. Ein Mikroskop wurde verwendet, um das Durchbrechen des Abdichtungs- bzw. Verschlusszustandes zu beobachten. Nach einem Durchbruch wurde der höchste Über-/Unter-Druck, der verwendet worden war, notiert, und der zweithöchste Überdruck/Unterdruck, der verwendet worden war, wurde als der offensichtliche untere Grenzwert für diese spezielle Vorrichtung notiert.
Es schien kein Unterschied zwischen den Ergebnissen vorhanden zu sein, die nach dem Anlegen von einem Überdruck/Unterdruck für 30 oder 60 Sekunden erzielt wurden und auch nicht zwischen zwei Start- bzw. Vorbereitungsvorgängen von beiden Seiten der Vorrichtung her. Die Ergebnisse wurden daher nur unter Berücksichtigung des Merkmals gruppiert, ob Druck oder Saugwirkung verwendet worden war. Die Ergebnisse für positiven Druck, die der Situation in 3a entsprechen, sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3: Experimentelle positive Haltedrücke
In allen 13 getesteten Chips hatten 100 mbar keinen Einfluss auf die Dichtungs- bzw. Verschlussfähigkeit. Bei einem Chip brach die Dichtung bei 150 mbar, was zu einem unteren Grenzwert von 100 mbar führte, usw. Die Ergebnisse für einen negativen Druck, entsprechend der Situation in 3b, sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Tabelle 4: Experimentelle negative Haltedrücke
Wenn die Vorrichtung verwendet wird, wie dies in 8a und 10 dargestellt ist, sind die Dichtungsfähigkeiten in der Situation wichtig, in der beide Seiten der Membran benetzt sind. Experimente wurden daher mit dem folgenden Protokoll durchgeführt:

1) 10 μl Wasser, das Malachitgrün enthielt, wurde in den Einlass mit einem Druck von +50 mbar 10 Sekunden lang eingeführt, was sicherstellte, dass die Flüssigkeitsoberfläche die Membran erreichte.
2) Ein 3 Sekunden dauernder Gasdruck-Impuls von 300 mbar wurde dann an den Einlass angelegt, was das Hindurchtreten von Flüssigkeit durch die Vorrichtung ermöglichte.
3) Ein Druck von +50 mbar wurde an den Einlass 5 Minuten lang angelegt, um sicherzustellen, dass das gesamte zur Verfügung stehende Flüssigkeitsvolumen durch die Vorrichtung hindurch in den Auslass eingetreten war, wodurch sich die Vorrichtung schloss bzw. abdichtete.
4) Für 8 verschiedene Chips wurden zunehmende positive Drücke an den Auslass angelegt, was der Situation in 3d entspricht, während das Durchbrechen der Dichtung und das darauf folgende sich Wiederfüllen des Einlasses überwacht wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
5) Für 6 verschiedene Chips wurden zunehmend negative Drücke an den Auslass angelegt, was der Situation in 3c entspricht, während das Durchbrechen der Dichtung beobachtet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst.

Tabelle 5: Experimentelle positive Haltedrücke, wenn beide Seiten benetzt waren
Tabelle 6: Experimentelle negative Haltedrücke, wenn beide Seiten benetzt waren.
Zusammenfassend zeigten die experimentellen Daten Haltedrücke, die gut mit den theoretischen Vorhersagewerten übereinstimmten. Die gemessenen negativen Haltedrücke sind größer als die positiven, wie dies für Membranen mit kleinen Kontaktwinkeln vorhergesagt wurde. Das Verhältnis zwischen positiven und negativen Haltedrücken in den Tabellen 3 und 4 kann verwendet werden, um den Kontaktwinkel der Membran auf τ = 11° zu extrapolieren, was in guter Übereinstimmung mit der Membran steht, die aus Siliziumoxid hergestellt wurde.
Die Experimente, bei denen beide Seiten der Membranen benetzt waren, zeigten in der vorhergesagten Weise einen großen Unterschied zwischen positiven und negativen Haltedrücken. Dies macht die Vorrichtung besonders geeignet bei Anwendungsfällen, in denen negative Drücke benötigt werden, während auch kleine positive Drücke angelegt werden können. Die Vorrichtung kann in diesen Situationen dadurch verbessert werden, dass die Seite der Membran, die trocken bleiben soll, mit einem hydrophoben Material beschichtet wird.
Literatur

[1] Biomaterials Properties Database, University of Michigan, Contact: Dr William J. O'Brien, Director (FAX: 313-647-5293). Quintessence Publishing, 1996. http://www.lib.umich.edu/libhome/Dentistry.lib/Dental_tables/Contangle.ht ml
[2] Madou, M., "Fundamentals of Microfabrication", 2nd Ed (December 2001) CRC Press; ISBN: 0849308267.
[3] International Patent Publication No. WO 02/29402.
[4] Pending patent application, J. Kutchinsky, R. Taboryski, M. Bech, Filing date: 02.10.01.

Claims

Mikrofluidsystem zum Ermitteln und/oder Überwachen von elektrophysiologischen Eigenschaften von Ionenkanälen in Ionenkanäle enthaltenden Strukturen, das folgendes umfasst: einen Kanal mit einem Einlass (62) und einem Auslass (68), eine erste Membran (37), die zwischen dem Einlass (62) und dem Auslass (68) angeordnet ist und eine Öffnung aufweist, die einen Radius im Bereich von 0,1 μm bis 50 μm besitzt, wobei der Einlass und der Auslass derart miteinander in hydraulischer Verbindung stehen, dass sich ein Fluid längs des Kanals vom Einlass (62) zum Auslass (68) bewegen kann, und Druckeinrichtungen (33) zum Erzeugen einer Druckdifferenz zwischen dem Einlass (62) und dem Auslass (68), wobei bei der Verwendung die Bewegung eines Fluids im Kanal an der ersten Membran (37) aufgrund der Oberflächenspannung gestoppt wird, die im Fluid an der Öffnung erzeugt wird, bis die Druckeinrichtungen eine Druckdifferenz zwischen dem Einlass (62) und dem Auslass (68) erzeugen, welche die an der Öffnung erzeugte Oberflächenspannung übersteigt.
System nach Anspruch 1, bei dem die erste Membran (37) eine Vielzahl von Öffnungen aufweist, von denen jede einen Radius besitzt, der in den Bereich von 0,1 μm bis 50 μm fällt.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Druckeinrichtungen (33) eine Pumpvorrichtung umfassen und das System weiterhin ein umschlossenes erstes Volumen (60), das zwischen dem Einlass (62) und dem Auslass (68) angeordnet ist, und ein zweites Volumen (64) umfasst, das in hydraulischer Verbindung mit dem ersten Volumen (60) steht, wobei die Pumpeinrichtungen (33) in hydraulischer Verbindung mit dem ersten und dem zweiten Volumen (60, 64) stehen, um Fluid durch das System zu pumpen oder eine hydraulische Druckdifferenz zwischen dem ersten und dem zweiten Volumen (60, 64) auszuüben, wobei die erste Membran (37) zwischen dem Auslass (68) und dem ersten Volumen (60) angeordnet ist.
System nach Anspruch 3, das weiterhin eine zweite Membran (31) umfasst, die eine Öffnung aufweist, die einen Radius im Bereich von 0,1 μm bis 50 μm besitzt und zwischen dem Einlass (62) und dem ersten Volumen (60) angeordnet ist.
System nach Anspruch 3 oder 4, das eine Vielzahl von zweiten Volumina (64, 66) umfasst.
System nach einem der Ansprüche 3, 4 oder 5, bei dem das oder jedes zweite Volumen (64, 66) einen zweiten Einlass umfasst.
System nach einem der Ansprüche 3, 4, 5 oder 6, bei dem das oder jedes zweite Volumen (64, 66) einen zweiten Auslass umfasst.
System nach Anspruch 4 oder jedem von diesem abhängenden Anspruch, bei dem die zweite Membran (31) eine Vielzahl von Öffnungen aufweist, von denen jede einen Radius besitzt, der in dem Bereich von 0,1 μm bis 50 μm fällt.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die oder jede Membran (31, 37) ein hydrophiles Material umfasst.
System nach Anspruch 8, bei dem die oder jede Membran (31, 37) aus oxidiertem Silizium, Siliziumnitrid, Glas, Siliziumdioxid, Aluminium, oxidiertem Aluminium oder Acryl gebildet ist.
System nach Anspruch 8, bei dem das System aus Silizium hergestellt ist.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die oder jede Membran (31, 37) auf zumindest einer Seite mit einem hydrophoben Material beschichtet ist.
System nach Anspruch 12, bei dem das hydrophobe Material PTFE oder PDMS umfasst.
System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Dicke der oder einer jeden Membran (31, 37) in dem Bereich von 50 nm bis 400 nm fällt, wenn die Membran (31, 37) aus Siliziumnitrid gebildet ist, in dem Bereich von 1 μm bis 20 μm, wenn die Membran (31, 37) aus oxidiertem Silizium gebildet ist, in dem Bereich von 2 μm bis 200 μm, wenn die Membran (31, 37) aus Glas oder Siliziumdioxid gebildet ist, und in dem Bereich von 5 μm bis 500 μm, wenn die Membran aus Aluminium oder einem Kunststoffmaterial gebildet ist.
Verwendung einer Membran, die eine Öffnung aufweist, welche einen Radius in dem Bereich von 0,1 μm bis 50 μm besitzt, in einem Mikrofluidsystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14.
Vorrichtung zur Durchführung von elektrophysiologischen Messungen, die ein System nach einem der Ansprüche 1 bis 14 umfasst.
Verfahren zum Starten eines Systems nach einem der Ansprüche 1 bis 14, das den Schritt umfasst, Luft, die anfänglich in dem System vorhanden ist, durch Flüssigkeit zu ersetzen.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem der Schritt des Ersetzens von anfänglich vorhandener Luft in dem System durch Flüssigkeit extern mit Hilfe von Gasdruck gesteuert wird.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem der Gasdruck in Impulsen mit einer Zeitdauer von 0,1 bis 10 s angelegt wird.