CN1774629B - 微观流体系统及与其相关的膜片、设备和方法 - Google Patents

微观流体系统及与其相关的膜片、设备和方法 Download PDF

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Abstract

一种微观流体系统包括一个具有入口(32)和出口(38)的通道；第一膜片(31)设置在入口(32)和出口(38)之间，并包括一个半径在0.1至50μm范围内的孔，该入口(32)和出口(38)彼此水力连通，于是流体能够沿着该通道从入口移动至出口。

Description

微观流体系统及与其相关的膜片、设备和方法
技术领域
本发明涉及一种具有一个或多个亚毫米尺寸的流体通道的系统。该系统用于化学、生物化学、分子细胞生物学，并且经常被称为微观流体系统。 
背景技术
本发明所涉及的系统通过建立一个电生理学的测量结构可用于在包括类脂膜结构的等离子体通道内监控等离子通道的电生理学特性，该类脂膜包含诸如细胞结构，其中细胞膜形成一个围绕测量电极的高阻力封闭，使得有可能测定并监控流经细胞膜的电流。该系统能够构成用于执行修补钳技术的仪器的一部分，该技术在研究例如离子传输通道及生物膜中应用。 
膜片修补的电绝缘及由于在电压钳条件下进行修补的离子通道的研究的通常观念，在Neher，Sakmann和Steinback(1978)的“TheExtracellular Patch Clamp，A Method For Resolving CurrentsThrough Individual Open Channlels In Biological Membranes”，Pflüger Arch.375；219-278中描述。人们发现，通过将含有乙酰胆碱(ACh)的移液管压靠肌细胞膜的表面，人们能够看见电流内的离散跳动，该跳动是由于受乙酰胆碱刺激的离子通道的张合导致的。但是，研究者受工作所限，即移液管的玻璃与膜片之间的密封电阻(10-50MΩ)相对通道的电阻(10GΩ)小很多。由这种密封导致的电噪声与电阻相反，从而其足够大，以至流经离子通道的电流不分明，其导电性小于乙酰胆碱通道的电流的导电性。它也禁止移液管内电压钳位的值不同于由大电流流经密封部导致的槽内的电压钳位值。 
随后可以发现，通过火琢玻璃移液管并通过提供吸力给移液管的内部，很高电阻(1至100GΩ)的密封能够随细胞表面获得，从而呈 数量级地将噪声减少至某水平，在该水平大部分生物通道的影响能够被研究并极大扩展了研究所基于的压力范围。这种改进的密封被称为‘十亿密封’，且该移液管被称为‘修补移液管’。关于十亿密封的更详细的描述可以参见O.P.Hamill，A.Marty，E.Neher，B.Sakmann & F.J.Sigworth(1981)“Improved patch-clamp techniques for high resultion currentrecordings from cells and cell-free membrane patches”，PflügersArch.391；85-100。由于它们在修补钳技术的研发工作，Neher和Sakmann在1991年在生理和医药领域获得了诺贝尔奖。 
离子通道是膜贯通蛋白质，它对跨越细胞膜输送的无机离子起催化作用。该离子通道参与各种生成且定时的作用电位，突触传递，激素分泌，肌肉收缩等过程。很多药理试剂通过离子通道的调整发挥特定效应。包括抗癫痫化合物，如苯妥英和lamotrigine的例子，该化合物阻断脑内压敏Na+通道，抗高血压的药物，如硝苯吡啶与硫氮草酮，它们阻断平滑肌细胞内的压敏Ca2+通道，以及优降糖与甲苯磺丁脲的胰岛素分泌刺激物，它们阻断胰脏内调节三磷酸腺苷的K+通道。除了从化学上引导离子通道活性的调节外，修补钳技术使得科学家能够完成与压敏通道的操作。该技术包括调整修补移液管内电极的极性并改变含盐合成物以减少槽液内自由离子的浓度。 
修补钳技术代表了生物学与医学领域的主要发展，因为它能够实现对流经单个离子通道蛋白质的离子流的测量，也能够实现对响应药物照射的单个离子通道活性的研究。简言之，在标准修补钳中，使用一个薄的(直径接近0.5-2μm)玻璃移液管。该修补移液管的尖端压靠细胞膜的表面。该移液管尖端紧密封住细胞膜并隔离由移液管孔所限定的膜的微小修补中的少量离子通道蛋白质。这些通道的活性能够被单独测量(‘单通道纪录’)或可选择地，该修补能够被破裂，允许进行整个细胞膜通道活性的测量(‘整个细胞结构’)。进入细胞内部用于实现整个细胞测量的高导电性能够通过在移液管内施加负电压通过破裂膜片而获得。 
如上所述，用于单通道电流的修补钳测量的一个重要要求是细胞膜与玻璃微量移液管尖端之间的高电阻密封的确定，以便限制离子在两个表面之间的空间内移动。典型地，需要超过1GΩ的电阻，因此体接触区被称为‘十亿密封’。 
十亿密封的形成需要细胞膜与移液管玻璃彼此紧密接近。因而，当组织中相邻细胞之间，或培养细胞与它们基质之间的距离通常在20-40nm数量级(Neher，2001)内时，十亿密封内的细胞膜与移液管玻璃之间的距离被预测在埃(即10-10m)范围内。该十亿密封的生理化学特性并不知道。然而，十亿密封可以在细胞膜之间形成，多种玻璃类型包括石英、铝硅酸盐和硼硅酸盐(Rae和Levis，1992)，这表示玻璃的专门化学组合物并不重要。 
细胞膜由夹有糖蛋白的双层磷脂构成，所述糖蛋白承担包括用作各种试剂的受体的多种功能。糖蛋白所生成的膜片通常包括肽和甘油部分，它们脱离细胞膜延伸到细胞外间隙，形成围绕该夹层的所谓的‘外被多糖’层，所述层达到20至50nm高度并产生邻近夹层的充有电解液的腔室。因而，外被多糖形成了一个亲水的且带负电荷的区域，该区域构成细胞与其含水环境之间的间隙。 
从修补夹钳方法论的近来发展已看出用平面基质(如硅片)的引用取代了传统的玻璃微观移液管(例如，见WO01/25769，Mayer，2000)。 
典型的微观流体系统包括一泵和借助一流体通道连接到泵上的测量仪器。在一些系统中，泵与测量仪器都是具有几微米数量级的尺寸。已知使用这种系统必须施加外部压力直至几个大气压以便起动该系统。 
当起初存在于系统内的空气被液体替换的过程中，该起动受限。由于流体通道的亚毫米尺寸，由于通道内流体的表面张力所施加的力变得越来越重要，并能够在起动过程中产生问题。 
一些已知的微观流体系统包括一个控制作用于测量系统上的压力的外部泵。 
在一些已知的微观流体系统中，泵整体形成，或与微观流体系统紧密联系。这种泵作为微动泵是已知的。 
在某些情况下，测量仪器内的气流阻力与相互连接的流体通道的体积相比很大。这意味着起动过程需要极长的持续时间，特别是用于排出最初存在于流体能道内的气体。 
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种用于在包含离子通道的结构中确定和/或监控离子通道的电生理学特性的微观流体系统，包括： 
一具有一入口和一出口的通道； 
设置在入口和出口之间的第一膜片，该膜片包括一半径在0.1至50μm范围内的孔，入口与出口彼此水力连通，于是流体能够沿着通道从入口到出口流动。 
用于在入口和出口之间产生压差的压力装置，借此，由于流体在该孔上所产生的表面张力，使得使用中的流体在通道内的流动在第一膜片上停止，直至该压力装置在入口和出口之间产生一个大于孔上所产生的表面张力的压差。 
本发明利用小孔或口内液体表面的表面张力所施加的压力。 
本发明通过引入流体路径中基于液体阻塞的毛细管力，因而解决或减少了大部分微观流体系统起动过程中的固有问题。 
方便地，第一膜片包括多个孔，虽然在某些实施例中，该第一膜片可以仅包括一个孔。 
有利地，该压力装置包括一个泵设备，该系统还包括在入口与出口之间设置的封闭的第一容积，与第一容积水力连通的第二容积；该泵设备与第一和第二容积水力连通，用于泵送流体通过该系统或用于在第一和第二容积之间施加一个液压差，该第一膜片设置在出口和第一容积之间。 
在某些情况下，有利地是可以具有一个系统，其包括多于一个膜片。方便地，该系统还包括一个第二膜片，该第二膜片包括一个半径在0.1至50μm范围内的孔，且该第二膜片设置在入口与第一容积之间。 
本发明最佳且最有利的特征从所附的从属权利要求中会很清楚。 
根据本发明的第二方面，提供了一种形成微观流体系统的膜片，所述微观流体系统用于在离子通道结构中确定和/或监控离子通道的电生理学特性，该系统包括一个具有一入口和一出口的通道； 
设置在入口与出口之间的第一膜片，该膜片包括一半径在0.1至50μm范围内的孔，入口与出口彼此水力连通，于是流体能够沿着通道从入口到出口流动。 
根据本发明的又一方面，提供了一种用于进行电生理学测量的设备，该设备包括一个微观流体系统，所述系统包括一个具有一入口和一出口的通道； 
设置在入口与出口之间的第一膜片，该膜片包括一半径在0.1至50μm范围内的孔，入口与出口彼此水力连通，于是流体能够沿着通道从入口到出口流动。 
根据本发明的再一方面，提供了一种起动一包括微观流体系统的方法，该方法包括： 
一具有一入口和一出口的通道； 
设置在入口和出口之间的第一膜片，该膜片包括一半径在0.1至50μm范围内的孔，入口与出口彼此水力连通，于是流体能够沿着通道从入口到出口流动。 
图1a和1c显示了硅膜片12内所形成的单个孔的横截面，其中硅膜片12的厚度L比孔半径r小很多。图1中膜片下面的区域充满液体，而膜片上面的区域则充满空气。该液体与空气被一球壳形液面13分开。膜片表面和与膜片接触点上的液面切线之间形成角度θ。 
液面的自由能由F＝σ·S给出，其中σ是表面张力常数，而S是表面积。特别是对于水而言，σ＝0.073J/m2。由表面张力所施加的压力由自由能F相对体积V的导数得出。 
直径r的孔所形成的水面积具有球壳形形状，因为该形状在给定体积下具有最小的表面积。该球壳的体积为： 
V = 1 3 · π · r 3 · ( 1 - x ) 2 · ( 2 - x ) ( 1 - x 2 ) 3 2
球壳的表面积为 
S = 2 · π · r 2 · 1 - x 1 - x 2
其中x＝cos(θ)。液滴所施加的压力为p＝σ·dS/dV，给出 
p = 2 · σ r · P ( θ )
而由因式P(θ)所决定的无穷小角被限定为 
P ( θ ) = 3 · sin ( θ ) 5 - 4 · cos ( θ )
特定压力P0＝2·σ/r也可以被限定。 
在图2中绘出的函数P(θ)在近似于θ＝37°时有最大值，在近似θ＝-37°时有最小值。在±180°的角中，当压力为零，相当于孔和最接近膜表面的位置要么全湿要么全干。在表面张力对围绕孔的液体流不起作用的位置，该液体流是不受阻碍的。该状态被称为孔的打开状态。 
在其它位置，水的弯液面在孔(或者微孔)的边缘定位。这相应于围绕θ＝0°的角区间。在此情况下，液流被阻止，孔用作膜片顶和底侧的密封。该状态被称为孔的密封状态。如果最初设备是干的，如果膜限定孔的内表面是亲水的，则随后膜片一侧上的空间在低于P0 很多的压力下逐步充满液体，孔会自动到达密封状态并阻止流体。 
分析如下位置很重要，即膜片下面的区域充满液体，膜片上面的区域充满空气，孔位于密封状态。如果压力从零开始逐步增加，密封在两个位置会破裂。第一种情况是液体/膜表面的接触角τ大于37°。弯液面将会保持稳定直至θ角达到37°，相当于P0的压力。在该点弯液面将会变得不稳定，且该不稳定会继续增加直至弯液面的顶侧被冲开。 
在τ小于37°的第二种情况中，相当于亲水材料，密封将保持直至θ角达到τ，相当于P0·P(τ)的压力。在该点，弯液面不再定位于孔的边缘，弯液面将开始展开于膜片顶表面。 
如果压力从零逐步减少，密封将被两种相似的位置破坏。第一种 情况是180°-τ＞37°。液体表面随后会稳定，直至θ角达到-37°，相当于-P0的压力。在该点，液体表面将不稳定，气泡将会在孔下方尺寸持续增大。在第二种情况180°-τ＜37°中，相当于非常亲水的材料，密封将会保持，直至θ角达到180°-τ，相当于-P0·P(180°-τ)的压力。在该点，液面将变得不稳定，空气将会展开于膜底部表面上。 
密封所能经受的最大压力被称为正负保持压。该正保持压因而是τ＞37°的P0，及τ＜37°的P0·P(τ)，该负保持压是180-τ＞37°的P0，及180-τ＜37°的P0·P(180°-τ)。当液体是水，且膜片是玻璃(τ＝14°)或有机玻璃(PMMAτ＝70°)时，通常计算出的保持压在下表中显示。接触角采自标号1。 
  孔半径(μm)   正保持压(mbar)   负保持压(mbar)
  0.1   9471   14600
  0.3   3157   4867
  0.5   1894   2920
  1   947   1460
  2   474   730
  2.5   379   584
  3.5   271   417
  5   189   292
  7   135   209
  10   95   146
  20   47   73
  50   19   29
  100   9   15
表1.用于玻璃膜上的水的保持压 
  孔半径(μm)   正保持压(mbar)   负保持压(mbar)
  0.1   14600   14600
  0.3   4867   4867
  0.5   2920   2920
  1   1460   1460
  2   730   730
  2.5   584   584
  3.5   417   417
  5   292   292
  7   209   209
  10   146   146
  20   73   73
  50   29   29
  100   15   15
表2.用于有机玻璃膜上的水的保持压 
对于其它的孔形状可以重复上述计算，但会得出同样的基本结果。增加膜厚度L并不能改变孔的保持压。更圆的孔截面也给出同样的基本结果，但是却具有比孔的最窄点更大的有效孔半径。有效半径的数值取决于膜片表面材料的接触角。 
膜片上一排相同的孔具有与单个孔相同的保持压，但是对于气体或液体却具有更大流导的优点。因而成排的孔是更佳选择，因为它在打开状态下能提供受更少阻挡的流体，并因而在打开与密封状态之间产生一更大的反差。如果成排的孔的直径有变化，那么保持压将由更大的孔所确定。 
图3a至3d显示了据本发明的各种结构密封状态的膜片30的横截面。在这些结构中，膜片34下面的空间是湿的，而膜片34上面的空间则充满空气。液体与空气被细线36所示的液面分开。在图3a和3b中，膜片的顶侧38是干的。在图3a中，从后面有一正压，在图3b中从后面有一负压。在这些情况下，设备会有上述表1和表2所示的保持压。
在图3c和3d中，膜片的顶侧38是湿的。如果密封状态被事先破坏，液体已经通过设备，则上述情况可能发生。在图3c中，从后面有一负压，设备能够保持与图3b的状态相同的压力。在图3d中却并不是这种情况，此时从后部会施加一正压。液滴会呈现在膜片的顶侧38上，并具有与成排孔的全部尺寸相当的直径。该液滴的表面张力仍能够保持与该液滴的半径相一致的些许正压。例如，如果孔排列具有100×100μm的面积，则液滴将会具有50μm数量级的半径，且对于玻璃表面，将能够保持接近20mbar的正压。 
有利地，膜片材料由适于微观布图的亲水材料形成，如氧化硅，氮化硅，玻璃，硅石，矾土，氧化铝或丙烯酸。 
由于两侧弄湿所引起的设备功能性减小能够通过用疏水材料，如(非限定)PTFE或PDMS随意涂敷膜片的预定干侧，且保持预定湿侧亲水而得到更好结果。 
当膜片由氮化硅形成时，膜片的厚度最好落在50至400nm范围内，当膜片由氧化硅形成时，厚度最好在1至20μm，由玻璃或硅石形成时，厚度在2至200μm范围内，由矾土或塑料材料形成时，厚度在5至500μm范围内。 
有利地，孔的半径落在0.1至50μm范围内。在需要100至1000mbar范围压力的系统中，孔的半径可以落在1至50μm范围内。 
对于由氧化硅形成的膜片，最好孔半径在1至3μm范围内。当膜片由塑料材料形成时，孔的半径会落在25至100μm范围内。 
附图说明
本发明现在将通过实施例并结合附图进行进一步描述，其中： 
图1a是根据本发明的膜片的示意性图，显示了形成膜片部分的孔； 
图1b和1c也是示意性图，显示了图1a中不同的可能形状的孔； 
图2是一曲线图，显示了用于图1a中所示膜片的由因子P(θ)而变的无穷小角； 
图3a至3d是根据本发明的各种结构密封空间的膜片的示意图； 
图4是根据本发明第一实施例的微观流体系统； 
图5是根据本发明第二实施例的微观流体系统的示意图； 
图6a，6b和6c是形成据本发明的微观流体系统部分的膜片的示意图，该膜片包括一个孔阵列； 
图7是根据本发明的包括一入口和一出口的微观流体系统的示意图； 
图8a和8b是根据本发明的微观流体系统另一实施例的示意图； 
图9是根据本发明的微观流体系统再一实施例的示意图，其中膜片由硅石形成； 
图10是根据本发明的单块集成在一硅片上的，一电生理学测量过程中的孔，一电渗流体泵，两个膜片，电整合的示意图； 
图11显示根据本发明所制造的膜片的扫描电子显微照片。 
具体实施方式
参见图4，根据本发明的微观流体系统通常由标号40表示。该系统特别适合与一外部泵一起使用。该系统40包括一个测量仪器1和一泵2，在此实施例中泵2是一外部气体压力泵。测量装置1和泵2通过一个流体通道4相互连通。根据本发明该系统40还包括一个膜片3。膜片3的存在意味着液体能够经膜片3导入，但是在填充过程完成时，膜片3会封闭该系统的入口。这需要确保泵的正常操作，否则可能会短路。 
在某些情况下，泵2与测量仪器1的气流阻力与互相连通的通道4的体积相比要大，从而导致填充过程需要过长时间。 
根据本发明的系统的第二实施例在图5中通常由标号50表示。在该实施例中，系统50包括一个将液体导入系统50的膜片5。该系统50还包括一个泵6，例如一电渗泵设备，及一个测量仪器7，仪器7 借助一相互连通的通道8连接到泵6上。根据本发明该系统50还包括一第二膜片9，该膜片9用作包含在系统50内的空气的出口，该出口允许空气从系统排出。一旦填充过程完成，两个膜片5，9将封闭系统50，使微泵6对测量系统施加压力。 
现在参见附图6a，6b和6c，根据本发明的膜片通常由标号10表示。膜片10包括成排的穿透孔11。膜片内的孔的定位可以是任意的，只要膜片保持其机械稳定性。因此，不需要将孔11精确定位在膜片10中。 
膜片的厚度对于膜片的功能并不重要，但是通常应该尽可能地小以便确保一个通过膜片的低流阻，而且同时要确保机械稳定性及易于制造。 
由于保持压被最大孔的半径确定，因而应该选择孔的半径，使得它们与特定的微观流体系统中所需要的流体静压力相适合，所述微观流体系统结合有膜片。 
图7显示根据本发明的膜片15，它插入具有一入口14和一出口16结构的通道中。液体能够以一过压流入一入口14，该过压小于设备的正保持压，迫使液体前部的空气通过膜片孔。当液体表面接触到膜片时，设备封闭，使得被压力驱使的敷贴进行而不与空气体积有关，所述空气体积在某些情况下会影响到敷贴的成功。 
以一个大于正保持压的数值将一短压力脉冲(0.1-10秒)施加到入口14上将会破坏该封闭，并且使液体通过膜片。如果限定体积的液体已经流入被外部气体压力或借助其它气流驱动的入口14，液体将继续通过设备，直至整个有用的液体都已通过膜片进入出口。当空气再次接触膜片时，设备将回到封闭状态，使得压力所驱动的敷贴在出口16区域产生功效。 
图8a显示一更复杂的流体系统，它具有一入口17，一封闭体积18，一出口19，一第一膜片20，一第二膜片21，一泵设备22，和一测量仪器或其它需要泵23的流体系统。类似这样的结构是最佳的，如果设备22和23的物理尺寸是这样小以致其中的表面张力和高流阻使 得它难以填充封闭体积18。填充后，需要两个膜片19和20进入封闭状态，以便能够使泵22作用于测量仪器23。 
为了填充封闭体积18，大量液体应当被引入入口17，所述液体具有与封闭体积18加上一些特别考虑导系统中的间隙的相同的体积，以保证在所有情况下都有足够的液体用于填充。应当将低于膜片20的正保持压的气压以足够长时间施加到入口17上，以允许液体接触膜片21，20。其后，一大于膜片20的正保持压的短压力脉冲(0.1-10秒)应当被施加以便促使液体通过膜片20的孔。随后，一小于膜片20的负保持压的正压力应当保持在入口17上，以便将液体转入封闭体积18。体积18内的空气将通过第二膜片21排出。在某些点液体将会接触第二膜片21，使其进入封闭状态。 
在此处，左侧的过量液体将会存在于入口通道17内。在填充泵22和测量仪器23内的液体系统的其它部分后，气压应该保持于该入口。这将确保入口17内的过量液体转入泵22和仪器23。当该转换完成后，设备20会进入其封闭状态，完成填充过程。 
在图8b中，显示了另一实施例，其中流体系统具有一入口17，一封闭体积18，一出口19，一膜片21，一泵设备24，和一测量仪器或要求泵23的其它流体系统。 
为了填充封闭体积18，在连接到泵设备之前，大量液体应该被导入入口17。所述液体应当具有与封闭体积18加上专门考虑了系统内的间隙的体积相同的体积，以确保在所有情况下能够有充分的液体用于填充。随后应当连接泵设备，且位于膜片21的负与正保持压之间范围内的气压现在能够被泵设备施加在测量仪器23上。 
通常膜片材料能够是适于微观布图的亲水材料，如氧化硅、氮化硅、玻璃、硅石、矾土、氧化铝，丙烯酸。膜片内的孔能够使用激光研磨、微钻、喷砂处理，用高压水流，用照相平版印刷技术或用其它的用于微观制造的技术制造。 
图9显示一优选实施例，其中具有孔的膜片使用标准MEMS技术(见标号2)限定在一硅衬底上。该结构包括硅衬底24，膜片25 和由平版印刷所限定并蚀刻入膜片26的微孔26。该实施例通过如下过程可以被制造： 
1)初始材料是具有100表面的硅片。 
2)硅的一个表面涂敷感光树脂，包含有位置和直径的图案通过暴露于UV光中而转印到感光树脂上。 
3)孔图案转印到使用感应耦合等离子体(ICP)而进行的深度电抗离子蚀刻(DRIE)或先进的硅蚀刻(ASE)的硅上，结果产生具有1-50μm深度的竖直微孔。 
4)使用低压化学蒸气沉积法(LPCVD)将硅表面涂敷氮化硅。 
5)硅片的另一侧(底侧)涂敷有感光树脂，包含有在氮化硅内限定开口的膜片的图案通过暴露于UV光中被转印到感光树脂。 
6)使用电抗离子蚀刻(RIE)将氮化硅从硅片被感光树脂内的开口所限定区域的底侧上蚀刻掉。 
7)硅片在KOH溶液中被各向异性地蚀刻，从而导致在硅片的底侧上形成锥形开口。蚀刻时间限定了硅片顶侧上残余硅膜片的厚度。可选择地，掺硼能够用于限定蚀刻的中止，从而对厚度给予更好的控制。 
8)氮化硅通过湿化学蚀刻被移走，用于在160°的磷酸中。 
9)或通过热氧化或用LPCVD将硅涂敷上氧化硅。 
可选择地，衬底也能通过如下过程制造： 
1)初始材料是具有100表面的硅片。 
2)使用低压化学蒸气沉积法(LPCVD)将硅表面涂敷氮化硅。 
3)硅片底侧涂敷感光树脂，包含有氮化硅中的开口限定的膜片的图案通过暴露于UV光中被转印到感光树脂上。 
4)使用电抗离子蚀刻(RIE)将氮化硅从硅片被感光树脂内的开口所限定区域的底侧上蚀刻掉。 
5)硅片在KOH溶液中被各向异性地蚀刻，从而导致在硅片的底侧上形成锥形开口。蚀刻时间限定了硅片顶侧上残余硅膜片的厚度。可选择地，掺硼能够用于限定蚀刻的中止，从而对厚度给予更好的控 制。可选择地，硅能够通过硅片的整个厚度被蚀刻，仅在顶表面上留下氮化硅作为一薄的膜片。 
6)硅片的顶表面涂敷有感光树脂，包含有微孔位置与直径的图案通过暴露于UV光中被转印感光树脂。 
7)微孔图案转印到使用感应耦合等离子体(ICP)而进行的深度电抗离子蚀刻(DRIE)或先进的硅蚀刻(ASE)的硅上，结果产生具有1-50μm深度的竖直微孔。 
8)或通过热氧化或用等离子体加强的化学蒸气沉积法(PECVD)或用LPCVD将硅涂敷上氧化硅。 
可选择地，衬底也能通过如下过程制造： 
1)初始材料是具有100表面，且在顶表面下1-50μm设置有埋入氧化层的硅绝缘体(SOI)。 
2)使用低压化学蒸气沉积法(LPCVD)将硅表面涂敷氮化硅。 
3)硅片底侧涂敷感光树脂，包含在氮化硅中的开口所限定的膜片的图案通过暴露于UV光中被转印到感光树脂上。 
4)使用电抗离子蚀刻(RIE)将氮化硅从硅片被感光树脂内的开口所限定区域的底侧上蚀刻掉。 
5)硅片在KOH溶液中被各向异性地蚀刻，从而导致在硅片的底侧上形成锥形开口。埋入的氧化层将用作各向异性蚀刻的蚀刻中止，从而导致膜片厚度被氧化的深度所限定。 
6)硅片的顶表面涂敷有感光树脂，包含有微孔位置与直径的图案通过暴露于UV光中被转印感光树脂上。 
7)微孔图案使用感应耦合等离子体(ICP)用深度电抗离子蚀刻(DRIE)或先进的硅蚀刻(ASE)转印到硅上，结果深的竖直孔直至埋入氧化层的深度。 
8)埋入氧化层的暴露区域通过RIE，湿的氢氟酸(HF)蚀刻，或HF蒸气蚀刻被移走。这将确保硅片中顶和底开口之间的接触。 
9)或通过热氧化或用等离子体加强的化学蒸气沉积法(PECVD)或用LPCVD用氧化硅涂敷硅。 
可选择地，衬底也能通过如下过程制造： 
1)初始材料是具有100表面，且在顶表面下1-50μm设置有埋入氧化层的硅绝缘体(SOI)。 
2)硅片底侧涂敷感光树脂，包含在硅中的开口所限定的膜片的图案通过暴露于UV光中被转印到感光树脂上。 
3)使用感应耦合等离子体(ICP)用深度电抗离子蚀刻(DRIE)或先进的硅蚀刻(ASE)将膜片图案转印到硅上，结果深的竖直孔洞直至埋入氧化层的深度。 
4)硅片的顶表面涂敷有感光树脂，包含有微孔位置与直径的图案通过暴露于UV光中被转印感光树脂上。 
5)微孔图案使用感应耦合等离子体(ICP)用深度电抗离子蚀刻(DRIE)或先进的硅蚀刻(ASE)转印到硅上，结果深的竖直孔直至埋入氧化层的深度。 
6)埋入氧化层的暴露区域通过RIE，湿的氢氟酸(HF)蚀刻，或HF蒸气蚀刻被移走。这将确保硅片中顶和底开口之间的接触。 
7)或通过热氧化或用等离子体加强的化学蒸气沉积法(PECVD)或用LPCVD用氧化硅涂敷硅。 
可选择地，衬底也能通过如下过程制造： 
1)初始材料是薄的例如由聚甲基丙烯酸甲酯、聚酯、聚酰亚胺、聚丙烯、环氧树脂或聚乙烯制成的聚合物片，并具有5-100μm的厚度。 
2)薄片衬底应当悬挂在塑料或其它适当材料的框架上。 
3)衬底内的微孔是使用激光研磨、微钻、喷砂处理，或用高压水流制造的。 
4)衬底至少在围绕微孔的区域通过低能等离子体加强化学蒸气沉积法涂敷有氧化硅、玻璃或硅石。 
可选择地，衬底也能通过如下过程制造： 
1)初始材料是由环氧树脂或丙烯酸固化的UV薄片，例如SU-8。薄片应该具有5-100μm的厚度。 
2)薄片衬底应当悬挂在塑料或其它适当材料的框架上。 
3)衬底通过具有包含微孔位置与直径的标准照相平版印刷术玻璃掩模暴露于UV光中。 
4)衬底浸入显影溶剂中，该溶剂将未暴露于UV光的区域内的衬底聚合物移走，从而导致微孔穿透该薄片。 
5)衬底至少在围绕微孔的区域通过低能等离子体加强化学蒸气沉积法涂敷有氧化硅、玻璃或硅石。 
可选择地，衬底也能通过如下过程制造： 
1)初始材料是玻璃薄片，例如硼硅酸玻璃或硼硅酸盐。 
2)薄片底侧涂敷感光树脂，包含有限定开口的膜片的图案通过暴露于UV光中被转印到感光树脂上。 
3)在底侧用HF蒸气或用HF水溶液蚀刻掉玻璃，而前侧被保护，使薄片变薄直至所选区域内的厚度为2-50μm。 
4)薄片的顶表面涂敷有感光树脂，包含有微孔位置与直径的图案通过暴露于UV光中被转印感光树脂上。 
5)微孔图案使用感应耦合等离子体(ICP)用深度电抗离子蚀刻(DRIE)或先进的硅蚀刻(ASE)转印到硅上。这会导致深的竖直孔直至从底侧开口的孔洞的深度，从而确保薄片两侧之间的接触。 
可选择地，衬底也能通过如下过程制造： 
6)初始材料是玻璃薄片，例如硼硅酸玻璃或硼硅酸盐。 
7)薄片底侧涂敷感光树脂，包含有限定开口的膜片的图案通过暴露于UV光中被转印到感光树脂上。 
8)在底侧用HF蒸气或用HF水溶液蚀刻掉玻璃，而前侧被保护，使薄片变薄直至所选区域内的厚度为2-50μm。 
9)薄片的顶表面被聚焦离子束在限定微孔位置与直径的图案内冲击，从而弱化该区域内的玻璃材料。 
10)用HF蒸气或用HF水溶液蚀刻玻璃。暴露于聚焦离子束的区域将比薄片剩余区域更快地蚀刻，导致在顶表面与从底侧开口的腔之间形成微孔，从而确保薄片两侧之间的接触。 
可选择地，衬底也能通过如下过程制造： 
11)初始材料是玻璃薄片，例如硼硅酸玻璃或硼硅酸盐。 
12)薄片底侧涂敷感光树脂，包含有限定开口的膜片的图案通过暴露于UV光中被转印到感光树脂上。 
13)图案使用感应耦合等离子体(ICP)用深度电抗离子蚀刻(DRIE)或先进的硅蚀刻(ASE)转印到玻璃上。这将膜片限定在薄片的顶表面内，薄片具有2-100μm的厚度。 
14)薄片的顶表面涂敷有感光树脂，包含有微孔位置与直径的图案通过暴露于UV光中被转印感光树脂上。 
15)微孔图案使用感应耦合等离子体(ICP)用深度电抗离子蚀刻(DRIE)或先进的硅蚀刻(ASE)转印到硅上。这导致深的竖直孔直至从底侧开口的孔洞的深度，从而确保薄片两侧之间的接触。 
可选择地，膜片能够通过使用一相似的过程被独自限定在氮化硅内。 
使用上面提及的硅技术制造本发明的主要优点在于它有可能将其与硅微观流体系统整合在一起。作为例子我们在此要证明本发明如何能够被整合入具有易于填充目的的用来做电生理学测量的硅基设备。 
在参考文献3中，公开了一设备的说明书，该设备包括一孔，该孔具有对单元的高阻力封闭，一个电渗流体泵，该泵用于对孔施加吸力，具有捕获并操纵单元的用途。该孔能够以与本发明相同的方式限定在硅膜内。 
在参考文献4中，公开了一种基于硅技术的电渗泵设备。该设备能够以与本发明相同的方式作为硅膜内的成排孔被制造。 
图10显示了用于进行电生理学测量的孔，电渗流体泵，和根据本发明单片集成在一硅片27上的两个系统的集成。该硅片系统是图9所示系统的一个实施例。硅的底侧用限定层28的通道和包含有一电化学电极29的底板封闭。片28和29可选择地制造成一体。片27、28和29能够结合或粘结在薄片大小上或一单独的模具水平面上。 
为了使硅片适当地操作已封闭的体积30，其应当被液体充填；由 膜片31形成填充入口；由膜片37形成的排出出口应当被封闭。膜片31有一液体最初引入的入口通道32。膜片31的孔半径为1.5-4μm。膜片可选择地涂敷有疏水材料。 
电渗流体泵33具有一顶侧流体系统34，它包括一液体入口和一电化学电极。泵33的孔半径为0.2-0.7μm。进行电生理学测量的孔35包括膜片内半径为0.3-1.0μm的单个孔。流体系统36包括有一用于单元的入口和至少一电化学电极。 
膜片37具有一排出通道38，最初容纳在封闭体内的空气通过该通道38能够排出。膜37的筛孔半径为1.5-4μm。膜片可选择地涂敷有疏水材料。 
膜片31、37、泵33和限定了孔35的膜片能够由厚度为1-50μm的同样膜片制造。电化学电极39和41能够包括在封闭体积30内，并与底板29内的通孔接触以接触衬垫40和42。 
图11显示了根据本发明所制造的膜片的扫描电子显微照片。膜片具有一在380μm厚的硅片上借助各向异性蚀刻制造的14μm厚的硅膜。3.5μm半径的孔是用深度电抗离子蚀刻(DRIE)蚀刻的。包含内部孔的硅表面涂敷有一薄层氧化硅(石英)。 
如图7所示的该设备包装在其顶和底侧具有流体通道的塑料壳体中。通过将带有少量孔雀绿染料的20μl水在设备顶侧加入到通道而测试该设备。+50mbar的气压随后施加10秒，以便填充通道，直至液体到达膜片。增大的吸力或压力在30或60秒时间内被施加。用显微镜监控密封状态的破损。在最高压力/吸力所用的破损被记录后，第二个最高压力/吸力所用的破损明显随着特定设备的下限的也被记录。 
施加压力/吸力30或60秒后所获结果之间，或由设备的任一侧填充所获结果之间似乎没有任何差别。因而结果就仅关于是否使用压力或吸力分组。根据图3a情况，对于正压的结果在表3中概括。 
  下限＞  +100mbar 下限＞+150mbar 下限＞+175mbar   下限＞  +200mbar 下限＞+230mbar
  13/13＝100％ 12/13＝92％ 10/13＝77％   5/13＝38％ 0/13＝0％
表3：经试验得出的正保持压 
在所有被测的13个硅片中，100mbar的压力对于封闭性能没有影响。给定100mbar下限，在150mbar时，在一个硅片中，封闭破损等等。根据图3b中的情况，对于负压的结果在表4中概括。 
  下限＜  -150mbar   下限＜  -300mbar   下限＜  -350mbar
  5/5＝100％   5/5＝100％   0/5＝0％
表4：经试验得出的负保持压 
当使用图8a和图10所示的设备时，封闭性能在膜片两侧都湿的情况下非常重要。使用如下协议完成试验。 
1)含孔雀绿的水10μl被引入入口，用+50mbar的压力10秒，以确保液体表面到达膜片。 
2)3秒钟300mbar气压脉冲随后作用于入口，以确保液体流过设备。 
3)用+50mbar的压力作用于入口5分钟，以确保整个可获得的液体体积都已流过设备进入出口，使设备封闭。 
4)根据图3d中的情况，对8个不同的硅片，用增大的正压作用在出口，同时监控封闭的破损并顺序再填充入口。其结果在表5中概括。 
5)根据图3c中的情况，对6个不同的硅片，用增大的负压作用在出口，同时监控封闭的破损。其结果在表6中概括。 
  下限＞  +10mbar 下限＞+20mbar 下限＞+30mbar 下限＞+40mbar 下限＞+50mbar 下限＞+60mbar
  8/8＝100％ 7/8＝88％ 5/8＝63％ 4/8＝50％ 2/8＝25％ 1/8＝13％
表5：经试验得出的两侧都湿时的正保持压 
  下限＜  -250mbar   下限＜  -300mbar   下限＜  -400mbar
  6/6＝100％   4/6＝67％   2/6＝33％
表6：经试验得出的两侧都湿时的负保持压 
总之，试验数据显示保持压与理论预测非常一致。如预测的膜片具有小接触角时，所测量的负保持压大于正保持压。表3和表4中的正与负保持压之间的比值能够用于推算膜片的接触角是τ＝11°，这与由氧化硅制成的膜片非常一致。 
膜片两侧都是湿的试验显示，如预测，正与负保持压之间存大很大差别。这使得设备更适用于需要负保持压的应用中，而且小的正保持压仍能被施加。在这些情况下，设备通过用疏水材料涂敷膜片预定的干侧而改进。 
参考文献 
Biomaterials Properties Database，University of Michigan，Contact：Dr.William J.O’Brien，Director(FAX：313-647-5293).Quintessence Publishing 1996. 
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Madou，M.，“Fundamentals of Microfabrication”，2nd Ed(December 2001) 
CRC Press；ISBN：0849308267. 
International Patent Publication No.WO02/29402. 
Pending Patent application，J.Kutchinsky，R.Taboryski，M.Bech，Filing date：02.10.01. 

Claims (19)

1.一种用于在包含离子通道的结构中确定和/或监控离子通道的电生理学特性的微观流体系统，包括：
一具有一入口和一出口的通道；
设置在入口和出口之间的第一膜片，该膜片包括一个或多个半径在0.1至50μm范围内的孔，入口与出口彼此水力连通，从而流体能够沿着通道从入口到出口流动；
用于在入口和出口之间产生压差的压力装置，由此，由于流体在该孔上所产生的表面张力，使得使用中的流体在通道内的流动在第一膜片上停止，直至该压力装置在入口和出口之间产生一个大于孔上所产生的表面张力的压差。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，该压力装置包括一个泵设备；该系统还包括在入口与出口之间设置的封闭的第一体积；一个或多个与第一体积水力连通的第二体积；该泵设备与第一和第二体积水力连通，用于泵送流体通过该系统或用于在第一和第二体积之间施加一个液压差，该第一膜片设置在出口和第一体积之间。
3.根据权利要求2所述的系统，还包括一个第二膜片，该第二膜片包括一个或多个半径在0.1至50μm范围内的孔，且该第二膜片设置在入口与第一体积之间。
4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，该第二体积或每个第二体积包括一第二入口。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，该第二体积或每个第二体积包括一第二出口。
6.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，第一膜片包括一亲水材料。
7.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，第二膜片包括一亲水材料。
8.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，第一膜片由氧化硅，氮化硅，玻璃，硅石，矾土，氧化铝或丙烯酸形成。
9.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，第二膜片由氧化硅，氮化硅，玻璃，硅石，矾土，氧化铝或丙烯酸形成。
10.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，该系统由硅形成。
11.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，第一膜片在至少一侧上涂敷有疏水材料。
12.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，第二膜片在至少一侧上涂敷有疏水材料。
13.根据权利要求11所述的系统，其特征在于，所述疏水材料包括PTFE或PDMS。
14.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，当第一膜片由氮化硅形成时，第一膜片的厚度落在50至400nm范围内，当第一膜片由氧化硅形成时，厚度在1至20μm，当第一膜片由玻璃或硅石形成时，厚度在2至200μm范围内，当第一膜片由矾土或塑料材料形成时，厚度在5至500μm范围内。
15.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，当第二膜片由氮化硅形成时，第二膜片的厚度落在50至400nm范围内，当第二膜片由氧化硅形成时，厚度在1至20μm，当第二膜片由玻璃或硅石形成时，厚度在2至200μm范围内，当第二膜片由矾土或塑料材料形成时，厚度在5至500μm范围内。
16.一种用于进行电生理学测量的设备，包括根据权利要求1-15中任一权利要求所述的系统。
17.一种填充根据权利要求1-15中任一权利要求所述的系统的方法，包括用液体来替换起初存在于系统中的空气的步骤。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，该填充过程借助气压被外部控制。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，该压力是用0.1至10秒持续的脉冲施加的。
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