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Allgemeiner Stand der
Technik
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In
der Massenspektrometrie (MS) ist eines der wesentlichen Merkmale
wirkungsvoller Elektrospray- oder Nanoelektrospray-Verfahren die
Notwendigkeit, der Probe flüchtigen
Puffer und/oder Lösungsmittel
zuzugeben, um eine wirkungsvolle Verdampfung in einer gesteuerten
puffernden Umgebung zu ermöglichen.
Dieses Erfordernis ist zuweilen unvereinbar mit Vorgängen vor
dem Versprühen,
die zu Analysen-, Trenn- und/oder Reinigungszwecken durchgeführt werden
müssen
oder die aufgrund der spezifischen Eigenschaften dieser flüchtigen
Bestandteile des Sprühnebels
erforderlich sind.
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Vermischen von Hüllflüssigkeit
und Probe nach einer Trennung
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Zur
Bewältigung
dieses Problems sind verschiedene Strategien vorgestellt worden,
die häufig darin
bestehen, an der Sprühdüsenöffnung einen durch
Druck erzeugten Strom, üblicherweise
Hüllflüssigkeit
genannt (häufig
Methanol, Acetonitril und Essig- oder Ameisensäure), zuzuführen, um die zu versprühende Lösung mit
dieser Hüllflüssigkeit
zu vermischen. In anderen Systemen wird ein Hüllgas (d.h. ein durch Druck
erzeugter Gasstrom, z.B. Argon) benutzt, um die Verdampfung des
Lösungsmittels
der Probe zu begünstigen.
Diese Konfigurationen, die bei der Elektrospray-Ionisierung (ESI)
Standard sind, sind mit Systemen vereinbar, die mit erzwungenen und
verhältnismäßig hohen
Durchflussgeschwindigkeiten sowohl von Hüllflüssigkeit/Hüllgas als auch der zu versprühenden Lösung (normalerweise
größer als
5 μl/min)
betrieben werden.
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In
anderen Fällen
(WO 97/04 297) wird mittels einer T-Zelle eine Flüssigkeitsverbindung
an dem Ende der Elektrospray-Kapillare eingebracht, um etwa 50 %
Hüllflüssigkeit
als Zusatzfluss zuzugeben, um so einen guten Sprühnebel zu erhalten. Wiederum
sind diese Systeme wirkungsvoll, wenn die Durchflussgeschwindigkeiten
groß genug
und gut gesteuert sind, erzeugen jedoch häufig ziemlich große Totvolumina,
die eine Probenverdünnung
bewirken und folglich die Empfindlichkeit sowie die Auflösung der
Detektion beeinträchtigen.
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In
einem Nanoelektrospray, d.h., wenn die Durchflussgeschwindigkeit
weniger als 5 μl/min
beträgt,
kann auch eine Flüssigkeitsverbindung
benutzt werden, jedoch ist es sehr schwierig, diese wirkungsvoll
zu steuern, weil der Druck, der auf die Hüllflüssigkeit ausgeübt wird,
um sich mit der zu versprühenden Lösung zu
vermischen, häufig
den Fluss in der Hauptprobenkapillare destabilisiert. Im Falle einer Trennung
kann dies die Auflösung
der getrennten Signalspitzen stark verringern. Schlussendlich kann, wenn
das System zur Elektrophorese benutzt wird, der Druck, der auf die
Hüllflüssigkeit
ausgeübt
wird, dem elektroosmotischen Fluss entgegenwirken und das Pfropfprofil
verzerren, was die Auflösung
der Trennung vermindert.
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Die
Möglichkeit,
in mikroanalytischen Vorrichtungen verschiedene Kanäle herzustellen
und diese auf demselben Chip miteinander zu verbinden, erlaubt es,
Flüssigkeitsverbindungen
mit einem minimalen Totvolumen zu erzeugen, was die Verluste an Empfindlichkeit
und Auflösung
vermindert. Trotzdem ist es die Hauptschwierigkeit bei der Elektrospray- und
Nanospray-Probenzuführung mit
Hüllflüssigkeiten,
die Durchflussgeschwindigkeit der Hüllflüssigkeit und diejenige der
Probenlösung
zu steuern. Diese Durchflussgeschwindigkeiten müssen natürlich die gleiche Größenordnung
aufweisen, um so eine gute und stabile Sprühnebelerzeugung zu ermöglichen, während ein
ausreichend großer
Probenanteil für
die Detektion bewahrt bleibt.
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Um
diese Durchflussgeschwindigkeiten zu steuern, haben einige Autoren
die Oberfläche
eines Seitenarmes derivatisiert, um in beiden Kanälen elektroosmotischen
Fluss in die richtige Richtung zu ermöglichen (Ramsey et al., Analytical
Chemistry, 1997, Vol. 69, 1174). Andere Gruppen haben eine Flüssigkeitsverbindung
in den Chip eingearbeitet, die durch eine Kapillare mit einer Hüllflüssigkeitsspritze verbunden
ist (R. D. Smith et al., Electrophoresis, 2000, Vol. 21, 191). Dennoch
ist die Mikrofluidsteuerung in diesen Systemen ziemlich schwierig
und erfordert das blasenfreie Befüllen der verschiedenen Arme
des Chips, bevor das Versprühen
mit echten Proben beginnt.
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Reaktionen in dem Nanoelektrospray
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Andere
Anwendungen, wie z.B. chemische oder biologische Reaktionen in dem
Nanoelektrospray sind vorgeführt
worden, von denen erwartet wird, dass sie mehr Informationen über winzige
Probenmengen liefern, insbesondere in der Proteomik, in der einige
Verdaue unmittelbar in dem Sprühnebel durchgeführt werden
könnten.
Beispielsweise sind Nanoelektrosprays mit immobilisiertem Trypsin
benutzt worden, um ein Peptid zu verdauen und dieses unmittelbar
in das MS einzusprühen,
wodurch ermöglicht
wurde, die Reaktionskinetik zu verfolgen. Einer der Hauptnachteile
ist, dass das Trypsin, das in organischen Lösungen wirken kann, dazu einen pH-Wert
von 8,2 benötigt,
wohingegen der Sprühnebel
bei einem pH-Wert von 3 wirkungsvoller wäre. Da das Volumen und die
Durchflussgeschwindigkeit bei dem Nanoelektrospray zu klein sind,
ist es schwierig, eine Flüssigkeitsverbindung
einzubringen, um die Hüllflüssigkeit
hinzuzugeben. Daher sind diese Arten der unmittelbaren Überwachung
von Reaktionen sehr beschränkt
und werden noch nicht als Analysenwerkzeuge angesehen.
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Kurzdarstellung der Erfindung
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Hüllflüssigkeit
außerhalb
des Sprühnebelauslasses
hinzuzugeben, was ermöglicht,
Nanoelektrosprays von rein wässrigen
Lösungen
sogar bei hohem pH-Wert (pH-Wert
7 z.B.) zu erzeugen. Das Prinzip hierbei ist es, die Hüllflüssigkeit
vorzugsweise ohne Druck von außen
(Spritze, Pumpe oder anderes) erst in den Taylor-Kegel einzubringen,
der sich an dem Nanoelektrospray-Auslass bildet, indem jegliche
schwierigen Mischschritte und das Vorkonditionieren des Sprüh-Chips
beseitigt werden. Mit der vorliegenden Erfindung können Trennungs-
(z.B. Elektrophorese) oder biologische Reaktionen (z.B. Affinitäts-, Markierungs-,
enzymatische Reaktion, Polymerasekettenreaktion usw.) in rein wässriger
Lösung
bei einem beliebigem pH-Wert und bis zu dem äußersten Ende der Säule durchgeführt werden.
Außerdem kann
das Vermischen der Probenlösung
und der Hüllflüssigkeit
erst in dem Taylor-Kegel erfolgen.
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Unter
einem ersten Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung eine
Vorrichtung zum Abgeben einer Probe zur Analyse mittels Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie
bereit, wobei die Vorrichtung ein Substrat aus elektrisch isolierendem
Material umfasst, das Substrat mindestens zwei bedeckte Mikrostrukturen
(im Allgemeinen Mikrokanäle)
umfasst, die beide einen Auslass an dem Rand des Substrates aufweisen,
wo durch Anlegen einer Spannung ein Elektrospray erzeugt werden
soll, eine der Mikrostrukturen (im Folgenden als „Mikrostruktur
für die
Probe" bezeichnet)
die Probe enthält,
die in einem Sprühnebel
versprüht
werden soll, und mindestens eine andere der Mikrostrukturen (im
Folgenden als die „Mikrostruktur
für die
Hüllflüssigkeit" bezeichnet) ein
Fluid, vorzugsweise eine Hüllflüssigkeit
oder ein Hüllgas,
enthält,
dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrostruktur für die Probe und diejenige für die Hüllflüssigkeit
zwei Auslässe bereitstellen,
die einen einzigen Sprühnebel
erzeugen, derart, dass erreicht wird, dass die Probenlösung und
das zweite Fluid erst in dem Taylor-Kegel des Sprühnebels,
der die beiden Mikrostrukturauslässe
an dem Rand des Substrates umgibt, und folglich außerhalb
der Mikrostruktur für
die Probe und derjenigen für
die Hüllflüssigkeit vermischt
werden.
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Die
Vorrichtung kann ferner elektrische Mittel umfassen, die ermöglichen,
dass in beiden Mikrostrukturen ein elektrisches Feld angelegt und
gesteuert werden kann. Die Vorrichtung ist insbesondere dadurch
gekennzeichnet, dass die Durchflussgeschwindigkeit sowohl in der
Mikrostruktur für
die Hüllflüssigkeit
als auch in derjenigen für
die Probe gesteuert werden kann, dass es nicht notwendig zu sein braucht,
einen Druck von außen
auf die Hüllflüssigkeit
und/oder die Probenlösung
auszuüben,
um den Sprühnebel
zu erzeugen (rein elektrokinetisches Pumpen), und dass rein wässrige Probenlösungen in das
MS eingesprüht
werden können
(aufgrund des Vermischens mit der Hüllflüssigkeitslösung in dem Taylor-Kegel).
Die Mikrostrukturoberfläche
braucht nicht derivatisiert zu werden, um zu verhindern, dass Fluid
aus dem Probenkanal in den Hüllflüssigkeitskanal
(oder aus dem Hüllflüssigkeitskanal
in den Probenkanal) fließt.
In einigen Anwendungen kann (können)
jedoch ein Abschnitt(e) der Mikrostrukturoberfläche(n) unter Anwendung von
chemischer(-n) Reaktion(en) oder Immobilisierungsvorgängen (wie
z.B. Physisorption oder kovalentes Binden) funktionalisiert werden.
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In
dieser Erfindung ist das Substrat ein fester Träger, der aus einem elektrisch
isolierenden Material, z.B. Polymeren, keramischen Stoffen, Silicium oder
Glas, hergestellt ist.
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In
der vorliegenden Erfindung gibt es keine Beschränkung hinsichtlich der Größe, der
Gestalt und/oder der Position der Mikrostruktur. Die Mikrostruktur
für die
Probe kann eine andere Gestalt und andere Abmessungen aufweisen
als die Mikrostruktur für
die Hüllflüssigkeit.
Die Mikrostrukturen sind vorzugsweise Mikrokanäle, die entweder eine Breite oder
eine Höhe
von weniger als 150 Mikrometern aufweisen. Ansonsten können die
Mikrostrukturen in vorteilhafter Weise ein Netzwerk von bedeckten
Mikrostrukturen bilden und/oder damit verbunden sein, derart, dass
die Vorrichtung dann ein Mikroanalysensystem bilden und/oder damit
gekoppelt sein kann, das im Allgemeinen aus einem Netzwerk von Kapillaren
oder Mikrostrukturen besteht, das beispielsweise zur Kapillarelektrophorese,
Chromatographie oder Affinitätstrennung
benutzt wird. In einigen Anwendungen kann die Mikrostruktur sogar
auf Mikrolöcher reduziert
sein, die in der Dicke des Polymerträgers oder in der Schicht erzeugt
sind, die benutzt wird, um eine oder alle Mikrostrukturen abzudecken.
Auch können
Gruppierungen von Vorrichtungen dieser Erfindung in demselben Polymerträger hergestellt
und dem MS exponiert werden. Zudem besteht keine Einschränkung hinsichtlich
der Technik, die angewendet wird, um die Mikrostrukturen zu erzeugen:
Beispielsweise kann Prägen,
Spritzgießen,
Abformen, Naß- oder
chemisches Ätzen,
physikalisches Ätzen,
wie z.B. Laser-Photoablation, Plasmaätzen oder UV-Liga, Siliciumtechnik
oder Überlagerung
von Schichten, wobei mindestens eine mechanisch gebohrte Rillen,
Aushöhlungen
oder Löcher
umfasst, angewendet werden, um die Mikrostrukturen zu erzeugen. In
einigen Anwendungen können
die Mikrostrukturen, die Vorratsbehälter und das Polymersubstrat
in vorteilhafter Weise Elektroden und/oder elektrische Kontakte
umfassen. Die Elektroden und elektrischen Kontakte können unmittelbar
während
des Verfahrens der Herstellung der Vorrichtung eingearbeitet werden,
und die Elektroden können
dann einen Abschnitt einer der Wände
der Mikrostruktur bilden. Zur Einarbeitung solcher Elektroden und/oder
elektrischen Kontakte wären
Laser-Photoablation, Plasmaätzen
oder Überlagerung
von Schichten, die mechanisch gebohrte Rillen, Löcher oder Aushöhlungen und/oder
elektrisch leitfähige
Mittel umfassen, besonders gut geeignet.
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Hinsichtlich
der Gestalt der Mikrostrukturauslässe besteht keine Einschränkung. Es
ist festgestellt worden, dass spitze Winkel die Sprühnebelerzeugung
und -stabilität
begünstigen
können,
jedoch wurde keine theoretische Erklärung für diese Erscheinung gefunden.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung sind die Mikrostrukturen in derselben Ebene gebildet,
derart, dass der Auslass der Mikrostruktur für die Probe und derjenige der
Mikrostruktur für
die Hüllflüssigkeit benachbart
sind. In einer anderen Ausführungsform befinden
sich die Mikrostrukturauslässe
nicht in derselben Ebene oder sogar einer über dem anderen. In diesem
Fall kann das Substrat ein mehrschichtiger Körper sein, wobei eine Schicht
eine der mindestens zwei Mikrostrukturen umfasst und eine andere Schicht
eine zweite der mindestens zwei Mikrostrukturen umfasst. Bei einer
anderen Variante kann eine Mikrostruktur auf einer Seite des Polymersubstrates gebildet
sein, wohingegen die zweite Mikrostruktur auf der entgegengesetzten
Seite des Polymersubstrates gebildet ist. Bei einer weiteren Variante
kann eine Mikrostruktur in der Abdeckung gebildet sein, die benutzt
wird, um die andere Mikrostruktur abzudichten (dies kann insbesondere
bei einem Mikroloch der Fall sein, das in der Laminierungsschicht
gebildet ist, die benutzt wird, um die Mikrostruktur für die Probe
abzudichten, wobei das Mikroloch unmittelbar benutzt wird, um die
Hüllflüssigkeitslösung am
oder in der Nähe
des Auslasses der Mikrostruktur für die Probe einzuführen, wo
der Sprühnebel
dann erzeugt wird). Für
eine einfache Handhabung kann es vorteilhaft sein, wenn alle Mikrostrukturen
Zugangslöcher (oder Einlassvorratsbehälter) auf
derselben Seite des Polymersubstrates aufweisen.
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Bei
allen Konfigurationen ist es vorteilhaft, dass der Abstand zwischen
dem Auslass der Mikrostruktur für
die Probe und demjenigen der Mikrostruktur für die Hüllflüssigkeit kleiner als 200 μm ist, so dass
der Taylor-Kegel, der sich während
des Versprühens
bildet, beide Auslässe
umgibt. Dieser kleine Abstand ermöglicht ein wirkungsvolles Vermischen
der Lösungen
und verhindert die Bildung von Flüssigkeitstropfen an den Mikrostrukturauslässen, was
die Sprühnebelerzeugung
erleichtert und die Stabilität
des Sprühnebels
begünstigt.
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In
einer anderen Ausführungsform
weist die Vorrichtung wie bei Dünnschicht-Mikrostrukturvorrichtungen
mindestens eine Abmessung auf, die kleiner als 500 Mikrometer ist.
Auf diese Weise sind die Mikrostrukturauslässe nur von einer kleinen Oberfläche umgeben,
wodurch die Tropfenbildung verhindert und folglich die Sprühnebelerzeugung
begünstigt
wird. Die Vorrichtung kann auch in einem mehrschichtigen Substrat
gebildet sein, wobei jede Schicht des mehrschichtigen Substrates
eine von mindestens zwei Mikrostrukturen umfassen kann.
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In
einer weiteren Ausführungsform
können die
Auslassenden der Vorrichtung eine V-Gestalt in der Sprührichtung
aufweisen oder dreidimensional geätzt sein, um die feste Oberfläche um die
Auslässe herum
zu minimieren und/oder in der Sprührichtung zu verjüngen.
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In
einer anderen Ausführungsform
sind die bedeckten Mikrostrukturen durch Aufkleben, Auflaminieren
oder Auftragen unter Druck einer Polymerfolie abgedichtet. Solch
eine Polymerfolie ist vorzugsweise eine dünne Kunststoffschicht, die
gegen die benutzten Lösungsmittel
beständig
sein muss. In einer anderen Ausführungsform
kann ein Abschnitt der Mikrostruktur für die Probe in unmittelbarem
Kontakt mit einer zusätzlichen
Mikrostruktur sein und/oder einen festen Träger, wie z.B. Kügelchen
oder eine Membran, umfassen, der diese beiden Mikrostrukturen trennt,
um vor der MS-Probenzuführung, aber
gekoppelt damit, eine diffusionsgesteuerte Untersuchung durchzuführen. Diese
letzte Konfiguration kann in vorteilhafter Weise zur physikalisch-chemischen Kennzeichnung
von Verbindungen (Lipophilie, Permeationsprüfungen oder dergleichen) oder
als ein Reinigungs- oder Trennschritt benutzt werden. In Permeationsuntersuchungen
beispielsweise kann die Membran, welche die beiden Mikrostrukturen trennt,
eine Lösung
enthalten (im Allgemeinen eine organische Phase, die in der Membran,
welche die beiden wässrigen
Lösungen
trennt, eingelagert ist).
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In
einer bevorzugten Ausführungsform sind/ist
das Polymersubstrat und/oder die Abdeckung aus einem hydrophoben
Material gebildet. In einer anderen Ausführungsform ist die Oberfläche der
Mikrostruktur(en) hydrophil, um so die Mikrofluidiksteuerung zu
begünstigen.
Zur Erleichterung der Sprühnebelerzeugung
kann es vorteilhaft sein, beide Kennzeichen, hydrophobes Substratmaterial
und hydrophile Mikrostrukturoberfläche, zu koppeln, da die Probenlösung innerhalb
der Mikrostruktur leicht fließen
würde,
während
die Tropfenbildung an dem Auslass aufgrund der hydrophoben Beschaffenheit
des Substrates, das den Sprühnebelauslass
umgibt, minimiert wird.
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In
einer anderen Ausführungsform
umfasst die Vorrichtung leitfähige
Mittel, nämlich
eine oder mehrere eingearbeitete Elektroden, die benutzt werden,
um die Spannung anzulegen, die zur Sprühnebelerzeugung erforderlich
ist, um die Flüssigkeiten innerhalb
der Mikrostruktur für
die Probe und/oder derjenigen für
die Hüllflüssigkeit
elektrokinetisch zu pumpen, um entweder in der Probenlösung oder
in der Hüllflüssigkeit
eine Reaktion zu bewirken, um elektrochemische Detektion einer Verbindung
oder eine beliebige Kombination davon durchzuführen. In einer weiteren Ausführungsform
ist in den polymeren Träger
an einer kontrollierten Position in der Nähe des (der) Mikrostrukturauslasses
(-lässe)
eine Elektrode eingearbeitet und in Kontakt mit den Lösungen, die
in der (den) Mikrostruktur(en) angeordnet sind. In einer anderen
Ausführungsform
ist in den polymeren Träger
ferner eine zweite Elektrode eingearbeitet, die an dem (den) Mikrostruktureinlass
(-lässen)
oder in einem Vorratsbehälter,
der den (die) Einlass (-lässe) umgibt,
angeordnet ist. In jeder der obigen Konfigurationen kann das leitfähige Mittel
eine metallische Schicht, eine leitfähige Tinte, ein leitfähiges Polymer, z.B.
Polypyrrol oder Polyanilin, ein leitfähiges Gel, eine ionenpermeable
Membran, wie z.B. eine Innode, oder eine beliebige Kombination davon
umfassen. Die Spannung, die benutzt wird, um den Sprühnebel zu
erzeugen, sowie die Versprühungs-Stromdichte, können somit
durch dieses elektrisch leitfähige
Mittel gesteuert werden. In einigen Anwendungen kann dieses leitfähige Mittel
eine äußere Elektrode
in Kontakt mit einem oder mehreren der Einlassvorratsbehälter der
Mikrostruktur(en) sein.
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Für bestimmte
Anwendungen sollte die Probe an sich nicht in unmittelbarem Kontakt
mit dem elektrisch leitfähigen
Mittel sein. In solch einem Fall kann das leitfähige Mittel einen leitfähigen Elektrolyten,
wie z.B. ein organisches Material, ein wässriges Gel oder Lösung, ein
Sol-Gel oder ein beliebiges Material umfassen, das die Elektrode
physikalisch von der Probe trennt, während die elektrische Leitfähigkeit
des Systems bewahrt ist.
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In
einigen Anwendungen können
die Mikrostruktur für
die Probe und die Mikrostruktur für die Hüllflüssigkeit in elektrischen Kontakt
gebracht werden. Auf diese Weise kann eine Hochspannung beispielsweise
längs der Mikrostruktur
für die
Hüllflüssigkeit
aufgezwungen werden, um das Versprühen einzuleiten und aufrechtzuerhalten,
während
eine zweite Spannung in dem Probenkanal überlagert werden kann. Diese überlagerte
Spannung kann ein Fließen
von Probenlösung
bewirken. Jede Mikrostruktur kann mit einer Stromversorgung verbunden sein,
um die erforderliche angelegte Spannung zu erzeugen. Die Sprühnebelquelle
des Massenspektrometers kann benutzt werden, um die Spannung in
einer der Mikrostrukturen anzulegen (im Allgemeinen in der Mikrostruktur
für die
Hüllflüssigkeit).
Eine unabhängige
Stromversorgung kann dann benutzt werden, um die Spannung in der
zweiten Mikrostruktur (im Allgemeinen der Probenkanal) anzulegen.
Auf diese Weise sind der MS-Eingang und die Stromversorgung mit
der Erde verbunden und die elektrischen Felder in den beiden Mikrostrukturen
angelegt. Wenn die Mikrostruktur für die Probe mit der Mikrostruktur für die Hüllflüssigkeit
elektrisch verbunden ist, kann dann ein schwebendes Potential zwischen
den beiden Mikrostrukturen angelegt werden, um das elektrische Feld
in beiden Mikrostrukturen zu steuern.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung enthält
die Mikrostruktur für
die Hüllflüssigkeit eine
Lösung,
die flüchtig
genug ist, um als eine Hüllflüssigkeit
benutzt zu werden. Beispiele für
solche Lösungen,
die üblicherweise
auch in der Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie benutzt werden,
sind Methanol, Acetonitril oder Gemische von Methanol oder Acetonitril
und Wasser. Die Lösung, die
in der Mikrostruktur für
die Hüllflüssigkeit
enthalten ist, kann in vorteilhafter Weise Säure(n) oder Base(n) enthalten,
welche die Ionisation der Probe, die in das MS abgegeben werden
soll, begünstigt
(-en). In einer anderen Ausführungsform
können
(kann) die Proben- und/oder
die Hüllflüssigkeitslösung auch eine
Verbindung umfassen, die bei der Erzeugung des Sprühnebels
ionisiert und weiter in das MS abgegeben wird. Solche Verbindungen
können
in vorteilhafter Weise als innere Standards benutzt werden und insbesondere
als Kalibrationsmittel für
quantitative MS-Analysen dienen.
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In
einer anderen Ausführungsform
enthält die
Mikrostruktur für
die Hüllflüssigkeit
ein Gas. Dieses Gas kann ein Inertgas, wie z.B. Stickstoff, Argon, Helium
oder dergleichen, sein, das z.B. dazu dient, die Sprühnebelerzeugung
zu begünstigen
und/oder die Bildung von Tröpfchen
an dem Mikrostrukturauslass zu verhindern. Für manche Anwendungen kann auch
ein reaktionsfähiges
Gas, wie z.B. Sauerstoff, oder ein Gemisch aus inerten und reaktionsfähigen Gasen
benutzt werden, um eine Reaktion mit der Probenlösung hervorzurufen.
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Die
Proben- und die Hüllflüssigkeitslösung können unmittelbar
in die Einlass-Vorratsbehälter
der jeweiligen Mikrostrukturen eingebracht und sogar ohne Anwendung
einer Kraft von außen
(z.B. Gegendruck) in das MS versprüht werden.
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Im
Allgemeinen ist die Vorrichtung in einem Gerät gelagert, was die Handhabung
der Vorrichtung erleichtert und/oder das präzise Positionieren der Sprühdüse (Mikrostrukturauslass)
vor dem MS-Eingang ermöglicht.
Das Haltegerät
kann in vorteilhafter Weise Flüssigkeitsverbindungsmittel
(z.B. mindestens eine Kapillare), um eine leichte Einführung von Probe
und/oder Hüllflüssigkeit
in die Mikrostrukturen der Vorrichtung (und im Allgemeinen mit minimierten Totvolumina)
zu ermöglichen,
ebenso wie elektrische Verbindungen zum Anlegen des (der) elektrischen Feldes
(-er) umfassen. Das Abgeben der Probe mittels Elektrosprayionisation
kann auch automatisiert und/oder computergesteuert werden, wodurch
die Steuerung der gesamten MS-Analysen ermöglicht wird (Probeneinführung, Sprühnebelerzeugung, Durchflussgeschwindigkeiten
der Proben- und der Hüllflüssigkeitslösung in
den Mikrostrukturen, Vermischen der beiden Lösungen in dem Taylor-Kegel, Probenionisation,
MS-Detektionsmodus usw.).
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In
einigen Ausführungsformen
ist die Mikrostruktur für
die Probe mit anderen Trenn- oder Detektionsmitteln, z.B. einer
Chromatographiesäule,
einer Elektrophoreseeinheit, einer Membran, einem Entsalzungsschritt
usw., verbunden. In einer anderen Ausführungsform kann die Mikrostruktur
für die
Probe auch ein Trennmittel, wie z.B. eine Festphase (z.B. eine Membran,
Kügelchen
und/oder einen Abschnitt der Mikrostrukturwand), ein Chromatographiemittel
oder ein Kapillarelektrophoresesystem, umfassen. Für Anwendungen,
in denen der Probenkanal mit einem Trennmittel gekoppelt ist und/oder
ein solches umfasst, z.B. Kapillarelektrophorese, kann es vorteilhaft
sein, einen Entkoppler einzubinden, der zwischen dem Trennmittel
oder dem trennenden Teil des Probenmikrokanals und dem Probenauslass
angeordnet wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform
können auf
die Mikrostrukturoberfläche
Verbindungen aufgetragen, daran adsorbiert oder gebunden sein. Dies kann
insbesondere zur physikalisch-chemischen Kennzeichnung von Verbindungen
(z.B. Löslichkeitsuntersuchungen)
benutzt werden, wobei die zu kennzeichnende Probe auf die Wände der
Mikrostruktur für
die Probe aufgetragen wird. Die Lösung, in der die Löslichkeit
beurteilt werden muss, wird dann in die Mikrostruktur für die Probe
eingeführt,
und die Probe, die nach einer gegebenen Zeit in dieser Lösung gelöst ist,
kann dann mittels Massenspektrometrie unter Benutzung der Vorrichtung
dieser Erfindung gemessen werden.
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In
einer anderen Ausführungsform
enthält die Mikrostruktur
für die
Probe ein biologisches Material, z.B. Proteine, Enzyme, Antikörper, Antigene,
Zucker, Oligonukleotide oder Zellen, das auf der Mikrostrukturoberfläche oder
auf einem festen Träger
(z.B. einer Membran, einem Gel, einem Sol-Gel oder Kügelchen)
immobilisiert oder kovalent gebunden sein kann, so dass enzymatische,
Affinitäts-,
Aktivitäts-, immunologische
und/oder Zelluntersuchungen in der Mikrostruktur für die Probe
durchgeführt
werden können.
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Viele
Reaktionen, die nicht für
die Lösungsmittel
geeignet sind, die üblicherweise
in der Massenspektrometrie benutzt werden (z.B. organische Lösungsmittel
wie Acetonitril oder Methanol) können
in der Vorrichtung dieser Erfindung durchgeführt werden, weil die Probe
eine rein wässrige
Lösung
sein kann.
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Somit
können
enzymatische Reaktionen, Affinitätsprüfungen,
Löslichkeitsuntersuchungen,
enzymatischer oder chemischer Verdau, Probenderivatisierung sowie
elektrochemisch bewirkte Reaktionen (z.B. Protonierung, Markieren
unter Benutzung von Chinonen oder beliebige andere Redoxreaktionen) vor
dem Abgeben in das Massenspektrometer in der Mikrostruktur für die Probe
durchgeführt
werden. Die Vorrichtung dieser Erfindung kann auch in vorteilhafter
Weise zu Untersuchungen molekularer Wechselwirkungen benutzt werden.
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Unter
einem zweiten Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zum Abgeben einer Probe aus einer Vorrichtung wie oben
definiert in ein Massenspektrometer bereit. Das Verfahren ist dadurch
gekennzeichnet, dass das elektrische Feld sowohl in der Mikrostruktur
für die
Probe als auch in derjenigen für
die Hüllflüssigkeit
angelegt werden kann und dass somit die Durchflussgeschwindigkeiten
der Lösungen,
die in diesen beiden Mikrostrukturen enthalten sind, gesteuert werden
können,
wodurch ermöglicht
wird, das Vermischen der Proben- und der Hüllflüssigkeitslösung in dem Taylor-Kegel und
folglich ihren Anteil in dem Sprühnebel
zu steuern. Das Verfahren dieser Erfindung kann in vorteilhafter
Weise zum Abgeben einer wässrigen
Probenlösung
sogar bei hohen ebenso wie bei niedrigen Durchflussgeschwindigkeiten
und sogar bei hohen pH-Werten
in ein Massenspektrometer angewendet werden.
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Das
Verfahren dieser Erfindung kann auch das Einführen einer Verbindung mit bekannter
Konzentration in eine oder beide von der Proben- und/oder der Hüllflüssigkeitslösung (innerer
(-e) Standard(s), benutzt zur Kalibrierung) umfassen, um so eine
quantitative MS-Detektion eines Analyten zu ermöglichen. Außerdem kann das Einführen innerer Standards
in die Lösungen
angewendet werden, um den Anteil von versprühter Proben- und Hüllflüssigkeitslösung zu
messen und die Wirksamkeit des Versprühens und/oder des Vermischens
der Lösungen in
dem Taylor-Kegel zu untersuchen.
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Das
Verfahren kann ferner das Koppeln der MS-Detektion einer Verbindung
mit der Reinigung oder Trennung der Probenlösung (z.B. mittels Chromatographie,
Kapillarelektrophorese, Affinitätskopplung,
Entsalzung usw.) umfassen. In ähnlicher
Weise kann das Verfahren das Immobilisieren von Molekülen der
Probe reversibel auf einem festen Träger (z.B. einer Membran oder
Kügelchen)
und Freisetzen der Moleküle
von dem festen Träger
in die Mikrostruktur für
die Probe durch Versprühen
eines Puffers oder durch einen Gradienten von unterschiedlichen
Lösungsmitteln
umfassen. Dieser feste Träger
kann auch mindestens ein oder mehrere immobilisierte Affinitätsmittel,
wie z.B. Antikörper,
Antigene, Oligonukleotide, DNA-Stränge und dergleichen, umfassen. Das
Verfahren kann auch das Durchführen
von Löslichkeitsuntersuchungen
umfassen, wobei die Mikrostruktur für die Probe beispielsweise
mit einer interessierenden Verbindung beschichtet werden kann, bevor
eine Lösung
eingeführt
und weiter versprüht wird,
in der sich die Verbindung löst.
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Unter
einem dritten Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung zum Abgeben einer Probe
zur anschließenden
Analyse mittels Elektrospray-Massenspektrometrie
bereit, wobei das Verfahren den Schritt des Benutzens eines Substrates
aus elektrisch isolierendem Material und des Herstellens von mindestens zwei
bedeckten Mikrostrukturen umfasst, die beide einen Auslass an dem
Rand des Substrates aufweisen, derart, dass die Proben- und die
Hüllflüssigkeitslösung, die
durch diese Auslässe
aus den Mikrostrukturen versprüht
werden sollen, erst in dem Taylor-Kegel, der die beiden Mikrostrukturauslässe an dem Rand
des Substrates umgibt, die einen einzigen Sprühnebel erzeugen, und folglich
außerhalb
der Mikrostruktur für
die Probe und derjenigen für
die Hüllflüssigkeit
vermischt werden.
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Das
Substrat ist ein mehrschichtiger Körper, wobei eine Schicht eine
der mindestens zwei Mikrostrukturen umfasst und eine andere Schicht
eine andere der mindestens zwei Mikrostrukturen umfasst. Die Mikrostrukturen
können
unabhängig
voneinander in den beiden Schichten hergestellt werden. Auf diese
Weise kann die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung durch Zusammenfügen von
zwei oder mehr der obigen Schichten (z.B. durch Zusammenkleben oder
Aufeinanderlaminieren) in solch einer Weise hergestellt werden,
dass ein mehrschichtiges Substrat mit mindestens zwei bedeckten
Mikrostrukturen gebildet wird, die beide einen Auslass an dem Rand des
Substrates aufweisen, so dass die Lösungen, die durch diese Auslässe aus
den Mikrostrukturen versprüht
werden sollen, erst in dem Taylor-Kegel vermischt werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
können die Mikrostrukturauslässe an dem
Rand des Substrates durch Schneiden des Substrates seiner Dicke nach
z.B. durch mechanische Mittel, wie z.B. eine Stanzung, hergestellt
werden.
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Das
Herstellungsverfahren kann ferner Schritte zum Einarbeiten elektrischer
Mittel unmittelbar in das Substrat umfassen, wobei das Substrat
somit mindestens einen leitfähigen
Abschnitt aufweist.
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Wenn
das Substrat ein Polymer ist, können die
bedeckten Mikrostrukturen durch Laser-Photoablation, UV-Liga, Prägen, Spritzgießen, Filmgießen aus
der Lösung
oder licht- oder thermisch induzierte Polymerisation, Siliciumtechnik
oder Überlagerung von
Schichten gebildet werden, wobei mindestens eine der Schichten mechanisch
gebohrte Rillen, Aushöhlungen
oder Löcher
umfasst. Der leitfähige
Abschnitt des Substrates kann auch durch Abscheiden einer Tinte,
von leitfähigem
Polymer, Ionenaustauschmaterial, Metallabscheidung, Kathodenzerstäubung oder
anderes gebildet werden. Alternativ können die Mikrostrukturen und/oder
der leitfähige Abschnitt
durch Plasmaätzen,
Photoablation oder chemisches Ätzen
gebildet werden. Leitfähige
Substratabschnitte, die auf diese Weise gebildet werden, sind ideal
zum Anlegen einer Hochspannung in dem Mikrokanal, um einen stabilen
Sprühnebel
zum Einführen
in ein Massenspektrometer zu erzeugen.
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Der
leitfähige
Substratabschnitt kann insbesondere durch Herstellen einer Aussparung
in dem Substrat und Füllen
der Aussparung mit elektrisch leitfähigem Material gebildet werden.
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Ein
Analysengerät,
das eine Gruppierung von jeweils erfindungsgemäßen Vorrichtungen umfasst,
kann in einem Verfahren zum Analysieren mehrerer Proben benutzt
werden, wobei jede Vorrichtung der Reihe nach benutzt wird, um eine
Probe aufzunehmen, und jede Probe kann von der jeweiligen Vorrichtung
abgegeben und mittels Massenspektrometrie analysiert werden. Die
Proben können
aus einem Analysensystem, z.B. einem Chromatographen, einer Elektrophoreseeinheit,
einer Trenneinheit oder einem Affinitätssystem aufgenommen werden.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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Die
Erfindung wird im Folgenden nur beispielhaft unter Bezugnahme auf
die beigefügten
Figuren ausführlicher
beschrieben, wobei
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1 eine
schematische Perspektivansicht einer Vorrichtung gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung ist;
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2 die
Vorrichtung von 1 in Gebrauch zeigt;
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3A eine Planskizze einer Gruppierung von
Vorrichtungen ist, die auf einem Träger gebildet sind;
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3B mögliche
unterschiedliche Querschnitte für
die Vorrichtungen von 3A längs der Linie
a zeigt;
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4 ein
Gerät zeigt,
das benutzt werden kann, um die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zu
halten;
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5A die Entwicklung des Massenspektrums
bei m/z = als eine Funktion der Zeit in einem Versuch zeigt, der
unter Benutzung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt wurde;
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5B die Entwicklung von ΔU als eine Funktion
der Zeit zeigt;
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5C ein Beispiel für ein Massenspektrum ist, das
mit einer Potentialdifferenz zwischen der Mikrostruktur für die Probe
und derjenigen für
die Hüllflüssigkeit
von 400 Volt erhalten wurde;
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5D ein Beispiel für ein Massenspektrum ist, das
mit einer Potentialdifferenz zwischen der Mikrostruktur für die Probe
und derjenigen für
die Hüllflüssigkeit
von 0 Volt erhalten wurde;
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6A die
Entwicklung der Intensität
des Massenspektrums von Propanolol und von Reserpin als eine Funktion
der Zeit bei Variierung der Differenz der angelegten Spannung zwischen
der Mikrostruktur für
die Probe und derjenigen für
die Hüllflüssigkeit, ΔU, zeigt;
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6B die
Entwicklung des Verhältnisses der
Intensität
des Massenspektrums von Propanolol gegenüber derjenigen von Reserpin
als eine Funktion von ΔU
für die
Versuchsdaten von 6A zeigt; und
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7 eine
Vorrichtung gemäß einer
anderen Ausführungsform
der Erfindung zeigt.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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1 ist
ein Beispiel für
eine erfindungsgemäße Vorrichtung,
die in einem Substrat 100 hergestellt ist und zwei bedeckte
Mikrostrukturen umfasst, und zwar einen Proben-Mikrokanal 1 und
einen Hüllflüssigkeits-Mikrokanal 2,
die zur Einführung
von Fluid mit dem Einlass-Vorratsbehälter 3 bzw. 4 verbunden
sind, die auf derselben Seite des Trägers 100 angeordnet
sind. 1 veranschaulicht auch, dass die Mikrostrukturen
Auslässe 6 aufweisen,
die an dem Rand des Trägers
gebildet sind, an dem der Sprühnebel
bei Anlegen von Spannung erzeugt werden soll.
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2 zeigt
die Vorrichtung wie in 1, wobei der Taylor-Kegel 5,
der sich beim Anlegen von Spannung bildet, den Auslass 6 sowohl
des Proben- als auch des Hüllflüssigkeits-Mikrokanals
umgibt, derart, dass sich die Probenlösung erst in dem Taylor-Kegel
mit der Hüllflüssigkeitslösung vermischt.
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3A zeigt ein Beispiel für eine Gruppierung
von Vorrichtungen, die auf demselben Träger 100 hergestellt
sind, wobei die Vorrichtungen eine Mikrostruktur für die Probe 1,
eine Mikrostruktur für
die Hüllflüssigkeit 2 und
eine zusätzliche
(aber wahlfreie) Mikrostruktur 12 umfassen (in dem vorliegenden
Beispiel sind alle Mikrokanäle),
die jeweils mit dem Vorratsbehälter 3, 4 bzw. 13 verbunden
sind, und beide ein Auslassende 6 aufweisen, das an dem
Rand des Trägers
gebildet ist, an dem bei der Erzeugung des Sprühnebels der Taylor-Kegel 5 erzeugt
wird. Diese Figur veranschaulicht ferner, dass der Träger geradlinig
quer durchgeschnitten oder zu der Gestalt einer Spitze geschnitten
sein kann, um die feste Oberfläche
um die Mikrostrukturauslässe
herum zu verkleinern, und dass in den Träger elektrische Mittel, wie z.B.
leitfähige
Kontaktfelder 11 und/oder Elektroden 7, 8, 9 oder 10,
eingearbeitet sein können,
die entweder in den Mikrostrukturen oder in Kontakt mit den Mikrostruktureinlässen angeordnet
sind.
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3B stellt eine Vielfalt von Querschnitten (längs der
Achse a von 3A) einer der Vorrichtungen
dar, die in 3A gezeigt sind, und veranschaulicht,
dass die Mikrostrukturauslässe
verschiedene Gestalttypen und Anordnungen aufweisen können.
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4 zeigt
ein Beispiel für
ein Gerät,
das benutzt werden kann, um die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung
zu halten. In diesem Beispiel umfasst das Haltegerät 20 einen
elektrischen Kontakt 21, der mit einem elektrischen Kontaktfeld 11 verbunden
ist, das in das Substrat 100 eingearbeitet ist, das die
Mikrostruktur für
die Probe 1 und mindestens eine Mikrostruktur für Hüllflüssigkeit
(nicht dargestellt) umfasst. Das Haltegerät 20 umfasst ferner
ein Fluidverbindungsmittel (hier eine Kapillare), welches das Einführen von
Fluiden an dem Einlass der Mikrostruktur für die Probe ermöglicht.
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5 zeigt
die Entwicklung der Intensität des
Massenspektrums als eine Funktion der Differenz der angelegten Spannung
zwischen der Mikrostruktur für
die Probe und der Mikrostruktur für die Hüllflüssigkeit, ΔU, unter Benutzung eines Beispiels für die Vorrichtung
der vorliegenden Erfindung, wobei die Probenlösung eine wässrige Lösung von 100 μM Propanolol
und Koffein in 10 mM Ammoniumacetat mit einem pH-Wert von 5,5 und
die Hüllflüssigkeitslösung eine
Lösung
von Reserpin in Methanol ist, das 1 % Essigsäure enthält. 5A zeigt
die Entwicklung des Massenspektrums bei m/z = als eine Funktion der
Zeit, und 5B zeigt die Entwicklung
von ΔU als
eine Funktion der Zeit. 5C ist ein
Beispiel für ein
Massenspektrum, das bei einer Potentialdifferenz zwischen der Mikrostruktur
für die
Probe und derjenigen für
die Hüllflüssigkeit
von 400 Volt erhalten wurde, während 5D ein Beispiel für ein Massenspektrum ist, das
bei einer Potentialdifferenz zwischen der Mikrostruktur für die Probe
und derjenigen für
die Hüllflüssigkeit
von 0 Volt erhalten wurde.
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6A zeigt
die Entwicklung der Intensität des
Massenspektrums von Propanolol (d.h. bei dem Masse-zu-Ladung-Verhältnis von
m/z = 259 bis 261) und von Reserpin (m/z = 608 bis 610) als eine
Funktion der Zeit bei Variierung der Differenz der angelegten Spannung
zwischen der Mikrostruktur für
die Probe und der Mikrostruktur für die Hüllflüssigkeit, ΔU. 6B zeigt
die Entwicklung des Verhältnisses
der Intensität
des Massenspektrums von Propanolol zu derjenigen von Reserpin als
eine Funktion von ΔU
für die
Versuchsdaten von 6R.
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7 zeigt
ein Beispiel für
eine Vorrichtung der vorliegenden Erfindung, wobei die Mikrostruktur für die Probe 1 unmittelbar
mit einem Netzwerk von Mikrokanälen 30 und 31 verbunden
ist, das verschiedene Verbindungs-Vorratsbehälter 32 und 33 bzw. 34 umfasst.
Die Vorratsbehälter 32 und 34 sind
mit Pumpmitteln 36 und 37 (elektrokinetische oder
mechanische Pumpsysteme, hier durch Spritzenpumpen symbolisiert)
verbunden, wohingegen der Vorratsbehälter 33 mit einer
Kapillare verbunden ist, welche die Probeneinführung ermöglicht. Solch eine Konfiguration
der Vorrichtung kann in vorteilhafter Weise zur Verbindung mit einem
Trennsystem, wie z.B. einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Säule oder
einer Kapillarelektrophoreseeinheit, benutzt werden. Die Probe kann
kontinuierlich in den Einlass 33 gedrückt werden, während das
Pumpmittel die Steuerung der Richtung des Probenflusses und folglich
die Einführung
der Probe in die Mikrostruktur für
die Probe ermöglicht.
Als ein Beispiel kann das Pumpmittel 37 in ziehendem Modus
benutzt werden, um die Lösung
anzusaugen, die von der Kapillare 35 an dem Einlass 33 ankommt,
während
das Pumpmittel 36 in einem drückenden Modus benutzt wird,
um das Fluid weiter zu zwingen, von dem Einlass 33 zu dem
Vorratsbehälter 34 zu
fließen, der
dann als eine Verbindung mit dem Abfluss benutzt wird. Durch Schalten
der Pumpmittel 37 und 36 auf Drücken bzw.
Ziehen fließt
die Probenlösung
von dem Einlass 33 auf den Vorratsbehälter 32 zu. Die Probenlösung kann
dann durch Anlegen einer Spannung zwischen dem Vorratsbehälter 3 und
dem Sprühnebelauslass
des Probenkanals in die Mikrostruktur für die Probe 1 injiziert
werden. Diese Konfiguration der Vorrichtung ermöglicht eine sehr genaue Injektion
der Probe, und die Probe kann in einigen Anwendungen ferner innerhalb
der Mikrostruktur für die
Probe getrennt werden, bevor sie versprüht wird.
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Das
Konzept der vorliegenden Erfindung wird anhand der folgenden Versuchsdaten,
die mit einer Vorrichtung erhalten wurden, die derjenigen ähnlich ist,
die in
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1 schematisch
gezeigt ist, veranschaulicht. Die Vorrichtung umfasste zwei plasmageätzte Mikrochips,
die aus einer Polyimidfolie mit einer Dicke von 75 μM hergestellt
waren, die einen Mikrokanal (60 mm x ≈ 120 mm x ≈ 1 cm), der durch Auflaminieren
einer 38 μM
dicken Polyethylen/Polyethylenterephthalat-Schicht abgedichtet war, und eine Mikroelektrode
(Goldelektrode mit einem Durchmesser von 52 μm) umfasste, die in den Boden
des Mikrokanals eingearbeitet war. Die beiden Polyimid-Chips wurden zusammengeklebt
und ferner mechanisch zur Gestalt einer Spitze geschnitten, derart,
dass dieses mehrschichtige System zwei Mikrostrukturen aufweist,
die beide einen Mikrokanal mit einem Auslass an dem Rand der Polyimidschichten
umfassen, wodurch eine Vorrichtung gebildet ist, bei welcher der Auslass
der Mikrostruktur für
die Probe und derjenige für
die Hüllflüssigkeit übereinander
gelagert waren und der Taylor-Kegel in ähnlicher Weise gebildet werden
konnte wie bei der Konfiguration, die in 2 gezeigt
ist. Bei dieser Vorrichtung betrug die Dicke des Trägers, welche
die beiden Mikrostrukturauslässe trennt,
weniger als 50 Mikrometer. Es sei hier auch angemerkt, dass die
Vorrichtung ferner Einlass-Vorratsbehälter an dem Einlass sowohl
der Mikrostruktur für
die Probe als auch derjenigen für
die Hüllflüssigkeit
umfasste. Ferner wurde ein Schacht aus Polystyrol oben auf jeden
Vorratsbehälter
geklebt, um so das Volumen der in die Vorrichtung einzubringenden
Proben- und der Hüllflüssigkeitslösung zu
vergrößern. Außerdem wurde
die eingearbeitete Elektrode nicht benutzt, um in den betreffenden
Versuchen die Spannung anzulegen. Um den Sprühnebel zu erzeugen, kann die
Spannung unmittelbar in den Polystyrol-Vorratsbehältern angelegt
werden, wobei beispielsweise 2 kV in dem Vorratsbehälter für die Hüllflüssigkeit
und 2 bis 2,5 kV in dem Vorratsbehälter für die Probe angelegt werden.
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Im
Folgenden ist ein Beispiel für
ein Verfahren zur Benutzung dieser Vorrichtung, um eine wässrige Probenlösung in
ein Elektrospray-Massenspektrometer (hier ein LCQ-Duo von Finnigan,
USA) abzugeben, beschrieben:
- 1) Vorrichtung
vor dem MS-Eingang anordnen, wobei die Mikrostrukturauslässe zu der
MS-Öffnung
weisen (typischerweise einige wenige Mikrometer bis einige wenige
Zentimeter);
- 2) Befüllen
der Mikrostruktur für
die Probe 1 durch Kapillarwirkung z.B. mit einer wässrigen
Probenlösung
(hier 10 mM Ammoniumacetat bei einem pH-Wert von 5,5 mit 100 μM Propanolol
und Koffein), indem ein Tropfen in dem Vorratsbehälter für die Probe
abgelegt wird (typischerweise ein Lösungsvolumen von einigen wenigen
Nanolitern bis einigen wenigen Mikrolitern);
- 3) Befüllen
der Mikrostruktur für
die Hüllflüssigkeit 2 durch
Kapillarwirkung mit einer Hüllflüssigkeitslösung (hier
Methanol, das 0,1 oder 1 Essigsäure und
100 μM Reserpin
enthält)
durch Ablegen eines Tropfens in dem Vorratsbehälter für die Hüllflüssigkeit;
- 4) Beginnen mit dem Versprühen
in dem Hüllflüssigkeits-Mikrokanal 2 durch
Anlegen einer Spannung (hier 2 kV) in dem Vorratsbehälter für die Hüllflüssigkeit 4;
- 5) Pumpen der Probenlösung
in der Mikrostruktur für
die Probe 1 durch Anlegen einer zusätzlichen Spannung (+ΔU = 100 bis
500 V) zwischen dem Vorratsbehälter
für die
Probe und demjenigen für die
Hüllflüssigkeit 3 bzw. 4,
um durch elektrokinetisches Pumpen einen Fluss der Probenlösung zu erzeugen.
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Zur
Veranschaulichung zeigt 5 die Entwicklung der Intensität des Massenspektrums
als eine Funktion der Differenz der angelegten Spannung zwischen
der Mikrostruktur für
die Probe und der Mikrostruktur für die Hüllflüssigkeit, ΔU, unter Benutzung des oben
beschriebenen Beispiels für
die Vorrichtung und das Verfahren. 5A zeigt
deutlich, dass die Gesamt-MS-Intensität mit der
Zeit variiert und der zeitlichen Variation der zusätzlichen Spannung ΔU folgt,
die in der Mikrostruktur für
die Probe angelegt wird. Wenn ΔU
groß ist,
ist die MS-Intensität
hoch, was der erhöhten
Innenkonzentration entspricht, die aufgrund des großen Anteils
von versprühter
Probenlösung
von dem MS detektiert wird. Wenn ΔU
abnimmt, nimmt die MS-Intensität ab, da der
Anteil an Hüllflüssigkeitslösung zunimmt.
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Dies
wird auch durch die Vollspektren bestätigt, die in 5C und 5D gezeigt sind und bei ΔU-Werten
von 400 bzw. 0 V gemessen wurden. Bei ΔU = 400 V wird die größte Signalspitzen-Intensität bei m/z
= 260,4 (entspricht Propanolol) aufgezeichnet, wohingegen die Signalspitze
bei m/z = 609,6 (entspricht Reserpin) sehr klein ist, was bedeutet, dass
der Anteil an versprühter
Probenlösung
groß ist. Im
Gegensatz dazu wird bei ΔU
= 0 V Reserpin mit der höchsten
Intensität
detektiert, wohingegen Propanolol mit sehr viel geringerer Intensität als bei ΔU = 400 V
detektiert wird, wodurch bestätigt
wird, dass der Anteil an versprühter
Probenlösung
sehr viel kleiner als bei ΔU
= 400 V ist. Dies ist in 6A weiter beispielhaft
dargestellt, welche die zeitliche Entwicklung des Massenspektrums
zeigt, das für
Propanolol und Reserpin bei Variierung von ΔU gemessen wird.
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Das
Verhältnis
der Signalspitzen-Intensität, die
für Propanolol
gemessen wurde, zu derjenigen, die für Reserpin gemessen wurde,
kann als eine Funktion von ΔU
angegeben werden. Wie in 6B beispielhaft dargestellt,
nimmt dieses Verhältnis
mit ΔU stark
zu, was einem erhöhten
Anteil an versprühter
Probenlösung
entspricht. Solch eine Kalibrationskurve kann dann benutzt werden,
um die Durchflussgeschwindigkeit in der Mikrostruktur für die Probe und
derjenigen für
die Hüllflüssigkeit
zu berechnen. Wie in 5C und 5D veranschaulicht, bleibt das Verhältnis der
Signalspitzen-Intensitäten
für Propanolol
und Koffein, die beide in der Probenlösung gegenwärtig sind, bei Variierung von ΔU gleich.
Dies zeigt auch, dass die Kalibrationskurve von 6B ferner
zur quantitativen Bestimmung einer Verbindung benutzt werden kann.
In solch einem Fall können
Reserpin und z.B. Koffein als innerer Bezug sowohl für die Hüllflüssigkeits-
als auch die Probenlösung
benutzt werden.
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Es
muss hier betont werden, dass die zusätzliche Spannung ΔU in den
Kanälen
nur angelegt wird, wenn eine Flüssigkeitsverbindung
zwischen der Mikrostruktur für
die Probe und derjenigen für
die Hüllflüssigkeit
vorhanden ist. Diese Flüssigkeits-„Brücke" ist in der vorliegenden
Erfindung der Taylor-Kegel, der von der ersten Spannung erzeugt wird.
Auf diese Weise ist die Vorrichtung dieser Erfindung besonders wirkungsvoll,
da das Pumpen in der Mikrostruktur für die Probe (wässrige Probenlösung) erst
erfolgt, nachdem das Versprühen
eingeleitet wurde (wodurch unerwünschte
Beendigung des Versprühens
minimiert wird). Außerdem
können
die Flüsse
von Proben- und Hüllflüssigkeitslösung in
den Taylor-Kegel
durch Ändern
des Wertes der aufgezwungenen zusätzlichen Spannung ΔU in einfacher Weise
variiert werden. Durch Zugabe einer Verbindung zu jeder Lösung in
einer bekannten Konzentration kann der Anteil der versprühten Hüllflüssigkeits- und
Probenlösung
anhand der Intensität überwacht werden,
die vom Massenspektrometer aufgezeichnet wird. Diese Strategie ermöglicht es
auch, quantitative MS-Analyse mit viel größerer Genauigkeit als herkömmliche
Verfahren durchzuführen.