CN112261975B - 用于质谱分析的盒、系统和方法 - Google Patents

用于质谱分析的盒、系统和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112261975B
CN112261975B CN201980036946.4A CN201980036946A CN112261975B CN 112261975 B CN112261975 B CN 112261975B CN 201980036946 A CN201980036946 A CN 201980036946A CN 112261975 B CN112261975 B CN 112261975B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
antibody
cartridge
column
membrane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201980036946.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112261975A (zh
Inventor
N.E.马尼科
C.张
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Indiana University Research and Technology Corp
Original Assignee
Indiana University Research and Technology Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Indiana University Research and Technology Corp filed Critical Indiana University Research and Technology Corp
Publication of CN112261975A publication Critical patent/CN112261975A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112261975B publication Critical patent/CN112261975B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/549—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic with antigen or antibody entrapped within the carrier
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
    • B01L2200/025—Align devices or objects to ensure defined positions relative to each other
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/16—Reagents, handling or storing thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0609—Holders integrated in container to position an object
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/069—Absorbents; Gels to retain a fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/02—Drop detachment mechanisms of single droplets from nozzles or pins
    • B01L2400/027—Drop detachment mechanisms of single droplets from nozzles or pins electrostatic forces between substrate and tip

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本公开内容提供了“全合一”盒，其含有为进行质谱检测而将目标蛋白质从血液血浆中分离/预浓缩并且将其离子化所需的试剂和材料。在另一种配置中，所述盒包括蛋白水解酶，用于除了预浓缩和离子化外还将蛋白质消化成较小的肽以进行质谱检测。

Description

用于质谱分析的盒、系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年4月11日提交的美国临时申请序列No.62/656,306的权益和优先权，其全部公开内容明确地通过引用的方式以其全文并入本文。
技术领域
本公开内容总体上涉及一种用于质谱分析的设备，并且更特别地，涉及一种用于质谱分析的盒(cartridge)设备。
背景技术
蛋白质分子在临床诊断实验室中作为肿瘤标志物、急性或慢性疾病标志物、风险或预后标志物以及激素进行测量。免疫分析已在临床实验室中成功用于检测蛋白质分析物数十年，但是这种方法仍然存在局限性。单克隆抗体的开发和制造是昂贵的。此外，存在公认的分析限制；例如，大多数免疫分析不能区分临床样品中存在的蛋白质的各种蛋白形式(proteoform)和变体。
在质谱(MS)检测之前的蛋白质的靶向富集是一种广泛使用的检测不同蛋白形式的方法。通常使用抗体进行富集，因为它们具有从富含蛋白质的基质(例如血浆)中选择性地富集目标蛋白质的能力。质谱免疫分析(MSIA)使用填装到移液器吸头中的涂覆抗体的珠，随后通过MALDI-MS检测完整蛋白质。另一种方法是MALDI目标蛋白质的抗体修饰。在SISCAPA(稳定同位素标准并且抗肽抗体捕获)和免疫-MALDI中，在消化(digestion，消解)后在肽水平上进行富集。肽水平富集给出更好的定量和改进的检测灵敏度。但是，受限的序列覆盖范围使翻译后修饰(PTM)和序列变体的检测复杂化。
期望对前述进行改进。
发明内容
本公开内容提供了“全合一(all-in-one)”盒，其含有必要的试剂和材料以从血液血浆中分离/预浓缩目标蛋白质并且将其离子化以用于质谱检测。在另一种配置中，盒还包括蛋白水解酶，以除了用于质谱检测的预浓缩和离子化外将蛋白质消化成较小的肽。
根据本公开内容的实施方案，提供了一种蛋白质检测盒。蛋白质检测盒包括：盖体，其包括开口；底座，其连接至盖体并且包括凹口；柱保持器，其可拆装地定位在开口中，该柱保持器包括配置为接收抗体柱的孔；废弃物垫，其可拆装地定位在柱保持器的下方和底座的凹口中；保持器，其可拆装地定位在底座中，该保持器包括凹口；以及固定酶的膜，其定位在保持器的的凹口中。
在另一个实施方案中，其中柱保持器在抗体柱定位于废弃物垫上方的第一位置和抗体柱与固定酶的膜接触并且定位于喷雾梢(尖端，tip)上方的第二位置之间可移动。在另一个实施方案中，柱保持器沿着盖体和底座之间的凹槽在第一位置和第二位置之间可移动。在另一个实施方案中，抗体柱包括配置为保留目标蛋白质的涂覆抗体的膜。在另一个实施方案中，将喷雾梢配置为向质谱仪提供样品，所述喷雾梢涂覆有碳纳米管处理的多孔聚乙烯。在另一个实施方案中，所述盒与电源连接。
在一个特别的实施方案中，提供了一种蛋白质检测盒。蛋白质检测盒包括：盖体，其包括开口；底座，其连接至盖体并且包括凹口；柱保持器，其可拆装地定位在开口中，该柱保持器包括配置为接收抗体柱的孔；废弃物垫，其可拆装地定位在柱保持器的下方，该废弃物垫可拆装地定位在底座的凹口中；保持器，其可拆装地定位在底座中，该保持器包括凹口；固定酶的膜，其定位在保持器的的凹口中；以及喷雾基底，其连接至保持器；其中柱保持器是能在盒内在第一位置和第二位置之间滑动的；并且其中在第一位置处抗体柱在废弃物垫的上方，并且在第二位置处抗体柱与固定酶的膜接触并且定位于喷雾基底上方。
在另一个实施方案中，喷雾基底涂覆有碳纳米管处理的多孔聚乙烯。在另一个实施方案中，抗体柱包括涂覆抗体的膜，以在抗体柱处于第一位置时保留样品的目标蛋白质。在另一个实施方案中，抗体柱在第二位置中在固定酶的膜的上方，并且固定酶的膜将蛋白质消化成肽。在另一个实施方案中，柱保持器是能沿着盖体和底座之间的凹槽在第一位置和第二位置之间移动的。在另一个实施方案中，喷雾基底连接至质谱仪。在另一个实施方案中，所述盒与电源连接。
在另一个实施方案中，提供了一种使用蛋白质检测盒进行质谱分析的方法。使用蛋白质检测盒进行质谱分析的方法包括：将蛋白质检测盒的柱保持器设置在第一位置，其中该柱保持器包括配置为接收抗体柱的孔；将血浆样品插入到蛋白质检测盒的抗体柱中，该血浆样品包含蛋白质；将洗涤缓冲液插入到抗体柱中；将柱保持器滑动至第二位置，在此处抗体柱在蛋白质检测盒的固定酶的膜的上方；以及将洗脱缓冲液插入到抗体柱中，其中蛋白质经由固定酶的膜消化而形成肽。
在另一个实施方案中，抗体柱包括涂覆抗体的膜，以在抗体柱处于第一位置时保留样品的目标蛋白质。在另一个实施方案中，该方法进一步包括将肽施加到喷雾基底上。在另一个实施方案中，喷雾基底涂覆有碳纳米管处理的多孔聚乙烯。在另一个实施方案中，喷雾基底连接至质谱仪。在另一个实施方案中，盒连接至电源。
在考虑以下说明性实施方案的详细描述后，本公开内容的另外的特征和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，所述说明性实施方案举例说明了目前所知的实施本公开内容的最佳模式。
附图说明
本公开内容的前述方面和许多预期的优点将变得更加容易被理解，因为当结合附图时，通过参考以下详细描述，其将变得更好理解，其中：
图1是根据本公开内容的用于完整蛋白质分析的盒的透视图；
图2是图1的盒的分解图；和
图3是根据本公开内容的用于蛋白质消化分析的盒的透视图；
图4是图3的盒的分解图；
图5是关于完整蛋白质分析的图1的盒的操作的示意图；
图6是关于蛋白质消化分析的图3的盒的操作的示意图；
图7与实施例1A相关，并且提供了来自质谱图的肽数据和提供的内插表；
图8A与实施例1B相关，并且提供了肽的使用10μm孔尺寸的膜获得的质谱数据；
图8B与实施例1B相关，并且提供了肽的使用5.0μm孔尺寸的膜获得的质谱数据；
图8C与实施例1B相关，并且提供了肽的使用1.2μm孔尺寸的膜获得的质谱数据；
图9A与实施例1C相关，并且提供了肽的用5μm孔尺寸的膜使用5％甲酸水性消化缓冲液获得的质谱数据；
图9B与实施例1C相关，并且提供了肽的用5μm孔尺寸的膜使用在20％甲醇消化缓冲液中的5％甲酸获得的质谱数据；
图10A与实施例1D相关，并且提供了通过10μm膜并且以10秒的消化时间消化的肌红蛋白的质谱数据；
图10B与实施例1D相关，并且提供了在溶液中以5分钟的消化时间消化的肌红蛋白的质谱数据；
图11与实施例1E相关，并且示出了使用固定胃蛋白酶的涂覆碳纳米管的聚乙烯(CNT-PE)梢获得的质谱数据；
图12A与实施例1F相关，并且示出了使用涂覆胃蛋白酶的CNT-PE梢获得的质谱；
图12B与实施例1F相关，并且示出了使用固定胃蛋白酶的膜获得的质谱；
图13A与实施例1G相关，并且示出了使用固定胃蛋白酶的膜作为过滤器的质谱数据；
图13B与实施例1G相关，并且示出了使用膜梢作为喷雾基底的质谱数据；
图14A与实施例1H相关，并且示出了仅胃蛋白酶的样品的质谱数据；
图14B与实施例1H相关，并且示出了仅肌红蛋白的样品的质谱数据；
图14C与实施例1H相关，并且示出了被胃蛋白酶样品消化5分钟的肌红蛋白的质谱数据；
图15A与实施例1I相关，并且示出了从在水性缓冲液中的胃蛋白酶消化获得的样品的质谱数据；
图15B与实施例1I相关，并且示出了从在20％甲醇缓冲液中的胃蛋白酶消化获得的样品的质谱数据；
图15C与实施例1I相关，并且示出了从在50％甲醇缓冲液中的胃蛋白酶消化获得的样品的质谱数据；
图16是不同喷雾基底的照片和SEM图像；
图17提供了说明TCEP-HCL还原的效果的质谱数据；
图18示出了通过使用纸喷雾(a，c)和涂覆CNT的PE基底(b，d)使10μg/mL肌红蛋白和0.1μg/mL的溶菌酶离子化而获得的全质谱数据；
图19示出了三种不同基底CNT-PE梢、涂覆CNT的纸梢和纸梢在施加高电压前后的照片；
图19A与实施例3相关，并且提供了从合并的人血浆样品获得的全MS谱图，其示出了全长、截短的ApoC1和截短的T45S变体；
图19B与实施例3相关，并且示出了较窄的MS扫描范围，其示出了从合并的人血浆获得的截短的ApoC1+6离子和截短的T45S变体+6离子；
图19C与实施例3相关，并且示出了较窄的MS扫描范围，其示出了从个体捐赠的血浆获得的截短的ApoC1+6离子；
图20A与实施例4相关，并且示出了人血浆血红蛋白的抗体盒分析，其中全MS谱图示出了带电状态为+11至+20的Hbα-/β-链离子。
图20B与实施例4相关，并且示出了人血浆血红蛋白的抗体盒分析，其中SIM谱图(m/z扫描窗口1.2Da)示出了非糖化Hb的相对强度；
图20C与实施例4相关，并且示出了人血浆血红蛋白的抗体盒分析，其中SIM谱图(m/z扫描窗口1.2Da)示出了糖化Hb的相对强度；
图21A与实施例5相关，并且示出了通过对来自野生型(wt)样品的人血浆进行抗体盒分析而获得的带电状态去卷积的MS谱图；和
图21B与实施例5相关，并且示出了通过对来自ATTR血浆样品的人血浆进行抗体盒分析而获得的带电状态去卷积的MS谱图。
在几个视图中，相应的附图标记指示相应的部分。尽管附图代表了根据本公开内容的各个特征和组件的实施方案，但是附图不一定按比例绘制，并且某些特征可被夸大以便更好地说明和解释本公开内容。本文阐述的示例说明了本公开内容的实施方案，并且这些示例不应被解释为以任何方式限制本公开内容的范围。
具体实施方式
出于促进对本公开内容的原理的理解的目的，现在将参考在附图中示出的实施方案，其在以下进行描述。以下公开的实施方案并非旨在是穷举的或将本公开内容限制为在以下详细描述中公开的精确形式。而是，选择和描述了实施方案使得本领域的其他技术人员可利用其教导。将理解，由此并不旨在限制本公开内容的范围。本公开内容包括在说明性装置以及所描述的方法和本公开内容的原理的进一步应用中的任何改变和进一步修改，这通常是本公开内容所属领域的技术人员会想到的。
本公开内容提供了“全合一”盒，其含有为了进行质谱检测而将目标蛋白质从血液血浆中分离/预浓缩并且将其离子化所需的试剂和材料。在另一种配置中，所述盒还包括蛋白水解酶，用于除了预浓缩和离子化外还将蛋白质消化成较小的肽以进行质谱检测。
参考图1和图2，示出了盒100。盒100可连接至电源106(例如高压电源)，并且盒100通常用于完整蛋白质分析。然而，可想到，盒100可用于其他的蛋白质分析方法(例如蛋白质消化)。盒100包括连接至底座104的盖体102。如图2所示，盖体102包括突出部105A，突出部105A被接收在凹口105B中以将盖体102连接至底座104。可想到，可使用其他连接方式将盖体102连接至底座104。盖体102包括开口101，其配置为接收柱保持器114和喷雾梢保持器122。柱保持器114可拆装地定位在开口101中，并且包括配置为接收抗体柱112的基本上圆形的孔116，抗体柱112包括用涂覆有胶乳珠-抗体缀合物的玻璃纤维膜填装的塑料管。柱保持器114还将吸收性废弃物垫120保持在孔116的下方。即，吸收性废弃物垫120可拆装地定位在底座104中。此外，吸收性废弃物垫120起到抽吸样品通过抗体柱112的作用。
盒100的所有部件组装在一起，并且柱保持器114沿着盖体102和底座104之间的凹槽117滑动，以将抗体柱112的位置从废弃物垫120上方(在该处发生样品添加和洗涤步骤)切换到喷雾基底108上方(在该处发生通过基底支持的电喷雾离子化的离子化)。
底座104包括凹口103，其配置为接收柱保持器114和吸收性废弃物垫120。底座104还包括与底座104一体形成的保持器122。保持器122配置为连接至喷雾梢或喷雾基底108，其中喷雾梢108起到将样品喷雾至质谱仪300(图5)的作用，如本文进一步详细描述。
现在参考图3和图4，示出了第二盒200。盒200通常用于蛋白质消化分析。然而，可想到，盒200可用于其他的蛋白质分析方法(例如完整蛋白质分析)。盒200除了对其加上100之外在其它方面与上述盒100基本上相似，其中盒200的符号类似于在盒100中使用的符号。如图4所示，盒200进一步包括定位在保持器222的凹口218中的固定酶的膜224。固定酶的膜224的作用是将目标蛋白质消化为肽，然后将其经由喷雾梢208送至质谱仪400(图6)，如下文进一步描述。
与盒100相似，盒200的所有部件组装在一起，并且柱保持器214沿着盖体202和底座204之间的凹槽217滑动，以将抗体柱212的位置从废弃物垫220上方(在该处发生样品添加和洗涤步骤)切换到固定酶的膜224和喷雾基底208上方(在该处发生通过基底支持的电喷雾离子化的离子化)。
盒100、200的长度范围为25mm至50mm，或更特别地为30mm至40mm。盒100、200的宽度范围为10mm至50mm，或更特别地为20mm至30mm。在一个实施方案中，盒100、200的长度为36mm并且宽度为22mm。
完整蛋白质检测/分析
通常，对于完整蛋白质检测/分析，将血浆样品添加至盒100。使用涂覆抗体的胶乳珠从血浆样品中预浓缩蛋白质目标。然后使用溶剂从所述珠上洗脱蛋白质目标。示例性溶剂包括：具有2％乙酸的甲醇:水50:50或具有5％甲酸的甲醇:水20:80。然后，将溶解有蛋白质目标的溶剂送到基底上，该基底使蛋白质离子化，用以随后的经由质谱仪300的质谱检测/鉴定(图5)。
盒100提供了一种质谱盒，其被设计用于靶向检测来自复杂生物流体(例如血浆)的蛋白质。蛋白质目标的选择性富集在没有泵送的情况下通过毛细管作用和重力在盒上被动地进行。然后，完整蛋白质目标的检测经由使用由涂覆碳纳米管(CNT)的多孔聚乙烯构成(组成)的内置喷雾基底108的蛋白质目标的离子化进行。在内置喷雾基底108的另一个实施方案中，多孔聚乙烯用碳溅射涂覆至约100nm的厚度。溅射涂覆提供喷雾基底108的更均匀和可再现的涂层。盒100提供一种简单、低成本的方法来实现廉价的横向流动分析与质谱分析的结合。
通过纸喷雾的蛋白质检测效率相对较差(报导过通过质谱(MS)检测从结合的抗体释放的带电探针的基于纸喷雾的免疫分析(J.Am.Chem.Soc.,2016,138(20),pp 6356–6359))。尽管此方法在一些情况下可具有更好的灵敏度，但是因为使用小分子进行检测，所以选择性最终受到抗体的限制。所述探针的检测无法给出关于抗原的任何信息，例如翻译后修饰(PTM)。已经报导就涂覆有CNT的纸以及尺寸排阻膜而言改进的蛋白质离子化，并且涂覆碳纳米管的纸已被用于低压纸喷雾。
在本公开中，已经对碳纳米管(CNT)处理的纸和CNT处理的多孔聚乙烯(PE)就它们离子化能力进行检查。喷雾基底的照片和扫描电子显微镜图像示于图16中。另外，如下表1所示，三种蛋白质的检测限因色谱纸涂覆或分散有单壁CNT而改进。
Figure BDA0002809400920000081
表1.通过纸和PE喷雾基底获得的蛋白质的检测限
涂覆CNT的PE进一步改进蛋白质检测；涂覆CNT的PE的检测限比使用CNT处理的纸获得的最佳检测限低8至100倍。如表1进一步所示，与典型的纸喷雾相比，蛋白质标准品的检测限提高50-1000倍。图18中示出了使用纸和涂覆CNT的PE获得的标准蛋白质溶液的质谱图。
如图19所示，与纸相比，由涂覆CNT的PE梢产生的Taylor锥明显更小。Taylor锥的尺寸与液滴尺寸相关，并且较小的电喷雾液滴与更好的离子化效率相关。因此，由涂覆CNT的PE基底引起的改进的蛋白质检测起因于对基底的表面能和溶剂的表面能进行平衡以产生更小的液滴和更高效的离子化。需要基底是能足够润湿的以允许为驱动流体和分析物传输所需的极性溶剂的芯吸，但不能是过于润湿的以致Taylor锥是大的。还发现，CNT-PE基底保留比纸少的蛋白质，但该差异相比于检测限的改进而言是小的(不重要的)。
为了实现对来自生物流体的目标蛋白质的选择性的且灵敏的检测，使用集成到盒100中的抗体柱112。在此方法(参考图5)中，使用含有胶乳珠-抗体缀合物-的膜进行蛋白质预浓缩。在阶段150，将血浆样品151添加至抗体柱112，在此处通过毛细管作用和重力的结合使血浆样品流动通过。过量的样品151被吸收到底部盒中的内置废弃物垫120中，而血浆样品151中的所述目标蛋白质部分保留在胶乳珠缀合物上。通过随后向预浓缩柱添加洗涤缓冲液153(例如水)，在阶段150还进行洗涤步骤，其中洗涤缓冲液153芯吸到废弃物垫120中。然后，通过将抗体柱112滑动至阶段152的抗体柱112在喷雾基底108上方的洗脱位置来检测蛋白质分析物，并且添加洗脱缓冲液或喷雾溶剂(例如具有2％乙酸的1:1甲醇/水)，其也可充当提取溶液。如本文进一步在实施例2C中所讨论的，在细胞色素c的情况下，所捕获的蛋白质的超过90％被洗脱。至少在本文讨论的实施例3-5中提供了进一步的讨论。
蛋白质消化分析
通常，对于蛋白质消化分析，在抗体预浓缩步骤和离子化步骤之间插入蛋白水解酶固定在其上的膜224。该涂覆酶的膜224将目标蛋白质消化成较小的肽片。然后，离子化通过与上述对于完整蛋白质工作相同的途径进行，且然后将该样品送往随后的经由质谱仪400的质谱检测/鉴定(图6)。
如图6所示，在阶段250，将稀释的血浆样品260添加至抗体柱212。样品260被芯吸通过抗体柱212和随后到容纳在盒200的底部内的吸收性垫220上。当样品260在指定的时间段内通过抗体柱212时，目标蛋白质253通过涂覆抗体的膜251保留在抗体柱212上，同时过量的基质被吸收到废弃物垫220上。然后，如阶段252所示，通过将洗涤缓冲液262(例如去离子水)施加至抗体柱212来洗涤保持在抗体柱212中的样品260；洗涤缓冲液262也芯吸通过柱212到达吸收垫220上。从抗体柱212收取目标蛋白质253，并且通过如下进行分析：将柱保持器214(以及抗体柱212)滑动到凹口218上方并且将抗体柱212向下推入到凹口218中，使得抗体柱212与固定酶的膜224接触并且定位于喷雾梢208的至少一部分而不是废弃物垫220的上方。将盒200放置在质谱仪400的入口402的前面，并且将洗脱缓冲液/喷雾溶剂264添加至富集柱212。喷雾溶剂264还充当提取缓冲液和消化缓冲液。溶剂264芯吸通过抗体柱212，从而在该过程中收取蛋白质。
随着收取的蛋白质穿过固定酶的膜224，目标蛋白质253被消化成肽255。然后肽溶液255流动到喷雾基底(喷雾梢208)上。通过从盒200的侧面插入的电线206向CNT-PE梢施加高压(典型地5kV)，从纸基底直接引发离子化。然后将盒放置在质谱仪400的入口的前面以用于肽鉴定。
与盒100相似，盒200提供了一种质谱盒，其被设计用于在盒上消化来自复杂生物流体(例如血浆)的目标蛋白质。蛋白质目标的选择性富集在没有泵送的情况下通过毛细管作用和重力在盒上被动地进行。富集的目标蛋白质被从涂覆抗体的膜上洗脱，然后在穿过固定酶的膜224时被消化成肽。然后，使用由涂覆碳纳米管(CNT)的多孔聚乙烯组成的内置喷雾基底，通过使蛋白质目标离子化来进行肽的检测。盒200提供了一种简单、低成本的方法来实现廉价的横向流动分析与质谱分析的结合。
蛋白质消化的一个优点是，本公开内容的方法将抗体预浓缩、消化和检测的步骤组合在单个盒上。另外，该方法提供来自消化的蛋白质的较小的肽的检测，这比通过完整蛋白质分析的检测更灵敏，因为与较小的肽相比，质谱分析(MS)在大分子如蛋白质的检测方面不太有效。此外，较小的肽的分析提升所使用仪器的灵活性，因为可使用低分辨率质谱仪(例如离子阱)。低分辨率仪器对于肽奏效，因为MS/MS或MS3(串联质谱)可用于鉴定肽。MS/MS通过使肽片段化来鉴定肽，并且可从MS/MS谱图测定序列。
相比之下，对于完整蛋白质分析，MS/MS就不有效得多，因为所分析的蛋白质要大得多，由此就蛋白质峰的鉴定需要高分辨率仪器(例如，轨道离子阱(orbitrap))。使用低分辨率离子阱而不是轨道离子阱的优点是离子阱便宜得多并且在肽鉴定方面更耐用。此外，与完整蛋白质相比，用肽进行蛋白质的定量分析可更准确和更容易地进行。
此外，盒200使得通过质谱分析能够由血浆样品进行靶向蛋白质检测。盒200允许蛋白质富集、消化和离子化在一个装置-盒200-内发生。由于与盒200有关的分析程序的简单性，因此盒200更好地实现蛋白质目标的基于质谱的检测，其可在临床诊断和其他领域中适用。
实施例
实施例1
用于蛋白质消化分析的样品的制备
为了制备用于蛋白质消化分析的样品，首先进行样品在膜上的胃蛋白酶固定。首先使10mL的0.02M聚(苯乙烯磺酸盐)(PSS)的0.5M NaCl溶液(pH＝2.3)以2mL/min通过直径25-mm的尼龙膜。然后，使30mL的去离子水以2mL/min的流速通过所述膜。随后，使4mL的在5％v/v甲酸(FA)中的2mg/mL胃蛋白酶以1mL/min循环通过所述膜1小时。在蛋白酶沉积后，将所述膜用30mL的5％v/v FA清洗以进行胃蛋白酶修饰。然后使膜干燥，并且在室温下储存。在测试之前，将膜切成直径为约5mm的圆盘。
在胃蛋白酶固定后，进行样品的离线蛋白质消化。在该实施例中，肌红蛋白通过穿过固定胃蛋白酶的尼龙膜而被消化。然后使用离心机将消化的样品收集到塑料瓶中，然后将消化的样品与甲醇以1:1v:v混合以用于使用具有碳纳米管涂覆的聚乙烯(CNT-PE)梢的delrin盒的离子化。
样品中的目标蛋白质使用消化盒200进行提取、消化和然后离子化，如图6所示。如图6所示，将稀释的人血浆样品(1:10稀释率，将20μL血浆通过180μL去离子水稀释)添加至抗体柱212。样品被芯吸通过抗体柱212，并且随后被吸到容纳在盒的底部内的吸收性废弃物垫上。当样品(在5分钟内)穿过抗体柱时，目标蛋白质通过涂覆抗体的膜251保留在抗体柱212上，同时过量的基质被吸收到废弃物垫上。然后通过将400μL的去离子水施加至抗体柱212来洗涤样品；去离子水也通过柱芯吸到吸收垫上。目标蛋白质从抗体柱212收取，并且通过如下进行分析：将柱保持器214(以及抗体柱212)滑动到凹口上方并且将抗体柱212向下推入到凹口中，使得抗体柱212接触固定酶的膜224(定位于五边形形状的CNT-PE基底208的上方)而不是废弃物垫。将盒放置在质谱仪的入口的前面，并且将喷雾溶剂(典型地具有5％乙酸的20:80甲醇:水)添加至富集柱的顶部。喷雾溶剂还充当提取缓冲液和消化缓冲液。溶剂被芯吸通过抗体柱，从而在该过程中收取蛋白质。
随着收取的蛋白质穿过固定酶的膜224，蛋白质样品被消化成肽。然后，肽溶液流动到喷雾基底208(喷雾梢208)上。通过从盒的侧面插入的电线向CNT-PE梢施加高压(典型地5kV)，从而从纸基底上直接引发离子化。在以下的质谱分析和数据处理中鉴定肽。
实施例1A–使用胃蛋白固定酶的膜获得的谱图
从谱图中鉴定了十几种来自肌红蛋白消化的肽，如图7所示。肽的详细信息标记在图和内插表中。观察不到完整蛋白质信号，这表明完整蛋白质的几乎全部被所述固定化酶消化。
实施例1B-膜孔尺寸对蛋白质消化的影响
通过使用10μm、5.0μm和1.2μm膜获得的谱图分别示于图8A-C中。消化效率随膜孔尺寸变小而增大。另外，使用较小的孔尺寸的膜观察到更多数量的具有较高强度的肽。在10μm膜的谱图中观察到蛋白质信号。在5.0μm和1.2μm膜的谱图中显示了相似的肽。但是，在1.2μm膜的谱图中较大的肽(例如m/z 1462，MW 8.7kDa)的强度降低，表明较小的孔尺寸提供了更完全的消化。
实施例1C-使用甲醇溶液作为消化缓冲液
在该实施例中，如图9A和9B所示，测试了20％和50％甲醇溶液作为用于所述膜实验的消化缓冲液。图9A和9B示出了使用水溶液和20％甲醇作为消化缓冲液的由5μm膜获得的谱图。如图所示，在50％甲醇缓冲液中未发生消化，这与在溶液中的实验相似。但是，在膜消化中，20％甲醇溶液如水性消化缓冲液那样奏效。
如从图9A和9B确定的，对于消化步骤和离子化步骤而言，20％甲醇和5％甲酸是有效溶剂。使一些甲醇存在于消化缓冲液中由于其极性而提供更有效的离子化步骤。换句话说，在没有一些极性有机溶剂(例如甲醇或乙腈)的情况下，离子化步骤不太有效。
实施例1D-消化效率通过使用固定化膜而显著提高
图10A和10B中所示的谱图是从通过固定化膜消化的样品中和在溶液实验中获得的。与溶液消化相比，固定化膜给出相似的I消化/I蛋白质的比率。但是，消化时间从5min减少至10s。因此，消化效率得以提高。另外，固定化膜与用于在线消化的MS柱兼容。
实施例1E-使用固定胃蛋白酶的CNT-PE梢获得的谱图
在该实施例中，测试了非共价方法“静电相互作用”。这也是用于将胃蛋白酶固定到尼龙膜上的方法。图11示出了使用固定胃蛋白酶的CNT-PE梢获得的谱图。将肌红蛋白溶液直接添加到喷雾梢上并且从喷雾梢上喷雾。m/z1045.85(+3)处的基峰是从肌红蛋白消化的肽。还可在该谱图中观察到肌红蛋白信号，例如m/z 893、m/z 942和m/z 998。
从该谱图中鉴定出的肽物种比膜上消化的物种(其为12种肽)少得多。通常，该谱图看起来像溶液中消化的谱图。消化效率显着低于膜上消化。测试了三种消化方法的消化效率[溶液中(5min)，膜上(～10s)，和喷雾梢上(立即)]，并且消化效率的等级为：膜上>>在CNT-PE梢上>＝在溶液中。
实施例1F-使用涂覆胃蛋白酶的CNT-PE梢获得的谱图
图12A和12B分别示出了使用涂覆胃蛋白酶的CNT-PE梢和固定胃蛋白酶的膜获得的谱图。在两个谱图中均观察不到肌红蛋白信号，表明胃蛋白酶消化的消化效率高。如前所述地处理固定胃蛋白酶的膜谱图(图12B)，并且鉴定出12种肽物种。在相对较低的m/z范围内发现在涂覆胃蛋白酶的梢的谱图中的肽信号(图12A)。
实施例1G-使用固定胃蛋白酶的5μm尼龙膜获得的谱图。
将固定胃蛋白酶的5μm尼龙膜切成喷雾梢，并且用于直接分析肌红蛋白样品。图13A和13B中所示的以下谱图证明了使用固定酶的膜圆盘作为过滤器(图13A)和使用固定酶的膜梢作为喷雾基底(图13B)之间的差异。
使用作为喷雾梢的膜导致较少的肽物种和较低的强度，尤其是对于分子量较大的肽。如图所示，图13A和13B标记了在两个谱图中鉴定出的3种肽。在图13A中，可鉴定9种其他的肽。
实施例1H-溶液中消化的数据
图14A-C中所示的谱图分别为仅胃蛋白酶、仅肌红蛋白和经胃蛋白酶消化5分钟的肌红蛋白。与仅胃蛋白酶的谱图(图14A)或仅肌红蛋白的谱图(图14B)相比，经胃蛋白酶消化5分钟的肌红蛋白的谱图(图14C)显示另外的一些峰。这些峰可归属于图中标记的一些蛋白质片段/肽。
实施例1I-甲醇比例对胃蛋白酶活性的影响
图15A-C中所示的以下谱图分别从在水性缓冲液、20％MeOH缓冲液和50％MeOH缓冲液中的胃蛋白酶消化获得。显示两个特征离子m/z 1045.85和m/z 865.53的强度。
与水性消化(图15A)相比，20％MeOH消化样品(图15B)显示具有就两种离子约一半的强度。相比之下，从50％MeOH消化样品中，所述离子均观察不到(图15C)。
实施例2
碳纳米管(CNT)的预处理。通过浸没在甲醇:水1:1(v:v)中并且超声处理15分钟(3X)，随后浸没在纯甲醇中并且超声处理15分钟(3X)来洗涤单壁碳纳米管粉末，然后以约10mg/mL的浓度作为浆料储存在纯甲醇中。
多孔聚乙烯(PE)的制备。将PE切成矩形(2.0cm X 0.5cm)，然后通过浸没在纯甲醇中并且涡旋1分钟(3X)，随后浸没在1:1甲醇:水中并且涡旋1分钟(3X)来洗涤。然后在施加CNT之前使洗涤的PE干燥。
分散CNT的喷雾基底的制备。将喷雾基底、色谱纸和多孔聚乙烯浸没在CNT浆料中并且超声处理30分钟。使分散CNT的喷雾基底干燥并且切成具有梢的五边形形状，如图16所示。
涂覆CNT的喷雾基底的制备。将纸基底和洗涤的PE薄片放置在吸收垫上，并且将CNT浆料(在甲醇中10mg/mL)吸移到喷雾基底的上表面上。在溶剂穿过喷雾基底到达吸收垫之后，大多数CNT停留在喷雾基底的表面上。涂覆CNT的纸基底在干燥后准备使用，并且切成具有梢的五边形形状。干燥后，向涂覆CNT的PE施加另外的处理。具体地，用抹布(wipe)抛光上表面以移除过量的CNT并且在PE基底上形成涂覆CNT的薄层，然后如多孔聚乙烯的制备中所述再次洗涤。使涂覆CNT的PE基底干燥，然后切成喷雾梢。为了形成喷雾梢，将矩形的一侧(短边)均匀地切成细三角点。
涂覆抗体的膜的制备。为了制备涂覆抗体的膜，将抗体涂覆到羧基胶乳珠上，制备涂覆抗体的膜(4片)的方案如下所述。在使用前将抗体和缓冲液温热至室温。
羧基胶乳的制备。移取50μL(40mg/mL，直径1.4μm)胶乳微球并且用150μL MES缓冲液稀释。然后，将混合物以3000转/分钟(rpm)离心5分钟以沉淀颗粒。然后移除上清液，并且将粒料重新分散在150μL MES缓冲液中。然后将混合物再次离心，并且从颗粒上移除上清液。然后将粒料通过涡旋重悬在100μL MES缓冲液中，以确保微球颗粒的完全悬浮。
抗体标记的胶乳珠的制备。
在以下步骤中提供了抗体标记的胶乳珠的制备：
1.将10mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDAC)粉末添加到以上制备的胶乳悬浮液中，并且在恒定涡旋下反应15min以活化胶乳珠。
2.离心混合物以沉淀活化的胶乳珠：3000rpm持续5min。
3.移除上清液，并且将粒料重新分散在100μL MES缓冲液中。
4.再次离心并且从颗粒上移除上清液。
5.再重复步骤3-4两次，进行总共3次洗涤。
6.通过涡旋将活化的胶乳珠重悬在50μL MES缓冲液中，以确保完全。
7.将抗体溶液(1mg/mL，250μL，10x过量)添加至以上制备的胶乳悬浮液。对于含有叠氮化钠的抗体溶液，在将抗体结合至胶乳珠之前，通过离心过滤器处理溶液以除去叠氮化物。
8.将胶乳/抗体混合物在室温下用温和混合培育5小时。
9.离心以将抗体标记的胶乳珠与未结合的抗体溶液分离。
10.移除并保留上清液，以制备更多的抗体标记的胶乳珠。
11.将珠重悬在100μL PBS缓冲液中。
12.再次离心以沉淀珠。
13.再重复步骤11-12两次，进行总共3次洗涤。
14.将最终的胶乳珠重悬在具有0.1％甘氨酸的100μL PBS缓冲液中。在4℃下储存直至使用。
将抗体标记的胶乳珠涂覆到玻璃-纤维膜上：将几个直径3-mm的玻璃纤维滤膜(截留(retention)为1.2μm)放置在吸收垫上。如上所述和制备，将重悬的最终的胶乳珠移液到膜上——每个膜25μL。使涂覆抗体的膜干燥并且放置在抗体柱的底部处。
样品制备。首先将标准蛋白质以1mg/ml的浓度溶解在水中，然后用喷雾溶剂(甲醇/水50:50v:v，具有2％乙酸)稀释至期望浓度。在制备蛋白质样品的同一天进行实验。
从K2EDTA处理的小瓶中将人血浆从供体人血液中分离，并且在-4℃下保存。ATTR样品在-20℃下储存并且在使用前恢复到室温。所有血浆样品均用PBS缓冲液按1:10稀释。购买的抗体使用离心过滤器纯化，以从储存缓冲液中除去叠氮化物。在使用前将所有血浆和缓冲液温热至室温。
实验方法。
使用纸和PE基底的直接喷雾离子化。标准蛋白质样品的检出限通过自PE基底的纸的直接喷雾离子化而获得。五角形基底的尺寸为约5mm×8mm(底×高度)。将标准蛋白质样品用具有2％乙酸的50:50(v:v)甲醇-水稀释至多种浓度。将20μL样品沉积至基底背面，并且通过毛细管作用芯吸通过基底到达梢。将纸或PE基底(其被切成尖点)定位在距质谱仪(图5)的大气压入口(302，图5)5mm处，然后将5kV的高压施加至喷雾基底，在基底的梢处引发电喷雾。溶剂从由电喷雾过程所产生的带电液滴中蒸发，留下分析物分子的气相离子，然后可通过质谱仪对其进行检测。
使用抗体盒的离子化。如图5的示意图所示，将稀释的人血浆样品(1:10稀释率，用180μL去离子水稀释的20μL血浆)添加至抗体柱。样品被芯吸通过抗体柱，并且随后被吸到容纳在盒的底部内的吸收垫上。当样品(5min内)穿过抗体柱时，目标蛋白质保留在抗体柱上，同时过量的基质被吸收到废弃物垫上。
然后通过将400μL的去离子水施加至抗体柱来洗涤样品；去离子水也通过柱芯吸到吸收垫上。目标蛋白质从抗体柱收取，并且通过如下进行分析：将柱保持器(以及抗体柱)滑动到上方并且将抗体柱向下推入，使得抗体柱与五边形形状的CNT-PE基底而不是废弃物垫接触。将盒放置在质谱仪的入口的前面，并且将提取/喷雾溶剂(典型地具有2％乙酸的1:1甲醇:水)添加至富集柱/抗体柱的顶部。溶剂被芯吸通过抗体柱，在该过程中收取蛋白质，并且被动地吸到喷雾基底上。
为了检测血浆TTR，将25mM TECP-HCl添加至喷雾溶剂以进行TTR翻译后修饰的在线还原。在离子化之前，使还原反应在盒上进行5分钟。
通过从盒的侧面插入的电线向CNT-PE梢施加高压(典型地5kV)，从而直接从纸基底上引发离子化。
质谱分析、数据收集和数据处理。如本文进一步描述的实施例2的实验用QExactive Focus质谱仪(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA,USA)进行。仪器参数如下：所有实验均为正离子模式；喷雾电压典型地为5kV，在不同情况下喷雾电压可有所不同以使喷雾电流处于～0.2μA；分辨率70,000；AGC目标1e6；最大注射时间100ms；毛细管温度320℃；和S-镜头RF水平60.0。在从稀释的人血浆样品中检测载脂蛋白、血红蛋白和运甲状腺素蛋白时，源内CID设置为25.0eV，Microscans对于全MS扫描设置为1并且对于SIM扫描设置为5，SIM扫描窗口对于载脂蛋白为7.0Da并且对于血红蛋白为1.2Da。使用软件MagTran生成人血浆运甲状腺素蛋白的去卷积MS谱图。
实施例2A.甲状腺素(TTR)翻译后修饰的还原
TTR翻译后修饰的还原是在蛋白质提取步骤期间进行的。将三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)掺入到浓度为25mM的喷雾溶剂(具有2％乙酸的甲醇:水1:1v:v)中。如图17所示，在TCEP-HCl还原后，一些高相对丰度的翻译后修饰(例如S半胱氨酸和S-谷胱甘肽)减少。游离硫醇野生型TTR的相对信号强度显着增加。但是，翻译后修饰S-磺化在谱图中仍存在。此外，增加TCEP-HCl的浓度(从25mM到50mM)或还原时间(从5min到20min)并未从样品中除去S-磺化TTR。
然后以5分钟通过在喷雾溶剂中25mM TCEP-HCl优化还原时间。还原大大简化了人血浆TTR以及突变体(mutant)的数据分析和定量。另外，TCEP-HCl还原显着减少了血浆TTR的翻译后修饰，并且增强了游离硫醇野生型TTR的MS响应。
实施例2B-通过喷雾基底的蛋白质截留
将来自马心脏的3μg/mL的细胞色素C的80μL等分试样溶解在喷雾溶剂中，并且以与典型分析一致的方式穿过纸喷雾基底或CNT-PE喷雾基底。从每个喷雾基底中收取50μL等分试样，并且将等分试样掺入0.5μg的内标蛋白质(来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的细胞色素c)。可使用以下公式比较两种基底的收取率：
Figure BDA0002809400920000171
其中
Figure BDA0002809400920000172
是两种基底之间的相对收取率，并且AUCA和AUCL分别是分析物和内标物的曲线下面积。在细胞色素C的情况下，
Figure BDA0002809400920000173
为1.8±0.2(N＝5)，表明从CNT-PE基底收取的蛋白质为从纸基底收取的量的约两倍。这表明纸比CNT-PE截留更多的目标蛋白质。因为CNT-PE基底的细胞色素C的检测限比纸低约300X，所以相较于离子化效率的改善，较低的CNT-PE截留是相对次要的贡献因素(contributor)。
实施例2C-捕获的蛋白质的收取
为了确定从抗体柱中捕获的蛋白质的洗脱效率，通过1.2mL的10μg/mL细胞色素c(马心脏)水溶液将涂覆抗体的胶乳珠进行离线培育。然后将珠洗涤3次并且分成六个相等的等分试样。将它们的三个以和典型分析相同地涂覆至膜圆盘。使用具有2％乙酸的甲醇:水1:1(v:v)离线提取其他三个10分钟同时涡旋。对于两个样品，将内标物(来自酿酒酵母的细胞色素C，0.6μg)掺入到洗脱/喷雾溶剂中。
使用以上方程式1将用于盒分析的直接洗脱方法与离线收取相比。发现
Figure BDA0002809400920000181
为0.94(N＝3)，表明，相比于在蛋白质盒中使用的直接洗脱方法，延长的离线提取不再洗脱蛋白。
在第二实验中，涂覆胶乳珠的膜在分析之后从盒中移出，并且对其进行如上所述的离线提取。在离线提取中检测不到蛋白质。这表明在直接洗脱期间，蛋白质的几乎全部从珠上洗脱。
实施例3–载脂蛋白c1的T45S变体(与体重指数和肥胖症有关的多态变体)的鉴定
载脂蛋白C1(ApoC1)T45S变体是一种天然存在的氨基酸多态变体，其与体重指数升高和糖尿病有关。如图19A所示，在从合并的人血浆样品获得的质谱(MS)谱图中鉴定出三种ApoC1物种，包括全长ApoC1(6.6kDa)，截短的ApoC1(减去氨基末端Thr-Pro，6.4kDa)和截短的T45S变体(Δm＝-14.03Da)。T45S变体在合并的血浆样品中的检测表明，所述血浆的一些来自具有ApoC1 S45等位基因的个体(图19B)。该蛋白质盒还用于分析来自单个供体的血浆；质谱表明，单个供体没有该等位基因(图19C)。与计算的准确质量相比，检测的T45S变体的质量误差为0.0056Da。这些结果表明，该方法对于快速检测ApoC1 T45S变体具有良好的潜力。
实施例4–血红蛋白(Hb)A1C(糖尿病的标志物)的相对定量
糖化血红蛋白是一种稳定的次要Hb变体，其在体内通过葡萄糖的非酶促共价连接形成。数十年来，特定Hb级分HbA1c的相对定量一直用作糖尿病的血糖控制的标志物。如图20A-C所示，使用蛋白质检测盒鉴定了几种血红蛋白物种，例如未糖化的α-/β-链(图20A)和糖化的α-/β-链(图20A内插谱图)。使用+15带电状态的单离子监测(SIM)监测Hb和糖化Hb，如图20B和20C所示。检测到的未糖化Hbβ-链和糖化Hbβ-链的质量误差分别为0.012Da和-0.079Da。与未糖化Hb相比，糖化Hb的相对强度为～7％，其与预期比例相似。结果表明该方法，对于Hb和HbA1c的相对定量具有潜力。
实施例5–运甲状腺素蛋白(TTR)的序列变体(运甲状腺素蛋白相关的遗传性淀粉样变性病的标志物)的鉴定
运甲状腺素蛋白(TTR)是一种55kDa的同源四聚体蛋白质，其可在血液和脑脊髓液中转运甲状腺素和视黄醇。野生型(wt)和突变型运甲状腺素蛋白(TTR)的错误折叠和聚集是运甲状腺素蛋白淀粉样变性病(ATTR)的病因，运甲状腺素蛋白淀粉样变性病是一种严重且致命的疾病，其特征是TTR淀粉样蛋白的异常沉积。使用质谱分析来筛选ATTR。抗体盒成功用于检测来自人血浆样品的wt TTR以及各种TTR突变体。
图17示出了对于wt TTR的+10带电状态获得的质谱。未修改的TTR为相对较少的组分；半胱氨酸、谷胱甘肽和磺酸盐PTM都更强。为了减少质谱的复杂性，将还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)掺入到喷雾溶剂中。尽管S-磺化残留，但该程序在消除S-半胱氨酸和S-谷胱甘肽修饰方面取得成功(图17)，所述程序在提取/喷雾溶剂中在盒上进行而没有分离的步骤。六个ATTR临床样品中的四种不同的TTR突变体清楚地被鉴定，并且区别于wtTTR。图21A和21B示出由wt样品(图21A)和代表性ATTR样品(图21B)获得的带电状态去卷积的质谱。来自ATTR样品的谱图(图21B)表明，患者就野生型TTR和Δm为32.00Da的TTR变体是杂合的。该质量偏移与甲硫氨酸的缬氨酸-30取代是一致的，这是TTR相关的神经病中最常见的突变。
尽管已经将本公开内容描述为具有示例性设计，但是可在本公开内容的精神和范围内进一步修改本公开内容。因此，本申请旨在涵盖体使用其一般原理的本公开内容的任何变化、使用或适应。此外，本申请旨在覆盖体在本公开内容所属的并且落入所附权利要求的限制内的领域中已知或惯常实践之内的与本公开内容的偏离。

Claims (12)

1.蛋白质检测盒，其包括：
盖体，其包括开口；
底座，其与盖体连接并且包括凹口；
柱保持器，其可拆装地定位在所述开口中，该柱保持器包括配置为接收抗体柱的孔；
废弃物垫，其可拆装地定位在柱保持器下方且在底座的凹口中；
保持器，其可拆装地定位在底座中，该保持器包括凹口；以及
固定酶的膜，其定位在保持器的凹口中。
2.如权利要求1所述的蛋白质检测盒，其进一步包括与保持器连接的喷雾基底；其中柱保持器能在第一位置和第二位置之间移动，所述第一位置为抗体柱定位于废弃物垫上方之处，所述第二位置为抗体柱与固定酶的膜接触且定位于喷雾基底上方之处。
3.如权利要求2所述的蛋白质检测盒，其中柱保持器是能沿着盖体和底座之间的凹槽在所述第一位置和所述第二位置之间移动的。
4.如权利要求1所述的蛋白质检测盒，其中抗体柱包括配置为保留目标蛋白质的涂覆抗体的膜。
5.如权利要求2所述的蛋白质检测盒，其中喷雾基底配置为向质谱仪提供样品，所述喷雾基底涂覆有碳纳米管处理的多孔聚乙烯。
6.如权利要求1所述的蛋白质检测盒，其中所述盒与电源连接。
7.如权利要求2所述的蛋白质检测盒，其中喷雾基底涂覆有碳纳米管处理的多孔聚乙烯。
8.如权利要求2所述的蛋白质检测盒，其中抗体柱包括用于在抗体柱在第一位置处时保留样品的目标蛋白质的涂覆抗体的膜。
9.如权利要求2所述的蛋白质检测盒，其中抗体柱在第二位置处在固定酶的膜的上方并且固定酶的膜将蛋白质消化成肽。
10.如权利要求2所述的蛋白质检测盒，其中所述喷雾基底与质谱仪连接。
11.使用如权利要求1至10任一项所述的蛋白质检测盒进行质谱分析的方法，其包括：
将蛋白质检测盒的柱保持器设置在第一位置处；
将血浆样品插入到蛋白质检测盒的抗体柱中，该血浆样品包含蛋白质；
将洗涤缓冲液插入到抗体柱中；
将柱保持器滑动至第二位置处，在此处抗体柱在蛋白质检测盒的固定酶的膜的上方；以及
将洗脱缓冲液插入到抗体柱中，其中经由固定酶的膜将所述蛋白质消化而形成肽。
12.如权利要求11所述的方法，其进一步包括将肽施加到喷雾基底上。
CN201980036946.4A 2018-04-11 2019-04-11 用于质谱分析的盒、系统和方法 Active CN112261975B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862656306P 2018-04-11 2018-04-11
US62/656,306 2018-04-11
PCT/US2019/027082 WO2019200166A1 (en) 2018-04-11 2019-04-11 Cartridges, systems and methods for mass spectrometry

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112261975A CN112261975A (zh) 2021-01-22
CN112261975B true CN112261975B (zh) 2022-09-13

Family

ID=68162993

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980036946.4A Active CN112261975B (zh) 2018-04-11 2019-04-11 用于质谱分析的盒、系统和方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11998907B2 (zh)
EP (1) EP3762118B1 (zh)
CN (1) CN112261975B (zh)
WO (1) WO2019200166A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021086954A1 (en) * 2019-10-29 2021-05-06 Quantum-Si Incorporated Methods and devices using cartridges for sequencing
CN114078687B (zh) * 2020-08-20 2023-03-21 中国科学院化学研究所 一种毛细管纸喷雾离子源装置及离子生成方法
IT202100010313A1 (it) * 2021-04-22 2021-07-22 Addlab Soc Cooperativa Kit per il controllo di qualita’ dei radiofarmaci iniettabili a scopo diagnostico o terapeutico
CN114582704B (zh) * 2022-02-15 2024-09-17 陈锂 纸喷雾装置及质谱检测系统

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101782581A (zh) * 2002-10-03 2010-07-21 诺曼·利·安德森 用质谱法高灵敏度定量肽

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6399023B1 (en) * 1996-04-16 2002-06-04 Caliper Technologies Corp. Analytical system and method
EP1208189B1 (en) 1999-05-28 2004-10-06 Cepheid Device and method for analysing liquid samples
US7070682B2 (en) * 2001-01-16 2006-07-04 Cheng Lee Microfluidic apparatus for performing gel protein extractions and methods for using the apparatus
US7166441B2 (en) * 2002-03-12 2007-01-23 Perseptive Biosystems Inc. Method and apparatus for the identification and quantification of biomolecules
GB0226160D0 (en) * 2002-11-08 2002-12-18 Diagnoswiss Sa Apparatus for dispensing a sample in electrospray mass spectrometers
US20060257991A1 (en) 2004-02-27 2006-11-16 Mcdevitt John T Integration of fluids and reagents into self-contained cartridges containing particle-based sensor elements and membrane-based sensor elements
US9500572B2 (en) * 2009-04-30 2016-11-22 Purdue Research Foundation Sample dispenser including an internal standard and methods of use thereof
JP5813638B2 (ja) * 2009-07-30 2015-11-17 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 可動クロマトグラフィーカラムセパレータ
US20160169892A1 (en) * 2014-12-10 2016-06-16 Hong Ke Monoclonal antibodies, hybridoma cell lines, methods and assays for detecting fungal phytase
EP3257066A4 (en) * 2015-02-10 2018-10-03 Indiana University Research & Technology Corporation Device and method for analysis of biofluids by ion generation using wetted porous material
JP6655245B2 (ja) * 2015-11-20 2020-02-26 学校法人慶應義塾 タンパク質又は病原体の検出用カートリッジおよび自動検出装置
CN105879938B (zh) * 2016-04-05 2017-12-15 中国水稻研究所 用于蛋白质质谱在线分析的pmma芯片及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101782581A (zh) * 2002-10-03 2010-07-21 诺曼·利·安德森 用质谱法高灵敏度定量肽

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Targeted Protein Detection using an All-In-One Mass Spectrometry Cartridge";Chengsen Zhang等;《Journal of the American Chemical Society》;20170731;10996-10999 *

Also Published As

Publication number Publication date
US11998907B2 (en) 2024-06-04
EP3762118B1 (en) 2023-06-07
EP3762118A1 (en) 2021-01-13
CN112261975A (zh) 2021-01-22
EP3762118A4 (en) 2021-12-15
US20210387175A1 (en) 2021-12-16
WO2019200166A1 (en) 2019-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112261975B (zh) 用于质谱分析的盒、系统和方法
Gobom et al. Sample purification and preparation technique based on nano‐scale reversed‐phase columns for the sensitive analysis of complex peptide mixtures by matrix‐assisted laser desorption/ionization mass spectrometry
JP6258707B2 (ja) 質量分析によるインスリンの定量
US6995363B2 (en) Reduction of matrix interference for MALDI mass spectrometry analysis
US20220349897A1 (en) Amyloid beta detection by mass spectrometry
US7700364B2 (en) Analysis of amino acids in body fluid by liquid chromatography-mass spectrometry
Gevaert et al. Peptides adsorbed on reverse‐phase chromatographic beads as targets for femtomole sequencing by post‐source decay matrix assisted laser desorption ionization‐reflectron time of flight mass spectrometry (MALDI‐RETOF‐MS)
Kjellström et al. In situ liquid− liquid extraction as a sample preparation method for matrix-assisted laser desorption/ionization ms analysis of polypeptide mixtures
US20210333291A1 (en) AUTOMATIC SAMPLE WORKFLOW FOR LC-MS BASED HbA1c MEASUREMENT ON INTACT PROTEIN LEVEL
US20050196789A1 (en) Preparation of biologically derived fluids for biomarker determination by mass spectrometry
JP4188229B2 (ja) 細胞内に存在するタンパク質又は当該タンパク質と相互作用する物質を分析する方法
US20130005050A1 (en) Glucagon detection and quantitation by mass spectrometry
EP3911959A1 (en) High speed sample workflow for lc-ms based hba1c measurement
US11885780B2 (en) Methods for detecting chromogranin a by mass spectrometry
US20240159631A1 (en) Method for detecting at least one analyte in a sample
Steckel et al. Detection of protein posttranslational modifications by mass spectrometry
Böddi Investigations of non-enzymatic glycation with new bioanalytical methods
Katalin Investigations of non-enzymatic glycation with new bioanalytical methods
Larsen et al. Proteome Specific Sample Preparation Methods for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry
Jensen et al. Peptide Sequencing by Nanoelectrospray Tandem Mass Spectrometry
Young Development of novel interfaces for combining liquid chromatography with matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant