DE102010022929A1

DE102010022929A1 - Verfahren zum Herstellen einer Bilipidschicht sowie Mikrostruktur und Messanordnung

Info

Publication number: DE102010022929A1
Application number: DE102010022929A
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr. Behrends Jan C.; Dr. Baaken Gerhard
Original assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Current assignee: Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date: 2010-06-07
Filing date: 2010-06-07
Publication date: 2011-12-08
Anticipated expiration: 2030-06-08
Also published as: DE102010022929B4; EP2577301A2; JP2013534619A; US20130140192A1; WO2011154114A3; WO2011154114A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen einer Bilipidschicht über einer einseitig offenen Mikrokavität sowie auf eine Mikrostruktur zum Untersuchen von Lipiddoppelschichten und eine diesbezügliche Messanordnung. Das Verfahren zum Herstellen einer Bilipidschicht über einer einseitig offenen Mikrokavität umfasst die folgenden Schritte: Befüllen der Mikrokavität mit einer Elektrolytlösung; Bewegen eines gelöste Lipide enthaltenden Fluids in einer ersten Richtung auf die Mikrokavität zu; Bewegen des Fluids in einer zweiten Richtung von der Mikrokavität weg; Überwachen des Ausbildens der Bilipidschicht über der Mikrokavität durch Erfassen einer Impedanz zwischen einer mit dem Fluid verbundenen Gegenelektrode und einer Messelektrode, die im Inneren der Mikrokavität angeordnet ist. Die Mikrostruktur weist ein Substrat auf, in welchem mindestens eine Mikrokavität ausgebildet ist, wobei im Inneren der Mikrokavität mindestens eine Messelektrode angeordnet ist und wobei die mindestens eine Mikrokavität so mit einem Fluidkanal verbunden sein kann, dass die Mikrokavität von einem laminaren Fluidstrom mit mindestens zwei unterschiedlichen Strömungsrichtungen überströmt werden kann.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur erleichterten Herstellung einer Bilipidschicht über einer einseitig offenen Mikrokavität sowie auf eine Mikrostruktur und eine Messanordnung, die diese Art der vereinfachten und erleichterten Herstellung von Lipiddoppelschichten ermöglichen.
Synthetische Bilipidschichten sind aus vielen Gründen für Forschung und Industrie interessant. Sie sind Modelle für Zellmembranen, an denen die biologischen Funktionen von rekonstituierten Membranproteinen besonders präzise untersucht werden können. Nachdem mit Hilfe dieses Modellsystems bereits kurz vor der Entwicklung der so genannten Patch-Clamp-Technik Ströme durch einzelne Ionenkanälen in Membranen gemessen wurden, erfährt es gerade in den letzten Jahren eine zunehmende Renaissance. Ein Grund dafür ist die erfolgreiche Miniaturisierung von Systemen zur Herstellung von und Messung an solchen Bilipidschichten [siehe z. B.: Wonderlin, W. F.; Finkel, A.; French, R. J., Biophys J, 1990 58, (2), 289–297; Akeson, M.; Branton, D.; Kasianowicz, J. J.; Brandin, E.; Deamer, D. W., Biophys J, 1999 77, (6), 3227–3233; Pantoja, R.; Sigg, D.; Blunck, R.; Bezanilla, F.; Heath, J. R., Biophys J, 2001 81, (4), 2389–239; Pantoja, R.; Nagarah, J. M.; Starace, D. M.; Melosh, N. A.; Blunck, R.; Bezanilla, F.; Heath, J. R., Biosens Bioelectron, 2004 20, (3), 509–517; Fertig, N.; Meyer, C.; Blick, R. H.; Trautmann, C.; Behrends, J. C., Phys Rev E, 2001 6404, (4),; Fertig, N.; Klau, M.; George, M.; Blick, R. H.; Behrends, J. C., Appl Phys Lett, 2002 81, (25), 4865–4867; Fertig, N.; Blick, R. H.; Behrends, J. C., Biophys J, 2002 82, (6), 3056–3062; Mayer, M.; Kriebel, J. K.; Tosteson, M. T.; Whitesides, G. M., Biophys J, 2003 85, (4), 2684–2695; Malmstadt, N.; Nash, M. A.; Purnell, R. F.; Schmidt, J. J., Nano Lett, 2006 6, (9), 1961–1965; Sondermann, M.; George, M.; Fertig, N.; Behrends, J. C., Bba-Biomembranes, 2006 1758, (4), 545–551; Basken, G.; Sondermann, M.; Schlemmer, C.; Ruhe, J.; Behrends, J. C., Lab Chip, 2008 8, (6), 938–44]. Neben einer dadurch deutlich gesteigerten Messauflösung hinsichtlich Zeit und Amplitude eröffnete diese Miniaturisierung zum anderen die Perspektive eines durch Parallelisierung stark erhöhten Durchsatzes an Messungen pro Zeit.
Von Seiten der Nachfrage ist die Renaissance durch mindestens zwei Faktoren bedingt, nämlich die Notwendigkeit, für das pharmakologische Wirkstoff-Screening Kanal- und Transporterproteine zu untersuchen, die für die Patch-Clamp-Technik nicht oder kaum zugänglich sind (insbesondere Proteine in Membranen intrazellulärer Organellen und die zunehmende Verwendung von bakteriellen Poren als molekulare Coulter-Counter und Nanoreaktoren für Einzelmolekülanalytik (z. B. Massenspektroskopie von Polymeren oder DNA-Sequenzierung durch die Firma Oxford Nanopore Technologies).
Das Potential der miniaturisierten Bilipidschichten für Hochdurchsatzuntersuchungen konnte bisher allerdings nicht ausreichend technisch genutzt werden. Wie z. B. in der Dissertation Basken, Gerhard: „Entwicklung einer mikrosystemtechnischen Plattform für parallele Untersuchungen von Ionenkanälen in artifiziellen Zellmembranen", Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2008, ausgeführt, wurden in den letzten Jahren zwar mit der Entwicklung chip-basierter planarer Patch-Clamp-Technologien hinsichtlich Miniaturisierung und Integrationsdichte für hochparallele Messungen an Zellmembranen neue Maßstäbe gesetzt; bisher fehlte für Hochdurchsatzuntersuchungen an synthetischen Membranen jedoch vor allem eine einfache und reproduzierbare sowie gut automatisierbare Lösung für die Herstellung der Doppellipidschichten. Dies ist mit der vorliegenden Erfindung nunmehr gelungen. Das neuentwickelte Verfahren zur automatisierten Herstellung von Bilipidschichten auf mikrostrukturierten Kavitäten ermöglicht es auf sehr einfache Weise, bestehende Geräte für Hochdurchsatz-Elektrophysiologie zu adaptieren, um in kurzer Zeit ein vollständiges System für vollständig automatisierte, parallele Messungen an Bilipidschichten bereitzustellen.
Zusammengefasst werden durch das hier vorzustellende Verfahren grundsätzliche praktische Schwierigkeiten und Nachteile hinsichtlich der Generierung von freistehenden Lipiddoppelschichten, wie sie zur Beantwortung von fundamentalen Fragen der Elektrophysiologie sowie für das pharmakologische Wirkstoff-Screening von Interesse sind, überwunden.
Bisherige Lösungen haben vor allem die nachfolgend erläuterten Nachteile.
Ein wesentlicher Schritt hin zur Automatisierung von elektrophysiologischen Untersuchungen an zellphysiologischen Modellmembranen im Allgemeinen und im weiteren an Membranproteinen ist es, eine Methode zu entwickeln, mit deren Hilfe das Erzeugen von freistehenden Lipiddoppelschichten über (kleinen) Aperturen ohne ein Eingreifen durch den Experimentator in reproduzierbarer Weise unkompliziert realisiert werden kann.
Für das Aufbringen von Lipiddoppelschichten auf eine Oberfläche oder über eine Apertur haben sich in den letzten dreißig Jahren zwei grundsätzliche Verfahren etabliert: Die Streichtechnik (engl.: painting-technique, siehe z. B. Müller et al., Z Kreislaufforschung, 1963, 52 (7) 534 ff.), und die Langmuir-Blodgett-Technik.
Die Streichtechnik ist zwar äußerst einfach anwendbar, ihr Erfolg hängt aber fast ausschließlich von der manuellen Geschicklichkeit des Experimentators ab, und deshalb erscheint eine Automatisierung dieser Methode sehr schwierig.
Das Aufbringen mit Hilfe der Langmuir-Blodgett-Technik und daraus entwickelter oder verwandter Methoden findet weitgehend beim Transfer von definierten mono- oder multimolekularen Schichten auf eine Substratoberfläche Verwendung. Die Autoren des Artikels Takagi, M. A., K.; Kishimoto, U., Annu. Report Biol. Works Fac. of Sci. Osaka Univ, 1965 13, 107–110, und später die Autoren des Artikels Montal, M.; Mueller, P., Proceedings of the National Academy of Sciences, 1972 69, (12), 3561–3566, vereinfachten diese Technik, so dass diese heute in vielen Experimenten für die Herstellung von Bilipidmembranen angewandt wird, wie dies z. B. in dem Artikel Danelon, C.; Lindemann, M.; Bonin, C.; Fournier, D.; Winterhalter, M., IEEE Transactions Nanobioscience, 2004 3, (1), 46–48, gezeigt ist.
Grundsätzlich wird bei diesem Verfahren zunächst eine Apertur in einer dünnen hydrophoben Substratfolie, welche zwei Kompartimente separiert, von beiden Seiten durch Befüllen mit einem Elektrolyten benetzt. Anschließend wird ein Tropfen Lipidlösung direkt auf die Oberfläche der wässrigen Elektrolytphase in einem der Kompartimente aufgegeben und dann gewartet, bis der größte Teil des Lösungsmittels verdampft ist. Danach wird der Wasserspiegel durch Entnahme von Elektrolytvolumen bis unter die Apertur abgesenkt und wieder angehoben. An der Öffnung bildet sich in Folge der hydrophoben/hydrophilen Wechselwirkungen eine Lipiddoppelschicht aus. Allerdings ist ein direktes Übertragen dieses Verfahrens auf planare Substrate, wie sie für eine Automatisierung unerlässlich erscheinen, nur bedingt möglich. Schwierig gestaltet sich hierbei vor allem die Handhabung, da der gesamte Versuchsaufbau nach dem Erzeugen der Lipidmembran vollständig in wässriger Lösung gelagert werden muss.
Die Autoren des Artikels Malmstadt, N.; Nash, M. A.; Purnell, R. F.; Schmidt, J. J., Nano Lett, 2006 6, (9), 1961–1965, nutzen mikrostrukturierte Kanäle in Poly-(dimethylsiloxan), PDMS, um eine Lipidmembran zu erzeugen. In diesem Ansatz wird die Permeabilität von PDMS für verschiedene Lösungsmittel genutzt, um durch Diffusion und Verdunstung ein in einen Mikrokanal eingebrachtes Volumen an Lipidlösung kontinuierlich zu verkleinern und dadurch eine Lipidmembran zwischen zwei wässrigen Phasen zu erzeugen.
Bei dem Ansatz von Suzuki, H.; Tabata, K. V.; Noji, H.; Takeuchi, S., Langmuir, 2006 22, (4), 1937–1942, und insbesondere bei der von den Autoren des Artikels Sandison, M. E.; Zagnoni, M.; Abu-Hantash, M.; Morgan, H., J Micromech Microeng, 2007 17, (7), S. 189–196, entwickelten so genannten Air-Exposure-Technik werden zunächst beide Seiten einer vergleichsweise großen Apertur (> 100 μm) mittels mikrofluidischer Zuläufe oder Zupipettieren mit Elektrolytlösung benetzt. Anschließend wird analog zur Streichtechnik an der Öffnung ein Tropfen Lipidlösung abgesetzt oder durch einen mikrofluidischen Kanal zugeführt Die wässrige Phase wird auf einer Seite abgesaugt, was ein definiertes Verdampfen des Lösungsmittels an der Luft ermöglicht. Durch Wiederdispensieren/Zuleiten eines Wassertropfens auf die Apertur wird die Membran konserviert.
Allen diesen bekannten Ansätzen ist allerdings gemein, dass die Lipiddoppelschichten nur durch Wechselwirkungen an der Luftphase oder komplizierten (mikro-)fluidischen Zugängen von beiden Seiten, vorzugsweise mit makroskopischen Pumpen, erzeugt werden können. Zudem stellen die konventionellen Verfahren sehr spezielle Anforderungen an den experimentellen Aufbau. Auch wird der Aufwand zur Steuerung und Kontrolle elektrophysiologischer Experimente erheblich gesteigert. Diese bekannten Verfahren sind methodisch nicht in der Lage, grundsätzliche praktische Probleme im Hinblick auf Automatisierbarkeit, Geschwindigkeit und Anwendbarkeit bei der Generation von Lipiddoppelschichten zu lösen. Insbesondere sind sie nicht geeignet, Lipiddoppelschichten auf sehr kleinen, fluidisch nur einseitig zugänglichen Aperturen zu erzeugen, die allein für Hochdurchsatzapplikationen in Frage kommen.
Weiterhin ist aus der WO 2009/069608 A1 ein Verfahren zum Herstellen eines planaren Lipiddoppelschichtmembranarrays bekannt, bei dem durch kammförmige Strukturen Mikrokammern gebildet werden, die jeweils in einen Mikrokanal münden. Durch sequenzielles Einleiten von Pufferlösung und Lipidlösung mittels einer Mikrospritze werden Lipiddoppelschichten in dem Grenzbereich zwischen Mikrokanal und Mikrokammer ausgebildet. Für eine Automatisierung der Herstellung von Lipiddoppelschichten, insbesondere bei geplanten Anwendungen in Hochdurchsatzuntersuchungen, ist das in diesem Dokument gezeigte System und Verfahren zum Herstellen der Bilipidschichten bei Weitem nicht reproduzierbar und zuverlässig genug. Vor allem aber ist es bei der bekannten Mikrostruktur, die in der WO 2009/069608 A1 gezeigt ist, nicht möglich, die Bildung einer Bilipidschicht eindeutig, d. h. durch elektrische Messung nachzuweisen, da die dafür notwendige Ausstattung der Kammern mit Elektroden fehlt. Vielmehr werden gemäß der WO 2009/069608 A1 optische Messverfahren verwendet, die aber allein eine zweifelsfreien Nachweis einer Bilipidschicht nicht zulassen.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht daher darin, eine schnelle, zuverlässige und einfache und in Echtzeit kontrollierte sowie automatisierbare Methode zur Erstellung der Lipiddoppelschichten sowie die sie ermöglichende Mikrostruktur und die entsprechende Messanordnung, insbesondere in einem für Hochdurchsatzuntersuchungen geeigneten System, anzugeben.
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der vorliegenden Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche.
Dabei basiert die vorliegende Erfindung auf der Erkenntnis, dass sich in Versuchen mit einem Pipettierroboter überraschenderweise gezeigt hat, dass in manchen Fällen bloßes alternierendes Aufbringen von Lipid in Alkan und Elektrolytlösung auf eine elektrisch kontaktierte Mikrokavität in einer hydrophobem Polymerschicht zur Ausbildung einer Bilipidschicht führt.
Diese höchst überraschende, zunächst eher selten gemachte Beobachtung führte zu der Überlegung, ob möglicherweise Selbstorganisationseffekte an Grenzflächen hierfür verantwortlich sein könnten, sowie zu der Frage, ob solche Effekte mit höherer Wahrscheinlichkeit auftreten könnten, wenn die Bewegung von Lipid und Elektrolyt geometrisch kontrolliert würden, wie dies z. B. in einem Mikrokanal oder bei der Bewegung eines definierten hängenden Tropfens der Fall ist,
Diese Versuche waren in sehr unerwartetem Maße erfolgreich, indem sich mit hoher Wahrscheinlichkeit eine Lipiddoppelschicht mit dem charakteristischen hohen Widerstand und der Kapazität nachweisen ließ. Zudem konnte die Existenz einer Lipiddoppelschicht durch Rekonstitution von Ionenkanälen nachgewiesen werden. Es wurde dazu eine geringe Menge Lipid in einen bereits mit Elektrolyt gefüllten Kanal über einer Mikrokavität in hydrophobem Polymer appliziert. Folgende Strategie zeigte sich als erfolgreich:
In einen bereits mit wässrigen Elektrolyten gefüllten Mikrokanal, an dessen Boden sich eine oder mehrere, ebenfalls mit demselben Elektrolyten gefüllte Mikroelektrodenkavitäten befinden, wird eine geringe Menge Lipidlösung gefolgt von wiederum demselben Elektrolyten eingebracht. Aufgrund der laminaren Strömung bleiben Lipid und Wasserphase nahezu ideal getrennt. Durch weiteres Einleiten von Elektrolytlösung wird die Lipidphase im Mikrokanal weiter über die Öffnung oder das Töpfchen im Substrat geschoben. Die Lipidmoleküle der Lipidphase richten sich gemäß ihres amphiphilen Charakters an der Grenzfläche zur Wasserphase entsprechend ihrer hydrophoben und hydrophilen Anteile aus. Es ist anzunehmen, dass sich nun aufgrund dieses Selbstordnungsprozesses eine erste Monolipidschicht ausbildet. Anschließend wird ein gewisser Teil des Elektrolytvolumens aus dem Mikrokanal abgezogen. Damit wird die Durchlaufrichtung der Flüssigkeiten umgekehrt und der Tropfen aus seiner Position über dem Töpfchen oder der Öffnung zurückgeschoben. Das dabei zwangsläufig ausgebildete parabolische Strömungsprofil führt nach unserer gegenwärtigen Vorstellung zum Aufbringen einer zweiten Monolipidschicht auf die erste und damit zur Ausbildung einer Lipiddoppelschicht.
Eine wichtige Vorrausetzung für die überraschend hohe Erfolgsrate stellt dabei neben der Hydrophobizität des Substratmaterials die Wahl der Eigenschaften des für diese Applikation zugeschnittenen Lipidlösungsmittels dar. Zum einen muss das Lösen der Lipidmoleküle vollständig gewahrt sein, d. h. die kritische Konzentration für eine Mizellenausformung (engl.: Critical Micelle Concentration, CMC) sollte möglichst hoch sein; zum anderen sollte das für das Lösen der Lipide verwendete Lösungsmittel (LM) sehr schlecht bis gar nicht mit wässrigen Lösungen mischbar sein. Vorzugsweise werden hydrophobe Lösungsmittel verwendet, z. B. Hexadekan, Dodekan, Dekan, Oktan, Hexan oder Pentan sowie Mischungen dieser Substanzen, wobei die Auswahl der Reinsubstanzen oder die Mischung den Größendimensionen der Kavität so angepasst wird, dass eine möglichst schnelle und sichere Ausbildung der Bilipidschicht resultiert.
Im Gegensatz zu den erwähnten Nachteilen bestehender Lösungen ist bei diesem Verfahren das Zustandekommen bzw. die Existenz einer Grenzfläche zur Luft nicht obligatorisch. Durch den Verzicht auf eine dritte Grenzfläche werden zusätzliche, unkontrollierbare Störgrößen ausgeschaltet. Dies führt zu einer erhöhten Ausbeute bei der erfolgreichen Generierung von Lipiddoppelschichten. Zusätzlich wird der apparative Aufwand gegenüber bisherigen Lösungen, die z T. einen (mikro)fluidischen Zugang sowohl über als auch unter der Öffnung erfordern, massiv reduziert. Hiermit kann eine deutliche Beschränkung hinsichtlich des Designs von Mikroaperturen, welches einseitig geschlossene Strukturen, wie sie üblicherweise in der Mikrochipproduktion üblich sind, ausschließt, überwunden werden. Das Erzeugen einer Lipiddoppelschicht mit nur einer Pumpe oder einer Pipette ist somit möglich. Verschiedene Lipidlösungen können durch einen einzigen Zulauf eingeleitet werden.
Der entscheidende Vorteil der Methode ist damit, dass zur Herstellung der Bilipidschichten z. B. einfache, handelsübliche Pipettierroboter verwendet werden können.
Durch die erfindungsgemäße Anordnung und Prozessführung ergibt sich der wesentliche Vorteil dieser Methode: Sie ist in einem hohen Maße automatisierbar.
Dabei können in mikrotechnischen Systemen über mehreren Öffnungen in einem einzigen Schritt Lipiddoppelschichten erzeugt werden. Von der akademischen Grundlagenforschung bis hin zum pharmakologischen Wirkstoff-Screening ist die stabile, einfache, schnelle und zuverlässige Erzeugung einer Lipiddoppelschicht, als artifizielles Zellmodell, in verschiedensten Anwendungen ein maßgeblicher Faktor. Für letztere sind insbesondere hohe experimentelle Durchsätze für eine generelle, produktive Evolution äußerst wichtig. Anwender aus der Grundlagenforschung profitieren von der Vereinfachung bei experimentellen Durchläufen, von reduziertem apparativem und systemischem Aufwand und von einer hohen Variabilität bei Experimenten mit statistisch unwahrscheinlichen Ereignissen bezüglich der Untersuchung von Membranproteinen oder der Modellmembran selbst. Zusammenfassend ist festzustellen: Die hier vorgestellte Methode steigert für Anwender aller elektrophysiologischen und biophysikalischen Fachrichtungen die Effizienz bei Experimenten mit Modellzellmembranen, indem sie generell die Zeitinvestitionen für deren Durchführung deutlich reduziert.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Messsystem mindestens ein elektronisches Datenaufnahme- und Steuersystem mit Steuer- und Auswerteeinheiten, welche die jeweils für die Bewegung der Lipidphase vorgesehenen Einrichtungen in Abhängigkeit von den in Echtzeit erfassten Werten von Gleichstromwiderstand, Impedanz und/oder Kapazität steuern können. Auf diese Weise kann eine automatische oder halbautomatische, rückkopplungsgesteuerte Bewegung der Lipidphase auf die Apertur zu und von der Apertur weg sowie eine automatisch kontrollierte Ausbildung einer Bilipidschicht ermöglicht werden.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird diese anhand der in den nachfolgenden Figuren dargestellten Ausführungsbeispiele näher erläutert. Dabei werden gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen und gleichen Bauteilbezeichnungen versehen. Weiterhin können auch einzelne Merkmale oder Merkmalskombinationen aus den gezeigten und beschriebenen Ausführungsformen für sich genommen eigenständige erfinderische oder erfindungsgemäße Lösungen darstellen. Es zeigen:
1 eine schematische Schnittdarstellung einer Mikrostruktur während des Überströmens mit Lipidlösung in einer ersten Flussrichtung;
2 eine schematische Schnittdarstellung der Mikrostruktur aus 1 bei Stoppen der Lipidlösung über einer ersten Kavität;
3 eine schematische Schnittdarstellung der Mikrostruktur während des Überströmens mit Lipidlösung in einer zweiten Flussrichtung;
4 eine schematische Schnittdarstellung durch eine Mikrostruktur mit einer Elektrodenanordnung zum Überwachen der Herstellung der Bilipidschichten;
5 ein Blockdiagramm einer Mikrostruktur mit integrierter Mikropumpe;
6 eine Übersicht über ein mikrotechnisches Herstellungsverfahren zum Herstellen der Anordnung aus 4;
7 eine perspektivische Darstellung einer erfindungsgemäßen Mikrostruktur mit vier Mikrokavitäten;
8 ein Beispiel für ein Zeitdiagramm, gemessen mit dem biologischen Modellsystem Alamethicin
9 ein Histogramm der Messung aus 8;
10 eine Ausschnittsvergrößerung der Messergebnisse aus 8.
1 zeigt eine erfindungsgemäße Mikrostruktur 100 während eines ersten Schritts der Herstellung von Lipidschichten. Die Mikrostruktur 100 umfasst in ihrer einfachsten Ausbildung ein Substrat 102, in dem mindestens eine Mikrokavität 104 ausgebildet ist. Im Folgenden werden diese Mikrokavitäten 104 auch als Töpfchen, Öffnungen oder Aperturen bezeichnet und sollen einseitig offene Hohlräume bezeichnen, die Abmessungen von weniger als etwa einem Millimeter aufweisen. Diese Abmessungen sind vor allem durch die noch stabile Größe der sie frei hängend überspannenden Lipidschicht bestimmt.
Unter „Lipidschichten” werden nachfolgend Membranen verstanden, die aus membranbildenden Lipiden bestehen. Membranbildende Lipide sind Lipide, die einen hydrophilen und einen hydrophoben Teil besitzen – also amphiphil sind. Dies erlaubt es ihnen, in polaren Lösungsmitteln wie Wasser je nach Beschaffenheit entweder Mizellen (kugelförmige Aggregate aus amphiphilen Molekülen, die sich in einem Dispersionsmedium spontan zusammenlagern) oder Doppellipidschichten zu bilden – wobei immer der hydrophile Teil mit dem polaren Lösungsmittel interagiert. Aus diesen Doppellipidschichten sind, mit Ausnahme der Membranen von Archaeen, alle Biomembranen aufgebaut, welche den Inhalt einer Zelle gegen die Umgebung abgrenzen. In der vorliegenden Anmeldung werden die Begriffe Bilipidschicht, Doppellipidschicht und Lipiddoppelschicht synonym verwendet.
Über den Mikrokavitäten 104 ist ein Mikrokanal 106 angeordnet. Der Mikrokanal wird durch eine Deckschicht 108 auf der den Mikrokavitäten 104 abgewandten Seite begrenzt und ist beispielsweise in einer Deckplatte ausgebildet.
Erfindungsgemäß werden der Mikrokanal 106 und die Mikrokavitäten 104 zunächst mit einer wässrigen Phase 110 befüllt. Wie in 1 gezeigt, wird in die wässrige Phase 110 eine Lipidphase 112 eingebracht. Beispielsweise mit Hilfe einer Mikropumpe oder einer Spritze wird die Lipidphase 112 unter Ausbildung eines laminaren Strömungsprofils in Richtung 114 (auf die Apertur zu) über die erste Apertur 104 geleitet. Die Lipidmoleküle 116 ordnen sich dabei, wie schematisch dargestellt, so an, dass ihre hydrophilen Enden auf die wässrige Phase 110 hin orientiert sind, während ihre lipophilen Enden auf die Lipidphase 112 hin orientiert sind. Das Material des Substrats 102 ist dabei entweder komplett aus hydrophobem Material oder oberflächenbeschichtet, so dass den Lipidmolekülen eine hydrophobe Oberfläche präsentiert wird.
Wie dies in 2 symbolisiert ist, stoppt in einem nächsten Verfahrensschritt der Durchlauf über der Mikrokavität 104 und es kann sich eine Lipidmonoschicht über der Öffnung der Mikrokavität 104 ausbilden.
Erfindungsgemäß wird nun durch Umkehrung des Pumpdrucks die Lipidphase 112 in die Gegenrichtung 118 wiederum unter Ausbildung eines laminaren Strömungsprofils von der Apertur 104 fortbewegt. Dabei bildet sich, wie in 3 symbolisch gezeigt, die gewünschte Lipiddoppelschicht über der wassergefüllten Mikrokavität 104 aus. Diese, wie aus den späteren Ausführungen noch deutlich wird, reproduzierbare Ausbildung von Bilipidschichten entsteht durch das gerichtete Bewegen eines definierten Volumens einer Lipidlösung über die Kavität und wieder davon weg.
Wie weiterhin aus 4 hervorgeht, kann die Bewegung des Lipidlösungsvolumens unmittelbar über die gemessenen elektrischen Parameter, insbesondere der Ohmsche Widerstand und die Kapazität, rückgekoppelt werden.
Die Mikrostruktur gemäß 4 umfasst neben den bereits mit Bezug auf 1, 2 und 3 erläuterten Bestandteilen außerdem mindestens eine Messelektrode 120, sowie mindestens eine Gegenelektrode 122. Mit Hilfe dieser Anordnung können Messungen wie in derDissertation Basken, Gerhard: „Entwicklung einer mikrosystemtechnischen Plattform für parallele Untersuchungen von Ionenkanälen in artifiziellen Zellenmembranen", Albert-Ludwig-Universität, Freiburg im Breisgau, November 2008, gezeigt ist, durchgeführt werden.
Insbesondere kann durch Anlegen einer definierten, zeitlich variablen Potenzialdifferenz der Stromfluss zwischen der in der Kavität befindlichen Messelektrode 120 und der außerhalb der Kavität 104 befindlichen Gegenelektrode 122 erfasst werden. Die unterschiedliche elektrische Leitfähigkeit der wässrigen Elektrolytphase 110 und des hydrophoben Lösungsmittels 112 verursachen Veränderungen in der Stromamplitude. Dies kann erfindungsgemäß zur Detektion des hydrophoben Lösungsmittelvolumens über der Kavität verwendet werden und kann im Falle einer direkten Verbindung zu einer elektrisch ansteuerbaren Pumpe zu einer Rückkopplung an die Pumpe verwendet werden. Weiterhin kann die einwandfreie Funktionsfähigkeit der aufgebrachte Bilipidschicht unmittelbar überprüft werden.
Als Elektrodenmaterial für die Elektroden 120 kommt dabei zum einen ein Edelmetall wie beispielsweise Gold in Frage. Bevorzugt kann aber auch, um das elektrochemische Verhalten der polarisierbaren Goldelektroden mit Hilfe einer mikrogalvanischen Beschichtung in das Verhalten einer nichtpolarisierbaren Elektrode umzuändern, die Goldelektrode so beschichtet werden, dass sie eine Silber-Silberchlorid-Elektrode darstellt. Dies kann beispielsweise entsprechend der Verfahren aus der obengenannten Dissertation Basken erfolgen. Auch die Gegenelektrode 122 kann mit einer entsprechenden Beschichtung versehen werden, um eine Silber-Silberchlorid-Elektrode auszubilden und dadurch ein stabiles Referenzpotential zu erhalten. Andere mögliche Ausführungsformen der Elektroden beinhalten die Beschichtung mit Platinschwarz oder Iridiumoxid.
Wie in 5 schematisch dargestellt, kann mit einem derartigen Elektrodensystem und einer zugehörigen Steuer- und Auswerteeinheit 124 eine entsprechende Pumpe 126 direkt angesteuert werden. Ein solcher geschlossener Regelkreislauf ermöglicht eine vollautomatisierte Beschichtung derartiger Mikrostrukturen. Selbstverständlich muss die Pumpe 126 keine Mikropumpe sein, sondern kann jede andere geeignete Form aufweisen. Das Vorsehen einer Mikropumpe ermöglicht aber, dass die Mikrostruktur mit den Mikrokavitäten 104 zusammen mit der Pumpe und gegebenenfalls auch zusammen mit der Elektronik der Steuer- und Auswerteeinheit 124 als ein integriertes Mikrosystem hergestellt wird.
Mit Bezug auf die 6 und 7 soll nachfolgend die Herstellung einer Mikrostruktur mit vier Mikrokavitäten 104 erläutert werden.
In einem ersten Schritt wird ein Substrat, beispielsweise aus Glas, bereitgestellt. Aufschleudern und Belichten eines Negativfotolacks liefert eine Maske für die Abscheidung der Metallschichten für die Messelektroden 120. Diese werden, wie in Schritt IV gezeigt, beispielsweise durch Aufdampfen erzeugt. In Schritt V wird die Fotolackschicht entfernt, so dass die überschüssigen Metallflächen dadurch entfernt werden. Erfindungsgemäß besteht die Wandung der Mikrokavitäten 104 aus einem SU8-Fotolack. Dieser kann direkt über eine Fototechnik mit den gewünschten Strukturen hergestellt werden. Wie in Schritt VIII gezeigt, kann mit Hilfe einer Galvanotechnik nunmehr die erforderliche Metallisierung zur Herstellung einer Silber-Silberchlorid-Elektrode aufgebracht werden.
7 zeigt in perspektivischer Darstellung den entstehenden Chip, der durch Anbringen einer Deckschicht, z. B. in Form einer weiteren Glasstruktur, zu einem geschlossenen System wird. In dieser Deckschicht, die hier nicht gesondert gezeigt ist, werden außerdem die Kanalstrukturen hergestellt, die beispielsweise je zwei der Aperturen 104 entsprechend der Anordnung aus den 1 bis 3 miteinander verbinden.
Mit Hilfe des in Kapitel 4 der Dissertation Basken, Gerhard: „Entwicklung einer mikrosystemtechnischen Plattform für parallele Untersuchungen von Ionenkanälen in artifiziellen Zellenmembranen", Albert-Ludwig-Universität, Freiburg im Breisgau, November 2008, beschriebenen Modellproteins Alamethicin kann belegt werden, dass sich über den Aperturen tatsächlich funktional aktive Bilipidschichten ausgebildet haben. Die 8, 9 und 10 zeigen exemplarisch die Ergebnisse einer Messung, die an den erfindungsgemäßen Mikrostrukturen durchgeführt wurde.
Dabei wurden Versuche durchgeführt, bei denen Lipiddoppelschichten mit eingebauten Alamethicin-Kanälen aufgebracht und vermessen wurden. Wie in der Dissertation Basken im Detail dargelegt, bildet Alamethicin abhängig von einem angelegten transmembranären Potential Poren in Membranen, und zwar ausschließlich in Bilipidschichten, aus. Daher kann durch Anlegen eines Potentials zwischen der Messelektrode 120 und der Gegenelektrode 122 ein Stromfluss durch die Poren in der Bilipidmembran gemessen werden. Werden erfolgreich Alamethicin-Kanäle in den die Töpfchen überspannenden Lipidschichten eingebaut, zeigt der gemessene Strom typische Fluktuationen, die einer Treppenfunktion mit unterschiedlichen Leitfähigkeitsstufen ähneln. Diese unterschiedlichen Leitfähigkeitsstufen repräsentieren Poren mit einer unterschiedlichen Anzahl von Alamethicin-Monomeren.
8 zeigt dabei einen Überblick über den Stromverlauf bei konstanter Haltespannung als Funktion der Zeit. 9 stellt ein Histogramm der Messwerte aus 8 dar, das belegt, dass eine elektrisch sehr hochohmige Schicht entstanden ist, und 10 ist eine Ausschnittsvergrößerung des Zeitbereichs zwischen 510 und 520 ms. Insbesondere die Treppenform des Stromverlaufs in 10 stellt in Übereinstimmung mit den Resultaten der Dissertation Basken die charakteristische Kurve für eine funktionsfähige Bilipidmembran mit darin eingelagerten Alamethicinporen dar. Dieses Verhalten schließt aus, dass lediglich eine ungeordnete Anhäufung von Protein für den hohen Isolationswiderstand verantwortlich ist.
Die Messergebnisse der 8 bis 10 belegen also eindeutig, dass mit der erfindungsgemäßen Herstellungsmethode eine funktionale Lipiddoppelschicht über dem entsprechenden Töpfchen in dem Kanal hergestellt wurde.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2009/069608 A1 [0015, 0015, 0015]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Sondermann, M.; George, M.; Fertig, N.; Behrends, J. C., Bba-Biomembranes, 2006 1758, (4), 545–551 [0002]
Basken, G.; Sondermann, M.; Schlemmer, C.; Ruhe, J.; Behrends, J. C., Lab Chip, 2008 8, (6), 938–44 [0002]
Dissertation Basken, Gerhard: „Entwicklung einer mikrosystemtechnischen Plattform für parallele Untersuchungen von Ionenkanälen in artifiziellen Zellmembranen”, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2008 [0004]
Müller et al., Z Kreislaufforschung, 1963, 52 (7) 534 ff. [0008]
Autoren des Artikels Takagi, M. A., K.; Kishimoto, U., Annu. Report Biol. Works Fac. of Sci. Osaka Univ, 1965 13, 107–110 [0010]
Autoren des Artikels Montal, M.; Mueller, P., Proceedings of the National Academy of Sciences, 1972 69, (12), 3561–3566 [0010]
Artikel Danelon, C.; Lindemann, M.; Bonin, C.; Fournier, D.; Winterhalter, M., IEEE Transactions Nanobioscience, 2004 3, (1), 46–48 [0010]
Autoren des Artikels Malmstadt, N.; Nash, M. A.; Purnell, R. F.; Schmidt, J. J., Nano Lett, 2006 6, (9), 1961–1965 [0012]
Suzuki, H.; Tabata, K. V.; Noji, H.; Takeuchi, S., Langmuir, 2006 22, (4), 1937–1942 [0013]
Autoren des Artikels Sandison, M. E.; Zagnoni, M.; Abu-Hantash, M.; Morgan, H., J Micromech Microeng, 2007 17, (7), S. 189–196 [0013]
Dissertation Basken, Gerhard: „Entwicklung einer mikrosystemtechnischen Plattform für parallele Untersuchungen von Ionenkanälen in artifiziellen Zellenmembranen”, Albert-Ludwig-Universität, Freiburg im Breisgau, November 2008 [0045]
Kapitel 4 der Dissertation Basken, Gerhard: „Entwicklung einer mikrosystemtechnischen Plattform für parallele Untersuchungen von Ionenkanälen in artifiziellen Zellenmembranen”, Albert-Ludwig-Universität, Freiburg im Breisgau, November 2008 [0052]

Claims

Verfahren zum Herstellen einer Bilipidschicht über einer einseitig offenen, in einem Substrat ausgebildeten Mikrokavität mit den folgenden Schritten: Befüllen der Mikrokavität sowie teilweises Bedecken des die Mikrokavität enthaltenden Substrats mit einer Elektrolytlösung, so dass zwischen der Elektrolytlösung in der Mikrokavität und der Elektrolytlösung auf dem Substrat Kontinuität besteht; Bewegen eines gelöste Lipide enthaltenden Fluids, das eine Lipidphase bildet, innerhalb der das Substrat bedeckenden wässrigen Elektrolytlösung in einer ersten Richtung auf die Mikrokavität zu; Einstellen und Überwachen der Position der Lipidphase auf der Mikrokavität durch Erfassen eines erhöhten Gleichstromwiderstandes oder einer Impedanz zwischen einer mit der außerhalb der Kavität befindlichen verbundenen Gegenelektrode und einer Messelektrode, die im Inneren der Mikrokavität angeordnet ist; Bewegen der Lipidphase in einer zweiten Richtung von der Mikrokavität weg; Überwachen des Ausbildens der Bilipidschicht über der Mikrokavität durch Erfassen eines Gleichstromwiderstandes, einer Impedanz und/oder einer Kapazität zwischen einer mit dem Fluid verbundenen Gegenelektrode und einer Messelektrode, die im Inneren der Mikrokavität angeordnet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bewegen der Lipidphase in einem Flüssigkeitsstrom erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die erste und die zweite Richtung entgegengesetzt gerichtet sind und die Strömung laminar ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Bewegen der Lipidphase durch Bewegung eines hängenden Tropfens dieses Fluids erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 4 wobei der hängende Tropfen an einer beweglichen Pipette oder an einem zum Bewegen eines Tropfens angepassten planaren Substrat adhäriert.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zum Erfassen der Impedanz zwischen der Messelektrode und der Gegenelektrode eine definierte zeitlich variierende elektrische Potentialdifferenz angelegt wird und eine Veränderung einer Amplitude eines elektrischen Stroms zwischen den Elektroden überwacht wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die zeitlich variierende Spannungsdifferenz die Form von Rechteckpulsen mit Amplituden zwischen 1 und 100 mV, vorzugsweise zwischen 1 und 30 mV, und einer Dauer von 5 ms bis 500 ms hat, oder wobei die zeitlich variierende Spannungsdifferenz die Form von Rampen mit einer Spitzenamplitude zwischen 1 und 100 mV, vorzugsweise zwischen 1 und 30 mV, und einer Dauer von 5 ms bis 500 ms hat, oder wobei die zeitlich variierende Spannungsdifferenz die Form einer Sinuskurve mit einer Spitze-zu-Spitze-Amplitude von 1 bis 500 mV und einer Frequenz von 0,1 Hz bis 1 MHz hat, vorzugsweise von 1 Hz bis 20 kHz, hat.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Fluid ein hydrophobes Lösungsmittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das hydrophobe Lösungsmittel Hexadekan, Dodekan, Dekan, Oktan, Hexan oder Pentan sowie Mischungen dieser Substanzen umfasst, wobei die Auswahl der Reinsubstanzen oder die Mischung den Größendimensionen der Kavität so angepasst wird, dass eine möglichst schnelle und sichere Ausbildung der Bilipidschicht resultiert.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der ohmsche Widerstand und die Kapazität zwischen der Messelektrode und der Gegenelektrode überwacht werden.
Mikrostruktur zum Untersuchen von Lipiddoppelschichten, wobei die Mikrostruktur (100) ein Substrat (102) aufweist, in welchem mindestens eine einseitig offene Mikrokavität (104) ausgebildet ist, wobei im Inneren der Mikrokavität (104) mindestens eine Messelektrode (120) angeordnet ist und wobei die mindestens eine Mikrokavität (104) so mit einem Fluidkanal (106) verbunden ist, dass die Mikrokavität von einem laminaren Fluidstrom mit mindestens zwei unterschiedlichen Strömungsrichtungen überströmt werden kann.
Mikrostruktur nach Anspruch 11, wobei die Messelektrode den Boden der Kavität bildet.
Mikrostruktur nach Anspruch 11 oder 12, wobei außerhalb der Mikrokavität mindestens eine Gegenelektrode (122) angeordnet ist, um das Fluid elektrisch zu kontaktieren, welches das Substrat bedeckt.
Mikrostruktur nach Anspruch 13, wobei die mindestens eine Gegenelektrode sich in einem Fluidkanal (106) befindet oder mit diesem elektrisch verbunden ist.
Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei in dem Substrat (102) eine Vielzahl von arrayförmig angeordneten Mikrokavitäten (104) vorgesehen ist.
Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei jede der Vielzahl von Mikrokavitäten (104) mindestens eine elektrisch separat kontaktierbare Messelektrode (120) aufweist.
Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 11 bis 16, weiterhin umfassend eine Mikropumpe (126) zum bidirektionalen Fördern des Fluids.
Mikrostruktur nach Anspruch 17, wobei die Mikropumpe (126) in dem Substrat (102) integriert ist.
Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 11 bis 18, wobei das Substrat (102) aus einem hydrophoben Material hergestellt ist oder mit einer hydrophoben Oberflächenbeschichtung versehen ist.
Mikrostruktur nach Anspruch 19, wobei das Substrat (102) durch ein photostrukturierbares Epoxidharz auf einem Glasträger gebildet ist.
Mikrostruktur nach Anspruch 20, wobei die mindestens eine Messelektrode (120) durch eine Leiterbahnstruktur auf dem Glasträger ausgebildet ist.
Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 11 bis 21, wobei die mindestens eine Messelektrode (120) eine Silber/Silberchlorid-Elektrode ist.
Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 11 bis 22, wobei die mindestens eine Mikrokavität einen größten Durchmesser von 1 μm bis 300 μm, vorzugsweise 2 μm bis 100 μm, sowie ein Aspektverhältnis zwischen 0,1 und 100, vorzugsweise zwischen 0,3 und 10, aufweist.
Messanordnung enthaltend eine Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 11 bis 23, wobei die Messelektroden und mindestens eine Gegenelektrode an einen für elektrische Widerstands-, Impedanz- und/oder Kapazitätsmessungen geeigneten Verstärker, vorzugsweise einen Potentiostaten, Voltage-Clamp- oder Patch-Clamp-Verstärker, angeschlossen sind.
Messanordnung enthaltend eine Mikrostruktur zum Untersuchen von Lipiddoppelschichten mit einem Substrat (102) in welchem mindestens eine einseitig offene Mikrokavität (104) ausgebildet ist, wobei im Inneren der Mikrokavität (104) mindestens eine Messelektrode (120) angeordnet ist und wobei die Messelektroden und mindestens eine Gegenelektrode an einen für elektrische Widerstands-, Impedanz- und/oder Kapazitätsmessungen geeigneten Verstärker, vorzugsweise einen Potentiostaten, Voltage-Clamp- oder Patch-Clamp-Verstärker, angeschlossen sind, wobei die Mikrostruktur in ein aufrechtes oder inverses Mikroskop zur optischen Betrachtung und Analyse der Bilipidschicht integriert ist.
Messanordnung enthaltend eine Mikrostruktur zum Untersuchen von Lipiddoppelschichten mit einem Substrat (102) in welchem mindestens eine einseitig offene Mikrokavität (104) ausgebildet ist, wobei im Inneren der Mikrokavität (104) mindestens eine Messelektrode (120) angeordnet ist und wobei die Messelektroden und mindestens eine Gegenelektrode an einen für elektrische Widerstands-, Impedanz- und/oder Kapazitätsmessungen geeigneten Verstärker, vorzugsweise einen Potentiostaten, Voltage-Clamp- oder Patch-Clamp-Verstärker, angeschlossen sind, wobei die Mikrostruktur zum Bewegen der Lipidphase im Fluidstrom oder in Form eines hängenden Tropfens in einen Pipettierautomaten integriert ist.
Messanordnung enthaltend eine Mikrostruktur zum Untersuchen von Lipiddoppelschichten mit einem Substrat (102) in welchem mindestens eine einseitig offene Mikrokavität (104) ausgebildet ist, wobei im Inneren der Mikrokavität (104) mindestens eine Messelektrode (120) angeordnet ist und wobei die Messelektroden und mindestens eine Gegenelektrode an einen für elektrische Widerstands-, Impedanz- und/oder Kapazitätsmessungen geeigneten Verstärker, vorzugsweise einen Potentiostaten, Voltage-Clamp- oder Patch-Clamp-Verstärker, angeschlossen sind, wobei die Mikrostruktur mit einer Pumpe zur Erzeugung von Fluidströmen in der Mikrostruktur verbunden ist.
Messanordnung enthaltend eine Mikrostruktur zum Untersuchen von Lipiddoppelschichten mit einem Substrat (102) in welchem mindestens eine einseitig offene Mikrokavität (104) ausgebildet ist, wobei im Inneren der Mikrokavität (104) mindestens eine Messelektrode (120) angeordnet ist, wobei die Messelektroden und mindestens eine Gegenelektrode an einen für elektrische Widerstands-, Impedanz- und/oder Kapazitätsmessungen geeigneten Verstärker, vorzugsweise einen Potentiostaten, Voltage-Clamp- oder Patch-Clamp-Verstärker, angeschlossen sind, wobei ein elektronisches Datenaufnahme- und Steuersystem mit Steuer- und Auswerteeinheiten vorgesehen ist, um die jeweils für die Bewegung der Lipidphase vorgesehenen Einrichtungen in Abhängigkeit von in Echtzeit erfassten Werten von Gleichstromwiderstand, Impedanz und/oder Kapazität zu steuern.
Messanordnung nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei sich in der Bilipidschicht mindestens ein Membranprotein, das die Membran durchspannt oder mit ihr assoziiert ist, befindet, so dass die Bilipidschicht mindestens eine Ionenleitfähigkeit und/oder mindestens eine andere mit elektrischen oder optischen Methoden nachweisbare biophysikalische Eigenschaft erhält.