EP2577301A2 - Verfahren zum herstellen einer bilipidschicht sowie mikrostruktur und messanordnung - Google Patents

Verfahren zum herstellen einer bilipidschicht sowie mikrostruktur und messanordnung

Info

Publication number
EP2577301A2
EP2577301A2 EP11727916.6A EP11727916A EP2577301A2 EP 2577301 A2 EP2577301 A2 EP 2577301A2 EP 11727916 A EP11727916 A EP 11727916A EP 2577301 A2 EP2577301 A2 EP 2577301A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microcavity
microstructure
substrate
measuring
electrode
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP11727916.6A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jan Behrends
Gerhard Baaken
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Original Assignee
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Albert Ludwigs Universitaet Freiburg filed Critical Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Publication of EP2577301A2 publication Critical patent/EP2577301A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/02—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance
    • G01N27/22—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance by investigating capacitance
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0673—Handling of plugs of fluid surrounded by immiscible fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/12—Specific details about manufacturing devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0645—Electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0877—Flow chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/161—Control and use of surface tension forces, e.g. hydrophobic, hydrophilic
    • B01L2300/165—Specific details about hydrophobic, oleophobic surfaces

Definitions

  • the present invention relates to a method for facilitating the production of a bilipid layer over a microcavity that is open on one side, as well as to a microstructure and a measuring arrangement that enable this type of simplified and facilitated production of lipid bilayers.
  • Synthetic bilipid layers are interesting for research and industry for many reasons. They are models of cell membranes in which the biological functions of reconstituted membrane proteins can be investigated with particular precision. Since, with the help of this model system, currents through individual ion channels in membranes were measured shortly before the development of the so-called patch-clamp technique, it is experiencing an increasing renaissance in recent years. One reason for this is the successful miniaturization of systems for the production of and measurement on such bilipid layers [see, for example, US Pat.
  • the renaissance is due to at least two factors, namely the need for channel and channel pharmacological drug screening
  • transporter proteins that are not or hardly accessible for the patch-clamp technique (in particular proteins in membranes of intracellular organelles and the increasing use of bacterial pores as molecular coulter counter and nanoreactors for single molecule analysis (eg mass spectroscopy of polymers or DNA sequencing by Oxford Nanopore Technologies).
  • WO 2009/069608 A1 discloses a method for producing a planar lipid bilayer membrane array, in which microchambers are formed by comb-shaped structures, each opening into a microchannel. By sequential introduction of buffer solution and lipid solution by means of a microsyringe lipid bilayers are formed in the boundary region between microchannel and microchamber.
  • lipid bilayers are formed in the boundary region between microchannel and microchamber.
  • the present invention is based on the finding that in experiments with a pipetting robot it has surprisingly been found that in some cases merely alternating application of lipid in alkane and electrolytic solution leads to an electrically contacted microcavity in a hydrophobic polymer layer to form a bilipid layer.
  • lipid solution is introduced, followed again by the same electrolyte. Due to the laminar flow lipid and water phase remain almost ideally separated.
  • electrolyte solution By further introducing electrolyte solution, the lipid phase in the microchannel is pushed further over the opening or the potty in the substrate.
  • the lipid molecules of the lipid phase align according to their amphiphilic character at the interface with the water phase in accordance with their hydrophobic and hydrophilic components. It is to be assumed that a first monolipid layer is now formed as a result of this self-assembly process.
  • the dissolution of the lipid molecules must be completely preserved, i. H. the critical concentration for micelle formation (Critical Micelle Concentration, CMC) should be as high as possible; on the other hand, the solvent (LM) used for dissolving the lipids should be very poorly or not at all miscible with aqueous solutions.
  • hydrophobic solvents are used, e.g.
  • hexadecane dodecane, decane, octane, hexane or pentane and mixtures of these substances, wherein the selection of pure substances or the mixture is adapted to the size dimensions of the cavity so that the fastest and safest formation of bilipid results.
  • lipid bilayers can be produced in a single step over several openings in a single step.
  • the stable, simple, rapid, and reliable generation of a lipid bilayer, as an artificial cell model is a key factor in a wide variety of applications.
  • high experimental throughputs are extremely important for a general, productive evolution.
  • Basic research users benefit from simplification of experimental runs, reduced equipment and systemic effort, and high variability in experiments with statistically unlikely events involving the study of membrane proteins or the model membrane itself.
  • the method presented here is of increasing value to users In all electrophysiological and biophysical disciplines, the efficiency of experiments with model cell membranes is generally reduced by significantly reducing the time invested in performing them.
  • the measuring system comprises at least one electronic data recording and control system with control and evaluation units, which provide the respectively provided for the movement of the lipid phase devices depending on the real-time values of DC resistance, impedance and / or Capacity control.
  • control and evaluation units which provide the respectively provided for the movement of the lipid phase devices depending on the real-time values of DC resistance, impedance and / or Capacity control.
  • Fig. 2 is a schematic sectional view of the microstructure of Fig. 1 when stopping the lipid solution over a first cavity; 3 shows a schematic sectional view of the microstructure during the overflow with lipid solution in a second flow direction;
  • FIG. 4 shows a schematic sectional view through a microstructure with an electrode arrangement for monitoring the production of the bilipid layers
  • Fig. 5 is a block diagram of a microstructure with integrated micropump; 6 shows an overview of a microtechnical production method for producing the arrangement from FIG. 4;
  • FIG. 7 is a perspective view of a microstructure according to the invention with four
  • Fig. 9 is a histogram of the measurement of Fig. 8.
  • FIG. 10 shows an enlarged detail of the measurement results from FIG. 8.
  • FIG. 1 shows a microstructure 100 according to the invention during a first step of the production of lipid layers.
  • the microstructure 100 comprises a substrate 102, in which at least one microcavity 104 is formed.
  • these microcavities 104 are also referred to as pots, openings or apertures and are intended to denote unilaterally open cavities having dimensions of less than about one millimeter. These dimensions are mainly determined by the still stable size of the lipid layer spanning it freely suspended.
  • Membrane-forming lipids are lipids that have a hydrophilic and a hydrophobic part-that is, amphiphilic-that allows them, in polar solvents such as water, to use either micelles (spherical or non-polar) depending on their nature Ag gregates of amphiphilic molecules that spontaneously assemble in a dispersion medium) or double lipid layers - whereby the hydrophilic moiety always interacts with the polar solvent. From these double lipid layers, with the exception of the membranes of Archaea, all biomembranes are constructed, which delimit the contents of a cell against the environment. In the present application, the terms bilipid layer, double lipid layer and lipid bilayer are used synonymously.
  • a microchannel 106 is arranged above the microcavities 104.
  • the microchannel is bounded by a cover layer 108 on the side facing away from the microcavities 104 and is formed, for example, in a cover plate.
  • the microchannel 106 and the microcavities 104 are first filled with an aqueous phase 110.
  • a lipid phase 112 is introduced into the aqueous phase 110.
  • the lipid phase 1 12 is directed over the first aperture 104 (toward the aperture) in the direction 114 (forming a laminar flow profile).
  • the lipid molecules 116 arrange themselves, as shown schematically, so that their hydrophilic ends are oriented towards the aqueous phase 110, while their lipophilic ends are oriented towards the lipid phase 112.
  • the material of the substrate 102 is either completely made of hydrophobic material or surface-coated, so that the lipid molecules a hydrophobic surface is presented.
  • the passage over the microcavity 104 stops and a lipid monolayer can form over the opening of the microcavity 104.
  • the lipid phase 1 12 is again moved in the opposite direction 1 18 from the aperture 104, forming a laminar flow profile.
  • the desired lipid bilayer forms above the water-filled microcavity 104.
  • At least one measuring electrode 120 as well as at least one counterelectrode 122.
  • measurements such as in the PhD thesis Baaken, Gerhard: "Entwicklung a microsystems engineering platform for parallel studies of ion channels in artificial cell membranes ", Albert-Ludwig University, Freiburg im Breisgau, November 2008, is performed.
  • the current flow between the measuring electrode 120 located in the cavity and the counter electrode 122 located outside the cavity 104 can be detected.
  • the different electrical conductivity of the aqueous electrolyte phase 110 and the hydrophobic solvent 112 cause changes in the current amplitude.
  • This can be used according to the invention for the detection of the hydrophobic solvent volume over the cavity and can be used in the case of a direct connection to an electrically controllable pump for a feedback to the pump.
  • the proper functioning of the applied bilipid layer can be checked immediately.
  • the gold electrode can be coated so that it represents a silver-silver chloride electrode.
  • the counter electrode 122 may be provided with a corresponding coating to form a silver-silver chloride electrode and thereby obtain a stable reference potential.
  • the electrodes include coating with platinum black or iridium oxide.
  • a corresponding pump 126 can be directly controlled with such an electrode system and an associated control and evaluation unit 124.
  • Such a closed control loop enables a fully automated coating of such microstructures.
  • the pump 126 need not be a micropump, but may be any other suitable shape.
  • the provision of a micropump allows the microstructure with the micro cavities 104 together with the pump and optionally also together with the electronics of the control and evaluation unit 124 is produced as an integrated microsystem.
  • a substrate for example made of glass
  • Spin-coating and exposing a negative resist provides a mask for depositing the metal layers for the measurement electrodes 120. These are generated by evaporation, as shown in step IV, for example.
  • the photoresist layer is removed so that the excess metal surfaces are thereby removed.
  • the wall of the microcavities 104 consists of a SU8 photoresist. This can be produced directly via a photographic technique with the desired structures.
  • step VIII the required metallization for producing a silver-silver chloride electrode can now be applied by means of an electroplating technique.
  • Fig. 7 shows a perspective view of the resulting chip, by attaching a cover layer, for. B. in the form of another glass structure, to a closed system.
  • a cover layer for. B. in the form of another glass structure
  • the channel structures are also made, for example, each connect two of the apertures 104 according to the arrangement of Figures 1 to 3 with each other.
  • FIG. 8 shows an overview of the current profile with a constant holding voltage as a function of time.
  • FIG. 9 shows a histogram of the measured values from FIG. 8, which proves that an electrically very high-resistance layer has formed
  • FIG. 10 shows an enlarged detail of the time range between 510 and 520 ms.
  • the staircase shape of the current profile in FIG. 10 represents the characteristic curve for a functional bilipid membrane with alamethicin pores incorporated therein, in accordance with the results of the PhD thesis Baaken. This behavior rules out that only a disordered accumulation of protein is responsible for the high insulation resistance.
  • FIGS. 8 to 10 thus clearly demonstrate that the production method according to the invention produced a functional lipid double layer over the corresponding potty in the channel.

Abstract

Das Verfahren zum Herstellen einer Bilipidschicht über einer einseitig offenen Mikrokavität (104) umfasst die folgenden Schritte: Befüllen der Mikrokavität (104) mit einer Elektrolytlösung (110); Bewegen eines gelöste Lipide enthaltenden Fluids (112) in einer ersten Richtung (114) auf die Mikrokavität (104) zu; Bewegen des Fluids in einer zweiten Richtung (118) von der Mikrokavität (104) weg; Überwachen des Ausbildens der Bilipidschicht über der Mikrokavität durch Erfassen einer Impedanz zwischen einer mit dem Fluid verbundenen Gegenelektrode (122) und einer Messelektrode (120), die im Inneren der Mikrokavität (104) angeordnet ist.

Description

VERFAHREN ZUM HERSTELLEN EINER BILIPIDSCHICHT SOWIE MIKROSTRUKTUR UND MESSANORDNUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur erleichterten Herstellung einer Bilipidschicht über einer einseitig offenen Mikrokavität sowie auf eine Mikrostruktur und eine Messanordnung, die diese Art der vereinfachten und erleichterten Herstellung von Lipid- doppelschichten ermöglichen.
Synthetische Bilipidschichten sind aus vielen Gründen für Forschung und Industrie interessant. Sie sind Modelle für Zellmembranen, an denen die biologischen Funktionen von re- konstituierten Membranproteinen besonders präzise untersucht werden können. Nachdem mit Hilfe dieses Modellsystems bereits kurz vor der Entwicklung der so genannten Patch- Clamp-Technik Ströme durch einzelne lonenkanälen in Membranen gemessen wurden, erfährt es gerade in den letzten Jahren eine zunehmende Renaissance. Ein Grund dafür ist die erfolgreiche Miniaturisierung von Systemen zur Herstellung von und Messung an sol- chen Bilipidschichten [siehe z. B.: Wonderlin, W. F.; Finkel, A.; French, R. J., Biophys J, 1990 58, (2), 289-297; Akeson, M.; Branton, D.; Kasianowicz, J. J.; Brandin, E.; Deamer, D. W., Biophys J, 1999 77, (6), 3227-3233; Pantoja, R.; Sigg, D.; Blunck, R.; Bezanilla, F.; Heath, J. R., Biophys J, 2001 81 , (4), 2389-239; Pantoja, R.; Nagarah, J. M.; Starace, D. M.; Melosh, N. A.; Blunck, R.; Bezanilla, F.; Heath, J. R., Biosens Bioelectron, 2004 20, (3), 509-517; Fertig, N.; Meyer, C; Blick, R. H.; Trautmann, C; Behrends, J. C, Phys Rev E, 2001 6404, (4),; Fertig, N.; Klau, M.; George, M.; Blick, R. H.; Behrends, J. C, Appl Phys Lett, 2002 81 , (25), 4865-4867; Fertig, N.; Blick, R. H.; Behrends, J. C, Biophys J, 2002 82, (6), 3056-3062; Mayer, M.; Kriebel, J. K.; Tosteson, M. T.; Whitesides, G. M., Biophys J, 2003 85, (4), 2684-2695; Malmstadt, N.; Nash, M. A.; Purneil, R. F.; Schmidt, J. J., Nano Lett, 2006 6, (9), 1961 -1965; Sondermann, M.; George, M.; Fertig, N.; Behrends, J. C, Bba-Biomembranes, 2006 1758, (4), 545-551 ; Baaken, G.; Sondermann, M.; Schlemmer, C; Ruhe, J.; Behrends, J. C, Lab Chip, 2008 8, (6), 938-44]. Neben einer dadurch deutlich gesteigerten Messauflösung hinsichtlich Zeit und Amplitude eröffnete diese Miniaturisierung zum anderen die Perspektive eines durch Parallelisierung stark erhöhten Durchsatzes an Messungen pro Zeit.
Von Seiten der Nachfrage ist die Renaissance durch mindestens zwei Faktoren bedingt, nämlich die Notwendigkeit, für das pharmakologische Wirkstoff-Screening Kanal- und Transporterproteine zu untersuchen, die für die Patch-Clamp-Technik nicht oder kaum zugänglich sind (insbesondere Proteine in Membranen intrazellulärer Organellen und die zunehmende Verwendung von bakteriellen Poren als molekulare Coulter-Counter und Nano- reaktoren für Einzelmolekülanalytik (z. B. Massenspektroskopie von Polymeren oder DNA- Sequenzierung durch die Firma Oxford Nanopore Technologies) .
Das Potential der miniaturisierten Bilipidschichten für Hochdurchsatzuntersuchungen konnte bisher allerdings nicht ausreichend technisch genutzt werden. Wie z. B. in der Dissertation Baaken, Gerhard: „Entwicklung einer mikrosystemtechnischen Plattform für parallele Untersuchungen von lonenkanälen in artifiziellen Zellmembranen", Albert-Ludwigs- Universität Freiburg, 2008, ausgeführt, wurden in den letzten Jahren zwar mit der Entwicklung chip-basierter planarer Patch-Clamp-Technologien hinsichtlich Miniaturisierung und Integrationsdichte für hochparallele Messungen an Zellmembranen neue Maßstäbe gesetzt; bisher fehlte für Hochdurchsatzuntersuchungen an synthetischen Membranen jedoch vor allem eine einfache und reproduzierbare sowie gut automatisierbare Lösung für die Herstel- lung der Doppellipidschichten. Dies ist mit der vorliegenden Erfindung nunmehr gelungen. Das neuentwickelte Verfahren zur automatisierten Herstellung von Bilipidschichten auf mikrostrukturierten Kavitäten ermöglicht es auf sehr einfache Weise, bestehende Geräte für Hochdurchsatz-Elektrophysiologie zu adaptieren, um in kurzer Zeit ein vollständiges System für vollständig automatisierte, parallele Messungen an Bilipidschichten bereitzustellen. Zusammengefasst werden durch das hier vorzustellende Verfahren grundsätzliche praktische Schwierigkeiten und Nachteile hinsichtlich der Generierung von freistehenden Lipiddoppelschichten, wie sie zur Beantwortung von fundamentalen Fragen der Elektrophysiolo- gie sowie für das pharmakologische Wirkstoff-Screening von Interesse sind, überwunden.
Bisherige Lösungen haben vor allem die nachfolgend erläuterten Nachteile. Ein wesentlicher Schritt hin zur Automatisierung von elektrophysiologischen Untersuchungen an zellphysiologischen Modellmembranen im Allgemeinen und im weiteren an Membranproteinen ist es, eine Methode zu entwickeln, mit deren Hilfe das Erzeugen von freistehenden Lipiddoppelschichten über (kleinen) Aperturen ohne ein Eingreifen durch den Experimentator in reproduzierbarer Weise unkompliziert realisiert werden kann. Für das Aufbringen von Lipiddoppelschichten auf eine Oberfläche oder über eine Apertur haben sich in den letzten dreißig Jahren zwei grundsätzliche Verfahren etabliert: Die Streichtechnik (engl.: painting-technique, siehe z. B. Müller et al., Z Kreislaufforschung, 1963, 52 (7) 534 ff.), und die Langmuir-Blodgett-Technik.
Die Streichtechnik ist zwar äußerst einfach anwendbar, ihr Erfolg hängt aber fast ausschließlich von der manuellen Geschicklichkeit des Experimentators ab, und deshalb er- scheint eine Automatisierung dieser Methode sehr schwierig.
Das Aufbringen mit Hilfe der Langmuir-Blodgett-Technik und daraus entwickelter oder verwandter Methoden findet weitgehend beim Transfer von definierten mono- oder multimolekularen Schichten auf eine Substratoberfläche Verwendung. Die Autoren des Artikels Ta- kagi, M. A., K.; Kishimoto, U., Annu. Report Biol. Works Fac. of Sei. Osaka Univ, 1965 13, 107-1 10, und später die Autoren des Artikels Montal, M.; Mueller, P., Proceedings of the National Academy of Sciences, 1972 69, (12), 3561-3566, vereinfachten diese Technik, so dass diese heute in vielen Experimenten für die Herstellung von Bilipidmembranen angewandt wird, wie dies z. B. in dem Artikel Daneion, C; Lindemann, M.; Borin, C; Fournier, D.; Winterhalter, M., IEEE Transactions Nanobioscience, 2004 3, (1 ), 46-48, gezeigt ist. Grundsätzlich wird bei diesem Verfahren zunächst eine Apertur in einer dünnen hydrophoben Substratfolie, welche zwei Kompartimente separiert, von beiden Seiten durch Befüllen mit einem Elektrolyten benetzt. Anschließend wird ein Tropfen Lipidlösung direkt auf die Oberfläche der wässrigen Elektrolytphase in einem der Kompartimente aufgegeben und dann gewartet, bis der größte Teil des Lösungsmittels verdampft ist. Danach wird der Was- serspiegel durch Entnahme von Elektrolytvolumen bis unter die Apertur abgesenkt und wieder angehoben. An der Öffnung bildet sich in Folge der hydrophoben/hydrophilen Wechselwirkungen eine Lipiddoppelschicht aus. Allerdings ist ein direktes Übertragen dieses Verfahrens auf planare Substrate, wie sie für eine Automatisierung unerlässlich erscheinen, nur bedingt möglich. Schwierig gestaltet sich hierbei vor allem die Handhabung, da der gesamte Versuchsaufbau nach dem Erzeugen der Lipidmembran vollständig in wässriger Lösung gelagert werden muss.
Die Autoren des Artikels Malmstadt, N.; Nash, M. A.; Purneil, R. F.; Schmidt, J. J., Nano Lett, 2006 6, (9), 1961-1965, nutzen mikrostrukturierte Kanäle in Poly-(dimethylsiloxan), PDMS, um eine Lipidmembran zu erzeugen. In diesem Ansatz wird die Permeabilität von PDMS für verschiedene Lösungsmittel genutzt, um durch Diffusion und Verdunstung ein in einen Mikrokanal eingebrachtes Volumen an Lipidlösung kontinuierlich zu verkleinern und dadurch eine Lipidmembran zwischen zwei wässrigen Phasen zu erzeugen. Bei dem Ansatz von Suzuki, H.; Tabata, K. V.; Noji, H.; Takeuchi, S., Langmuir, 2006 22, (4), 1937-1942, und insbesondere bei der von den Autoren des Artikels Sandison, M. E.; Zagnoni, M.; Abu-Hantash, M.; Morgan, H., J Micromech Microeng, 2007 17, (7), S. 189- 196, entwickelten so genannten Air-Exposure-Technik werden zunächst beide Seiten einer vergleichsweise großen Apertur (>100 μηι) mittels mikrofluidischer Zuläufe oder Zupipettieren mit Elektrolytlösung benetzt. Anschließend wird analog zur Streichtechnik an der Öffnung ein Tropfen Lipidlösung abgesetzt oder durch einen mikrofluidischen Kanal zugeführt Die wässrige Phase wird auf einer Seite abgesaugt, was ein definiertes Verdampfen des Lösungsmittels an der Luft ermöglicht. Durch Wiederdispensieren/Zuleiten eines Wasser- tropfens auf die Apertur wird die Membran konserviert.
Allen diesen bekannten Ansätzen ist allerdings gemein, dass die Lipiddoppelschichten nur durch Wechselwirkungen an der Luftphase oder komplizierten (mikro-)fluidischen Zugängen von beiden Seiten, vorzugsweise mit makroskopischen Pumpen, erzeugt werden können. Zudem stellen die konventionellen Verfahren sehr spezielle Anforderungen an den experi- mentellen Aufbau. Auch wird der Aufwand zur Steuerung und Kontrolle elektrophysiologi- scher Experimente erheblich gesteigert. Diese bekannten Verfahren sind methodisch nicht in der Lage, grundsätzliche praktische Probleme im Hinblick auf Automatisierbarkeit, Geschwindigkeit und Anwendbarkeit bei der Generation von Lipiddoppelschichten zu lösen. Insbesondere sind sie nicht geeignet, Lipiddoppelschichten auf sehr kleinen, fluidisch nur einseitig zugänglichen Aperturen zu erzeugen, die allein für Hochdurchsatzapplikationen in Frage kommen.
Weiterhin ist aus der WO 2009/069608 A1 ein Verfahren zum Herstellen eines planaren Lipiddoppelschichtmembranarrays bekannt, bei dem durch kammförmige Strukturen Mikro- kammern gebildet werden, die jeweils in einen Mikrokanal münden. Durch sequenzielles Einleiten von Pufferlösung und Lipidlösung mittels einer Mikrospritze werden Lipiddoppelschichten in dem Grenzbereich zwischen Mikrokanal und Mikrokammer ausgebildet. Für eine Automatisierung der Herstellung von Lipiddoppelschichten, insbesondere bei geplanten Anwendungen in Hochdurchsatzuntersuchungen, ist das in diesem Dokument gezeigte System und Verfahren zum Herstellen der Bilipidschichten bei Weitem nicht reproduzierbar und zuverlässig genug. Vor allem aber ist es bei der bekannten Mikrostruktur, die in der WO 2009/069608 A1 gezeigt ist, nicht möglich, die Bildung einer Bilipidschicht eindeutig, d. h. durch elektrische Messung nachzuweisen, da die dafür notwendige Ausstattung der Kammern mit Elektroden fehlt. Vielmehr werden gemäß der WO 2009/069608 A1 optische Messverfahren verwendet, die aber allein eine zweifelsfreien Nachweis einer Bilipidschicht nicht zulassen.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe besteht daher darin, eine schnelle, zuverlässige und einfache und in Echtzeit kontrollierte sowie automatisierbare Methode zur Erstellung der Lipiddoppelschichten sowie die sie ermöglichende Mikrostruktur und die entsprechende Messanördnung, insbesondere in einem für Hochdurchsatzuntersuchungen geeigneten System, anzugeben.
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der vorliegenden Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Patentan- sprüche.
Dabei basiert die vorliegende Erfindung auf der Erkenntnis, dass sich in Versuchen mit einem Pipettierroboter überraschenderweise gezeigt hat, dass in manchen Fällen bloßes alternierendes Aufbringen von Lipid in Alkan und Elektrolytlösung auf eine elektrisch kontaktierte Mikrokavität in einer hydrophobem Polymerschicht zur Ausbildung einer Bilipidschicht führt.
Diese höchst überraschende, zunächst eher selten gemachte Beobachtung führte zu der Überlegung, ob möglicherweise Selbstorganisationseffekte an Grenzflächen hierfür verantwortlich sein könnten, sowie zu der Frage, ob solche Effekte mit höherer Wahrscheinlichkeit auftreten könnten, wenn die Bewegung von Lipid und Elektrolyt geometrisch kontrolliert würden, wie dies z. B. in einem Mikrokanal oder bei der Bewegung eines definierten hängenden Tropfens der Fall ist,
Diese Versuche waren in sehr unerwartetem Maße erfolgreich, indem sich mit hoher Wahrscheinlichkeit eine Lipiddoppelschicht mit dem charakteristischen hohen Widerstand und der Kapazität nachweisen ließ. Zudem konnte die Existenz einer Lipiddoppelschicht durch Rekonstitution von lonenkanälen nachgewiesen werden. Es wurde dazu eine geringe Menge Lipid in einen bereits mit Elektrolyt gefüllten Kanal über einer Mikrokavität in hydrophobem Polymer appliziert. Folgende Strategie zeigte sich als erfolgreich:
In einen bereits mit wässrigen Elektrolyten gefüllten Mikrokanal, an dessen Boden sich eine oder mehrere, ebenfalls mit demselben Elektrolyten gefüllte Mikroelektrodenkavitäten be- finden, wird eine geringe Menge Lipidlösung gefolgt von wiederum demselben Elektrolyten eingebracht. Aufgrund der laminaren Strömung bleiben Lipid und Wasserphase nahezu ideal getrennt. Durch weiteres Einleiten von Elektrolytlösung wird die Lipidphase im Mikro- kanal weiter über die Öffnung oder das Töpfchen im Substrat geschoben. Die Lipidmoleküle der Lipidphase richten sich gemäß ihres amphiphilen Charakters an der Grenzfläche zur Wasserphase entsprechend ihrer hydrophoben und hydrophilen Anteile aus. Es ist anzu- nehmen, dass sich nun aufgrund dieses Selbstordnungsprozesses eine erste Monolipid- schicht ausbildet. Anschließend wird ein gewisser Teil des Elektrolytvolumens aus dem Mikrokanal abgezogen. Damit wird die Durchlaufrichtung der Flüssigkeiten umgekehrt und der Tropfen aus seiner Position über dem Töpfchen oder der Öffnung zurückgeschoben. Das dabei zwangsläufig ausgebildete parabolische Strömungsprofil führt nach unserer ge- genwärtigen Vorstellung zum Aufbringen einer zweiten Monolipidschicht auf die erste und damit zur Ausbildung einer Lipiddoppelschicht.
Eine wichtige Vorrausetzung für die überraschend hohe Erfolgsrate stellt dabei neben der Hydrophobizität des Substratmaterials die Wahl der Eigenschaften des für diese Applikation zugeschnittenen Lipidlösungsmittels dar. Zum einen muss das Lösen der Lipidmoleküle vollständig gewahrt sein, d. h. die kritische Konzentration für eine Mizellenausformung (engl.: Critical Micelle Concentration, CMC) sollte möglichst hoch sein; zum anderen sollte das für das Lösen der Lipide verwendete Lösungsmittel (LM) sehr schlecht bis gar nicht mit wässrigen Lösungen mischbar sein. Vorzugsweise werden hydrophobe Lösungsmittel verwendet, z. B. Hexadekan, Dodekan, Dekan, Oktan, Hexan oder Pentan sowie Mischungen dieser Substanzen, wobei die Auswahl der Reinsubstanzen oder die Mischung den Größendimensionen der Kavität so angepasst wird, dass eine möglichst schnelle und sichere Ausbildung der Bilipidschicht resultiert.
Im Gegensatz zu den erwähnten Nachteilen bestehender Lösungen ist bei diesem Verfahren das Zustandekommen bzw. die Existenz einer Grenzfläche zur Luft nicht obligatorisch. Durch den Verzicht auf eine dritte Grenzfläche werden zusätzliche, unkontrollierbare Störgrößen ausgeschaltet. Dies führt zu einer erhöhten Ausbeute bei der erfolgreichen Generierung von Lipiddoppelschichten. Zusätzlich wird der apparative Aufwand gegenüber bisherigen Lösungen, die z T. einen (mikro)fluidischen Zugang sowohl über als auch unter der Öffnung erfordern, massiv reduziert. Hiermit kann eine deutliche Beschränkung hinsichtlich des Designs von Mikroaperturen, welches einseitig geschlossene Strukturen, wie sie üblicherweise in der Mikrochipproduktion üblich sind, ausschließt, überwunden werden. Das Erzeugen einer Lipiddoppelschicht mit nur einer Pumpe oder einer Pipette ist somit möglich. Verschiedene Lipidlösungen können durch einen einzigen Zulauf eingeleitet werden. Der entscheidende Vorteil der Methode ist damit, dass zur Herstellung der Bilipidschichten z.B. einfache, handelsübliche Pipettierroboter verwendet werden können.
Durch die erfindungsgemäße Anordnung und Prozessführung ergibt sich der wesentliche Vorteil dieser Methode: Sie ist in einem hohen Maße automatisierbar. Dabei können in mikrotechnischen Systemen über mehreren Öffnungen in einem einzigen Schritt Lipiddoppelschichten erzeugt werden. Von der akademischen Grundlagenforschung bis hin zum pharmakologischen Wirkstoff-Screening ist die stabile, einfache, schnelle und zuverlässige Erzeugung einer Lipiddoppelschicht, als artifizielles Zellmodell, in verschiedensten Anwendungen ein maßgeblicher Faktor. Für letztere sind insbesondere hohe ex- perimentelle Durchsätze für eine generelle, produktive Evolution äußerst wichtig. Anwender aus der Grundlagenforschung profitieren von der Vereinfachung bei experimentellen Durchläufen, von reduziertem apparativem und systemischem Aufwand und von einer hohen Variabilität bei Experimenten mit statistisch unwahrscheinlichen Ereignissen bezüglich der Untersuchung von Membranproteinen oder der Modellmembran selbst. Zusammenfassend ist festzustellen: Die hier vorgestellte Methode steigert für Anwender aller elektrophysiolo- gischen und biophysikalischen Fachrichtungen die Effizienz bei Experimenten mit Modellzellmembranen, indem sie generell die Zeitinvestitionen für deren Durchführung deutlich reduziert.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Mess- System mindestens ein elektronisches Datenaufnahme- und Steuersystem mit Steuer- und Auswerteeinheiten, welche die jeweils für die Bewegung der Lipidphase vorgesehenen Einrichtungen in Abhängigkeit von den in Echtzeit erfassten Werten von Gleichstromwiderstand, Impedanz und/oder Kapazität steuern können. Auf diese Weise kann eine automatische oder halbautomatische, rückkopplungsgesteuerte Bewegung der Lipidphase auf die Apertur zu und von der Apertur weg sowie eine automatisch kontrollierte Ausbildung einer Bilipidschicht ermöglicht werden.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird diese anhand der in den nachfolgenden Figuren dargestellten Ausführungsbeispiele näher erläutert. Dabei werden gleiche Teile mit gleichen Bezugszeichen und gleichen Bauteilbezeichnungen versehen. Wei- terhin können auch einzelne Merkmale oder Merkmalskombinationen aus den gezeigten und beschriebenen Ausführungsformen für sich genommen eigenständige erfinderische oder erfindungsgemäße Lösungen darstellen. Es zeigen: Fig. 1 eine schematische Schnittdarstellung einer Mikrostruktur während des Überströmens mit Lipidlösung in einer ersten Flussrichtung;
Fig. 2 eine schematische Schnittdarstellung der Mikrostruktur aus Fig. 1 bei Stoppen der Lipidlösung über einer ersten Kavität; Fig. 3 eine schematische Schnittdarstellung der Mikrostruktur während des Überströmens mit Lipidlösung in einer zweiten Flussrichtung;
Fig. 4 eine schematische Schnittdarstellung durch eine Mikrostruktur mit einer Elektrodenanordnung zum Überwachen der Herstellung der Bilipidschichten;
Fig. 5 ein Blockdiagramm einer Mikrostruktur mit integrierter Mikropumpe; Fig. 6 eine Übersicht über ein mikrotechnisches Herstellungsverfahren zum Herstellen der Anordnung aus Fig. 4;
Fig. 7 eine perspektivische Darstellung einer erfindungsgemäßen Mikrostruktur mit vier
Mikrokavitäten;
Fig. 8 ein Beispiel für ein Zeitdiagramm, gemessen mit dem biologischen Modellsystem
Alamethicin
Fig. 9 ein Histogramm der Messung aus Fig. 8;
Fig. 10 eine Ausschnittsvergrößerung der Messergebnisse aus Fig. 8.
Fig. 1 zeigt eine erfindungsgemäße Mikrostruktur 100 während eines ersten Schritts der Herstellung von Lipidschichten. Die Mikrostruktur 100 umfasst in ihrer einfachsten Ausbil- dung ein Substrat 102, in dem mindestens eine Mikrokavität 104 ausgebildet ist. Im Folgenden werden diese Mikrokavitäten 104 auch als Töpfchen, Öffnungen oder Aperturen bezeichnet und sollen einseitig offene Hohlräume bezeichnen, die Abmessungen von weniger als etwa einem Millimeter aufweisen. Diese Abmessungen sind vor allem durch die noch stabile Größe der sie frei hängend überspannenden Lipidschicht bestimmt. Unter„Lipidschichten" werden nachfolgend Membranen verstanden, die aus membranbildenden Lipiden bestehen. Membranbildende Lipide sind Lipide, die einen hydrophilen und einen hydrophoben Teil besitzen - also amphiphil sind. Dies erlaubt es ihnen, in polaren Lösungsmitteln wie Wasser je nach Beschaffenheit entweder Mizellen (kugelförmige Ag- gregate aus amphiphilen Molekülen, die sich in einem Dispersionsmedium spontan zusammenlagern) oder Doppellipidschichten zu bilden - wobei immer der hydrophile Teil mit dem polaren Lösungsmittel interagiert. Aus diesen Doppellipidschichten sind, mit Ausnahme der Membranen von Archaeen, alle Biomembranen aufgebaut, welche den Inhalt einer Zelle gegen die Umgebung abgrenzen. In der vorliegenden Anmeldung werden die Begriffe Bilipidschicht, Doppellipidschicht und Lipiddoppelschicht synonym verwendet.
Über den Mikrokavitäten 104 ist ein Mikrokanal 106 angeordnet. Der Mikrokanal wird durch eine Deckschicht 108 auf der den Mikrokavitäten 104 abgewandten Seite begrenzt und ist beispielsweise in einer Deckplatte ausgebildet. Erfindungsgemäß werden der Mikrokanal 106 und die Mikrokavitäten 104 zunächst mit einer wässrigen Phase 110 befüllt. Wie in Fig. 1 gezeigt, wird in die wässrige Phase 1 10 eine Lipidphase 112 eingebracht. Beispielsweise mit Hilfe einer Mikropumpe oder einer Spritze wird die Lipidphase 1 12 unter Ausbildung eines laminaren Strömungsprofils in Richtung 114 (auf die Apertur zu) über die erste Apertur 104 geleitet. Die Lipidmoleküle 116 ordnen sich dabei, wie schematisch dargestellt, so an, dass ihre hydrophilen Enden auf die wässrige Phase 1 10 hin orientiert sind, während ihre lipophilen Enden auf die Lipidphase 112 hin orientiert sind. Das Material des Substrats 102 ist dabei entweder komplett aus hydrophobem Material oder oberflächenbeschichtet, so dass den Lipidmolekülen eine hydrophobe Oberfläche präsentiert wird. Wie dies in Fig. 2 symbolisiert ist, stoppt in einem nächsten Verfahrensschritt der Durchlauf über der Mikrokavität 104 und es kann sich eine Lipidmonoschicht über der Öffnung der Mikrokavität 104 ausbilden.
Erfindungsgemäß wird nun durch Umkehrung des Pumpdrucks die Lipidphase 1 12 in die Gegenrichtung 1 18 wiederum unter Ausbildung eines laminaren Strömungsprofils von der Apertur 104 fortbewegt. Dabei bildet sich, wie in Fig. 3 symbolisch gezeigt, die gewünschte Lipiddoppelschicht über der wassergefüllten Mikrokavität 104 aus. Diese, wie aus den späteren Ausführungen noch deutlich wird, reproduzierbare Ausbildung von Bilipidschichten entsteht durch das gerichtete Bewegen eines definierten Volumens einer Lipidlösung über die Kavität und wieder davon weg. Wie weiterhin aus Fig. 4 hervorgeht, kann die Bewegung des Lipidlösungsvolumens unmittelbar über die gemessenen elektrischen Parameter, insbesondere der Ohmsche Widerstand und die Kapazität, rückgekoppelt werden. Die Mikrostruktur gemäß Fig. 4 umfasst neben den bereits mit Bezug auf Fig. 1 , 2 und 3 erläuterten Bestandteilen außerdem mindestens eine Messelektrode 120, sowie mindestens eine Gegenelektrode 122. Mit Hilfe dieser Anordnung können Messungen wie in der Dissertation Baaken, Gerhard: „Entwicklung einer mikrosystemtechnischen Plattform für parallele Untersuchungen von lonenkanälen in artifiziellen Zellenmembranen", Albert- Ludwig-Universität, Freiburg im Breisgau, November 2008, gezeigt ist, durchgeführt werden.
Insbesondere kann durch Anlegen einer definierten, zeitlich variablen Potenzialdifferenz der Stromfluss zwischen der in der Kavität befindlichen Messelektrode 120 und der außerhalb der Kavität 104 befindlichen Gegenelektrode 122 erfasst werden. Die unterschiedliche e- lektrische Leitfähigkeit der wässrigen Elektrolytphase 110 und des hydrophoben Lösungsmittels 112 verursachen Veränderungen in der Stromamplitude. Dies kann erfindungsgemäß zur Detektion des hydrophoben Lösungsmittelvolumens über der Kavität verwendet werden und kann im Falle einer direkten Verbindung zu einer elektrisch ansteuerbaren Pumpe zu einer Rückkopplung an die Pumpe verwendet werden. Weiterhin kann die einwandfreie Funktionsfähigkeit der aufgebrachte Bilipidschicht unmittelbar überprüft werden.
Als Elektrodenmaterial für die Elektroden 120 kommt dabei zum einen ein Edelmetall wie beispielsweise Gold in Frage. Bevorzugt kann aber auch, um das elektrochemische Verhalten der polarisierbaren Goldelektroden mit Hilfe einer mikrogalvanischen Beschichtung in das Verhalten einer nichtpolarisierbaren Elektrode umzuändern, die Goldelektrode so beschichtet werden, dass sie eine Silber-Silberchlorid-Elektrode darstellt. Dies kann beispielsweise entsprechend der Verfahren aus der obengenannten Dissertation Baaken erfolgen. Auch die Gegenelektrode 122 kann mit einer entsprechenden Beschichtung versehen werden, um eine Silber-Silberchlorid-Elektrode auszubilden und dadurch ein stabiles Referenzpotential zu erhalten. Andere mögliche Ausführungsformen der Elektroden beinhalten die Beschichtung mit Platinschwarz oder Iridiumoxid.
Wie in Fig. 5 schematisch dargestellt, kann mit einem derartigen Elektrodensystem und einer zugehörigen Steuer- und Auswerteeinheit 124 eine entsprechende Pumpe 126 direkt angesteuert werden. Ein solcher geschlossener Regelkreislauf ermöglicht eine vollautoma- tisierte Beschichtung derartiger Mikrostrukturen. Selbstverständlich muss die Pumpe 126 keine Mikropumpe sein, sondern kann jede andere geeignete Form aufweisen. Das Vorsehen einer Mikropumpe ermöglicht aber, dass die Mikrostruktur mit den Mikrokavitäten 104 zusammen mit der Pumpe und gegebenenfalls auch zusammen mit der Elektronik der Steuer- und Auswerteeinheit 124 als ein integriertes Mikrosystem hergestellt wird.
Mit Bezug auf die Fig. 6 und 7 soll nachfolgend die Herstellung einer Mikrostruktur mit vier Mikrokavitäten 104 erläutert werden. In einem ersten Schritt wird ein Substrat, beispielsweise aus Glas, bereitgestellt. Aufschleudern und Belichten eines Negativfotolacks liefert eine Maske für die Abscheidung der Metallschichten für die Messelektroden 120. Diese werden, wie in Schritt IV gezeigt, beispielsweise durch Aufdampfen erzeugt. In Schritt V wird die Fotolackschicht entfernt, so dass die überschüssigen Metallflächen dadurch entfernt werden. Erfindungsgemäß besteht die Wandung der Mikrokavitäten 104 aus einem SU8-Fotolack. Dieser kann direkt über eine Fototechnik mit den gewünschten Strukturen hergestellt werden. Wie in Schritt VIII gezeigt, kann mit Hilfe einer Galvanotechnik nunmehr die erforderliche Metallisierung zur Herstellung einer Silber-Silberchlorid-Elektrode aufgebracht werden.
Fig. 7 zeigt in perspektivischer Darstellung den entstehenden Chip, der durch Anbringen einer Deckschicht, z. B. in Form einer weiteren Glasstruktur, zu einem geschlossenen System wird. In dieser Deckschicht, die hier nicht gesondert gezeigt ist, werden außerdem die Kanalstrukturen hergestellt, die beispielsweise je zwei der Aperturen 104 entsprechend der Anordnung aus den Figuren 1 bis 3 miteinander verbinden.
Mit Hilfe des in Kapitel 4 der Dissertation Baaken, Gerhard:„Entwicklung einer mikrosys- temtechnischen Plattform für parallele Untersuchungen von lonenkanälen in artifiziellen Zellenmembranen", Albert-Ludwig-Universität, Freiburg im Breisgau, November 2008, beschriebenen Modellproteins Alamethicin kann belegt werden, dass sich über den Aperturen tatsächlich funktional aktive Bilipidschichten ausgebildet haben. Die Fig. 8, 9 und 10 zeigen exemplarisch die Ergebnisse einer Messung, die an den erfindungsgemäßen Mikrostruktu- ren durchgeführt wurde.
Dabei wurden Versuche durchgeführt, bei denen Lipiddoppelschichten mit eingebauten A- lamethicin-Kanälen aufgebracht und vermessen wurden. Wie in der Dissertation Baaken im Detail dargelegt, bildet Alamethicin abhängig von einem angelegten transmembranären Potential Poren in Membranen, und zwar ausschließlich in Bilipidschichten, aus. Daher kann durch Anlegen eines Potentials zwischen der Messelektrode 120 und der Gegenelektrode 122 ein Stromfluss durch die Poren in der Bilipidmembran gemessen werden. Werden erfolgreich Alamethicin-Kanäle in den die Töpfchen überspannenden Lipidschichten einge- baut, zeigt der gemessene Strom typische Fluktuationen, die einer Treppenfunktion mit unterschiedlichen Leitfähigkeitsstufen ähneln. Diese unterschiedlichen Leitfähigkeitsstufen repräsentieren Poren mit einer unterschiedlichen Anzahl von Alamethicin-Monomeren.
Fig. 8 zeigt dabei einen Überblick über den Stromverlauf bei konstanter Haltespannung als Funktion der Zeit. Fig. 9 stellt ein Histogramm der Messwerte aus Fig. 8 dar, das belegt, dass eine elektrisch sehr hochohmige Schicht entstanden ist, und Fig. 10 ist eine Ausschnittsvergrößerung des Zeitbereichs zwischen 510 und 520 ms. Insbesondere die Treppenform des Stromverlaufs in Fig. 10 stellt in Übereinstimmung mit den Resultaten der Dissertation Baaken die charakteristische Kurve für eine funktionsfähige Bilipidmembran mit darin eingelagerten Alamethicinporen dar. Dieses Verhalten schließt aus, dass lediglich eine ungeordnete Anhäufung von Protein für den hohen Isolationswiderstand verantwortlich ist.
Die Messergebnisse der Figuren 8 bis 10 belegen also eindeutig, dass mit der erfindungsgemäßen Herstellungsmethode eine funktionale Lipiddoppelschicht über dem entsprechen- den Töpfchen in dem Kanal hergestellt wurde.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Herstellen einer Bilipidschicht über einer einseitig offenen, in einem Substrat ausgebildeten Mikrokavität mit den folgenden Schritten:
Befüllen der Mikrokavität sowie teilweises Bedecken des die Mikrokavität enthaltenden Substrats mit einer Elektrolytlösung, so dass zwischen der Elektrolytlösung in der Mikrokavität und der Elektrolytlösung auf dem Substrat Kontinuität besteht;
Bewegen eines gelöste Lipide enthaltenden Fluids, das eine Lipidphase bildet, innerhalb der das Substrat bedeckenden wässrigen Elektrolytlösung in einer ersten Richtung auf die Mikrokavität zu;
Einstellen und Überwachen der Position der Lipidphase auf der Mikrokavität durch Erfassen eines erhöhten Gleichstromwiderstandes oder einer Impedanz zwischen einer mit der außerhalb der Kavität befindlichen verbundenen Gegenelektrode und einer Messelektrode, die im Inneren der Mikrokavität angeordnet ist;
Bewegen der Lipidphase in einer zweiten Richtung von der Mikrokavität weg;
Überwachen des Ausbildens der Bilipidschicht über der Mikrokavität durch Erfassen eines Gleichstromwiderstandes, einer Impedanz und/oder einer Kapazität zwischen einer mit dem Fluid verbundenen Gegenelektrode und einer Messelektrode, die im Inneren der Mikrokavität angeordnet ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Bewegen der Lipidphase in einem Flüssigkeitsstrom erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die erste und die zweite Richtung entgegengesetzt gerichtet sind und die Strömung laminar ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Bewegen der Lipidphase durch Bewegung eines hängenden Tropfens dieses Fluids erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 4 wobei der hängende Tropfen an einer beweglichen Pipette oder an einem zum Bewegen eines Tropfens angepassten planaren Substrat adhäriert.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zum Erfassen der Impedanz zwischen der Messelektrode und der Gegenelektrode eine definierte zeitlich variierende elektrische Potentialdifferenz angelegt wird und eine Veränderung einer Amplitude eines elektrischen Stroms zwischen den Elektroden überwacht wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die zeitlich variierende Spannungsdifferenz die Form von Rechteckpulsen mit Amplituden zwischen 1 und 100 mV, vorzugsweise zwischen 1 und 30 mV, und einer Dauer von 5 ms bis 500 ms hat, oder wobei die zeitlich variierende Spannungsdifferenz die Form von Rampen mit einer Spitzenamplitude zwischen 1 und 100 mV, vorzugsweise zwischen 1 und 30 mV, und einer Dauer von 5 ms bis 500 ms hat, oder wobei die zeitlich variierende Spannungsdifferenz die Form einer Sinuskurve mit einer Spitze-zu-Spitze-Amplitude von 1 bis 500 mV und einer Frequenz von 0,1 Hz bis 1 MHz hat, vorzugsweise von 1 Hz bis 20 kHz, hat.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Fluid ein hydrophobes Lösungsmittel umfasst.
9. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das hydrophobe Lösungsmittel Hexadekan, Do- dekan, Dekan, Oktan, Hexan oder Pentan sowie Mischungen dieser Substanzen umfasst, wobei die Auswahl der Reinsubstanzen oder die Mischung den Größendimensionen der Kavität so angepasst wird, dass eine möglichst schnelle und sichere Ausbildung der Bilipidschicht resultiert.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der ohmsche Widerstand und die Kapazität zwischen der Messelektrode und der Gegenelektrode überwacht werden.
11. Mikrostruktur zum Untersuchen von Lipiddoppelschichten, wobei die Mikrostruktur (100) ein Substrat (102) aufweist, in welchem mindestens eine einseitig offene Mik- rokavität (104) ausgebildet ist, wobei im Inneren der Mikrokavität (104) mindestens eine Messelektrode (120) angeordnet ist und wobei die mindestens eine Mikrokavität (104) so mit einem Fluidkanal (106) verbunden ist, dass die Mikrokavität von einem laminaren Fluidstrom mit mindestens zwei unterschiedlichen Strömungsrichtungen überströmt werden kann.
12. Mikrostruktur nach Anspruch 1 1 , wobei die Messelektrode den Boden der Kavität bildet.
13. Mikrostruktur nach Anspruch 1 1 oder 12, wobei außerhalb der Mikrokavität mindestens eine Gegenelektrode (122) angeordnet ist, um das Fluid elektrisch zu kontaktieren, welches das Substrat bedeckt.
1 . Mikrostruktur nach Anspruch 13, wobei die mindestens eine Gegenelektrode sich in einem Fluidkanal (106) befindet oder mit diesem elektrisch verbunden ist.
15. Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14, wobei in dem Substrat (102) eine Vielzahl von arrayförmig angeordneten Mikrokavitäten (104) vorgesehen ist.
16. Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 1 1 bis 15, wobei jede der Vielzahl von Mikrokavitäten (104) mindestens eine elektrisch separat kontaktierbare Messelektrode (120) aufweist.
17. Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 1 1 bis 16, weiterhin umfassend eine Mikro- pumpe (126) zum bidirektionalen Fördern des Fluids.
18. Mikrostruktur nach Anspruch 17, wobei die Mikropumpe (126) in dem Substrat (102) integriert ist.
19. Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 1 1 bis 18, wobei das Substrat (102) aus einem hydrophoben Material hergestellt ist oder mit einer hydrophoben Oberflächen- beschichtung versehen ist.
20. Mikrostruktur nach Anspruch 19, wobei das Substrat (102) durch ein photostruktu- rierbares Epoxidharz auf einem Glasträger gebildet ist.
21. Mikrostruktur nach Anspruch 20, wobei die mindestens eine Messelektrode (120) durch eine Leiterbahnstruktur auf dem Glasträger ausgebildet ist.
22. Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 11 bis 21 , wobei die mindestens eine Messelektrode (120) eine Silber/Silberchlorid-Elektrode ist.
23. Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 1 1 bis 22, wobei die mindestens eine Mikrokavität einen größten Durchmesser von 1 μηι bis 300 μηι, vorzugsweise 2 μιτι bis 100 μιτη, sowie ein Aspektverhältnis zwischen 0,1 und 100, vorzugsweise zwischen 0,3 und 10, aufweist.
24. Messanordnung enthaltend eine Mikrostruktur nach einem der Ansprüche 1 1 bis 23, wobei die Messelektroden und mindestens eine Gegenelektrode an einen für elektri- sehe Widerstands-, Impedanz- und/oder Kapazitätsmessungen geeigneten Verstärker, vorzugsweise einen Potentiostaten, Voltage-Clamp- oder Patch-Clamp- Verstärker, angeschlossen sind.
25. Messanordnung enthaltend eine Mikrostruktur zum Untersuchen von Lipiddoppel- schichten mit einem Substrat (102) in welchem mindestens eine einseitig offene Mik- rokavität (104) ausgebildet ist, wobei im Inneren der Mikrokavität (104) mindestens eine Messelektrode (120) angeordnet ist und wobei die Messelektroden und mindestens eine Gegenelektrode an einen für elektrische Widerstands-, Impedanz- und/oder Kapazitätsmessungen geeigneten Verstärker, vorzugsweise einen Potentiostaten, Voltage-Clamp- oder Patch-Clamp-Verstärker, angeschlossen sind, wobei die Mikrostruktur in ein aufrechtes oder inverses Mikroskop zur optischen Betrachtung und Analyse der Bilipidschicht integriert ist.
26. Messanordnung enthaltend eine Mikrostruktur zum Untersuchen von Lipiddoppel- schichten mit einem Substrat (102) in welchem mindestens eine einseitig offene Mikrokavität (104) ausgebildet ist, wobei im Inneren der Mikrokavität (104) mindestens eine Messelektrode (120) angeordnet ist und wobei die Messelektroden und mindestens eine Gegenelektrode an einen für elektrische Widerstands-, Impedanz- und/oder Kapazitätsmessungen geeigneten Verstärker, vorzugsweise einen Potentiostaten, Voltage-Clamp- oder Patch-Clamp-Verstärker, angeschlossen sind, wobei die Mikrostruktur zum Bewegen der Lipidphase im Fluidstrom oder in Form eines hängenden Tropfens in einen Pipettierautomaten integriert ist.
27. Messanordnung enthaltend eine Mikrostruktur zum Untersuchen von Lipiddoppel- schichten mit einem Substrat (102) in welchem mindestens eine einseitig offene Mikrokavität (104) ausgebildet ist, wobei im Inneren der Mikrokavität (104) mindestens eine Messelektrode (120) angeordnet ist und wobei die Messelektroden und mindes- tens eine Gegenelektrode an einen für elektrische Widerstands-, Impedanz- und/oder Kapazitätsmessungen geeigneten Verstärker, vorzugsweise einen Potentiostaten, Voltage-Clamp- oder Patch-Clamp-Verstärker, angeschlossen sind, wobei die Mikrostruktur mit einer Pumpe zur Erzeugung von Fluidströmen in der Mikrostruktur verbunden ist.
28. Messanordnung enthaltend eine Mikrostruktur zum Untersuchen von Lipiddoppel- schichten mit einem Substrat (102) in welchem mindestens eine einseitig offene Mik- rokavität (104) ausgebildet ist, wobei im Inneren der Mikrokavität (104) mindestens eine Messelektrode (120) angeordnet ist, wobei die Messelektroden und mindestens eine Gegenelektrode an einen für elektrische Widerstands-, Impedanz- und/oder Kapazitätsmessungen geeigneten Verstärker, vorzugsweise einen Potentiostaten, Voltage-Clamp- oder Patch-Clamp-Verstärker, angeschlossen sind, wobei ein elektronisches Datenaufnahme- und Steuersystem mit Steuer- und Auswerteeinheiten vorgesehen ist, um die jeweils für die Bewegung der Lipidphase vorgesehenen Einrichtungen in Abhängigkeit von in Echtzeit erfassten Werten von Gleichstromwiderstand, Impedanz und/oder Kapazität zu steuern.
29. Messanordnung nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei sich in der Bilipid- schicht mindestens ein Membranprotein, das die Membran durchspannt oder mit ihr assoziiert ist, befindet, so dass die Bilipidschicht mindestens eine lonenleitfähigkeit und/oder mindestens eine andere mit elektrischen oder optischen Methoden nachweisbare biophysikalische Eigenschaft erhält.
EP11727916.6A 2010-06-07 2011-06-01 Verfahren zum herstellen einer bilipidschicht sowie mikrostruktur und messanordnung Withdrawn EP2577301A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102010022929A DE102010022929B4 (de) 2010-06-07 2010-06-07 Verfahren zum Herstellen einer Bilipidschicht sowie Mikrostruktur und Messanordnung
PCT/EP2011/002738 WO2011154114A2 (de) 2010-06-07 2011-06-01 Verfahren zum herstellen einer bilipidschicht sowie mikrostruktur und messanordnung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2577301A2 true EP2577301A2 (de) 2013-04-10

Family

ID=44627563

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP11727916.6A Withdrawn EP2577301A2 (de) 2010-06-07 2011-06-01 Verfahren zum herstellen einer bilipidschicht sowie mikrostruktur und messanordnung

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20130140192A1 (de)
EP (1) EP2577301A2 (de)
JP (1) JP2013534619A (de)
DE (1) DE102010022929B4 (de)
WO (1) WO2011154114A2 (de)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100196203A1 (en) 2007-02-20 2010-08-05 Gurdial Singh Sanghera Formation of Lipid Bilayers
GB0724736D0 (en) 2007-12-19 2008-01-30 Oxford Nanolabs Ltd Formation of layers of amphiphilic molecules
DE102011008205A1 (de) * 2011-01-10 2012-07-12 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Verfahren zur automaisierten Herstellung einer Molekülschicht aus amphiphilen Molekülen und Vorrichtung zum Herstellen dieser Molekülschicht
GB201202519D0 (en) 2012-02-13 2012-03-28 Oxford Nanopore Tech Ltd Apparatus for supporting an array of layers of amphiphilic molecules and method of forming an array of layers of amphiphilic molecules
GB201313121D0 (en) 2013-07-23 2013-09-04 Oxford Nanopore Tech Ltd Array of volumes of polar medium
US9567630B2 (en) 2013-10-23 2017-02-14 Genia Technologies, Inc. Methods for forming lipid bilayers on biochips
GB201418512D0 (en) 2014-10-17 2014-12-03 Oxford Nanopore Tech Ltd Electrical device with detachable components
GB201611770D0 (en) 2016-07-06 2016-08-17 Oxford Nanopore Tech Microfluidic device
EP3583420B1 (de) * 2017-02-14 2023-08-16 Axbio Inc. Vorrichtung und verfahren zur kontinuierlichen diagnostik von makromolekülen
AU2020239385A1 (en) 2019-03-12 2021-08-26 Oxford Nanopore Technologies Plc Nanopore sensing device and methods of operation and of forming it
CN113061531B (zh) * 2021-06-03 2021-08-20 成都齐碳科技有限公司 芯片结构、芯片组件、成膜方法、纳米孔测序装置及应用
CN114908358A (zh) * 2022-04-14 2022-08-16 广州孔确基因科技有限公司 一种两亲性分子层的制备方法及装置

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585069A (en) * 1994-11-10 1996-12-17 David Sarnoff Research Center, Inc. Partitioned microelectronic and fluidic device array for clinical diagnostics and chemical synthesis
WO2003011553A1 (en) * 2001-07-31 2003-02-13 Massachusetts Institute Of Technology On-chip membrane maker
ITTO20020809A1 (it) * 2002-09-17 2004-03-18 St Microelectronics Srl Micropompa, in particolare per un dispositivo integrato di analisi del dna.
DE10361927B4 (de) * 2003-12-19 2006-12-14 Technische Universität Dresden Ionenkanal-Sensorarray
US20100196203A1 (en) * 2007-02-20 2010-08-05 Gurdial Singh Sanghera Formation of Lipid Bilayers
JP5441142B2 (ja) 2007-11-26 2014-03-12 国立大学法人 東京大学 マイクロ流体による平面脂質二重膜アレイ及びその平面脂質二重膜を用いた分析方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2011154114A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE102010022929A1 (de) 2011-12-08
DE102010022929B4 (de) 2013-07-18
WO2011154114A3 (de) 2012-03-08
WO2011154114A2 (de) 2011-12-15
US20130140192A1 (en) 2013-06-06
JP2013534619A (ja) 2013-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102010022929B4 (de) Verfahren zum Herstellen einer Bilipidschicht sowie Mikrostruktur und Messanordnung
EP1218736B1 (de) Vorrichtung zum messen an in einer flüssigen umgebung befindlichen zellen
DE112008003078B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zur einseitigen Doppelschichtbildung
EP1040349B1 (de) Positionierung und elektrophysiologische charakterisierung einzelner zellen und rekonstituierter membransysteme auf mikrostrukturierten trägern
DE60025929T2 (de) Anordnung und verfahren zum feststellen und/oder überwachen elektrophysiologischer eigenschaften von ionenkanälen
EP0938674B1 (de) Mikroelementenanordnung, verfahren zum kontaktieren von in einer flüssigen umgebung befindlichen zellen und verfahren zum herstellen einer mikroelementenanordnung
EP1178315A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung von Zellen mit Hilfe der Patch Clamp-Methode
WO2002003058A2 (de) Vorrichtung und verfahren zum elektrischen kontaktieren von in einer flüssigkeit in suspension befindlichen biologischen zellen
DE60311973T2 (de) Substrat und verfahren zum messen elektrophysiologischer eigenschaften von zellmembranen
WO2002066596A2 (de) Vorrichtung und verfahren zur untersuchung von ionenkanälen in membranen
EP2049894B1 (de) Vorrichtung und verfahren zum erfassen von partikeln mit pipette und nanopore
DE112007001257T5 (de) Vorrichtung und Verfahren zum Sensieren eines zeitvarianten Ionenstroms in einem elektrolytischen System
DE19848112C2 (de) Minimalinvasives Sensorsystem
EP1315553A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur separation von ungelösten bestandteilen aus biologischen flüssigkeiten
EP3140390A1 (de) Verfahren und vorrichtungen zur in-vitro-herstellung von anordnungen von zellschichten
DE602004005681T2 (de) Kapillarsperre
EP2663860B1 (de) Mikrostrukturvorrichtung zur messung an molekularen membranen und ein verfahren zur herstellung dieser mikrostrukturvorrichtung
DE102011120394B4 (de) Verfahren und Mikrostrukturvorrichtung zur elektrischen Kontaktierung biologischer Zellen
DE102005030858A1 (de) Elektrodenanordnung, deren Verwendung sowie Verfahren zu deren Herstellung
EP1807696B1 (de) Vorrichtung und verfahren zur messung von zelleigenschaften
DE10157070A1 (de) Anordnung zur Messung von durch Ionenkanäle fließende Ionenströme, sowie Verfahren zur Herstellung dieser und Messverfahren
EP2663861B1 (de) Verfahren zur automatisierten herstellung einer molekülschicht aus amphiphilen molekülen und vorrichtung zum herstellen dieser molekülschicht
DE102013217694A1 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Messung an Membranen und Zellen
DE102008012760B4 (de) Vorrichtung zur elektrischen Kontaktierung biologischer Zellen
WO2004100229A2 (de) Biokompatible sensorelektrodenanordnung und verfahren zu deren herstellung

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20130102

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

17Q First examination report despatched

Effective date: 20131025

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20141104