DE10157070A1 - Anordnung zur Messung von durch Ionenkanäle fließende Ionenströme, sowie Verfahren zur Herstellung dieser und Messverfahren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur flächenaufgelösten Messung von durch Ionenkanäle (1) fließende Ionenströme, bestehend aus DOLLAR A - einer dünnen Polymerschicht (3), die eine Vielzahl von Durchbrüchen (5) aufweist, DOLLAR A - in den Durchbrüchen (5) Ionenkanäle (1) fest vermittels einer dünnen, planaren Membran (2) verankert sind, DOLLAR A - die Polymerschicht (3) an einer Seite mit einer Metallschicht (8) verbunden ist, DOLLAR A - die von Membran (2) und Metallschicht (8) begrenzten Durchbrüche (5) so beschaffen sind, dass sich ein Reservoir zum Ansammeln chemischer Substanzen bildet, und DOLLAR A - die von der Anordnung erzeugten Signale mit Mitteln zur Messung der Oberflächenplasmonen-Resonanz erfassbar sind. DOLLAR A Beschrieben ist ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Anordnung sowie ein Verfahren zur flächenaufgelösten Messung mit der Anordnung. DOLLAR A Mit der Erfindung lässt sich das von außen durch chemische Substanzen induzierte Schalten und/oder die Inhibierung von Ionenkanälen flächenaufgelöst abbilden.

Description

• Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur flächenaufgelösten Messung von durch Ionenkanäle fließende Ionenströme. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Anordnung zur flächenaufgelösten Messung von durch Ionenkanäle fließende Ionenströme. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur flächenaufgelösten Messung von durch Ionenkanäle fließende Ionenströme nach dem Oberbegriff des Anspruchs 17.
• Ionenkanäle sind Proteine die ausgelöst durch bestimmte Substanzen oder Ionenkonzentrationen einen Ionenstrom steuern. Wird das Öffnen und Schließen der Ionenkanäle durch chemische Verbindungen gesteuert, so spricht man von ligandengesteuerten Ionenkanälen. Im anderen Fall führen bestimmte Konzentrationsunterschiede von Ionen zwischen den beiden Seiten der Ionenkanäle zum Öffnen bzw. Schließen der Ionenkanäle. Die technische Nutzung von Ionenkanälen steht seit einigen Jahren im Mittelpunkt unterschiedlicher Forschungsaktivitäten. Obwohl das Wissen um die Funktionsweise von Ionenkanälen durch die Anwendung der Patch-Clamp-Technik zur Detektion der Ionenströme durch einzelne Ionenkanäle einen enormen Zuwachs erfahren hat, ist es bislang jedoch nur bedingt gelungen, isolierte Ionenkanäle so einzubauen, dass technische Anwendungen möglich werden. Neben der Anwendung nativer Ionenkanäle werden auch synthetische Nachbildungen eingesetzt.
• Für einige Anwendungen können die extrem hohen Anforderungen bei der Fusion natürlicher Ionenkanäle in synthetische Matrizes mit der Entwicklung künstlicher Ionenkanäle umgangen werden. Dazu wurden in den vergangenen Jahren zahlreiche polymere Strukturen untersucht. Ionenkanäle erfordern eine spezielle Umgebung, wobei häufig natürliche Lipidschichten eingesetzt werden. Planare Lipiddoppelschichten lassen sich entweder freistehend (BLM - black lipid membrane) oder trägerfixiert (SPM - supported planar membrane) präparieren. Bei der Herstellung von BLMs setzt man hauptsächlich zwei unterschiedliche Techniken ein, die Streichtechnik und die Langmuir-Blodgett-Technik. Für den Aufbau von Lipidschichten in polymeren Mikroporen hat sich die Streichtechnik bewährt. Die Detektion der Ionentransportvorgänge wird überwiegend mit elektrochemischen Methoden realisiert.
• In dem Journal Nature, 387 (1997), 580-583, werden auf modifizierten Gramicidin-Kanälen beruhende Sensoren mit elektrochemischem Transducer beschrieben. Obgleich sich elektrochemische Methoden durch eine hohe Empfindlichkeit und weite Modifizierbarkeit auszeichnen, ist der Durchbruch für eine breite praktische Anwendung noch nicht gelungen. Hauptsächlich die extrem hohen Anforderungen an die Güte sowohl der Lipidmembran als auch der Transduceroberfläche haben immer wieder zu Einschränkungen der Akzeptanz außerhalb des Labors geführt.
• Die Kopplung von Lipiddoppelschichten an Oberflächen unter Beibehaltung ihrer Eigenschaften ist von besonderem Interesse für den Aufbau von membrangestützten Systemen. Bereits ein einzelner "Kurzschluss" zwischen Elektrodenoberfläche und dem Biofluid führt zur Unbrauchbarkeit des gesamten Meßsystems. Gegenüber solchen ganz natürlich auftretenden Defekten sind optische Methoden toleranter. Als sehr empfindliche Methode hat sich die Oberflächenplasmonen Resonanz (SPR) erwiesen. In dem Journal Nature, 332 (1988), 615-617 wurde erstmals die flächenaufgelöste SPR beschrieben. Aber auch die Reflexionsinterferenz-Spektroskopie (RifS) weist eine hohe Empfindlichkeit auf und zeigt nur eine geringe Temperaturabhängigkeit. Beide Methoden lassen sich parallelisieren und erlauben kontinuierliche Messungen.
• Für eine Verbindung mit optischen Transduceroberflächen ist eine spezielle Oberflächenchemie erforderlich. So werden in dem Journal Colloids and Surfaces A 161 (2000), 115-137 Oberflächen beschrieben auf der sich die in einer Membran integrierten Ionenkanäle verankern lassen. Für diese zunächst gegensätzlich erscheinenden Anforderungen finden in jüngster Zeit zunehmende polymere Strukturen Aufmerksamkeit, die sich durch eine starke, jedoch geordnete Verzweigung auszeichnen und gleichzeitig über eine hohe Funktionalität an den Kettenenden verfügen können. Hochverzweigte Polymere und Polymere mit dendritischen Bausteinen erlauben vielversprechende Entwicklungen in diese Richtung mit einem breiten perspektivischen Anwendungspotential. Erste Beispiele zur Polymerisation von dendritischen Einheiten, die zu interessanten Überstrukturen im Nanometerbereich führten, wurden beschrieben.
• Aus der DE 199 61 951 A1 ist ein Verfahren zur Herstellung einer biosensorischen Schicht und eine Vorrichtung zur Messung mit derartigen Schichten bekannt. Das Verfahren besteht darin, dass in eine 2 bis 30 µm dünne Schicht aus Polyester durch Beschuss mit Ionen und anschließender Ätzung Löcher eingebracht werden, die einen mittleren Durchmesser von 400 nm bis 40 µm aufweisen. Die so hergestellten Löcher in der Schicht werden mit einer eine Lipiddoppelschicht ausbildenden Flüssigkeit unter Normaldruck gefüllt, wobei in die Lipiddoppelschicht anschließend Ionenkanäle eingebracht werden. Die biosensorische Schicht wird in eine Vorrichtung eingelegt, bei der mittels der Schicht zwei voneinander getrennte Messkammern gebildet werden, und ein durch die Ionenkanäle der Schicht von einer Kammer zur anderen fließender Ionenstrom messbar ist. Eine flächenaufgelöste Messung von Ionenströmen ist mit dieser Lösung nicht möglich.
• Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, durch eine Detektion das Schalten von Ionenkanälen als Folge der Anwesenheit bestimmter biochemischer Substanzen mit großer Empfindlichkeit und flächenaufgelöst zu erfassen, so dass mehrere, auch unterschiedliche Ionenkanäle, gleichzeitig erfasst werden können.
• Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch eine Anordnung gelöst, die aus einer dünnen Polymerschicht besteht, die eine Vielzahl von Durchbrüchen ausweist, in den Durchbrüchen Ionenkanäle fest vermittels einer dünnen, planaren Membran verankert sind, die Polymerschicht an einer Seite mit einer Metallschicht verbunden ist, und die von Membran und Metallschicht begrenzten Durchbrüche so beschaffen sind, dass sich ein Reservoir zum Ansammeln chemischer Substanzen bildet, wobei die von der Anordnung erzeugten Signale mit Mitteln zur Messung der Oberflächenplasmonen Resonanz erfassbar sind.
• Vorteilhafte Weiterbildungen der Anordnung sind Gegenstand von abhängigen Unteransprüchen.
• Erfindungsgemäß wird die Aufgabe weiterhin durch ein Verfahren gelöst, bei dem in eine 2 bis 30 µm dünne Polymerschicht Durchbrüche eingebracht werden, die Durchbrüche mit einer eine Lipiddoppelschicht ausbildenden Flüssigkeit gefüllt werden, wodurch sich in den Durchbrüchen Membranen ausbilden, in die Membranen ein oder mehrere Ionenkanäle eingebracht werden, und die so erzeugte Polymerschicht auf eine Metallschicht aufgebracht wird, die zur Erzeugung und Erfassung von Signalen mittels der Oberflächenplasmonen Resonanz ausgebildet ist.
• Vorteilhafte Herstellungsvarianten sind Gegenstand von abhängigen Unteransprüchen.
• Erfindungsgemäß wird die Aufgabe ferner durch ein Verfahren zur flächenaufgelösten Messung von durch natürliche oder synthetische Ionenkanäle fließende Ionenströme mittels einer zuvor beschriebenen Anordnung dadurch gelöst, dass die Ionenkanäle zum Öffnen und/oder Schließen angeregt werden, die durch einen geöffneten Ionenkanal in ein zugehöriges Reservoir strömenden Ionen mittels der Oberflächenplasmonen Resonanz erfasst werden, und das erhaltene Signal flächenaufgelöst dargestellt wird.
• Vorteilhafte Varianten des Messverfahrens werden in den abhängigen Unteransprüchen genannt.
• Gemäß der Erfindung wird zur optischen Messung des Ionenstroms durch Ionenkanäle die Oberflächenplasmonen Resonanz eingesetzt. Dabei sammeln sich die durch einen geöffneten Ionenkanal gelangten Ionen in ein allseitig abgegrenztes Reservoir an, so dass lokale Aktivitäten flächenaufgelöst gemessen werden können. Um das zu erreichen muss die für die Oberflächenplasmonen Resonanz erforderliche Metallschicht mit einer dünnen strukturierten Schicht fest verbunden sein. Hierzu können vorzugsweise polymere Schichten oder Folien mit gezielter Mikrostrukturierung eingesetzt werden. Vorteilhaft kann die Polymerschicht durch eine spezielle ultradünne Verbindungsschicht fest mit der Metalloberfläche verbunden werden. Zur Aufnahme der Ionenkanäle und für die Ausbildung eines Reservoirs werden Durchbrüche mit wenigen Mikrometern Durchmesser in die Polymerschicht eingebracht. In diese kleinen Hohlräume lassen sich die Ionenkanäle fest einsetzen. Es ist bekannt, dass natürliche Ionenkanäle nur in ihrer ursprünglichen nativen Lipidumgebung ordnungsgemäß schalten und schließen. Deshalb müssen die Ionenkanäle mit Hilfe einer Lipidmembran, die üblicherweise als Lipiddoppelschicht ausgebildet ist in die Durchbrüche eingebracht werden. Die Anordnung der Durchbrüche innerhalb der Polymerschicht kann regellos oder geordnet erfolgen. Für die getrennte Erfassung der Ionenkanalaktionen in verschiedenen Durchbrüchen wird als Verfahren die flächenaufgelöste Oberflächenplasmonen Resonanz eingesetzt. Ist ein bestimmter Ionenkanal infolge der Anwesenheit bestimmter chemischer Stoffe geöffnet so verändern die durchgeströmten Ionen die elektrooptischen Eigenschaften in dem Reservoir die sich mit hoher Empfindlichkeit mittels der Oberflächenplasmonen Resonanz lokal erfassen lassen.
• Der Vorteil der Erfindung besteht darin, dass gleichzeitig unterschiedliche und über eine Fläche verteilt auftretende Ionenkanalaktionen gemessen werden können, wobei die Messung selbst die Funktionsfähigkeit der Ionenkanäle nicht beeinflußt und ebenso keine Rückwirkungen auf das Messmedium auftreten. Durch die über eine Fläche verteilte Messung lassen sich Messsysteme ähnlich der Biochips aufbauen.
• Nachfolgend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen:
• Fig. 1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Anordnung
• Fig. 2 eine elektronenmikroskopische Aufnahme einer für die Erfindung geeigneten Polymerschicht (3) mit Durchbrüchen (5) in Form von Rundlöchern
• Fig. 3 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Anordnung, bei der die Durchbrüche (5) für die Ionenkanäle (1) regelmäßig angeordnet und Kanäle (9) für einen Ionentransport eingebracht sind.
• In der Fig. 1 zeigt die linke Seite eine Darstellung einer erfindungsgemäßen Anordnung mit einem Ionenkanal 1 und die rechte Seite eine Anordnung mit zwei Ionenkanälen 1, 1' in der Membran 2. Auf einer Metallschicht 8 ist eine Verbindungsschicht 4 aufgebracht, mit der eine Polymerschicht 3 verbunden ist. Die Polymerschicht weist eine Vielzahl von Durchbrüchen 5 auf, die an der Verbindungsschicht 4 enden. Die Fig. 1 zeigt jeweils nur einen Durchbruch 5. Der Durchbruch 5 wird von einer Membran 2 in etwa zwei gleich große Reservoirs unterteilt. Im linken Teil der Fig. 1 ist der Zutritt der Ionen 6 in das untere Reservoir durch ein Öffnen des Ionenkanals 1 gewährleistet. Gemäß der Darstellung im rechten Teil der Fig. 1 gelangen die Ionen 6 über einen geöffneten Ionenkanal 1 in das untere Reservoir und durch einen geöffneten Ionenkanal 1' aus diesem wieder hinaus. In der Metallschicht 8 breitet sich ein Messlicht 7 aus.
• Natürliche oder synthetische Ionenkanäle 1 sind von einer geeigneten Membran 2 zu umschließen. Im Fall natürlicher Ionenkanäle werden vorzugsweise Lipide für die Ausbildung der Membran eingesetzt. Die eingeschlossenen Ionenkanäle 1 werden in einer Aussparungen die in Form eines Durchbruches 5 durch die Polymerschicht 3 ausgebildet ist fixiert. Dabei muss gewährleistet sein, dass auf beiden Seiten der Lipidmembran ein genügend großes Reservoir vorhanden ist. Insbesondere auf der zur Metalloberfläche 8 hin gerichteten Seite muss das Volumen für die durchströmenden Ionen 6 ausreichend sein. Das wird gewährleistet, indem das Volumen des Reservoir 5 wenige Kubikmikrometer umfasst. Um eine feste und dicht abschließende Haftung der Polymerschicht 3 auf der Oberfläche der Metallschicht 8 zu erreichen, ist die dünne haftvermittelnde Verbindungsschicht 4 vorgesehen.
• Es ist von Vorteil, unterschiedliche Ionenkanäle in einen Durchbruch 5 einzubringen. Werden zum Beispiel ligandengesteurte Ionenkanäle (hier Ionenkanal 1) zusammen mit spannungsgesteuerten Ionenkanälen (hier Ionenkanal 1') paarweise betrieben, so können ab Erreichen einer bestimmten Ionenkonzentration die Ionen 6 wieder auf die gegenüberliegende Membranseite transportiert werden. In jedem Fall erfolgt der Abgriff des Messsignals mittels der Oberflächenplasmonen Resonanz, wobei sich eine Lichtwelle als Messlicht 7 an der Oberfläche der Metallschicht 8 ausbreitet.
• Fig. 2 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme einer speziellen Polymerschicht 3. Mittels Elektronenstrahlen wurden durchgehende Löcher in die Membran eingebracht. In diese Durchbrüche 5 mit wenigen Mikrometer Durchmesser lassen sich nachfolgend die Ionenkanäle zusammen mit der umgebenden Membran einbringen.
• Fig. 3 zeigt schematisch eine Draufsicht auf eine erfindungsgemäße Anordnung. Die Durchbrüche 5 in der Polymerschicht 3 sind hier quadratisch dargestellt und regelmäßig angeordnet. Zwei der zwölf Durchbrüche 5 sind ohne und die übrigen mit Membran 2 dargestellt. Jede Membran 2 weist einen Ionenkanal 1 auf. Oberhalb und unterhalb der Membran 2 bildet sich im Durchbruch 5 ein Reservoir, das mit Strömungskanälen 9 verbunden ist.
• Ein Strömungskanal 9, der in das obere Reservoir führt, verläuft unter Berücksichtigung von Fig. 1 durch die Polymerschicht 3. Ein Strömungskanal zum unterhalb der Membran 2 liegenden Reservoir kann durch die Polymerschicht 3 oder durch die Verbindungsschicht 4 verlaufen. Gegenüber der Anordnung in Fig. 1 kann gemäß Fig. 3 von außen gezielt die Ionenkonzentration und die zu analysierende Substanz eingebracht oder abgeführt werden. Eine solche Anordnung lässt sich als Biochip für die gleichzeitige Detektion unterschiedlicher Substanzen einsetzen. Bezugszeichenliste 1 Ionenkanal
  2 Membran
  3 Polymerschicht
  4 Verbindungsschicht
  5 Durchbruch
  6 Ionen
  7 Messlicht
  8 Metallschicht
  9 Strömungskanal
  

Claims (21)

1. Anordnung zur flächenaufgelösten Messung von durch Ionenkanäle (1) fließende Ionenströme, bestehend aus
einer dünnen Polymerschicht (3), die eine Vielzahl von Durchbrüchen (5) ausweist,
in den Durchbrüchen (5) Ionenkanäle (1) fest vermittels einer dünnen, planaren Membran (2) verankert sind,
die Polymerschicht (3) an einer Seite mit einer Metallschicht (8) verbunden ist,
die von Membran (2) und Metallschicht (8) begrenzten Durchbrüche (5) so beschaffen sind, dass sich ein Reservoirs zum Ansammeln chemischer Substanzen bildet, und
die von der Anordnung erzeugten Signale mit Mitteln zur Messung der Oberflächenplasmonen Resonanz erfassbar sind.

2. Anordnung nach Anspruch 1, bei der die Ionenkanäle (1) zusammen mit der umgebenden Membran (2) in Durchbrüchen (5) der Polymerschicht (3) eingebracht sind und sich auf beiden Seiten der Membran (2) ein genügend großes Reservoir für die durch den Ionenkanal (1) strömenden Ionen (6) bildet.

3. Anordnung nach Anspruch 1 oder 2, bei der die Reservoirs ein Volumen von wenigen Kubikmikrometern aufweisen.

4. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der die Polymerschicht (3) mit der Membran (2) und den Ionenkanälen (1) mittels einer Verbindungsschicht (4) mit der Metallschicht (8) fest verbunden ist.

5. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der in die Membran (2) mehrere, vorzugsweise unterschiedliche Ionenkanäle (1, 1') eingebracht sind.

6. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei der die Membran (2) mit den Ionenkanälen (1) und mit der Polymerschicht (3) fest verbunden ist und für Ionen undurchlässig ist.

7. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei der die Durchbrüche (5) regellos oder regelmäßig angeordnet sind und eine vorzugsweise runde Form mit wenigen Mikrometern Größe aufweisen.

8. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei der die Polymerschicht (3) nur wenige Mikrometer dick ist.

9. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei der die Verbindungsschicht (4) zur Aufnahme und zum Binden von Ionen ausgebildet ist.

10. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei der in die Polymerschicht (3) oder in die Verbindungsschicht (4) Kanäle (9) für den Zu- und/oder Abfluss der durch den Ionenkanal (1) strömenden Ionen (6) eingebracht sind.

11. Verfahren zur Herstellung einer Anordnung zur flächenaufgelösten Messung von durch Ionenkanäle (1) fließende Ionenströme, bei dem
in eine 2 bis 30 µm dünne Polymerschicht (3) Durchbrüche (5) eingebracht werden,
die Durchbrüche (5) mit einer eine Lipiddoppelschicht ausbildenden Flüssigkeit gefüllt werden, wodurch sich in den Durchbrüchen (5) Membranen (2) ausbilden,
in die Membranen (2) ein oder mehrere Ionenkanäle (1) eingebracht werden, und
die so erzeugte Polymerschicht (3) auf eine Metallschicht (8) aufgebracht wird, die zur Erzeugung und Erfassung von Signalen mittels der Oberflächenplasmonen Resonanz ausgebildet ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem in die Polymerschicht (3) mittels Mikrokontaktprinting, Photolithographie, Elektonenstrahllithographie oder maskiertes chemisches Ätzen Durchbrüche (5) eingebracht werden.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem die Membran (2) durch gleichmäßiges mechanisches Auftragen von Lipiden mit Ionenkanälen (1) auf die Polymerschicht (3) mit den eingebrachten Durchbrüchen (5) und nachfolgendem Entfernen von Lipiden auf der Oberfläche der Polymerschicht (3) hergestellt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem die Ionenkanäle (1) mittels Patch-Clamp Technik in die Membranen (2) eingebracht werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, bei dem natürliche oder synthetische Ionenkanäle eingesetzt werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, bei dem die Metallschicht (8) vor der Verbindung mit der Polymerschicht (3) mit einer Verbindungsschicht (4) versehen wird.

17. Verfahren zur flächenaufgelösten Messung von durch natürliche oder synthetische Ionenkanäle (1) fließende Ionenströme, mittels einer Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass
die Ionenkanäle (1) zum Öffnen und/oder Schließen angeregt werden,
die durch einen geöffneten Ionenkanal (1) in ein zugehöriges Reservoir strömenden Ionen (6) mittels der Oberflächenplasmonen Resonanz erfasst werden, und
das erhaltene Signal flächenaufgelöst dargestellt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass gleichzeitig und flächenaufgelöst die Ionenströme durch mehrere Ionenkanäle (1) erfasst werden.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass in einer größeren Fläche die Plasmonenwelle (7) in der Metallschicht (8) angeregt wird und mittels optischen Arraydetektor oder anderen geeigneten abbildenden Detektoren erfasst wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ligandengesteuerte und/oder spannungsgesteuerte Ionenkanäle (1) angeregt werden, so dass mit Erreichen eines bestimmten Konzentrationsunterschiedes von Ionen (6) zwischen den beiden Seiten der Membran (2) ein spannungsgesteuerte Ionenkanal (1') öffnet und die Ionen in das freie Reservoir zurückgeführt werden.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Abfluss der Ionen (6) aus den Reservoirs durch Kanäle (9) gesteuert wird.