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Die
Erfindung betrifft einen Biochip zur optischen Messung der Eigenschaften
von einzelnen Transport-Systemen.
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Biologische
Membranen trennen Zellen vom äußeren Medium
und die einzelnen Zellkompartimente der Zellen voneinander ab. Transport-Systeme wie Transportproteine
und Kanäle
steuern selektiv den Stoffdurchlass durch diese Membranen. Funktionsstörungen dieser
Transporter und Kanäle sind
für zahlreiche
verbreitete Krankheiten verantwortlich. Unter den 100 am meisten
verkauften Arzneimitteln in den USA im Jahre 2004 waren die Membrantransporter
die am häufigsten
vorkommende Targetgruppe. Es sind mindestens 1.302 Transporter-Pharmaka, sowohl
eingeführte
als auch noch in der Entwicklung sich befindende Arzneimittel, in
den Portfolios von 326 Firmen weltweit vorhanden. Insgesamt werden
zurzeit mehr als 100 Transporter-Targets bei den Pharmafirmen erforscht,
was zeigt, welche immense wirtschaftliche Bedeutung diese haben.
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Für die Entwicklung
solcher Wirkstoffe werden Messmethoden benötigt, mit denen Eigenschaften
wie die Transportraten von spezifischen Substraten durch das Transporter-Target
und der Einfluss von Wirkstoffkandidaten evaluiert werden kann.
Hierbei werden insbesondere Methoden benötigt, die einzelne Targetmoleküle sogar
automatisiert im Hochdurchsatz charakterisieren können.
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Für die Analyse
von Transportraten von Ionen und geladenen Teilchen können elektrische
Messungen eingesetzt werden. Dieses Verfahren findet bereits eine
Anwendung im Hochdurchsatz in der biotechnologischen und pharmazeutischen
Forschung. Es ist jedoch auf geladene Transportsubstrate beschränkt und
wird daher in der Regel für die
Gruppe der Ionenkanäle
eingesetzt. Der Transport von ungeladenen Molekülen wie Aminosäuren, Peptiden,
Zuckerverbindungen und Fettsäuren,
aber auch biologischen Makromolekülen wie RNA, DNA und Proteinen kann
nur indirekt mit elektrischen Verfahren gemessen werden.
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Die
Fluoreszenzanalyse kann dagegen den Transport dieser Moleküle sichtbar
machen. Erste Vorarbeiten dazu wurden von einer akademischen Gruppe
für den
Transport von Biomolekülen
durch den Kernporenkomplex in Kernhüllen aus Xenopus Laevis durchgeführt. Dieses
Verfahren wurde dort als Optische Einzeltransporter-Aufnahme (OSTR)
bezeichnet. Es wurde auch für
die Messung des Transports von Calcium-Ionen durch die α-Hämolysin-Pore angewendet,
welche direkt in vorgefertigte, künstliche Lipidmembranen insertiert
wurde und sich dabei aus einer denaturierten Struktur in eine funktionale Form
rückfaltet.
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In
den Veröffentlichungen
wurden dazu Polycarbonatfilter oder Polycarbonatstrukturen eingesetzt,
deren Vertiefungen für
die Fluoreszenzmessung von Transportraten mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie
genutzt wurden. Dies bedingt schlechte optische Eigenschaften, u.
a. auf Grund von Divergenzen in den Brechungsindices von Polycarbonat
und Messpuffer. Weitergehende Experimente, die über die Grundlagenforschung
hin zu einer biotechnologischen oder pharmazeutischen Anwendung
des Verfahrens im Hochdurchsatz führen oder hierfür geeignete
Chips verwenden, sind nicht publiziert worden.
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Aufgabe
der Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung vorzuschlagen, durch
die die Eigenschaften von Transportermolekülen mit hoher Messgenauigkeit
und hohem Durchsatz gemessen werden können.
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Diese
Aufgabe wird dadurch gelöst,
dass ein Biochip zur optischen Messung der Eigenschaften von einzelnen
Transport-Systemen vorgeschlagen wird, der im Wesentlichen aus einem
transparentem Träger sowie
mehreren nach oben geöffneten
Vertiefungen besteht, wobei die Vertiefungen derart ausgebildet
sind, dass bei einer Messung ihre Öffnungen durch eine Membran
bedeckt und so geschlossene Messkammern gebildet werden und der
Transport von Substratmolekülen über die
Membran in die Vertiefungen nachgewiesen wird. Dazu wird die Membran über die
Vertiefungen im Biochip aufgespannt, so dass diese verschlossen
sind. Über
der Membran zugegebene und mit Fluoreszenzverfahren detektierbare
Transportsubstrate gelangen somit nur mittels der in der Membran
enthaltenen Transportproteine oder Kanäle in die Messräume des
Biochips. Durch Fluoreszenzmessungen können diese Substrate in den Vertiefungen
nachgewiesen und quantifiziert werden. Eine Auswertung ergibt Parameter
wie die Transportrate, die Rückschlüsse auf
das Transportprotein/den Kanal oder z. B. einen Einfluss eines Wirkstoffkandidaten
erlauben. Sowohl das Verfahren als auch die Auswertung kann automatisiert
und im Hochdurchsatz eingesetzt werden. Für die biotechnologische und
pharmazeutische Anwendung dieses Verfahrens ist es notwendig, mittels
Standardverfahren hergestellte Proteo-Liposomen, also künstliche,
hohle Membranvesikel, die in die Membran insertierte Transportproteine
enthalten, einzusetzen. Diese können
entweder direkt an die aktivierte Oberfläche des Biochips gekoppelt
werden oder durch Fusion mit einer vorgeformten Lipidmembran aufgebracht
werden. Dabei wird der Vesikel zu einer den Transporter enthaltenden
Membran umgeformt, die die aus den Vertiefungen gebildeten Messkammern
im Biochip verschließt
und somit eine Fluoreszenzmessung zur Charakterisierung der Transporter
und Bestimmung der Transportraten ermöglicht.
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Mit
Vorteil besteht der Träger
aus einem Material mit hohem Brechungsindex, wie Glas oder Silizium.
Hierdurch werden optische Artefakte vermindert und die Fluoreszenzdetektion
in den Vertiefungen mit Abmessungen im Nanometerbereich möglich. Ist
der Brechungsindex höher
als der Brechungsindex der verwendeten Messlösung, kann durch Einstrahlen
des Anregungslichtes unter einem Winkel eine Totalreflektion und
somit ein evaneszentes Feld an der Phasengrenze von Material und Messlösung erzeugt
und für
die Fluoreszenzdetektion genutzt werden.
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Die
Vertiefungen können
durch eine oder mehrere mit der Oberseite des Trägers verbundene Schichten gebildet
werden, welche durchgehende Öffnungen
aufweisen. Hierdurch kann unterschiedliches Material für den Träger und
Messkammern verwendet werden, was weitere vorteilhafte Eigenschaften
ermöglicht.
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Mit
Vorteil besteht, ebenso wie der Träger, die genannte verbundene
Schicht aus einem Material mit hohem Brechungsindex, vorzugsweise
Glas oder Silizium, um optische Artefakte zu vermindern und eine
Fluoreszenzdetektion in den Vertiefungen mit Abmessungen im Nanometerbereich
zu ermöglichen.
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Wenn
die die Vertiefungen bildende Schicht aus Metall besteht, sind die
so gebildeten Messkammern an ihren Wandseiten lichtundurchlässig. Bei Abmessungen
der Vertiefungen im Nanometerbereich kann das eingestrahlte Licht
nicht mehr vollständig
in die Vertiefungen eindringen, wodurch in den Vertiefungen ein
evaneszentes Feld entsteht, welches für die Fluoreszenzdetektion
der Transportsubstrate in den Vertiefungen genutzt werden kann.
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Ein
besonders geeignetes Metall ist Gold, da es chemisch inert ist,
sicher mit dem Trägermaterial verbunden
werden kann und außerdem
geeignete Lichtreflektionseigenschaften hat.
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Die
Metallschicht wird mit dem Träger
mittels eines Haftvermittlers fest verbunden.
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Es
hat sich herausgestellt, dass als Haftvermittler ein Metall, insbesondere
Chrom oder Titan, sehr gut geeignet ist.
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Eine
Verbesserung der Messgenauigkeit lässt sich dadurch erreichen,
dass die Metallschicht das Anregungslicht reflektiert und so die
Substratmoleküle
mehrfach angeregt werden.
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Mit
Vorteil wird die Öffnung
der Vertiefung zum Teil von der darüber angeordneten Metallschicht abgedeckt,
indem die Öffnung
in der Metallschicht so gewählt
ist, dass sie kleiner ist als die Vertiefungsöffnung. Hierdurch wird das
Anregungslicht von den Substratmolekülen abgeschirmt, die sich nicht
in der Messkammer befinden und so die Messgenauigkeit verbessert.
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Es
hat sich herausgestellt, das sowohl unter fertigungstechnischen
als auch messtechnischen Gesichtspunkten besonders günstige Verhältnisse vorliegen,
wenn die Öffnung
in der teilweise abdeckenden Metallschicht einen Durchmesser von
etwa 60 nm und die Öffnung
der Vertiefung einen Durchmesser von etwa 200 nm hat.
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Sofern
die Schicht aus Silizium besteht, ist die Fluoreszenzdetektion der
Transportsubstrate in den Vertiefungen der Schicht möglich.
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Besteht
die dem transparenten Träger
aufliegende Schicht aus einem Fluoropolymer, wie Teflon oder Cytop,
dann erlaubt dies die Detektion der Fluoreszenz in den Messkammern,
z. B. mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie.
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Die
gleichzeitige Fluoreszenzanalyse von mehreren Transportmolekülen wird
dadurch ermöglicht,
dass die Vertiefungen als Gruppen oder als Arrays angeordnet sind.
Dabei sind vorzugsweise jeweils vier Vertiefungen gruppiert und
diese Vertiefungsgruppen wiederum zu einem Array gruppiert, welches
aus sechzehn Vertiefungsgruppen besteht.
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Eine
weitere Verbesserung lässt
sich dadurch erzielen, dass sich der Durchmesser der Vertiefungen
von unten zur Oberseite hin kontinuierlich verringert, so dass die
Vertiefungen annähernd
eine Kegelform aufweisen. Die zum Träger hin größeren Durchmesser der Kammern
ermöglichen
dann eine konfokale Detektion der Fluoreszenz in den so gebildeten
Messräumen
mit höherer
Genauigkeit.
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Die
Kopplung, das heißt
Fixierung, der Vesikel an den Biochip kann so erfolgen, dass dessen Oberfläche Linkermoleküle und/oder
Lipidderivate aufweist, an die geeignete Bestandteile des Vesikels, kovalent
oder nichtkovalent, binden.
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Die
Membran weist als Transportermolekül ein oder mehrere Proteine,
insbesondere Poren-, Kanal- oder Carrierproteine, auf, deren Transport-Aktivität über die
Vesikelmembran nachgewiesen wird.
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Eine
weitere Anwendung des Biochips ist die Charakterisierung von Produktionszelllinien
für rekombinante
Proteine und Antikörper.
Hierzu werden Zellen oder Zellbestandteile für die Produktion von rekombinanten
Proteinen oder Antikörpern
gemessen. Dabei werden die Zellen auf den Biochips angezogen, so
dass sie mit ihrer Membran die Vertiefungen des Chips verschließen. Bei
Sekretion der hergestellten Proteine in die Messräume wird über ein
Reportersystem ein Fluoreszenzsignal erzeugt. Dieses Fluoreszenzsignal
gibt Aufschluss über
die erzeugte Menge an rekombinantem Protein oder Antikörper und
erlaubt somit das Auffinden von viel produzierenden Zellen, die
für die
biotechnologische Herstellung dieser Proteine und Antikörper eingesetzt
werden können.
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Die
bei der Messung verwendeten Membranen können biologische oder künstliche
Lipidmembranen sein. Sofern biologische Membranen verwendet werden,
ergeben sich besonders natürliche Messbedingungen.
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Vorzugsweise
erfolgt die Messung mit einer Vesikelmembran, die darin rekonstituierte
Transportermoleküle
enthält.
Dies erlaubt schnelle, reproduzierbare Messungen. Durch die Einbettung
in die Vesikelmembran nimmt das Transporterprotein außerdem wieder
seine funktionelle Konformation ein.
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Die
Messung eines einzelnen Moleküls
ist dann möglich,
wenn die über
eine Vertiefung gespannte Membran gerade ein Transportermolekül enthält.
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Der
Nachweis des durch die Transportermoleküle transportierten Substrates
wird dadurch ermöglicht,
dass die Substratmoleküle
fluoreszieren, vorzugsweise indem sie an einen Fluoreszenzfarbstoff
gebunden sind.
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Die
fluoreszierenden Substratmoleküle
werden von dem Transportermolekül über die
Membran in die Vertiefungen des Biochips transportiert. Dort werden
sie mittels einer geeigneten Fluoreszenzdetektionsvorrichtung nachgewiesen.
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Eine
besonders genaue Messung erfolgt dadurch, dass die Detektionsvorrichtung
die Fluoreszenz in einer konfokalen Ebene innerhalb der Vertiefung
misst.
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Eine
weitere Verbesserung der Genauigkeit wird dadurch erzielt, dass
der Durchmesser der Vertiefungen unter Berücksichtigung der Wellenlänge des
Anregungslichtes so gewählt
ist, dass ein evaneszentes Feld erzeugt wird, welches zur Fluoreszenzdetektion
verwendet wird.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird ein evaneszentes Feld erzeugt, indem das Anregungslicht unter
einem totalreflektierenden Winkel eingestrahlt und so zur Fluoreszenzdetektion
verwendet wird.
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Eine
Steigerung der Messgeschwindigkeit wird erreicht, wenn die Messung
automatisiert ist.
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Eine
weitere Verbesserung ergibt sich dadurch, dass auch die Auswertung
der Messdaten automatisiert ist.
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Der
Biochip ist zweckmäßigerweise
als Bestandteil in einer Messvorrichtung integriert, der die Automatisierung
von Messreihen erlaubt.
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Die
Erfindung wird in einer bevorzugten Ausführungsform unter Bezugnahme
auf eine Zeichnung beispielhaft beschrieben, wobei weitere vorteilhafte Einzelheiten
den Figuren der Zeichnung zu entnehmen sind.
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Funktionsmäßig gleiche
Teile sind dabei mit denselben Bezugszeichen versehen.
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Die
Figuren der Zeichnung zeigen im Einzelnen:
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1 einen
Vertikalschnitt des erfindungsgemäßen Biochips;
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2 einen
Vertikalschnitt wie in 1 mit einem Vesikel;
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3 einen
Vertikalschnitt wie in 2 mit aufliegender biologischer
Zelle;
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4 eine
Draufsicht auf ein Array des Biochips;
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5a eine
Detailansicht des Biochips mit einer Vertiefung im Vertikalschnitt;
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5b eine
Detailansicht des Biochips mit einer konusförmigen Vertiefung des Biochips
im Vertikalschnitt und
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6 eine
Detailansicht einer bevorzugten Ausführungsform des Biochips mit
einer Vertiefung im Vertikalschnitt.
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1 zeigt
einen Vertikalschnitt durch den erfindungsgemäßen Biochip.
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Der
Biochip 1 besteht aus einem Träger 30, der für das Anregungslicht
beziehungsweise das Fluoreszenzlicht transparent ist. An seiner
Oberseite weist der Chip Vertiefungen 30 auf, die als Messkammern
zum Nachweis eines Substrates 60 dienen. In einer Ausführungsform
besteht der Biochip 1 einteilig aus demselben Material.
In einer anderen Ausführungsform
besteht der Biochip 1 aus einem Verbund unterschiedlicher
Materialien, beispielsweise aus dem optisch durchlässigen Träger 10 und
einer darauf aufliegenden und mit dem Träger 30 verbundenen
Schicht 20 aus Metall oder Silizium. Die Schicht 20 enthält durchgehende Öffnungen 31,
durch die zusammen mit dem Träger 30 eine
nach oben geöffnete Messkammer
gebildet wird.
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Auf
die Oberfläche
des Biochips 1 wird zur Messung eine Membran 40 aufgebracht,
so dass die Messräume 30 verschlossen
werden. Die Membran 40 kann aus künstlichen Proteo-Liposomen 5 hergestellt
werden, welche als Transport-System Transport-Proteine oder Poren-Proteine enthalten.
Andererseits kann die Membran 40 auch die Zellmembran von
Produktionszelllinien für
rekombinante Proteine oder Antikörper
sein.
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Die
Membran 40 enthält
Transport-Systeme 50, wie Transport-Proteine oder Poren-Proteine.
Exemplarisch können
hierbei Transporter der ABC-Transportergruppe
genannt werden, die für
viele Krankheiten relevant sind, wie z. B. der Adrenoleukodystrophie
ABCD1-Transporter mit Fettsäuren
als Substrat oder z. B. der Glutamat-Transporter mit dem Substrat
Glutamat, dessen Stoffwechsel bei psychischen Erkrankungen gestört ist.
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Auf
der Unterseite der Membran werden ein oder mehrere mit Fluoreszenzverfahren
detektierbare Transport-Substrate 60 zugegeben. Dies wird
beispielsweise dadurch ermöglicht,
indem das Substrat mit einem Fluoreszenzfarbstoff kovalent markiert
ist. Der Transport 70 der Transportsubstrate durch die
in der Membran 40 enthaltenen Transport-Systeme 50 in die Vertiefungen 30 des
Biochips ist spezifisch für das
enthaltene Transport-System 50 und kann durch Fluoreszenzmessungen
in den Messräumen 30 quantifiziert
werden. Dies ermöglicht
Rückschlüsse auf
für das
Transport-System 50 spezifische Parameter wie Transportraten
und Durchlässigkeit
und somit die Evaluation von Wirkstoffkandidaten oder die Produktionsraten
von Produktionszelllinien.
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Der
Biochip kann aus einem Fluoropolymer 20 wie Teflon oder
Cytop bestehen, welches die Messräume 30 enthält und auf
einen lichtdurchlässigen
Träger 10 aufgebracht
wird. Dies erlaubt die Detektion der Fluoreszenz in den Messräumen z.
B. mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie.
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Der
Biochip kann aber auch aus einer Metallschicht 20 bestehen,
in die die Löcher 30 eingebracht werden,
und die auf einem lichtdurchlässigen
Träger 10 aufgebracht
werden. Unterschreitet der Durchmesser der Löcher 30 eine bestimmte
Größe im Nanometer-Bereich,
so kann das eingestrahlte Licht nicht mehr vollständig in
die Messräume
eindringen, stattdessen bildet sich ein evaneszentes Feld am Übergang
von Träger
und mit Messlösung
gefülltem Messraum
aus. Die Vertiefungen stellen dann „Zero Mode Waveguides" dar und erlauben
so die Detektion der Fluoreszenz in den gebildeten Messräumen.
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Eine
weitere Möglichkeit,
den Biochip herzustellen besteht darin, kegelförmige Löcher 30 anisotrop
in Silizium 20 zu ätzen
und dieses dann auf einen durchlässigen
Träger 10 z.
B. aus Pyrex aufzubringen. Der zum Träger 10 hin größere Durchmesser
der Löcher
erlaubt dann eine konfokale Detektion der Fluoreszenz in diesen
Vertiefungen.
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Außerdem kann
der Biochip durch Erzeugen von Vertiefungen 30 in ein Material
mit einem hohen Brechungsindex, wie z. B. Glas 10 + 20,
Brechungsindex 1,53 hergestellt werden. Dieser Brechungsindex ist
deutlich höher
als der der in den Messräumen 30 befindlichen
Messlösung
mit einem Brechungsindex von 1,33. Wird das Anregungslicht schräg von unten
eingestrahlt, so wird ab einem bestimmten Winkel am Übergang
vom Träger
zur Messlösung
bei Totalreflektion des Lichtes ein evaneszentes Feld erzeugt, welches
zur Detektion der Fluoreszenz in den Messkammern 30 genutzt
werden kann.
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2 zeigt
einen Vertikalschnitt wie in 1 mit einem
Vesikel (5). In der Vesikelmembran sind porenbildende Proteine
(50) rekonstituiert.
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3 zeigt
einen Vertikalschnitt wie in 2 mit einer
aufliegenden biologischen Zelle 15. Dies kann eine vollständige Zelle 15 sein
oder auch nur ein Teil davon. Die Zelle erstreckt sich über mehrere Vertiefungen 30 und
bedeckt diese. Hierdurch ist eine Messung unter natürlichen
biologischen Bedingungen möglich.
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4 zeigt
eine Draufsicht auf ein Array 36 des Biochips 1.
Dieses wird dadurch gebildet, dass jeweils vier in der Draufsicht
quadratische Vertiefungen 30 dicht beieinander angeordnet
sind und so eine Gruppe 35 bilden. Die Gruppe 35 hat
dabei eine Länge
c bzw. Breite d von jeweils etwa 100 μm. Jeweils sechzehn Vertiefungsgruppen 35 bzw.
vierundsechzig Vertiefungen 30 sind zu einem Array 36 angeordnet,
welches eine Länge
a bzw. Breite b von jeweils etwa 500 μm aufweist.
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5a zeigt
eine Detailansicht einer Ausführungsform
des Biochips 1 mit einer Vertiefung 30 im Vertikalschnitt.
Hierbei ist auf einen Träger 10 aus Glas,
geeignet sind BK7 von Schott oder Pyrex, mittels eines Haftvermittlers
aus Chrom oder Titan (nicht gezeigt) eine Metallschicht 20 aus
Gold aufgebracht. Die bevorzugten Maße des Glasträgers sind
20 × 20 × 0,17 mm.
Die Metallschicht 20 hat eine Dicke von 0,5 bis 5 μm. Die Metallschicht 20 ist
mit einer durchgehenden Schichtöffnung 31 versehen,
die einen Durchmesser von 60 bis 120 nm hat. Bevorzugt sind Durchmessern
von ca. 60 nm, 80 nm, 100 nm und 120 nm. Der Pitch beträgt vorzugsweise
1 μm. Die Messkammer 30 wird
bei dieser Ausführungsform also
ausschließlich
durch die Öffnung 31 im
Metall 20 gebildet, während
der Glasträger 10 selbst
keine Vertiefung aufweist.
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5b zeigt
eine ähnliche
Ausführungsform wie
in 5a, allerdings weist die Metallschicht 20 eine
konus-, bzw. kegelförmige
Vertiefung 30 auf. Die Öffnung 31 hat
an ihrer Oberseite ebenfalls einen Durchmesser von 60 bis 120 nm,
erweitert sich aber nach unten hin. Hierdurch erhöht sich
die Messgenauigkeit, weil die Messkammer 30 mehr Substrat 60 (nicht
gezeigt) enthält
und so das Signal/Rauschverhältnis
verbessert wird.
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6 zeigt
eine Detailansicht einer bevorzugten Ausführungsform des Biochips 1 mit
einer Vertiefung 30 im Vertikalschnitt. Wie in den in 5a und 5b dargestellten
Ausführungsformen
ist auf einen Träger 10 aus
Glas eine Metallschicht 20 mittels eines (nicht dargestellten)
Haftvermittlers aufgebracht. Die Metallschicht 20 weist
ebenfalls eine durchgehende Öffnung 21 auf.
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Im
Unterschied zu den oben gezeigten Ausführungsformen wird die Messkammer
aber im Wesentlichen durch eine Vertiefung 30 innerhalb
des Glasträgers 10 gebildet.
Die Vertiefung hat eine Länge
e von etwa 450 nm und einen Öffnungsdurchmesser 31 von
etwa 200 nm. Die Dicke f der Metallschicht 20 beträgt vorzugsweise
etwa 50 nm, der Durchmesser der Schichtöffnung 21 etwa 60
nm. Da die Vertiefungsöffnung 31 im
Glasträger 10 also
wesentlich größer ist
als die Öffnung 21 in
der oberen Metallschicht 20, wird sie größtenteils
von dieser abgedeckt.
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Ein
Vorteil dieser Ausführungsform
besteht zum einen darin, dass der im Glasträger 10 durch die Vertiefung 30 gebildete
Messraum eine größere Ausdehnung
in vertikaler Richtung hat. Hierdurch sind die über die Membran transportierten
Substratmoleküle 50 (nicht
gezeigt) im Mittel weiter von der Membran und damit von den nicht
transportierten Substratmolekülen 50 entfernt.
Idealerweise sollen nur die unterhalb der Lipidmembran (nicht gezeigt)
befindlichen Substratmoleküle 50 zur
Fluoreszenz angeregt werden, was durch den größeren räumlichen Abstand erleichtert
wird. Dadurch erhöht
sich das Signal/Rauschverhältnis.
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Das
Signal/Rauschverhältnis
wird weiter durch das erfindungsgemäße Merkmal verbessert, dass
die obere Vertiefungsöffnung 31 zum
Teil durch die Metallschicht 20 abgedeckt wird. Das Anregungslicht
wird so effektiv von den nicht transportierten Substratmolekülen 50 (nicht
dargestellt) oberhalb der Membran abgeschirmt.
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Ein
weiterer und überraschender
Vorteil besteht darin, dass die Metallschicht 20 das Anregungslicht
reflektiert. Um dieses zu verdeutlichen, zeigt die 6 eine
schematische Darstellung der Strahlen 80 des Anregungslichts.
Ein paralleles Lichtbündel 80 wird
schrägwinklig
in die Unterseite des Glasträgers 10 eingestrahlt.
Der Strahlengang ist dabei wie bei einem handelsüblichen TIRF-Mikroskop angeordnet. Die
Strahlen 80 werden von der Metallschicht 20 reflektiert
und durchstrahlen mehrfach das Messvolumen 30 mit der Probe 60 (nicht
gezeigt).
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Hierdurch
wird die Signalanregung um ein Vielfaches verstärkt, was die Messgenauigkeit
weiter erheblich verbessert.
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Die
sich neben dem Anregungslicht ausbildende evaneszente Welle ist
in der 6 nicht gezeigt. Durch den Schrägeinfall
und die Dicke der Metallschicht 20 reicht der Durchmesser
für eine „Zero Mode"-Anregung nicht aus,
was jedoch zur Signalunterdrückung
erwünscht
ist.
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- 1
- Biochip
- 5
- Vesikel
- 10
- Träger
- 15
- Biologische
Zelle
- 20
- Schicht
- 21
- Schichtöffnung
- 30
- Vertiefung
- 31
- Vertiefungsöffnung
- 35
- Vertiefungsgruppe
- 36
- Array
- 40
- Membran
- 50
- Transportermolekül
- 60
- Substrat
- 80
- Anregungslicht