DE112014006687T5

DE112014006687T5 - Kartusche für ein magnetisches Durchflusszytometer, magnetisches Durchflusszytometer und Verfahren für die Analyse einer Probe mit einer solchen Kartusche

Info

Publication number: DE112014006687T5
Application number: DE112014006687.7T
Authority: DE
Inventors: Oliver Hayden; Michael Johannes Helou; Mathias Reisbeck; Lukas Richter
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Earlybio De GmbH
Priority date: 2014-05-20
Filing date: 2014-05-20
Publication date: 2017-02-09
Also published as: US20170102313A1; CN106461686B; US10520419B2; CN106461686A; WO2015176744A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Kartusche (1) für ein magnetisches Durchflusszytometer, die sich hauptsächlich in einer xy-Ebene erstreckt, mit einem Einlass (2) zum Injizieren einer Probe (15) in die Kartusche (1), einem Blister (3) für eine Pufferlösung (21) mit magnetischen Markern zum Markieren von vorgegebenen Teilchen (16, 16') der Probe (15), einem Auslass und einem Fluidkanal (9), wobei der Fluidkanal (9) einen ersten Teil, der den Einlass (2) mit dem Blister (3) verbindet, und einen zweiten Teil, der den ersten Teil mit dem Auslass verbindet, aufweist, wobei der zweite Teil des Fluidkanals (9) eine Anreicherungszone (5) mit mechanischen Führungsstrukturen zum Fokussieren der markierten Teilchen (16, 16') der Probe (15) in einem vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals (9) und eine Messzone (6) zwischen der Anreicherungszone (5) und dem Auslass aufweist, wobei die Messzone (6) einen Magnetfeldsensor (14) in dem vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals (9) aufweist, um vereinfachte und schnellere Mittel zum Messen von Teilchen, insbesondere Konzentrationen von Teilchen, einer Probe bereitzustellen.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Kartusche für ein magnetisches Durchflusszytometer, die sich hauptsächlich in einer xy-Ebene erstreckt, mit einem Einlass für die Injektion einer Probe in die Kartusche, einem Blister für eine Pufferlösung mit magnetischen Markern zum Markieren vorgegebener Teilchen der Probe, einem Auslass und einem Fluidkanal, wobei der Fluidkanal einen ersten Teil, der den Einlass mit dem Blister verbindet, und einen zweiten Teil, der den ersten Teil mit dem Auslass verbindet, umfasst. Sie bezieht sich ferner auf ein magnetisches Durchflusszytometer mit einer derartigen Kartusche und auf das Messen von Teilchen einer Probe durch ein magnetisches Durchflusszytometer mit einer derartigen Kartusche.
Das Messen von Teilchen oder Proben mit Teilchen, insbesondere Blut oder dergleichen, mithilfe eines magnetischen Durchflusszytometers beinhaltet in der Regel eine Reihe von zu ergreifenden Maßnahmen. Die Teilchen, beispielsweise Zellen, müssen durch wiederholtes Hinzufügen und Entfernen von Pufferlösungen markiert und angereichert werden. Wenn ein Marker zu einer Probe in einer Pufferlösung hinzugefügt wird, wird die Probe in der Regel durch die Pufferlösung verdünnt oder ausgedünnt und letztlich können chemische Substanzen der Pufferlösung in Kontakt mit der Probe kommen und somit ihre Eigenschaften ändern.
Die vorliegende Erfindung hat zur Aufgabe, ein vereinfachtes und schnelleres Mittel für die Messung von Teilchen, insbesondere Konzentrationen von Teilchen, einer Probe bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch eine Kartusche mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 sowie ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 11 gelöst.
Weitere Vorteile und Ausführungsformen werden gemäß den abhängigen Ansprüchen, der detaillierten Beschreibung und der Figuren dargelegt.
Eine erfindungsgemäße Kartusche für ein magnetisches Durchflusszytometer erstreckt sich hauptsächlich in einem xy-Ebene senkrecht zu einer Z-Richtung und umfasst einen Einlass zum Injizieren einer Probe in die Kartusche, einen Blister für eine Pufferlösung mit magnetischen Markern zum Markieren vorgegebener Teilchen der Probe, einen Auslass und einen Fluidkanal. Der Einlass kann so konzipiert sein, dass eine Spritze mit der Kartusche verbunden wird. Der Fluidkanal umfasst einen ersten Teil, der den Einlass mit dem Blister verbindet, und einen zweiten Teil, der den ersten Teil mit dem Auslass verbindet. Der Auslass kann mit einem Abfallbehälter verbunden sein. Der Blister kann ein Blister, eine Tasche oder eine andere Form von für den Einsatz in einer Kartusche geeignetem Behälter sein. Er kann bereits die Pufferlösung mit magnetischen Markern enthalten. Die magnetischen Marker können immunomagnetische Marker sein, die nur bestimmte, vorgegebene Teilchen der Probe markieren. Insbesondere können diese bestimmten Teilchen Leukozyten und/oder Thrombozyten und/oder Lymphozyten und/oder Monozyten sein, insbesondere Monozyten mit HL-DR-Expression, und/oder eosinophile Granulozyten und/oder basophile Granulozyten und/oder neutrophile Granulozyten, insbesondere neutrophile Granulozyten mit CD-64-Expression, und/oder Tumorzellen einer biologischen Probe.
Um für eine schnelle und einfache Messung der vorgegebenen Teilchen der Probe zu sorgen, umfasst der zweite Teil des Fluidkanals eine Anreicherungszone mit mechanischen Führungsstrukturen zum Fokussieren der markierten vorgegebenen Teilchen in einem vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals und eine Messzone zwischen der Anreicherungszone und dem Auslass. Die Messzone umfasst einen Magnetfeldsensor im vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals. Der Magnetfeldsensor kann ein Sensor basierend auf dem Riesenmagnetwiderstandseffekt (eng. giant magnetoresistive, GMR) oder dem Tunnelmagnetwiderstandseffekt (engl. tunnel magnetoresistive, TMR) sein. Es kann sich auch um einen Hall-Sensor oder einen supraleitenden Quanteninterferenzdetektor (SQUID) handeln. Der vorbestimmte Teilabschnitt des Fluidkanals kann ein Teilabschnitt eines Querschnitts senkrecht zu einer Strömungsrichtung der Probe in dem Fluidkanal sein. Insbesondere kann der vorbestimmte Teilabschnitt des Fluidkanals dasjenige Volumen des Fluidkanals sein, in dem, falls die mechanischen Führungsstrukturen nicht vorhanden wären, jedes Teilchen, das dem Fluss der Probe durch den Fluidkanal folgt, den Magnetfeldsensor in einem möglichst kleinen Abstand passieren würde, so dass das Teilchen in optimaler Weise durch die Magnetfeldsensor gemessen werden könnte.
Dies bietet den Vorteil der Messung von Teilchen, insbesondere der Konzentration von Teilchen, in mehrere Größenordnungen ohne die Notwendigkeit zum Verdünnen oder Anreichern der die Teilchen enthaltenden Probe in zusätzlichen, zeitaufwändigen und teuren Schritten. Darüber hinaus wird dieser hohe Dynamikbereich unabhängig von der Kapazität des Magnetsensors erreicht. Somit können identische Magnetsensoren in Kartuschen verwendet werden, die für verschiedene Arten von Proben vorgesehen sind. Darüber hinaus kann eine Verfälschung der Messung durch die Koinzidenz von Teilchen in der Nähe des Sensors aufgrund von Unterschieden in der Konzentration der Teilchen in der Probe vermieden werden. Dies ist besonders nützlich, wenn es sich bei der Probe um Vollblut handelt. Mit der vorgeschlagenen Kartusche ist die Messung einer Vollblut-Probe auch dann möglich, wenn das Vollblut nicht stabilisiert ist. Dadurch können bei der Durchführung der Diagnose mit einem Durchflusszytometer in-vivo-Bedingungen reproduziert werden, was wichtig ist, wenn es darum geht, die Funktion der Zelle zum Beispiel auf zelluläre Hämostase, Sepsis oder Trauma zu analysieren. Die vorgeschlagene Kartusche ermöglicht auch einen integrierten Arbeitsablauf für die Diagnose der zellulären Funktionen auf Seiten des Patienten, zum Beispiel in der Notaufnahme eines Krankenhauses. In der Regel werden mit der vorgeschlagenen Kartusche nur drei Minuten für die Prüfung auf eine zelluläre Hämostase und etwa zehn Minuten für Hämatologietests benötigt.
Das Testen auf zelluläre Hämostase kann zum Beispiel das Messen der Konzentration, Funktion, d. h. der Fähigkeit, aktiviert zu werden, und Mikroaggregation von Thrombozyten umfassen. Der Hämatologietest kann das Messen der CD 64-Expression auf neutrophilen Granulozyten und/oder der HL-DR-Expression auf Monozyten umfassen.
Darüber hinaus ermöglicht die Kartusche auf Seiten des Patienten zeitkritische Messungen der Zellkonzentrationen, zum Beispiel das Zählen von Thrombozyten oder weißen Blutkörperchen im Liquor bis hinunter auf zum Beispiel vier weiße Blutkörperchen pro Mikroliter, das Erkennen von Tumorzellen im Urin, oder ähnliches. Darüber hinaus ermöglicht die Kartusche die Messung der Eigenschaften und Merkmale von Teilchen wie Thrombozyten, die einer definierten Scherrate an einer Grenzfläche eines Substrats, d. h. an einer Fläche des Fluidkanals, ausgesetzt worden sind. Schließlich erlaubt die vorgeschlagene Kartusche im Rahmen der Point-of-Care-Tests (POCT) das Sortieren von Teilchen, insbesondere Zellen, nach Anzahl und Funktion.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform hat die Kartusche eine Fluidkammer, die ein Teil des Fluidkanals ist, insbesondere eine Fluidkammer im ersten Teil des Fluidkanals, um die Probe mit den Markern zu mischen. Die Fluidkammer hat physikalische Abmessungen, insbesondere einen Durchmesser, die größer als die des Fluidkanals in x- und/oder y- und/oder z-Richtung sind, insbesondere um ein Vielfaches größer. Es kann auch eine Mischvorrichtung in der Fluidkammer vorhanden sein. Dies bietet den Vorteil, dass die Marker in der Fluidkammer mithilfe eines Magnetfelds festgehalten werden können, während der Rest der Pufferlösung weggespült werden kann. Die Marker können dann in einem größeren Volumen als dem des Fluidkanals alleine mit der Probe gemischt werden. Somit kann ein besonders großer Anteil der vorgegebenen Teilchen der Probe markiert werden. Dies ist besonders nützlich, wenn die Teilchen, die durch die magnetischen Marker markiert werden sollen, in der Probe eine niedrige Konzentration haben. Da ein relativ großer Anteil der Teilchen markiert werden kann, können auch bei geringen Teilchenkonzentrationen genügend statistische Daten für die Messung erlangt werden. Außerdem macht es die Fluidkammer möglich, eine definierte Verdünnung der Probe für den Vorgang der Markierung der vorgegebenen Teilchen zu erreichen und immer noch den Vorgang der Messung der markierten Teilchen durchzuführen, während sie von einer unverdünnten oder unausgedünnten Probe umgeben sind.
Gemäß einer anderen Ausführungsform umfassen die mechanischen Führungsstrukturen die Abnahme der Ausdehnung des Fluidkanals in z-Richtung in der Anreicherungszone, wenn der Fluidkanal der Messzone näher kommt. Insbesondere kann diese Abnahme stufenweise realisiert werden, indem der Fluidkanal in verschiedene Abschnitte mit unterschiedlicher Höhe unterteilt wird, d. h. mit einer unterschiedlichen Ausdehnung in der z-Richtung. Dies bietet den Vorteil, dass die Teilchen nahe an einer Oberfläche des Fluidkanals senkrecht zur z-Richtung fokussiert werden.
Wenn ferner der Durchmesser des Fluidkanals in einer Richtung senkrecht zur z-Richtung und der Strömungsrichtung die Abnahme der Höhe nicht ausgleicht, wird die Probe mit unterschiedlicher Geschwindigkeit durch die unterschiedlichen Abschnitte des Fluidkanals fließen. Dies erlaubt die Ausübung einer definierten Scherrate oder Scherbeanspruchung auf die Teilchen für eine vorgegebene Strömungsrate und/oder eine vorgegebene Strömungsgeschwindigkeit durch den Fluidkanal. Dies ist zum Beispiel vorteilhaft für die Aktivierung von Thrombozyten.
In noch einer anderen Ausführungsform umfassen die mechanischen Führungsstrukturen eine Vielzahl von Erhebungen, insbesondere Wänden, die sich auf einer Fläche des Fluidkanals in der xy-Ebene erstrecken. Insbesondere haben die Erhebungen eine Ausdehnung in der z-Richtung von mehr als der Hälfte eines Durchmessers der zu markierenden Teilchen. Diese Erhebungen können gerade sein oder zumindest aus geraden Teilen bestehen. Dies bietet den Vorteil, die markierten Teilchen, vor allem, wenn sie durch das Magnetfeld zu der genannten Fläche des Fluidkanals gezogen werden, in eine bestimmte Richtung oder auf einen bestimmten Bereich zu lenken, insbesondere den vorgegebenen Teilabschnitt des Fluidkanals. Eine Ausdehnung in der z-Richtung von mehr als der Hälfte des Durchmessers der zu markierenden Teilchen ist vorteilhaft, weil dann die Erhebungen oder Wände von den Teilchen nicht leicht überwunden werden können. Somit wird eine wirksame Führung erreicht.
Aus der Perspektive einer Strömung durch den Fluidkanal zum Auslass können die Erhebungen entweder auf einen vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals weisen, um Teilchen zu den vorbestimmten Teilabschnitten zu lenken, oder von den vorbestimmten Teilabschnitten weg weisen, um Teilchen, die nahe, aber nicht innerhalb des vorbestimmten Bereichs sind, von dem Magnetfeldsensor weg zu lenken. Auch Kombinationen von Erhebungen, die auf die vorbestimmten Teilabschnitte weisen und von diesen weg weisen, können realisiert werden. Mindestens ein Teil der Erhebungen, die auf den vorbestimmten Teilabschnitt weisen, oder alle Erhebungen können auch Strukturen in „v”-Form bilden, wobei die Spitze des „v” innerhalb des vorbestimmten Teilabschnitts liegt und in Strömungsrichtung weist. In Bezug auf die Strömungsrichtung durch den Fluidkanal in Richtung des Auslasses nähern sich also die Erhebungen dem vorbestimmten Teilabschnitt, wenn sie darauf zeigen, und drehen von dem vorbestimmten Teilabschnitt weg, wenn sie von ihm weg zeigen. Dies ergibt den Vorteil, dass die Konzentration der Teilchen in der Messzone eingestellt werden kann. Weiterhin kann vermieden werden, dass ein koinzidenter, gleichzeitiger Strom von mehreren Teilchen nebeneinander den Magnetsensor passiert und dadurch die Ergebnisse des Magnetsensors verfälscht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der vorbestimmte Teilabschnitt des Fluidkanals der mittlere oder zentrale Teil des Fluidkanals sein, das heißt die Mitte einer Strömung durch den Fluidkanal in der xy-Ebene auf einer Oberfläche des Fluidkanals. Dies bietet den Vorteil, dass in dem vorbestimmten Teilabschnitt auf sehr einfache Weise ein homogenes Magnetfeld, welches für die meisten Magnetfeldsensoren vorteilhaft ist, realisieren werden kann. Außerdem können die Konzentration und der Fokus der Teilchen in dem vorbestimmten Teilabschnitt auf einfache Weise gesteuert werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform mäandert der Fluidkanal in der Anreicherungszone, um eine Wegstrecke, auf der die Teilchen durch die mechanischen Führungsstrukturen gelenkt werden, zu verlängern. Dies bietet den Vorteil, dass die Teilchen aufgrund der verlängerten Wegstrecke sehr genau fokussiert werden können, während die Kartusche weiterhin kompakte Abmessungen aufweisen kann und ein relativ kleines, kompaktes Magnetfeld verwendet werden kann, um die Teilchen in der Anreicherungszone zu lenken.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Messzone eine Vertiefung, die sich – aus einer Perspektive der Strömung durch den Fluidkanal zum Auslass – hinter dem Magnetfeldsensor befindet. Bei dieser Vertiefung kann es sich um eine Grube oder einen Hohlraum handeln. Somit fungiert die Vertiefung als eine Falle für Teilchen, die den Magnetfeldsensor passiert haben. Die Vertiefung oder die Kartusche in der Nähe der Vertiefung kann einen Hilfsauslass umfassen. Dies bietet den Vorteil, dass die gemessenen Teilchen in einem ersten Schritt aufgefangen werden können und dann in einem zweiten Schritt auf einfache Weise über den Hilfsauslass aus der Kartusche extrahiert werden können, um in weiteren Anwendungen verwendet zu werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform hat der Fluidkanal, insbesondere der Fluidkanal in der Messzone, eine Breite zwischen 250 und 2500 Mikrometer und einer Höhe zwischen 50 und 600 Mikrometer, oder eine Querschnittsfläche mit einer Größe, die einem Rechteck über die obige Breite und Höhe entspricht.
Breite und Höhe werden senkrecht zu einer Strömungsrichtung durch den Fluidkanal berechnet, die Höhe in z-Richtung und die Breite in der xy-Ebene. Dies bietet den Vorteil, dass eine vordefinierte Scherrate oder Scherbeanspruchung in der Probe realisiert werden kann, wenn sie durch den Fluidkanal fließt, wobei die Scherraten ähnlich den Scherraten sind, die unter in-vivo-Bedingungen auftreten.
Die Erfindung umfasst auch ein magnetisches Durchflusszytometer mit der Kartusche nach einer der beschriebenen Ausführungsformen, mit einem Magneten, insbesondere einem Dauermagneten, der sich in einer xy-Ebene unterhalb der Anreicherungszone und/oder der Messzone erstreckt, wobei sich der Magnetfeldsensor oberhalb einer Mitte des Magneten in der xy-Ebene befindet. Insbesondere ist der Bereich oberhalb der Mitte des Magneten durch ein homogenes Magnetfeld mit Komponenten hauptsächlich in der z-Richtung gekennzeichnet. Dies bietet den Vorteil, dass der Magnetfeldsensor verwendet werden kann, um magnetisch markierte Teilchen durch eine Änderung des Magnetfelds zu messen. Darüber hinaus können markierte Teilchen zu einer Oberfläche des Fluidkanals gezogen werden. Folglich können die markierten Teilchen, wenn sie durch den Fluidkanal strömen, tatsächlich auf der Oberfläche rollen, zu der sie gezogen werden. Insbesondere können die markierten Teilchen in Richtung der Oberfläche mit den mechanischen Führungsstrukturen gezogen werden und somit für die ordnungsgemäße Messung durch den Magnetfeldsensor fokussiert werden, wenn sie durch den Fluidkanal strömen oder rollen.
Wenn das magnetische Durchflusszytometer ausgelegt ist, um mit einer Kartusche verwendet zu werden, die die oben beschriebene Fluidkammer umfasst, kann ein zusätzlicher Magnet verwendet werden, um die Marker in der Fluidkammer festzuhalten und/oder um sie mit der Probe zu mischen. Der zusätzliche Magnet kann ein beweglicher Magnet oder ein Elektromagnet sein, um die irgendwann Marker freizugeben und somit die dann markierten Teilchen durch den Fluidkanal in Richtung der Messzone strömen zu lassen.
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Messen von Teilchen einer Probe durch ein magnetisches Durchflusszytometer unter Verwendung einer Kartusche für das magnetische Durchflusszytometer, die einen Einlass für die Injektion einer Probe in die Kartusche, einen Blister mit einer Pufferlösung mit magnetischen Markern zum Markieren vorbestimmter Teilchen der Probe, einen Auslass und einen Fluidkanal umfasst, wobei der Fluidkanal einen ersten Teil, der den Einlass mit dem Blister verbindet, und einen zweiten Teil, der den ersten Teil mit dem Auslass verbindet, umfasst. Das Verfahren umfasst die Schritte des Aktivierens des Blisters, so dass die Pufferlösung mit den magnetischen Markern in den Fluidkanal strömt, gefolgt durch ein Festhalten der magnetischen Marker in einer vorbestimmten Position des Fluidkanals mittels eines Magnetfelds. Diesem Vorgang folgt das Injizieren der Probe in den Fluidkanal, so dass die Pufferlösung in dem Fluidkanal in Richtung des Auslasses gedrängt wird, und die Probe fließt durch den Fluidkanal, so dass zumindest einige der vorbestimmten Teilchen der Probe durch die magnetischen Marker in der vorbestimmten Position markiert werden. Der nächste Schritt ist das Fokussieren der markierten Teilchen in einem vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals mithilfe mechanischer Führungsstrukturen in einer Anreicherungszone im zweiten Teil des Fluidkanals, wenn sie durch den Fluidkanal strömen oder vorzugsweise auf einer Oberfläche des Fluidkanals durch den Fluidkanal rollen. Dieses Fokussieren wird durch den Einfluss eines Magnetfelds zumindest unterstützt, insbesondere sogar erst ermöglicht. Schließlich umfasst das Verfahren das Messen der markierten Teilchen durch einen Magnetfeldsensor im vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals, wobei sich der Magnetfeldsensor in einer Messzone zwischen der Anreicherungszone und dem Auslass befindet. Das Verfahren kann auch das Verbinden eines die Probe enthaltenden Behälters mit dem Einlass vor der Aktivierung des Blisters umfassen. Zusätzlich zu den Vorteilen der Kartusche und des magnetischen Durchflusszytometers, die oben beschrieben wurden, bietet dieses Verfahren den Vorteil, dass die magnetischen Marker, wenn sie in der vorbestimmten Position festgehalten werden, durch die Probe aus der Pufferlösung entfernt werden, wenn die Probe die Pufferlösung, die ursprünglich die magnetischen Marker umgibt, wegspült. Somit ist die Probe nicht durch die Pufferlösung verdünnt oder ausgedünnt, wenn sie schließlich die markierten Teilchen enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die magnetischen Marker in einer Fluidkammer festgehalten und mit der Probe in der Fluidkammer gemischt, nachdem die Probe in die Kartusche injiziert wurde. Dies bietet den Vorteil, dass ein großer Teil oder sogar alle der vorbestimmten Teilchen der Probe kann markiert werden können, selbst wenn ihre Konzentration in der Probe sehr gering ist. Eine Konzentration kann als gering angesehen werden, wenn zum Beispiel weniger als 10.000 Teilchen pro Mikroliter der Probe verfügbar sind. Somit ist diese Ausführungsform besonders nützlich, wenn es darum geht, Leukozyten in einem Liquor oder Tumorzellen im Urin zu messen oder im Allgemeinen auf dem Gebiet der Hämatologie.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform werden die magnetischen Marker auf einer Oberfläche des Fluidkanals in der Anreicherungszone festgehalten, insbesondere durch das Magnetfeld, das in Kombination mit dem Magnetfeldsensor zur Messung der Teilchen verwendet wird. Dies bietet den Vorteil, dass nur ein kleiner Anteil der vordefinierten Teilchen in der Probe markiert wird, da die Marker an einer Oberfläche des Fluidkanals festgehalten werden und nur diejenigen der vorbestimmten Teilchen, die diese Oberfläche sehr nahe passieren, durch die Marker markiert werden. Dies ist besonders nützlich, wenn eine hohe Konzentration der vorbestimmten Teilchen in der Probe vorliegt, zum Beispiel mehr als 1.000 Teilchen pro Mikroliter. Dies ist besonders nützlich im Bereich der Hämostase, wo die vorbestimmten Teilchen, insbesondere Thrombozyten, Konzentrationen von bis zu 1 Million Teilchen pro Mikroliter erreichen können.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine Strömungsgeschwindigkeit der Probe durch den Fluidkanal auf einen vorgegebenen Wert eingestellt, so dass eine vorgegebene Scherrate oder Scherbeanspruchung der Teilchen der Probe erreicht wird. Hier hängt der Scherrate sowohl von den Teilchen als auch von der Geometrie des Fluidkanals der jeweiligen Kartusche ab. Insbesondere kann die Strömungsgeschwindigkeit durch die Messzone des Fluidkanals eingestellt werden. Zum Beispiel kann eine Kombination aus hoher und niedriger Strömungsrate durch den Fluidkanal, insbesondere mit einer kurzen Pause vorher oder zwischendurch, zum Abscheren von nur denjenigen Teilchen führen, die sich innerhalb einer Grenzschicht der Probe in Bezug auf den Fluidkanal befinden. Dies bietet den Vorteil, dass in-vivo-Bedingungen für die vorgegebenen Teilchen, zum Beispiel Thrombozyten, simuliert werden können. Da diese Bedingungen einen Einfluss auf die Aktivität von Teilchen, namentlich Thrombozyten, haben können, hat dies eine Auswirkung auf die Funktionsanalyse der Teilchen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Probe, die für dieses Verfahren verwendet ist, eine biologische Probe. Es kann sich um eine Probe von Blut, insbesondere Vollblut, oder Liquor oder Lymphe oder Urin oder Magenspülung handeln. Dies ist vorteilhaft für die Diagnostik auf Patientenseite.
Alle Attribute der Kartusche und/oder des Durchflusszytometers und die entsprechenden Vorteile gelten auch für das beschriebene Verfahren und umgekehrt.
Wenn man die folgende ausführliche Beschreibung von Ausführungsformen in Verbindung mit der beiliegenden Zeichnung beachtet, können die Lehren der vorliegenden Erfindung leicht verstanden werden, und es werden sich zumindest einige weitere spezifische Details ergeben. Es zeigen:
1 eine schematische Darstellung einer beispielhaften Ausführungsform einer Kartusche für ein magnetisches Durchflusszytometer in einer xy-Ebene;
2 einen schematische Querschnitt der beispielhaften Ausführungsform einer Kartusche aus 1 in einer xy-Ebene;
3 eine schematische Darstellung einer alternativen Ausführungsform der Kartusche für ein magnetisches Durchflusszytometer in einer xy-Ebene;
4 einen schematischen Querschnitt einer beispielhaften Ausführungsform eines Fluidkanals mit Probe und Teilchen in einer Fluidkammer;
5 den Querschnitt aus 4 mit Probe und Teilchen in dem Fluidkanal, ohne einen Magnet;
6 den Querschnitt aus 4 mit Magnet und Probe mit Teilchen in dem Fluidkanal;
7 eine schematische Darstellung einer beispielhaften Ausführungsform eines Fluidkanals in einer Anreicherungszone und in einer Messzone in einer xy-Ebene;
8 ein vergrößertes Detail des Fluidkanals aus 7 in einer xy-Ebene;
9 eine schematische Darstellung einer alternativen Ausführungsform eines Fluidkanals im Detail, wobei das Detail dem in 8 dargestellten Detail entspricht;
10 eine schematische Darstellung der Kartusche 1 aus 1 mit einem aktivierten Blister in einer xy-Ebene;
11 die Kartusche aus 10, wenn eine Probe in die Kartusche injiziert wird; und
12 die Kartusche aus 11 mit der Probe, die markierte Teilchen enthält und durch eine Anreicherungszone und eine Messzone in einen Abfallbehälter fließt.
Gleiche oder einander entsprechende Teile sind in den Figuren mit übereinstimmenden Bezugszeichen bezeichnet.
1 zeigt eine schematische Darstellung einer beispielhaften Ausführungsform einer Kartusche für ein magnetisches Durchflusszytometer. Die Kartusche 1 erstreckt sich vor allem in einer xy-Ebene. Sie kann eine rechteckige oder vorwiegend rechteckige Form haben, im vorliegenden Beispiel zum Beispiel mit der Länge l in x-Richtung von 75 mm und einer Breite b in y-Richtung von 25 mm. Sie erstreckt sich auch in einer z-Richtung senkrecht zur x- und y-Richtung, aber in deutlich geringerem Maße. Die vorliegende Ausführungsform umfasst einen Einlass 2, einen Blister 3 und eine Fluidkammer 4 in der linken Seite, also in der Seite der Kartusche 1, die sich in die negative x-Richtung erstreckt, und eine Anreicherungszone 5 sowie ein Messzone 6 und, im vorliegenden Beispiel, einen Abfallbehälter 7 in der rechten Seite der Kartusche 1. Wenn die Kartusche 1 in einem magnetischen Durchflusszytometer verwendet wird, ist ihr Teil auf der rechten Seite dem Einfluss eines Magneten 8 ausgesetzt, der auch in der vorliegenden Abbildung dargestellt ist. In der Regel ist der Magnet 8 eines magnetischen Durchflusszytometers ein Dauermagnet oder ein Elektromagnet. In der vorliegenden Abbildung befindet sich der Magnet 8 unterhalb, also in negativer z-Richtung, von der rechten Seite der Kartusche 1, so dass die Anreicherungszone 5 und die Messzone 6 oberhalb des Magneten 8 angeordnet sind.
In der linken Seite der Kartusche 1 sind der Einlass 2 und die Fluidkammer 4 über eine Fluidkanalverbindung 9' direkt miteinander verbunden. Auf ähnliche Weise sind der Blister 3 und die Fluidkammer 4 über eine Fluidkanalverbindung 9'' direkt miteinander verbunden. Diese beiden Fluidkanalverbindungen 9', 9'' und die Fluidkammer 4 bilden im vorliegenden Beispiel den ersten Teil des Fluidkanals 9. Hier weist die Fluidkammer 4 auch eine Mischvorrichtung 10 auf, die zum Beispiel verwendet werden kann, indem sie in Bewegung versetzt wird, um eine Pufferlösung mit magnetischen Markern mit einer Probe zu mischen, die vorgegebene Teilchen umfasst, welche durch die Marker markiert werden sollen. Von der Fluidkammer 4 aus erstreckt sich der Fluidkanal 9 in dieser Ausführungsform in positiver x-Richtung zur rechten Seite der Kartusche 1. Nach Erreichen eines Bereichs der Kartusche 1 über dem Magneten 8 beginnt sich im vorliegenden Beispiel der Fluidkanal 9 in einer Anreicherungszone 5 zu schlängeln. Innerhalb der Anreicherungszone 5 macht der Fluidkanal also mehrere Wendungen und führt oder läuft nicht nur in x-Richtung, sondern auch in positiver und negativer y-Richtung. Indem er in positiver und negativer y-Richtung läuft, wird der Fluidkanal in der Anreicherungszone 5 verlängert. Dadurch wird es mechanischen Führungsstrukturen, die in der vorliegenden Figur nicht dargestellt sind, möglich, die markierten Teilchen einer durch den Fluidkanal 9 strömenden Probe besser zu fokussieren. Nach der Anreicherungszone 5 hat der Fluidkanal 9 eine Messzone 6, in der sich ein Magnetfeldsensor 14 (4 bis 9) befindet, der in der vorliegenden Figur nicht dargestellt ist. In diesem Beispiel führt der Fluidkanal 9 dann zu einem Abfallbehälter 7.
2 zeigt einen schematischen Querschnitt der Kartusche aus 1 entlang einer Achse A in einer xy-Ebene. Es wird deutlich, dass die Fluidkammer 4 größer als der Fluidkanal 9 ist, sich also im vorliegenden Beispiel viel mehr in der z-Richtung erstreckt als der Fluidkanal 9. Dies ermöglicht der Mischvorrichtung 10, ein relativ großes Volumen der Probe mit den Markern zu mischen. Auf diese Weise werden große Anteile der durch die Marker zu markierenden Teilchen tatsächlich markiert. Um die magnetischen Marker zu fixieren oder festzuhalten und somit die vorbestimmten Teilchen der Probe, nachdem sie markiert sind, innerhalb der Fluidkammer 4 zu halten, befindet sich ein zusätzlicher Magnet 11 in der Nähe der Fluidkammer 4, der aktiviert und deaktiviert werden kann. Im vorliegenden Beispiel wird der zusätzliche Magnet 11 einfach in Richtung der Kartusche 1 bewegt, wenn die Marker in der Fluidkammer 4 festgehalten werden sollen, und von der Kartusche 1 weg bewegt, wenn die markierten Teilchen durch den Fluidkanal 9 strömen sollen. Diese Bewegung wird durch den Pfeil 12 dargestellt. Alternativ kann der zusätzliche Magnet 11 ein Elektromagnet sein, der nach Bedarf ein- und ausgeschaltet wird.
Die vorliegende Ausführungsform ist besonders nützlich, wenn die Teilchen, die durch die magnetischen Marker markiert werden sollen, eine relativ niedrige Konzentration in der Probe haben. Beispielsweise ist dies der Fall, wenn weniger als 5.000 Teilchen pro Mikroliter der Probe vorhanden sind. Wenn die Probe eine Blutprobe ist, kann dies zum Beispiel der Fall für weiße Blutkörperchen sein. In diesem Fall werden die magnetischen Marker der Pufferlösung durch den zusätzlichen Magneten 11 in der Fluidkammer 4 festgehalten, wenn die Probe, die durch den Einlass 2 in die Kartusche 1 injiziert wird, die Pufferlösung ohne die Marker aus der Fluidkammer 4 drückt und sie ersetzt. Da es nicht viele der vorbestimmten Teilchen gibt, die in einer solchen Umgebung in der Probe markiert werden sollen, wird durch die Verwendung der Mischvorrichtung 10 zum Mischen der magnetischen Marker und der Probe die Wahrscheinlichkeit des Markierens der vordefinierten Teilchen der Probe erhöht. Somit verbessert die Verwendung der Mischvorrichtung 10 eine Messung der Probe, d. h. der Teilchen, in der Messzone 6. Alternativ ist es möglich, dass die Probe die Pufferlösung nicht vollständig verdrängt, so dass die Probe in einer vordefinierten Weise durch die Reste der Pufferlösung in der Fluidkammer 4 verdünnt werden kann.
3 zeigt eine schematische Darstellung einer alternativen Ausführungsform der Kartusche 1 in einer xy-Ebene. Im Gegensatz zu der in den 1 und 2 dargestellten Ausführungsform fehlt die Fluidkammer 4 in der gezeigten Ausführungsform. Somit führen die Fluidkanalverbindungen 9', 9'' im vorliegenden Beispiel direkt ineinander. In diesem Beispiel ist der Einlass 2 der Kartusche 1 durch den Fluidkanal 9 direkt mit der Anreicherungszone 5 verbunden. Die Fluidkanalverbindung 9'' des Blisters 3 führt direkt in den Fluidkanal 9. Ein solcher Aufbau ist besonders nützlich, wenn die Konzentration der zu markierenden Teilchen in der Probe besonders hoch ist. Beispielsweise ist dies der Fall, wenn die Konzentration der vorbestimmten zu markierenden Teilchen mehr als 20.000 Teilchen pro Mikroliter beträgt.
Wenn der Blister 3 mit der Pufferlösung gefüllt ist und die magnetischen Marker in der Pufferlösung aktiviert sind, strömen in dem vorliegenden Aufbau die Pufferlösung und die magnetischen Marker durch die Fluidkanalverbindung 9'', den Fluidkanal 9, die Anreicherungszone 5 und die Messzone 6 in den Abfallbehälter 7. Zumindest ein Anteil der Marker wird jedoch in einer vorbestimmten Position des Fluidkanals 9, in diesem Fall in der Anreicherungszone 5, festgehalten. Wenn die Probe mit den zu markierenden vordefinierten Teilchen in den Einlass 2 der Kartusche 1 injiziert wird, findet keine spezifische Vermischung von Markern und Teilchen mittels der Mischvorrichtung 10 oder ähnlichem statt. Stattdessen kommen nur einige Teilchen in direkten physikalischen Kontakt mit den Markern und werden dann markiert. Da im vorliegenden Beispiel die Marker magnetisch sind und dem Magnetfeld des Magneten 8, zum Beispiel in der rechten Seite der Kartusche 1, ausgesetzt sind, werden die magnetischen Marker am Boden des Fluidkanals 9 festgehalten, d. h. an der Oberfläche des Fluidkanals 9, die dem Magneten 8 am nächsten ist. In diesem Fall werden durch die Gestaltung der Kartusche 1 die Eigenschaften der laminaren Strömung der durch den Fluidkanal 9, insbesondere die Anreicherungszone 5, strömenden Probe genutzt, wobei hauptsächlich eine erste Schicht von Teilchen direkt über dem Boden des Fluidkanals 9 mit den Markern in Berührung kommt. Infolgedessen wird nur ein definierter, kleiner Anteil der Teilchen homogen markiert und kann somit in der Messzone 6 gemessen werden. Im Falle einer großen Konzentration der vorbestimmten Teilchen ist es wichtig, nur einen kleinen Teil von ihnen zu markieren, um zu vermeiden, dass mehrere markierte Teilchen koinzident an dem Magnetfeldsensor 14 (4 bis 9) vorbeiströmen. Darüber hinaus kann eine geringe Menge an Markern oder Antikörpern verwendet werden, um die Teilchen trotz ihrer hohen Konzentration zu markieren. Derartige hohe Konzentrationen sind zum Beispiel wichtig, wenn Thrombozyten in einer Blutprobe gemessen werden.
4 zeigt einen schematischen Querschnitt durch einen beispielhaften linearen Fluidkanal 9 in einer xz-Ebene mit der die Teilchen 16 enthaltenden Probe 15 in der Fluidkammer 4. Der Fluidkanal 9 erstreckt sich in der vorliegenden Ausführungsform gerade in einer Linie in der x-Richtung von der Fluidkammer 4 aus über einen Zwischenabschnitt von beliebiger Länge zur Anreicherungszone 5 und von dort zur Messzone 6. In dieser Abbildung ist die Mischvorrichtung 10 in Aktion dargestellt, so dass die Teilchen 16 gerade mit Markern vermischt werden, die hier nicht dargestellt sind. In der Anreicherungszone 5 weist der Fluidkanal 9 eine Ausdehnung e₁, e₂, e₃, e₄ in der z-Richtung auf, die stufenweise abnimmt. Im vorliegenden Beispiel nimmt die Ausdehnung e₁, e₂, e₃, e₄ von einer ersten Ausdehnung e₁ um ca. 25% auf eine zweite Ausdehnung e₂ ab und dann auf eine dritten Ausdehnung e₃, die etwa 50 Prozent der ersten Ausdehnung e₁ entspricht, gefolgt von einer weiteren plötzlichen Verringerung der Ausdehnung in z-Richtung auf eine Ausdehnung e₄, die hier etwa 10 Prozent der ersten Ausdehnung e₁ entspricht. Somit ist die Anreicherungszone 5 des Fluidkanals 9 hier in vier verschiedene Abschnitte 18 unterteilt, die jeweils eine andere Ausdehnung e₁, e₂, e₃, e₄ in der z-Richtung haben.
Der Rückgang der Ausdehnungen e₁, e₂, e₃, e₄ in z-Richtung ermöglicht eine Anpassung der Scherrate der Teilchen 16, wenn sie durch die Anreicherungszone 5 des Fluidkanals 9 strömen. Der Boden des Fluidkanals 9 kann zu diesem Zweck in der Messzone 6 auch näher am Magneten 8 sein als in der Anreicherungszone 5. Auf dem Boden des Fluidkanals 9, also der Oberfläche des Fluidkanals 9, die dem Magneten 8 unter der Kartusche 1 am nächsten ist, d. h. der Anreicherungszone 5 und der Messzone 6 des Fluidkanals 9, sind Erhebungen 13 in einer xy-Ebene senkrecht zum hier gezeigten Querschnitt angeordnet. Details der Erhebungen 13 sind in den 7 bis 9 dargestellt.
5 zeigt den Querschnitt aus 4 mit der Probe 15 und den Teilchen 16 in der Anreicherungszone 5 des Fluidkanals 9. Hier ist der Magnet 8 entfernt, sodass keine magnetische Kraft auf die Teilchen 16 oder ihre jeweiligen Marker ausgeübt wird. Infolgedessen sind sie in der z-Richtung in der Anreicherungszone 5 gleichmäßig verteilt.
6 zeigt den Querschnitt aus 5 mit vorhandenem Magneten 8. Aufgrund der durch den Magneten 8 auf die markierten Teilchen 16 ausgeübten Magnetkraft befinden sich alle markierten Teilchen in der Anreicherungszone 5 am Boden des Fluidkanals 9. Infolgedessen können die Erhebungen 13 am Boden des Fluidkanals 9 die markierten Teilchen 16 in einem vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals, zum Beispiel in die Mitte einer Strömung durch den Fluidkanal 9 in einer xy-Ebene, fokussieren.
7 zeigt eine schematische Darstellung einer beispielhaften Ausführungsform eines Fluidkanals in einer xy-Ebene. Ähnlich wie in den 4 bis 6 gibt es vier Abschnitte 14 des Fluidkanals 9, die eine unterschiedliche Ausdehnung in der z-Richtung haben. Der Fluidkanal 9 ist im aktuellen Beispiel gerade und weist sowohl eine Anreicherungszone 5 als auch eine Messzone 6 auf, die hier zur Veranschaulichung durch die Linie 19 getrennt sind. Der Fluidkanal 9 hat eine Strömungsrichtung F, in der die Probe 15 mit den markierten Teilchen 16 fließt. Die Anreicherungszone 5 weist wieder vier verschiedene Abschnitte 18 auf, jeweils mit einer anderen Ausdehnung in der z-Richtung, um die Teilchen 16 einer vordefinierten Scherrate auszusetzen. Ein Feld 17 markiert einen Teil des Fluidkanals 9, die Messzone 6 und einen Teil der Anreicherungszone 5, die in 8 im Detail dargestellt sind.
Am Boden des Fluidkanals 9 sind Erhebungen 13 vorgesehen, die hier die markierten Teilchen 16, die im vorliegenden Beispiel durch den Magneten 8 zum Boden gezogen werden, zur oder in die Mitte M des Fluidkanals 9 treiben oder fokussieren. Diese Erhebungen 13 sind im vorliegenden Beispiel v-förmig, wobei die Spitzen der Vs auf die Mitte M des Fluidkanals 9 ausgerichtet sind und in die Strömungsrichtung F zeigen. Im vorliegenden Beispiel gibt es mehrere Gruppen von Erhebungen 13, die die gleichen Abmessungen haben. Dies bedeutet, dass sich die Erhebungen 13 von einigen Erhebungsgruppen 13 weniger in eine Richtung senkrecht zur Strömungsrichtung F erstrecken als die Erhebungen 13 von anderen Erhebungsgruppen 13. Somit erstrecken sich die Erhebungen 13 weniger in diese Richtung, wenn sie der Messzone 6 näher sind. Obwohl der Abstand zwischen den benachbarten Erhebungen 13 variieren kann, können sie einander insbesondere näher kommen, je näher sie der Messzone 6 sind. Aus der Perspektive eines Teilchens 16, das in der Strömungsrichtung F durch den Fluidkanal 9 fließt, zeigen die Erhebungen 13 auf den vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals 9, der im vorliegenden Beispiel die Mitte M des Fluidkanals 9 ist. Dies ist sinnvoll, da sich der Magnetfeldsensor 14 genau in die dem vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals 9 befindet, d. h. in der Strömungsrichtung F in der Mitte M des Fluidkanals 9.
Die Kombination einer Veränderung der Ausdehnung des Fluidkanals 9 in der z-Richtung und der Breite der Erhebungen 13 ermöglicht die Messung von Teilchen 16 in einer Vielzahl von unterschiedlichen Konzentrationen mit der gleichen Kartusche 1. Wenn die Probe eine Vollblutprobe ist, kann ein Dynamikbereich von mehr als zwei Größenordnungen, in der Regel drei bis vier Größenordnungen, für die Konzentrationen der vorbestimmten Teilchen 16 im Vollblut abgedeckt werden.
8 zeigt ein vergrößertes Detail des Fluidkanals aus 7, das in 7 durch das Feld 17 gekennzeichnet ist. Die Teilchen 16 um die Mitte M des Fluidkanals 9 herum werden durch die Erhebungen 13 in der Mitte M konzentriert bzw. auf die Mitte M fokussiert. Infolgedessen liegt eine fast homogene Konzentration der markierten Teilchen 16 außerhalb eines zentralen Bereichs C um die Mitte M des Fluidkanals 9 herum vor. Außerhalb des zentralen Bereichs C sind die Teilchen 16 nicht mehr fokussiert. Im zentralen Bereich C befinden sich fast alle Teilchen 16 genau in der Mitte M des Fluidkanals 9 und passieren daher nacheinander den Magnetfeldsensor 14. Da es keine anderen markierten Teilchen 16 in der Nähe des Magnetfeldsensors 14 gibt, werden die Messergebnisse nicht durch in der Nähe befindliche Teilchen 16 beeinflusst.
9 zeigt eine schematische Darstellung einer alternativen Ausführungsform eines Fluidkanals 9 im Detail, wobei das Detail dem in 8 dargestellten Detail entspricht. Hier bewegen zusätzliche Erhebungen 13' die Teilchen 16', die nicht richtig auf die Mitte des Fluidkanals fokussiert wurden, von der Mitte M weg. Auf diese Weise wird die Messung der korrekt fokussierten Teilchen 16 nicht durch die schlecht fokussierten Teilchen 16' verfälscht. Die schlecht fokussierten Teilchen 16' können versehentlich markiert werden, zum Beispiel, wenn sich die Marker an Teilchen binden, an die sie sich nicht binden sollen. In diesem Fall werden diese Teilchen 16' durch deutlich weniger Marker markiert als die vorgegebenen Teilchen und werden daher weniger durch das Magnetfeld beeinflusst und nicht korrekt fokussiert. In diesem Beispiel sind die zusätzlichen Erhebungen 13' gerade Erhebungen, ähnlich einem V, dessen offene Spitze in entgegengesetzter Richtung zu den v-förmigen Originalerhebungen 13 zeigt, d. h. mit einer offenen Spitze, die entgegen der Strömungsrichtung F zeigt.
Darüber hinaus wurde eine Vertiefung 20 hinzugefügt, in dieser Ausführungsform direkt hinter dem Magnetfeldzentrum 14 in Strömungsrichtung F. Diese Vertiefung 20 fungiert als eine Falle für die markierten und gemessenen Teilchen 16. Auf diese Weise können die markierten und gemessenen Teilchen 16 nach der Messung leicht extrahiert werden. Die Vertiefung 20 kann ein Hohlraum in der Messzone 6 sein, der sich in z-Richtung erstreckt, sodass zum Beispiel der Rest der Probe, z. B. Blut, mit einer Pufferlösung weggespült werden kann und die hochkonzentrierten, gemessenen Teilchen 16 als gereinigte Probe der gemessenen Partikel 16 extrahiert werden können.
10 zeigt eine schematische Darstellung der Kartusche 1 aus 1 mit einem aktivierten Blister. Da der Blister 3 hier aktiviert wurde und somit die Pufferlösung 21 und die Marker, die zuvor im Blister 3 enthalten waren, in die Fluidkammer 4 gedrängt wurden, wurde auch ein Teil der Pufferlösung 21 in den Fluidkanal 9 gedrängt, der die Fluidkammer 4 über die Anreicherungszone 5 und die Messzone 6 mit den Abfallbehälter 7 verbindet. Die magnetischen Marker werden jedoch aufgrund des zusätzlichen Magneten 11, der in 2 dargestellt ist, in der Fluidkammer 4 bleiben. Die Pufferlösung 21 wird jedoch weiterhin durch den Fluidkanal 9 strömen, wenn mehr von Pufferlösung 21 mit den Markern oder von der Probe 15 in die Fluidkammer 4 gedrängt wird.
11 zeigt die Kartusche aus 10 mit einer in den Einlass injizierten Probe. Hier ist die Probe 15 bereits in den Einlass 2 injiziert und ist teilweise in die Fluidkammer 4 geströmt. Die in die Fluidkammer 4 strömende Probe 15 hat die Pufferlösung 21 durch die Anreicherungszone 5 und die Messzone 6 weiter in den Fluidkanal 9 Richtung Abfallbehälter 7 gedrängt. Im vorliegenden Beispiel sind die magnetischen Marker der Pufferlösung 21 in der Fluidkammer 4 geblieben, weil sie dort durch den zusätzlichen Magneten 11 (1) festgehalten wurden. Die Pufferlösung 21 jedoch ist bereits durch die Anreicherungszone 5 und die Messzone 6 geströmt. In einem nächsten Schritt kann entweder mehr von der Probe 15 in den Einlass 2 injiziert werden, so dass der Rest der Pufferlösung 21 aus der Fluidkammer 4 verdrängt wird, oder die Probe 15 kann, wie in dem in 12 dargestellten Beispiel, mit dem Rest der Pufferlösung 21, die in der Fluidkammer 4 verblieben ist, und mit den magnetischen Markern gemischt werden. Daraus resultiert eine verdünnte Probe 22 (12) zusammengesetzt aus der Originalprobe 15 und der Pufferlösung 21, mit markierten Teilchen 16 (4 bis 9) in der verdünnten Probe 22, während sich die verdünnte Probe 22 immer noch in der Fluidkammer 4 befindet. Diese verdünnte Probe 22 kann dann weiter durch den Fluidkanal 9 in Richtung Anreicherungs- und Messzone 6 gedrängt werden, in dem mehr von der Originalprobe 15 in die Kartusche 1 injiziert wird.
Wenn der zusätzliche Magnet an diesem Punkt aktiviert bleibt, werden die markierten Teilchen in der Fluidkammer 4 festgehalten und im Folgenden daher von der Originalprobe 15 umgeben. Dies ermöglicht nach dem Deaktivieren des zusätzlichen Magneten 11 das Messen der markierten Teilchen als Teil der Originalprobe 15, zum Beispiel als Teil von Vollblut, wodurch in diesem Beispiel in-vivo-Bedingungen imitiert werden. Wenn der zusätzliche Magnet vor dem Injizieren von mehr von der Originalprobe 15 in die Kartusche 1 deaktiviert wurde, werden die markierten Teilchen als Teil der verdünnten Probe 22 gemessen.
12 zeigt die Kartusche aus 11 mit der Probe, die markierte Teilchen enthält und durch eine Anreicherungszone und eine Messzone in einen Abfallbehälter fließt. Hier wurde die verdünnte Probe 22 nach dem Mischen der Probe 15 mit magnetischen Markern und einem Teil der in der Fluidkammer 4 verbleibenden Pufferlösung 21 weiter in den Fluidkanal 9 hinein gedrängt, indem mehr von der Originalprobe 15 in die Kartusche 1 injiziert wurde. Der zusätzliche Magnet 11 wurde abgeschaltet oder entfernt, nachdem die verdünnte Probe 22 die Fluidkammer 4 verlassen hatte, um es den markierten Teilchen 16 (4 bis 9), die jetzt von der Originalprobe 15, z. B. Vollblut, umgeben sind, zu ermöglichen, den Fluidkanal 9 entlang zu strömen. Die verdünnte Probe 22 wird in dem vorliegenden Beispiel durch die Anreicherungszone 5 in den Abfallbehälter 7 gedrängt. Wenn dieser Prozess abgeschlossen ist, strömt die Originalprobe mit den markierten Teilchen 16 (4 bis 9) durch die Anreicherungszone 5, wo die genannten mechanischen Führungsstrukturen, zum Beispiel die Erhebungen 13 (4 bis 9), die markierten Teilchen 16 in einem vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals 9, zum Beispiel in der Mitte M des Fluidkanals 9, fokussieren. So können die markierten Teilchen 16 in der Originalprobe 15 ordnungsgemäß, beispielsweise unter in-vivo-Bedingungen, durch einen Magnetfeldsensor 14 (4 bis 9) gemessen werden. Nach Durchströmen der Messzone 6 wird die Originalprobe 15 einschließlich der markierten Teilchen 16 durch eine konstante Strömung der Originalprobe 15 in diesem Beispiel in den Abfallbehälter 7 gedrängt.

Claims

Kartusche (1) für ein magnetisches Durchflusszytometer, die sich hauptsächlich in einer xy-Ebene erstreckt, mit – einem Einlass (2) zum Injizieren einer Probe (15) in die Kartusche (1), – einem Blister (3) für eine Pufferlösung (21) mit magnetischen Markern zum Markieren vorgegebener Teilchen (16, 16') der Probe (15), – einem Auslass und – einem Fluidkanal (9), wobei der Fluidkanal (9) einen ersten Teil, der den Einlass (2) mit dem Blister (3) verbindet, und einen zweiten Teil, der den ersten Teil mit dem Auslass verbindet, umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Teil des Fluidkanals (9) aufweist: – eine Anreicherungszone (5) mit mechanischen Führungsstrukturen zum Fokussieren der markierten Teilchen (16, 16') der Probe (15) in einem vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals (9) und – eine Messzone (6) zwischen der Anreicherungszone (5) und dem Auslass, wobei die Messzone (6) einen Magnetfeldsensor (14) in dem vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals (9) aufweist.
Kartusche (1) nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Fluidkammer (4), insbesondere eine Fluidkammer (4) im ersten Teil des Fluidkanals (9), zum Mischen der Probe (15) mit den Markern.
Kartusche (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mechanischen Führungsstrukturen die Abnahme des Fluidkanals (9), insbesondere eine stufenweise Abnahme, in seiner Ausdehnung (e₁, e₂, e₃, e₄) in der z-Richtung in der Anreicherungszone (5) umfassen, wenn sich der Fluidkanal (9) der Messzone (6) nähert.
Kartusche (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mechanische Führungsstrukturen eine Vielzahl von Erhebungen (13), insbesondere Wände, umfassen, die sich auf einer Fläche des Fluidkanals (9) in der xy-Ebene erstrecken, wobei insbesondere die Erhebungen (13) eine Ausdehnung in der z-Richtung von mehr als der Hälfte des Durchmessers der zu markierenden Teilchen (16, 16') aufweisen.
Kartusche (1) nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch Erhebungen (13), die, aus der Perspektive einer Strömung durch den Fluidkanal (9) zum Auslass, entweder auf den vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals (9) hin weisen, um Teilchen (16, 16') zu dem vorbestimmten Teilabschnitt zu lenken, oder von dem vorbestimmten Teilabschnitt weg weisen, um Teilchen (16, 16'), die nahe, aber nicht innerhalb des vorbestimmten Bereichs sind, von dem Magnetfeldsensor (14) weg zu lenken, oder durch Kombinationen von Erhebungen (13), die auf den vorbestimmten Teilabschnitt hin weisen und von diesem weg weisen.
Kartusche (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der vorbestimmte Teilabschnitt des Fluidkanals (9) die Mitte (M) des Fluidkanals (9) auf einer Oberfläche in der xy-Ebene des Fluidkanals (9) ist.
Kartusche (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluidkanal (9) in der Anreicherungszone (5) mäandert, um eine Wegstrecke, auf der die Teilchen (16, 16') durch die mechanischen Führungsstrukturen gelenkt werden, zu verlängern.
Kartusche (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Messzone (6) eine Vertiefung (20) aufweist, die sich – aus einer Perspektive einer Strömung durch den Fluidkanal (9) zum Auslass – hinter dem Magnetfeldsensor (14) befindet.
Kartusche (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluidkanal (9), insbesondere der Fluidkanal (9) in der Messzone (6), eine Breite zwischen 250 und 2500 Mikrometer und eine Höhe zwischen 50 und 600 Mikrometer hat, oder eine Querschnittsfläche mit einer Größe, die einem Rechteck über die obige Breite und Höhe entspricht.
Magnetisches Durchflusszytometer mit der Kartusche (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, mit einem Magneten (8), insbesondere einem Dauermagneten, der sich in einer xy-Ebene unterhalb der Anreicherungszone (5) erstreckt, wobei sich der Magnetfeldsensor (14) oberhalb einer Mitte des Magneten in der xy-Ebene befindet.
Verfahren zum Messung von Teilchen (16, 16') einer Probe (15) durch ein magnetisches Durchflusszytometer unter Verwendung einer Kartusche (1) für das magnetische Durchflusszytometer, die Folgendes aufweist – einen Einlass (2) zum Injizieren einer Probe (15) in die Kartusche (1), – einen Blister (3) mit einer Pufferlösung (21) mit magnetischen Markern zum Markieren vorbestimmter Teilchen (16, 16') der Probe (15), – einen Auslass und – einen Fluidkanal (9), der einen ersten Teil, der den Einlass (2) mit dem Blister (3) verbindet, und einen zweiten Teil, der den ersten Teil mit dem Auslass verbindet, aufweist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: a) Aktivieren des Blisters (3), so dass die Pufferlösung (21) mit den magnetischen Marker in den Fluidkanal (9) strömt; b) Festhalten der magnetischen Marker in einer vorbestimmten Position des Fluidkanals (9) mittels eines Magnetfelds; c) Injizieren der Probe (15) in den Fluidkanal (9), so dass die Pufferlösung (21) in dem Fluidkanal (9) in Richtung des Auslasses gedrängt wird und die Probe (15) durch den Fluidkanal (9) strömt, so dass zumindest einige der vorbestimmten Teilchen (16, 16') der Probe (15) durch die magnetischen Marker in der vorbestimmten Position markiert werden; d) Fokussieren der markierten Teilchen (16, 16') in einem vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals (9) mithilfe mechanischer Führungsstrukturen in einer Anreicherungszone (5) im zweiten Teil des Fluidkanals (9); e) Messen der markierten Teilchen (16, 16') durch einen Magnetfeldsensor (14) im vorbestimmten Teilabschnitt des Fluidkanals (9), wobei sich der Magnetfeldsensor (14) in einer Messzone (6) zwischen der Anreicherungszone (5) und dem Auslass befindet.
Verfahren nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch das Festhalten der magnetischen Marker in einer Fluidkammer (4) in Schritt b) und das Mischen der magnetischen Marker mit der Probe (15) in der Fluidkammer (4) nach dem Injizieren der Probe (15) in Schritt c).
Verfahren nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch Festhalten der magnetischen Marker auf einer Oberfläche des Fluidkanals (9) in der Anreicherungszone (5) in Schritt b), insbesondere mithilfe des Magnetfelds zur Messung der markierten Teilchen (16, 16') in Kombination mit dem Magnetfeldsensor (14).
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, gekennzeichnet durch das Einstellen der Strömungsgeschwindigkeit der Probe (15) durch den Fluidkanal (9), insbesondere durch die Messzone (6) des Fluidkanals (9), auf einen vorgegebenen Wert, so dass eine vorgegebene Scherrate der Teilchen (16, 16') der Probe (15) erreicht wird, wobei die Scherrate sowohl von Eigenschaften der Teilchen (16, 16') als auch von der Geometrie des Fluidkanals (9) abhängig ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (15) eine Probe (15) von Blut, insbesondere Vollblut, oder Liquor oder Lymphe oder Urin oder Magenspülung ist.