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Die
Erfindung betrifft ein Messgerät
zur Überwachung
und Steuerung der Injektion von Fluiden in mikrofluiden Kanälen, insbesondere
zum Einsatz in der hochauflösenden
Kapillarelektrophorese.
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Moderne
mikroanalytische Messgeräte
vom Typ Lab-on-a-Chip basieren auf dem Transport von Flüssigkeiten
in mikrofluidischen Kanalstrukturen. Ein typischer Verfahrensschritt
ist hierbei das Zuführen
bzw. das Zusammenführen
von exakt definierten Flüssigkeitsmengen
in Mikrokanälen,
z.B. zu Mikromischern und Mikroreaktoren, oder die Injektion eines
Analytpfropfens in eine Separationskapillare zur Flüssigchromatographie
oder zur Kapillarelektrophorese.
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In
der Praxis besteht häufig
die Schwierigkeit in der Einstellung definierter Flüssigkeitsmengen,
vor allem die genaue Definition eines Analytpfropfens. Da das Ergebnis
der chemischen Analyse von dieser Genauigkeit bestimmt wird, sind
Kontrollfunktionen außerordentlich
wünschenswert.
Dabei sollen lokale Information zum Stofftransport gewonnen werden, die
sowohl zur Verfahrensoptimierung als auch zur Kontrolle in der Routineanalytik
dienen.
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Aus
dem Stand der Technik ist die Kontrolle des Transports durch optische
Messungen, z.B. durch den Zusatz von Fluoreszenzmarkern und die Echtzeit-Beobachtung
im Fluoreszenzmikroskop bekannt. Vorteilhaft ist dabei eine hohe
lokale Auflösung,
die direkte Aussagen über
das Verhalten der Teil-Flüssigkeitsströme ermöglicht.
Dem stehen jedoch die Einflüsse
der optischen Parameter der Messzelle nachteilig gegenüber, deren
Beachtung einen hohen apparativen und experimentellen Aufwand erfordert.
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Weiterhin
ist aus der Kapillarelektrophorese die Messung des Stromes zwischen
den Reservoirs an den Enden der Mikrokanäle als Maß für den elektrokinetischen Stofftransport
bekannt. Vorteilhaft hieran ist die Erfassung einer systemimmanenten Messgröße, so dass
außer
der Bereitstellung von Elektronik kein zusätzlicher Messaufbau erforderlich ist.
Nachteilig hieran ist aber, dass durch die Messpunkte zur Messung
des Stroms zwischen den Reservoirs nur eine integrale Aussage über die
gesamte Kanallänge
möglich
ist. Zur Erfassung minimaler Ströme
bzw. Stromänderungen
in der Größenordnung
von wenigen nA ist zudem ein hoher apparativer Aufwand erforderlich.
Verfahrensbedingt werden zudem hydrodynamisch bedingte Einflüsse nicht
erfasst.
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In
der US 2005/150 766 A1 wird zur besseren Definition des Analytpfropfens
die Verringerung des Querschnitts der Injektionskanäle beschrieben. Die
US 6 423 198 B1 und
die
EP 1 296 134 A1 offenbaren
die genauere Injektion über
eine Doppel-T-Struktur.
Mit diesen Vorrichtungen ist jedoch keine Überwachung des Systems möglich. Bestehen Konzentrationsunterschiede
wie z.B. beim Sample-Stacking verringern die beschriebenen Vorrichtungen
höchstens
die oben genannten Probleme.
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Die
US 2003/136 679 A1 beschreibt die Verwendung einer strömungshemmenden
Membran zur Verringerung des Nachströmens als eine Ursache für die ungenaue
Definition des Analytpfropfens. Nachteilig hieran ist jedoch der
zusätzliche
Herstellungsaufwand.
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Ausgehend
hiervon ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Messgerät zur Überwachung
und Steuerung der Injektion von Fluiden in mikrofluiden Kanälen vorzuschlagen,
das diese Nachteile und Einschränkungen
nicht aufweist.
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Insbesondere
soll ein solches Messgerät
bereitgestellt werden, mit dem Aussagen zum Transport von Fluiden,
auch von Teilströmen,
möglich
sind. Die Messungen sollen hierbei in Echtzeit erfolgen und Ergebnisse
liefern, die unabhängig
von den optischen Eigenschaften des Kanalsystems sind. Das Messgerät soll die
Fluidik des Systems nicht störend
beeinflussen, für
ein großes
Spektrum an Fluiden einsetzbar sein, kompatibel zur Funktion und
zur Herstellung von Lab-on-a-Chips, kostengünstig und damit als integraler
Bestandteil von Massenprodukten einsetzbar sein.
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Diese
Aufgaben werden durch ein Messgerät mit den Merkmalen des Anspruchs
1 gelöst.
Die Unteransprüche
beschreiben jeweils vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.
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Ein
erfindungsgemäßes Messgerät zur Überwachung
und Steuerung der Injektion von Fluiden in mikrofluiden Kanälen besteht
aus einer Anordnung aus mindestens zwei in einem Verbindungsbereich
miteinander verbundenen mikrofluidischen Kanälen, wobei das Fluid, d.h.
eine Flüssigkeit
oder ein Gas, aus einem Injektionskanal in mindestens einen weiteren
Kanal injizierbar ist und mindestens ein Messelektrodenpaar für eine kontaktlose
Leitfähigkeitsmessung
im Verbindungsbereich der mikrofluidischen Kanäle angebracht ist.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung erfolgt die Injektion des Fluids
aus dem Injektionskanal in den mindestens einen weiteren Kanal durch
entsprechend gestaltete elektrokinetische oder hydrodynamische Mittel.
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In
einer bevorzugten Ausgestaltung ist ein einziges Messelektrodenpaar
vorhanden, das entweder in Richtung des Injektionskanals oder in
Richtung des mindestens einen weiteren Kanals angebracht ist.
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In
einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist mindestens einer der
weiteren Kanäle
als Trennkanal ausgestaltet. Der Trennkanal ist hierbei vorzugsweise
Bestandteil einer Vorrichtung für
die Kapillarelektrophorese im Chipformat.
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In
dieser Ausgestaltung sind bevorzugt zwei Messelektrodenpaare vorhanden,
wobei eines in Richtung des Injektionskanals und das andere in Richtung
des Trennkanals angebracht ist.
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Am
Trennkanal, vorzugsweise an dessen Ausgang, ist in dieser Ausgestaltung
ein Detektionsbereich vorgesehen, der die kontaktlose Detektion von
Bestandteilen im Fluid mittels Hochfrequenz ermöglicht.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
ermöglicht
das Erfassen der lokalen Zusammensetzung von Fluiden durch kontaktloses
Erfassen der elektrischen Leitfähigkeit
(Impedanz) in einer miniaturisierten Messzelle (mikrofluidische
Impedanzmesszelle). Durch Layout und Materialauswahl lässt sich
die Messzelle optimal an die Messaufgabe anpassen. Der Einsatz von
mehreren Messzellen erlaubt eine Multiparametererfassung.
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Die
mittels der Messelektrodenpaare erhaltenen Messergebnisse dienen
einerseits zur Beurteilung der Analysenparameter und ermöglichen
andererseits die Steuerung des Fluidtransports und die weitere Optimierung
des Messgeräts.
Das erfindungsgemäße Messgerät lässt sich
einsetzen in der Kapillarelektrophorese zur Untersuchung von gelösten Bestandteilen
in einem flüssigen
oder gasförmigen
Analyten (Fluid).
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Ein
besonderer Einsatzbereich ist die mehrdimensionale (sukzessive)
Kapillarelektrophorese. Hierzu wird in einem ersten Trennkanal die
Trennung der Spezies registriert und anschließend der Analytpfropfen, der
bei dieser Art der Messung den Peaks in der ersten Dimension entspricht,
in einen zweiten Trennkanal überführt, um
ihn dort unter geänderten Bedingungen
in weitere Spezies aufzutrennen, die dann bevorzugt wiederum mittels
berührungslosem Leitfähigkeitsnachweis
(Contactless Conductivity Detection, CCD) nachgewiesen werden.
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Die
Erfindung weist insbesondere die im Folgenden erwähnten Vorteile
auf:
- – Einfacher,
kostengünstiger
Aufbau des Messgeräts,
- – optimale
lokale Messzellenanpassung durch Flusskontrolle direkt im bzw. am
Verbindungsbereich,
- – Erweiterung
aller Vorteile der CCD von bisher nur Nachweis im Detektionsbereich
am Kapillarausgang auf andere Bereiche der Vorrichtung,
- – Multiparameter-Erfassung
bei einer Vielzahl von CCD-Messspots
wird möglich,
- – hohe
lokale Auflösung,
- – Messung
unabhängig
von den optischen Eigenschaften des Systems,
- – Arbeiten
unter instabilen Bedingungen wird möglich,
- – einfache
Integration in bestehende Systeme.
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Die
Erfindung wird im Folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels und der Figur
näher erläutert.
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Die
Figur zeigt schematisch den Aufbau eines erfindungsgemäßen Messgeräts. Zur
hochauflösenden
Kapillarelektrophorese wird aus einem Injektionskanal 1 eine
definierte Menge an einem flüssigen
oder gasförmigen
Analyten in einen Trennkanal 2 injiziert, der weiterhin
ein Reservoir 21 für
einen Hintergrundelektrolyten und ein erstes Abfall-Reservoir 22 aufweist.
Hierzu wird über
den Injektionskanal 1 mittels der Spannungsversorgung 3 ein
elektrisches Feld angelegt, wodurch sich die in der Lösung befindlichen
Analytionen aus einem Vorrat 11 ihrer Ladung entsprechend
im elektrischen Feld in Richtung eines zweiten Abfall-Reservoirs 12 bewegen. Dadurch
wird der Verbin dungsbereich 5 der beiden Kanäle mit Analyt
befüllt.
Beim anschließenden Trennvorgang
wird das elektrische Feld über
den Trennkanal 2 angelegt. Im Idealfall würde nun
nur das Volumen des Verbindungsbereichs 5 und somit eine
definierte Analytmenge in den Trennkanal 2 injiziert werden.
Am Ende des Trennkanals 2 in einem Detektionsbereich 4 werden
die nach ihrer Größe und Ladung
im elektrischen Feld entsprechend aufgetrennten Analytionen nachgewiesen.
Wurde zuvor eine definierte Analytmenge injiziert, so ist am Ende eine
quantitative Auswertung der Analytzusammensetzung möglich.
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Mit
einem Fluoreszenzmikroskop durchgeführte Untersuchungen zeigten
jedoch, dass der Injektionsprozess in der Realität nicht ideal abläuft. In Fluoreszenzmikroskopaufnahmen
des Verbindungsbereichs 5 wurden Injektions- und Trennsequenzen bei
verschiedenen Geometrien des Verbindungsbereichs 5 untersucht.
Hierzu besaß ein
erster Verbindungsbereich abgerundete Ecken, während ein zweiter Verbindungsbereich
Ecken mit einem Winkel von 90° aufwies.
Hierbei war zu erkennen, dass bei beiden Geometrien der Analyt bei
der Injektion nicht nur in den Verbindungsbereich 5 strömt, sondern
auch darüber
hinaus in den Trennkanal 2, wodurch sich ein undefinierte
Analytvolumen ergeben konnte. Beim anschließenden Trennvorgang kam es
bei beiden Geometrien darüber
hinaus zu einem unerwünschten Nachströmen des
Analyten in den Trennkanal 2. Diese beiden Effekte können sowohl
zu einer Verringerung der Empfindlichkeit der Messung als auch zu Mess-Instabilitäten führen.
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Untersuchungen
zur Reproduzierbarkeit der Messungen mit solchen Messgeräten zeigten,
dass sich im Idealfall ein stabiler Zustand einstellt; es konnten
sich jedoch insbesondere bei speziellen Verfahrensweisen, die z.B.
zu wesentlich höheren
Empfindlichkeiten führten,
auch instabile Zustände
ausbilden. Hierzu wurden mehrere Analysesequenzen, d.h. jeweils
eine Injektion und eine Trennung, hintereinander ausgeführt. Dabei wurde
sowohl der elektrische Strom im Injektionskanal 1 als auch
das quantitative Signal des Analyten im Detektionsbereich 4 erfasst.
Beim Standardverfahren, bei dem der Analyt im Hintergrundelektrolyten,
mit dem auch der Trennkanal 2 befüllt ist, verdünnt wird,
zeigen sich nur kleine Schwankungen in beiden Signalen. Wird hingegen, wie
z.B. beim Sample-Stacking, der Analyt in Wasser verdünnt, ließen sich
Instabilitäten
sowohl im Injektionsstrom als auch im Analytsignal beobachten. Eine quantitative
Analyse über
mehrere Zyklen, wie z.B. bei der Online-Untersuchung eines Prozesses,
ist dann ohne zusätzliche
Kalibrierungen nicht mehr möglich.
Dieses Verfahren besitzt jedoch den Vorteil, dass es eine wesentlich
höhere
Nachweisempfindlichkeit ermöglicht.
So war das Analytsignal bei Messungen, in denen der Analyt in Wasser
verdünnt
wurde, im Vergleich zu Messungen, in denen der Analyt lediglich
im Hintergrundelektrolyten verdünnt
wurde, bis zu ca. 4 mal größer, obwohl
die Konzentration des Analyten 2,5 mal geringer war.
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Die
erfindungsgemäße Lösung dieses
Problems besteht nun in der Anbringung von zusätzlichen Messelektroden im
Verbindungsbereich 5 zwischen dem Injektionskanal 1 und
dem Trennkanal 2. In der Figur sind zwei Messelektrodenpaare 6, 6' und 7, 7' im Verbindungsbereich 5 dargestellt,
wobei sich ein Messelektrodenpaar 6, 6' in Richtung
des Injektionskanals 1 und ein weiteres Messelektrodenpaar 7, 7' sich in Richtung
des Trennkanals 2 befindet. Die Messelektrodenpaare 6, 6', 7, 7' erlauben es
zum einen, die Vorgänge
in diesem Bereich zu erfassen, und ermöglichen zum anderen die Steuerung
des Fluidtransports über
diesen Bereich und damit eine Optimierung der hochauflösenden Kapillarelektrophorese.
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Bei
beiden oben beschriebenen Geometrien wurde mit dem erfindungsgemäßen Messgerät mit den
Messelektrodenpaaren in Richtung des Injektionskanals 1 Signale
bei einer Variation der Injektionszeit aufgenommen. Es zeigte sich,
dass nach 1 Se kunde der Injektionskanal 1 noch nicht ganz
mit Analyt befüllt
war; dies trat erst nach ca. 3 Sekunden ein, wenn das Signal nicht
weiter anstieg. Der am Ende der Injektionszeit beobachtbare kurze
Anstieg des Signals ist auf den Umschaltimpuls der Hochspannung
von Injektion auf Trennung zurückzuführen.
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Wurde
der gleiche Vorgang mit den Messelektrodenpaaren in Richtung des
Trennkanals 2 beobachtet, so zeigte sich, dass die Signale
auch nach 10 Sekunden noch weiter anstiegen: Es strömte kontinuierlich
Analyt in den Trennkanal 2 hinein.
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Bei
Variation der Injektionsspannung bei einer festen Injektionszeit
von 5 Sekunden zeigte sich bei der Beobachtung in Richtung des Injektionskanals 1 mit
zunehmender Spannung ein steiler Anstieg des Messsignals: Der Analyt
bewegte sich mit höherer
Geschwindigkeit durch den Injektionskanal 1, wodurch das
Ende des Signalanstiegs, also die komplette Befüllung des Injektionskanals 1,
früher
erreicht wurde.
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Die
Beobachtung desselben Vorgangs in Richtung des Trennkanals 2 zeigte,
dass kontinuierlich mehr Analyt in den Trennkanal 2 strömte und
sich die Menge mit zunehmender Injektionsspannung stärker erhöhte, da
der Analyt schneller hineinströmte.
Bei Variation der Trennspannung nach einer Injektionszeit von 5
Sekunden zeigte sich, dass mit zunehmender Trennspannung das Signal
schneller abfällt: Der
Analyt wurde schneller aus dem Injektionskreuzungsbereich entfernt.
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In
Richtung des Trennkanals 2 war nach dem ersten starken
Abfall des Signals nochmals ein leichter Anstieg zu beobachten,
der mit zunehmender Spannung stärker
ausgeprägt
war. Dieser Effekt beruht auf dem Nachströmverhalten, das sich mit zunehmender
Trennspannung erhöht,
und erlaubt, Informationen über
das Injektions- und das Nachströmverhalten
zu gewinnen.
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Bei
Mehrfachanalysezyklen wie z.B. in der Online-Analytik ließ sich sowohl
ein stabiles Verhalten für
Injektion und Nachströmen
beobachten und kontrollieren als auch ein deutlich instabiles Verhalten,
insbesondere beim Verfahren des Sample-Stackings. Hierbei konnten
Instabilitäten
wesentlich deutlicher aufgezeigt werden als bei vergleichenden Untersuchungen
mittels Fluoreszenzmikroskopie.
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Über einen
oder mehrere Analysezyklen (Injektionszeit jeweils 10 Sekunden)
lassen sich nun die Stabilität
des Systems kontrollieren und ggf. Instabilitäten korrigieren, indem die
gewonnenen Informationen dazu eingesetzt werden, um unter realen
Bedingungen eine quantitative Analyse durchzuführen, indem jeweils das injizierte
Analytvolumen errechnet wird.
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Weiterhin
dienen diese Informationen dazu, um Gegenmaßnahmen zu ergreifen, die das
Nachströmen
verringern bzw. zu verhindern und das Gesamtsystem aus Injektion
und Trennung durch Regeleingriffe stabilisieren. Auf diese Weise
ist es sogar möglich,
unter normalerweise instabilen Bedingungen zu arbeiten.