DE2145531C2 - Vorrichtung zum Zählen und Klassieren von in einer elektrisch leitenden Flüssigkeit suspendierten Teilchen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Zählen und Klassieren von in einer elektrisch leitenden Flüssigkeit suspendierten Teilchen mit mehreren, von der Probe durchflossenen Meßöffnungen mit unterschiedlichen Abmessungen, denen in die Probe eintauchende Elektroden unterschiedlichen Potentials zugeordnet sind, die an einen elektrischen Auswertstromkreis für die durch das Hindurchtreten eines Teilchens durch eine Meßöffnung erzeugten Teilchenimpulse angeschlossen sind, deren Größe ein Maß für die Größe des jeweiligen Teilchens ist

Eine derartige Vorrichtung ist aus der vorveröffentlichten DE-OS 15 98 291 bekannt. Bei dieser Vorrichtung sind mehrere Meßöffnungen vorhanden, die unterschiedliche Querschnitte besitzen. Die einzelnen Meßöffnungen unterschiedlichen Querschnitts werden jeweils für sich von der zu untersuchenden Suspension durchflossen, die sich in einem die Meßgefäße mit ihren Meßöffnungen umgebenden Außengefäß befindet. Bei dieser bekannten Vorrichtung sind die Meßöffnungen bezogen auf die zu untersuchende Probensuspension nebeneinander, d. h. parallel in einem Meßsystem angeordnet. Jede Meßölfnung wird von einer anderen Probensuspension durchflossen. Nachteilig ist hierbei, daß nicht die Teilchen einer einzigen Probe hinsichtlich ihrer Zahl, ihrer Größe und ihrer Beschaffenheit untersucht werden, so daß Fehlmessungen möglich sind.

Die US-PS 34 41848 beschreibt eine Vorrichtung zum Zählen von in einer elektrisch 'eitenden Flüssigkeit suspendierten Teilchen und lehrt allgemein die physikalischen Zusammenhänge zwischen Teilchensignal, insbesondere Amplitude, und Größe, insbesondere Volumen bzw. Querschnitt des Teilchens. Unter anderem ist dieser Druckschrift zu entnehmen, daß, wenn das Teilchen länger als die Meßöffnung ist, die Amplitude des Teilchensignals im wesentlichen in einem Verhältnis zum Querschnitt des Teilchens steht. Durch diese Druckschrift wird aber nicht gelehrt, daß für ein und dasselbe Teilchen sowohl Informationen über sein Volumen als auch über seinen Querschnitt zu erhalten sind.

Sollen Erythrozyten und Leukozyten nach dem auf der US-PS 34 41848 beruhenden Coulter-Verfahren meßtechnisch voneinander unterschieden werden, so gelingt dies nur, wenn nach Anreicherung der Leukozyten die Konzentrationsunterschiede — im Vollblut kommt aus etwa 700 Erythrozyten 1 Leukozyt — erheblich verringert werden. Im unfraktionierten

Blut werden in den Volumenbereichen der Leukozyten auch jene Erythrozyten erfaßt, die nicht einzeln die Meßöffnung passieren, da das Volumen eines Leukozyten etwa so groß wie das von zwei bis vier Erythrozyten ist. Die Koinzidenzwahrscheinlichkeit eines gleichzeitigen Durchtrittes zweier oder mehrerer Ezythrozyten läßt sich nicht durch Verdünnung beliebig verringern, da die Abstände zwischen den Eiythrozyten nicht nur durch die statistische Verteilung bedingt sind. Vielmehr verbleiben in Abhängigkeit von dem verwendeten Suspensionsmedium 1 —10% der Erythrozyten such bei hochgradiger Verdünnung agglomeriert (in Form von Geldrollen aneinander gelagert). Die Zähling oder Messung der Leukozyten im Vollblut oder Vollblutverdünnungen ist daher nicht möglich, ohne den Erythrozytenanteii vor der Messung durch präparative Methoden mindestens um zwei Zehnerpotenzen zu reduzieren. Bei präparativen Methoden, die auf einer selektriven Hämolyse der Erythrozyten beruhen, wird die für die Meßwerterfassung erforderliche Isolatoreigenschaft der Leukozytenmembran vermindert oder aufgehoben, während Methoden der Sedimentation quantitative Bestimmungen ausschließen, da das Ausmaß der Leukozytenanreicherung nicht hinreichend genau bestimmbar ist

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, die bekannten Vorrichtungen so zu verbessern, daß die Teilchen entsprechend ihrem Durchmesser und zusätzlich Leukozyten- und Erythrozytenagglomerate meßtechnisch voneinander getrennt erfaßt werden können.

Die Erfindung löst diese Aufgabe mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1.

Die Erfindung nutzt einen Effekt bei der Partikel-Volumen-Analyse nach dem Coulter-Verfahren aus, der durch den Begriff» Formfaktor« definiert ist. Tritt ein sehr langes und stromlinienförmiges Partikel wie ein Torpedo durch die Meßöffnung, so entspricht das Verhältnis Widerstandsänderung Δ R zu Widerstand R der Meßöffnung in erster Näherung dem Verhältnis Partikelvolumen/Meßöffnungsvolumen, da die Ionen als Träger der elektrischen Leitfähigkeit nur verdrängt, aber nicht in ihrer Wanderungsrichtung abgelenkt werden. Bewertet man bei örtlicher Kohärenz des elektrischen Feldes den Formfaktor eines solchen stromlinienförmigen Teilchens mit 1,0, so wird ein kugelförmiger Partikel des gleichen Volumens mit 1,5 bewertet. Dieser Faktor ist sowohl berechnet als auch im elektrolytischen Trog des öfteren bestimmt worden. Am Ein- und Ausgang, insbesondere bei kurzen Meßöffnungen, werden Strömungs- und elektrisches Feld stark verzerrt, so daß außer dem Formfaktor weitere Korrekturfaktoren, die von der Geometrie der Meßöffnung, bei Plastizität der suspendierten Partikel auch von der Viskosität des Suspensionsmediums abhängig sind, ermittelt werden können.

Ist die Meßöffnung so klein, daß der Bereich annähernd gleichmäßig hoher Feldstärke in der Meßöffnung kleiner ist als die Länge eines hindurchtretenden Teilchens, so ergibt sich daraus eine Unterbewertung des Partikelvolumens, da die Enden des Teilchens im Augenblick der Meßwerterfassung aus dem Bereich des konzentrierten elektrischen Feldes in der Meßöffnung herausragen und somit nur unvollständig zur Bewertung beitragen. In einer entsprechend kurzen Meßöffnung werden daher langgestreckte 6S Teilchen gegenüber runden Teilchen gleichen Volumens nicht ihrem Formfaktor gemäß, sondern zu klein bewertet Man stattet daher die erfindungsgemäße Vorrichtung mit zwei Meßoffnungen unterschiedlicher Geometrie aus, von denen die eine lang genug sein muß, um das gesamte Volumen der hindurch tretenden Teilchen im Bereich gleichmäßiger Feldstärke zu erfassen, während die kürzere vornehmlich den Teikhenquerschnitt bewertet und somit eine Unterscheidung der hindurchtretenden Teilchen hinsichtlich ihrer Form trifft

Für das Unterscheiden agglomerierter Erythrozyten von den Leukozyten bedient man sich eines Phänomens, das in der Natur der zu untersuchenden Zellen liegt Erythrozyten und Leukozyten unterscheiden sich nicht nur im Hinblick auf ihr Volumen, sondern auch durch ihrer Plastizität, indem die kernlosen Säugetier-Erythrozyten im Gegensatz zu den Leukozyten infolge ihrer geringen inneren Viskosität extrem leicht verformbar sind Beim Durchströmen der Meßöffnung verlieren sie die bekannte Linsenform und werden entsprechend den infolge dort vorliegenden hydrodynamischen Druckverhältnissen bis zu 20 μ, etwa dem dreifachen Durchmesser eines Erythrozyten bei Ruhelage, langgestreckt Die Anordnung nach der Erfindung, die eine relativ lange und eine relativ kurze Meßöffnung vorsieht bewertet in der langen Meßötfnung die Teilchen anders als in der kurzen kleinen Meßöffnung. Die Leukozyten behalten auf Grund ihrer Steifigkeit in beiden Meßoffnungen ihre kugelige Form mit einem Durchmesser von 6—8,5 μ und werden in Meßoffnungen etwa von 40 μ Länge noch volumenproportional bewertet, während Erythrozyten bei dieser Meßöffnungslänge etwa 10% unterbewertet werden. Die Verformung der Teilchen ist auch vom Durchmesser der öffnungen abhängig.

Mittels bekannter elektronischen Methoden auf analoger oder digitaler Basis kann das Verhältnis der sich ergebenden Impulsamplituden, die beim Hindurchtreten eines Teilchens durch die Meßoffnungen aus der Stromänderung im elektrischen Meßkreis abgeleitet werden, bestimmt werden. Zur analogen Verhältnisbildung kann man die Impulse der beiden Meßoffnungen in getrennten Zweigen unterschiedlich verstärken und so verzögern, daß sie bei kugeligen Zellen deckungsgleich sind, und durch die anschließende analoge Subtraktion dieser beiden Impulse stellt man dann fest, daß bei kugeligen Zellen das Endresultat praktisch 0 ist. Gleiches gilt für nichtverformbare feste Körper. Beim Durchtritt einer verformbaren Zelle oder eines gestreckten festen Körpers gleichen Volumens wie bei kugeliger Gestalt, wird das Endresultat von 0 abweichen und so für die Steuerung der weiteren Auswertung zur Verfügung stehen. Man kann natürlich die beiden verstärkten Signale zunächst analog/digita! wandeln und die Verhältnisbildung rein digital ausbilden. Diese Methode würde eine analoge Verzögerung erübrigen.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es möglich geworden, Untersuchungen im verdünnten Vollblut durchzuführen, ohne daß die Erythrozytenkonzentration gegenüber der Leukozytenkonzentration in der Probe vor der Untersuchung herabgesetzt zu werden braucht. Die Vorrichtung nach der Erfindung ist in der Lage, zwei oder drei echt zusammengeklebte Erythrozyten als solche eindeutig von Leukozyten zu unterscheiden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Die Fi g. 1 zeigt als Ausführungsbeispiel ein Gefäß 1, das durch zwei Trennwände 2 und 3 in drei Räume unterteilt ist. In dem Raum 4 befindet sich Flüssigkeit 16,

in der zu klassierende Partikel enthalten sind, die durch eine in der Trennwand 2 vorgesehene öffnung 5 in den Raum 6 und durch eine in der Trennwand 3 angeordnete Öffnung 7 in den Raum 8 fließt. In die in den Räumen 4,6 und 8 enthaltene Flüssigkeit tauchen Elektroden 9, 10 und 11 ein, die unterschiedliches Potential gegeneinander aufweisen. Die Elektroden 9 und 10 sind mit einer Meßeinrichtung 12 verbunden, in der die Stromänderungen registriert werden, die sich ergeben, wenn ein in der Flüssigkeit 16 enthaltener Partikel durch die Meßöffnung 5 hindurchwandert. Entsprechend sind die Elektroden 10 und 11 an eine Meßeinrichtung 13 angeschlossen, die wiederum die Stromänderungen beim Durchtritt der Teilchen durch die öffnung 7 registriert.

Die öffnung 5 weist einen geringeren Durchmesser auf als die Öffnung 7, womit auf vorbeschriebene Art in der Öffnung 5 im wesentlichen der Querschnitt der Teilchen bewertet wird und in der öffnung 7 im wesentlichen das Volumen. Es ist auch möglich, der Öffnung 5 den gleichen Durchmesser zu geben wie der Öffnung 7. dafür aber deren Länge so klein zu wählen, daß lange Teilchen beim Hindurchtreten vorne und hinten noch herausragen, runde Teilchen dagegen nicht. Auch dann ist eine Unterscheidung der Teilchen nach den vorerwähnten Kriterien möglich. Es lassen sich aber auch beide Ausführungsformen miteinander kombinieren. Die Ergebnisse, die mittels der Meßeinrichtungen 12 und 13 ermittelt wurden, werden einer Auswerteeinrichtung 14 zugeführt, in der durch Differenzbildung zwischen den Meßergebnissen in bereits erwähnter Weise eine Bewertung gleichvolumiger aber verschieden geformter oder verformbarer Teilchen durchgeführt wird.

Die Fi g. 2 zeigt im Ausschnitt noch einmal die zwei hintereinander angeordneten Meßöffnungen und den Durchtritt verschieden großer und verschieden geformier Teilchen durch die Meßöffnungen. Durch :üc Strömungsverhältnisse wandern gestreckte Teilchen <.vts längsgerichtet durch die Öffnungen rind':!'.::. Elektroden und andere? Zubehör sind in der Fig? m-ht dargestellt.

In der F i g. 3 ist dargestellt, wie veiformbare Teilchen durch die Meßöffnungen verschiedenartig beeinflußt werden. Die Teilchen 15. von denen angenommen ist, es seinen Erythrozyten, werden in der engen Meßöffnung 5 torpedoförmig verformt, also aus ihrer linsenförmigen Gestalt in die Länge gestreckt Die Meßöffnung 5 ist also so gestaltet daß sie kurzer ist als der in die Länge gestreckte Erythrozyt so daß dessen Ende zu beiden Seiten aus der Meßöffnung 5 herausragen. Die nachfolgende Meßöffnung 7 passieren die Teilchen 15 unverformt Der Flüssigkeitsstrom wird durch die eingezeichneten Pfeile verdeutlicht. Es ist in der F i g. 3 zugleich auch angegeben, daß aus dem Raum 6 zwischen den beiden Meßöffnungen günstigerweise zusätzlich zu der aus der Meßöffnung 5 einströmenden Flüssigkeit weitere Flüssigkeit mit durch die Meßöffnung 7 in den Raum 8 strömt. Auf die Darstellung der Elektroden und Meßanordnungen wurde wiederum verzichtet.

Die F i g. 4 zeigt ein besonders vorteilhaftes Ausführungsbeispiel der Anordnung gemäß der Erfindung, die zusätzlich von der in DE-AS 18 06512 beschriebenen hydrodynamischen Fokussierung Gebrauch macht. Vor der ersten Meßöffnung 5 ist in sehr geringem Abstand die Austrittsöffnung 17 einer Kapillare 18 angeordnet

ίο Die Elektrolytflüssigkeit 16 in dem Raum 4 vor der ersten Meßöffnung ist partikelfrei, und die Partikel werden der Meßöffnung 5 in Suspension durch die Kapillare 18 zugeführt. Die in die Meßöffnung 5 einströmende Flüssigkeit 16 saugt infolge des geringen Abstandes der Austrittsöffnung 17 ve." der Meßölfnung 3 Probensuspension aus der Kapii'are 18 heraus unci führt sie hydrodynamisch fokussiert in das Zentrum der Meßöffnung 5. Durch diese Art der Probensuspensionszuführung wird eine in der DE-AS 18 06512 näher beschriebene Verbesserung in der Meßgenauigkeit erreicht. Hinter der Meßöffnung 5 ist koaxial zu dieser in geringem Abstand die zweite Meßöffnung 7 angeordnet, deren Länge und ggf. auch deren Durchmesser größer gewählt ist als diejenige der ersten

2·; Meßöffnung 5, so daß die Meßöffnung 7 wiederum das Volumen der Teilchen bewertet und die Meßöffnung 5 die Form oder Verformbarkeit der Teilchen. Weiterhin •st in der Fig.4 dargestellt, daß aus dem Raum b zwischen den beiden Meßöffnungen mehr Flüssigkeit

:.c durch die Meßöffnung 7 fließt, als ihr aus der Meßöffnung 5 zufließt, so daß ein Aufspreizen des gestrichelt dargestellten Probensuspensionsstrahls vor der Meßöffnur.g 7 unterbunden wird.

Die F i g. 5 zeigt ein anderes Ausführungsbeispiel der

y. Vorrichtung gemäß der Erfindung, in der außer den Meßöffnungen 5 und 7 eine eigene öffnung 19, die nur der hydrodynamischen Fokussierung des aus der Kapillare !8 austretenden Probensusnensionsstrahles ment, vorgesehen ist Diese Fol-.uisieröffnung 19

ίο jef'ndei * ich in einer Trennwand 20. die in geringem \bstand vor der Meßöffnung 5 angeordnet ist. Die eine, der Meßöffnung 5 zugehörige Elektrode 9 vor der Meßöffnung ist in dem Raum 21 zwischen der Trennwand 20 und der Trennwand 2 angeordnet Durch unterschiedlich hohe Flüssigkeitsspiegel in den Räumen 4, 21, 6 und 8 soll wiederum verdeutlicht werden, daß in die jeweils nachfolgende Meßöffnung mehr Flüssigkeit einfließt, als dem Raum vor der betreffenden Meßöffnung aus der davorliegenden Öffnung zufließt Das Ausführungsbeispiel gemäß der Fig.5 ist durch die zusätzliche Anordnung einer eigenen Fokussieröffnung 19 aufwendiger als das Ausführungsbeispiei gemäß der F i g. 4 und dürfte nur dann Anwendung finden, wenn der Fokussierkegel zwischen der Austrittsöffnung 17 und der Meßöffnung 5 aus dem elektrischen Feldraum vor der Meßöffnung ferngehalten werden solL

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (8)

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zum Zählen und Klassieren von in einer elektrisch leitenden Flüssigkeit suspendierten Teilchen mit mhereren, von der Probe durchflössenen Meßöffnungen mit unterschiedlichen Abmessungen, denen in die Probe eintauchende Elektroden unterschiedlichen Potentials zugeordnet sind, die an einen elektrischen Auswertstromlcreis für die durch das Hindurchtreten eines Teilchens durch eine ι ο Meßöffnung erzeugten Teilchenimpulse angeschlossen sind, deren Größe ein Maß für die Größe des jeweiligen Teilchens ist, dadurch gekennzeichnet, daß zwei im Flüssigkeitsstrom hintereinander liegende Meßöffnungen (5, 7) vorhanden sind, deren Durchmesser und Länge jeweils derart aufeinander abgestimmt sind, daß mit der einen Meßöffnung im wesentlichen das Volumen und mit der anderen Meßöffnung im wesentlichen der Querschnitt der Partikel gemessen wird.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der in Strömungsrichtung des Flüssigkeitsstromes vorausgehenden ersten Meßöffnung (5) die elektrisch leitende Flüssigkeit (16) teilchenfrei zugeleitet ist und die Teilchensuspension dieser ersten Meßöffnung aus einer Kapillare (18) zugeführt wird, deren Austrittsöffnung (17) sich in derart geringem Abstand vor dieser Meßöffnung befindet, daß die umgebende, in die Meßöffnung fließende elektrisch leitende Flüssigkeit Teilchensuspension aus der Kapillare saugt und hydrodynamisch in das Zentrum dieser Meßöffnung fokussiert.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in Strömungsrichtung des Flüssigkeitsstromes nachfolgende zweite Meßöffnung (7) fluchtend mit der ersten Meßöffnung (5) und derart dicht hinter dieser angeordnet ist, daß der Flüssigkeitsstrom weitgehend homogen von der ersten Meßöffnung in die zweite Meßöffnung fließt.

4. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Durchmesser der zweiten Meßöffnung (7) größer ist als der Durchmesser der ersten Meßöffnung (5).

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Druckverhältnisse in den an die Meßöffnungen angrenzenden Gefäßräumen (4,6,8,21) derart gewählt sind, daß aus dem Gefäßraum (6) hinter der ersten Meßöffnung (5) mehr Flüssigkeit in die zweite Meßöffnung (7) einfließt, als ihm aus der ersten Meßöffnung zufließt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest vor der ersten Meßöffnung (5) in geringem Abstand eine Trennwand (20) angeordnet ist, in der eine Fokussieröffnung (19) in der Größenordnung der Meßöffnung, fluchtend mit dieser, vorhanden ist, daß die Flüssigkeit (16) vor dieser Trennwand partikelfrei ist, daß die Teilchen in Suspension in an sich bekannter Weise über eine Kapillare (18) zugeführt sind, deren Austrittsöffnung (17) sich gegenüber der Fokussieröffnung in derart geringem Abstand befindet, daß die Suspension durch die die Kapillare umgebende, in die Fokussieröffnung fließende Flüssigkeit aus der Öffnung herausgesaugt und in das Zentrum der Fokussieröffnung geleitet wird, und daß sich eine Elektrode (9) vor der Meßöffnung in dem Raum (21) zwischen der Meßöffnung und der Trennwand befindet

7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zum getrennten Erfassen von Teilchen gleichen Volumens, aber unterschiedlicher Verformbarkeit, die Meßöffnungen (5,7) in ihren Durchmesser- und Längenverhältnissen derart aufeinander abgestimmt sind, daß die Teilchen die eine Meßöffnung (7) unverformt passieren, in der anderen Meßöffnung (5) jedoch die Teilchen entsprechend ihrer Viskosität in die Länge gestreckt werden.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge der Meßöffnung (5), in der die Teilchen nach ihrer Verformbarkeit oder ihrem Querschnitt bewertet werden, so klein gewählt ist, daß durch das Strömungsprofil verformte oder langgestreckte Teilchen sich teilweise in einem Bereich abgeschwächter Feldstärke befinden.