DE19601054C1 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von Parametern von Partikeln in Elektrolyten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Parametern von Partikeln in Elektroly­ ten, insbesondere von biologischen Partikeln, wobei die zu bestimmenden Partikel durch eine Meßpore gespült werden, die aus einem Multilayersystem besteht.

Es sind verschiedene Verfahren zur Bestimmung physikalischer und biologisch-chemischer Parameter von Partikeln, wie Mikroorganismen oder Zellen, in Elektrolyten bekannt. Dabei wird die Widerstandsänderung ausgenutzt, die in einer Meßpo­ re infolge der Verdrängung des Elektrolyten durch ein Partikel hervorgerufen wird. (Thom, R. u. a., Die elektro­ nische Volumenbestimmung von Blutkörperchen und ihre Fehler­ quellen; Z. ges. exp. Med. 151, 331-349/1969). Bekannt sind in diesem Zusammenhang insbesondere die Amplitudenmessung nach Coulter, bei der nur das Amplitudenmaximum eines Impul­ ses ausgenutzt wird, sowie die Pulsflächenanalyse, bei der die Impulsfläche als Maß für das Partikelvolumen ausgewer­ tet wird.

Bei beiden Verfahren werden Meßporen aus monokristallinen Strukturen eingesetzt, z. B. Uhrensteine, die aus mechani­ schen Stabilitäts- und meßtechnischen Gründen ein Längen-/ Durchmesserverhältnis von annähernd eins zu eins aufweisen. Bei Meßporen für kleine Partikel muß die Porenlänge aus den genannten Stabilitätsgründen mindestens gleich dem Durchmes­ ser sein, da sonst die bei konischer Öffnung der Meßpore verbleibende Wandstärke, die der Kapillarlänge entspricht, instabil wird. Bei Meßporen für größere Partikel, d. h. ab 45 µm, muß die Porenlänge gleich oder größer dem Durchmes­ ser des Partikels sein, damit dieses während der Messung zur Verhinderung von Meßfehlern vollkommen von der Pore aufgenommen wird.

Die Meßpore ist bei den bekannten Vorrichtungen zwischen zwei Elektroden angeordnet, deren Abstand zur Meßpore ein Vielfaches der Länge der Meßpore beträgt (DE 21 45 531 C2) Dieser Abstand beträgt bis zum 100fachen der Länge der Meßpore.

Aus der DE 36 26 600 A1 ist eine Vorrichtung zur Bestimmung von Eigenschaften in Flüssigkeiten aufgeschwemmter Teilchen bekannt. Diese Vorrichtung weist einen Kanal als Meßpore auf, der durch Material verläuft, das mittels der Mehrlagen­ verbundtechnik hergestellt ist. Hierbei sind mehrere Mate­ rialschichten miteinander untrennbar verbunden. Dadurch ist es leicht möglich, den Kanal mit einem stufenweise ver­ änderten Querschnitt herzustellen.

Der Nachteil der Verfahren unter Verwendung der bekannten Meßporen besteht darin, daß Kapillarlängen von weniger als 40 µm aus Stabilitätsgründen mit den bekannten Technologien zur Bearbeitung monokristalliner Strukturen nicht stabil herstellbar sind und im Einsatz mechanisch nicht stabil sind. Das wirkt sich auf die untere Meßgrenze aus, da diese abhängig ist vom Verhältnis des verdrängten Volumens zum gesamten Volumen innerhalb der Meßpore. Bei großem Volumen der Meßpore und gleichzeitig kleinem Partikelvolumen ist die relative Widerstandsänderung klein und liefert keine brauchbaren Meßergebnisse. Deshalb sind nur große Partikel meßbar.

Bekanntlich darf sich stets nur ein Partikel innerhalb der Meßpore befinden, da es sonst bezüglich der Partikelzahl und -größe zu Fehlmessungen kommt. Aufgrund des großen Volumens der Meßpore ist das aber nur unvollkommen gewähr­ leistet, d. h. daß die Koinzidenzgrenze relativ niedrig ist. Deshalb sind bei hohen Partikelkonzentrationen hohe Verdün­ nungsraten vor der Messung erforderlich.

Da die Elektroden nur im genannten großen Abstand von der Meßpore angebracht werden können, ergibt sich vor der Pore ein inhomogenes elektrisches Feld. Große Partikel bewirken schon in weitem Abstand vor der Pore eine elektrische Widerstandsänderung und damit Pulsverbreiterung. Daraus resultieren dann Fehler bei der Pulsflächenanalyse und zusätzliche Koinzidenzfehler.

Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß eine hohe Empfindlichkeit gegen äußere elektromagnetische Einstrahlun­ gen besteht, da immer nur eine Seite der Meßpore auf Massepotential liegen kann, während die andere Seite mit dem Eingang des Verstärkers verbunden ist und als Antenne wirkt. Daraus resultiert, daß das Meßverfahren nicht on-line fähig ist.

Weiterhin ist das Meßsignal nur vom Volumen, nicht aber von der Form der Partikel abhängig. Die Form ist aber bei verschiedenen Anwendungen, z. B. bei biologischen Messungen an Zellen, von großem Interesse.

Bei den bekannten Meßverfahren besteht ein kubischer Zusammenhang zwischen Durchmessern des Partikels und der Amplitude des Meßimpulses, woraus ein sehr geringer Dynamik­ bereich des Meßverfahrens resultiert. So ergibt sich z. B. bei einer anzustrebenden Auflösung von 0,05 µm (Durchmes­ ser des Partikels) bei einer unteren Meßgrenze von 1 µm ein maximaler Dynamikbereich von 1 : 3,5 bei 8-bit-Auflösung des Meßsignals.

Ein weiterer Nachteil besteht in dem hohen Innenwiderstand der Kapillare. Die Rauschspannung der Meßanordnung wird durch den hohen Innenwiderstand erhöht, der proportional der Wurzel aus dem Innenwiderstand ist. Diese Rauschspannung schränkt auch die Verschiebung der Meßgrenze in Richtung kleinerer Partikel ein.

Bei den genannten Verfahren werden nur einfache Widerstands­ messungen durchgeführt, die nur Aussagen zu den physikali­ schen Parametern erlauben. Wenn auch Aussagen über das biochemische Verhalten von Mikroorganismen oder Zellen in deren Innerem bzw. auf ihrer Oberfläche benötigt werden, müssen diese Untersuchungen mit Hilfe aufwendiger Präparati­ onstechniken (Mikromanipulatoren bzw. Mikroelektroden, patch-clamp-Technik) und ebenfalls einfacher Widerstandsmes­ sungen durchgeführt werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine einfachere und genauere Bestimmung physikalischer und bei biologischen Partikeln auch biochemischer Parameter zu ermöglichen, wobei der Größenbereich der zu ermittelnden Partikel erwei­ tert werden soll.

Erfindungsgemäß wird das entsprechend den Merkmalen der Ansprüche 1 und 5 erreicht.

Bei einem Verfahren zur Bestimmung von Parametern von Par­ tikeln in Elektrolyten, insbesondere von biologischen Partikeln, wobei die zu bestimmenden Partikel durch eine Meßpore gespült werden, sind die Partikel beim Durchlaufen der Meßpore abwechselnd unterschiedlichen elektrischen Po­ tentialen ausgesetzt und die aufgrund der Wechselwirkung der unterschiedlichen Potentiale mit den Partikeln gewonne­ nen Signale werden anschließend miteinander verknüpft.

Es werden vorzugsweise zeitlich versetzt gemessene Signale so verknüpft, daß die resultierenden Signale unterschiedli­ che Vorzeichen aufweisen. Derart verknüpfte Signale ermögli­ chen eine Verbesserung des Signal-/Rauschverhältnisses.

In einer weiteren Ausgestaltung des Verfahrens wird bei konstanter Strömungsgeschwindigkeit des Elektrolyten die Laufzeitdifferenz des Partikels zwischen den unterschiedli­ chen Potentialen gemessen. Dieser Verfahrensschritt ermög­ licht in Verbindung mit der oben genannten Verknüpfung der Signale zusätzlich zur Verdopplung der Amplitude des Meßsignals die Längenbestimmung des Partikels. In einem zu­ sätzlichen Verfahrensschritt kann mittels des zuerst gemes­ senen Signals das gesamte Meßsignal getriggert werden.

Eine Vorrichtung zur Bestimmung von Parametern von Parti­ keln in Elektrolyten, insbesondere von biologischen Parti­ keln, weist eine Meßpore auf, die aus einem Multilayersystem gebildet ist, wobei abwechselnd elektrisch leitende und nichtleitende Schichten angeordnete sind und wobei die Meßpore quer und vorzugsweise senkrecht zu den verschiede­ nen Schichten verläuft. Mindestens eine leitende Schicht dient vorzugsweise gleichzeitig als Meßelektrode.

Die Dicke der Schichten liegt im Mikrometerbereich und beträgt vorzugsweise 1/10 bis 1/100 des Durchmessers des Mikroorganismus.

Diese Anordnung weist den Borteil auf, daß infolge der Nutzung der die Meßpore bildenden leitfähigen Schichten als Meßelektroden die äußeren Elektroden entfallen können, wodurch ein homogeneres elektrisches Feld und als Folge davon geringere Meßfehler auftreten und eine verbesserte Koinzidenz vorhanden ist. Weiterhin weist diese Vorrich­ tung einen geringeren Innenwiderstand auf, wodurch die Meßgrenze in Richtung kleinerer Partikel verschoben wird. Das Meßsignal ist außerdem nur noch vom Querschnitt des Partikels und nicht mehr von seinem Volumen abhängig, wodurch eine größere Meßdynamik möglich wird.

Diese Vorrichtung weist weiterhin den Vorteil auf, daß infolge des schichtförmigen Aufbaus eine Herstellung mit­ tels moderner Herstellungstechnologien, wie z. B. der Halbleitertechnik oder der Mikrosystemtechnik, möglich ist. Damit sind hohe Fertigungskonstanz, geringe Toleranzen und geringe Kosten gewährleistet. Weiterhin ist eine leichtere Kontaktierung der Meßelektroden möglich und es wird eine verbesserte mechanische Stabilität der Vorrichtung er­ reicht.

Aufgrund dieser verbesserten Eigenschaften ist es nun möglich, den Anwendungsbereich der Meßporen sowohl in Rich­ tung kleinerer als auch größerer Partikel zu erweitern, z. B. auf Bakterien, technische Stäube oder große Zellen.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, daß die Dicke der nichtleitenden Schichten geringer ist als die Partikelgrö­ ße. Dadurch wird ein scheibchenweises Abtasten des Parti­ kels und damit die Bestimmung von Länge, Durchmesser und Volumen bei einem Durchgang des Partikels durch die Meßpore möglich. Durch diese scheibchenweise bzw. tomographische Vermessung wird die Bestimmung der Form des Partikels möglich.

Eine weitere zweckmäßige Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, daß die beiden äußeren leitfähigen Schichten geerdet sind. Dadurch wird die Störanfälligkeit weiter verringert und die Vorrichtung kann on-line in einem technischen System eingesetzt werden.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß in Durchflußrichtung vor den Schichten ein elektrisch leiten­ der Hohlzylinder vorgesehen ist, der konzentrisch zur Meßpore verläuft und gegenüber dieser durch eine elektrisch nichtleitende Schicht isoliert ist. Dadurch wird bei An­ schluß einer elektrischen Spannung zwischen der nächsten elektrisch leitenden Schicht und dem elektrisch leitenden Zylinder ein elektrisches Feld so ausgebildet, daß der die Meßpore durchfließende Elektrolyt, der der Träger der zu vermessenden Partikel ist, zur Wandung der Meßpore abge­ lenkt und dort abgebremst wird, so daß sich im Ergebnis von der Wandung zur Mitte der Meßpore ein Geschwindigkeitsgra­ dient der Strömung ergibt und somit in der Mitte der Pore auf die nicht leitenden zu vermessenden Partikel eine elek­ tronische Fokussierung wirkt.

Bei den bekannten Verfahren und Vorrichtungen konnten nur einfache Widerstandsmessungen zur Vermessung biologischer Objekte angewandt werden, wobei in getrennten Vorrichtungen und Verfahrensschritten entweder eine geometrische Vermes­ sung oder durch Anwendung aufwendiger Präparationstechniken Aussagen über das biochemische Verhalten gewonnen werden konnten. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der erfin­ dungsgemäßen Vorrichtung sind nun in einfacher Weise on-line Impedanzmessungen an biologischen Objekten möglich. Es ist bekannt, daß Impedanzmessungen in den drei Disper­ sonsgebieten (α, β, γ), d. h., im kHz bis GHZ-Frequenzbe­ reich, Aussagen über das biochemische Verhalten biologischer Objekte, wie Mikroorganismen oder Zellen, in deren Innerem bzw. auf ihrer Oberfläche ergeben. In einer Vorrichtung werden ohne besondere Präparationen erstmalig die geometri­ sche und die biochemische Vermessung von Partikeln möglich.

Die Erfindung soll in Ausführungsbeispielen anhand von Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigt

Fig. 1 eine Meßpore in einer ersten Ausführungsform;

Fig. 2 eine Meßpore mit einem zusätzlichen elektrisch leitenden Zylinder;

Fig. 3a eine Meßpore mit einer an die Meßelektrode ange­ schlossenen Stromquelle zur Signalgewinnung;

Fig. 3b ein Blockschaltbild mit Verstärker für die Meßpo­ re nach Fig. 3a;

Fig. 4a eine Meßpore mit einer an dessen leitendem Grund­ körper liegender Spannungsquelle zur Signalgewin­ nung;

Fig. 4b ein Blockschaltbild mit Verstärker für die Meßpo­ re nach Fig. 4a.

Die Meßpore nach Fig. 1 besteht aus einem Grundkörper 1 aus leitendem Material, der eine Durchgangsöffnung 2 aufweist, die in Strömungsrichtung gesehen aus einem zylinderförmigen Abschnitt 2a, aus einem sich diesem anschließenden kegelför­ mig verkleinernden Abschnitt 2b und anschließend aus einem weiteren zylinderförmigen Abschnitt 2c besteht, dessen Querschnitt kleiner ist als der Querschnitt des zylinderför­ migen Abschnitts 2a. Auf dieser Seite des Grundkörpers sind an diesem abwechselnd nichtleitende Schichten 3, 5 und leitende Schichten 4, 6 vorgesehen. Diese Schichten werden z. B. mittels der Halbleitertechnik oder der Mikrosystemtech­ nik, z. B. durch Sputtern oder durch Plasmaspritzen aufge­ tragen. Diese Schichten 3-6 weisen Durchgangsöffnungen 3a, 4a, 5a und 6a auf, die den gleichen Querschnitt aufwei­ sen, wie der Abschnitt 2c der Durchgangsöffnung 2. Die Durchgangsöffnungen insgesamt bilden die Meßpore.

Während der Grundkörper 1 und die leitende Schicht 6 auf Massepotential liegen, dient die leitende Schicht 4 als Meßelektrode. Das zu bestimmende Partikel tritt im Ab­ schnitt 2a in die Meßpore ein und durchläuft nacheinander den leitenden Grundkörper 1, die nichtleitende Schicht 3, die leitende Schicht 4, die nichtleitende Schicht 5 und die leitende Schicht 6.

Bei der in Fig. 3a und 3b dargestellten Ausführungsform einer Schaltung für die Ausnutzung der mit der erfindungs­ gemäßen Meßpore möglichen Vorteile ist eine Stromquelle 16 mit der leitenden Schicht 4 verbunden. Es werden mit zeitli­ chem Abstand zwei positive Meßsignale M1 und M2 erzeugt. Das erste Meßsignal M1 wird zum zeitverzögerten Triggern des zweiten Meßsignals mittels eines Triggers 14 verwendet. Nach Verstärkung mittels eines Verstärkers 17 erhält man ein verstärktes zweites Meßsignal VM2, wobei das vorher vorhandene Rauschen R eliminiert wurde. Zur Auswertung der Meßergebnisse ist dem Verstärker 17 eine entsprechende Vorrichtung 15 nachgeordnet.

Bei der in den Fig. 4a und 4b dargestellten Ausführungs­ form einer Schaltung ist eine Spannungsquelle an die Meßpo­ re angeschlossen. Mittels dieser Schaltung wird ein negati­ ves erstes Meßsignal M1 und ein positives zweites Meßsignal M2 erzeugt. Mittels eines Gleichrichters 18 für eine Spit­ zenwertgleichrichtung und eines Differenzverstärkers 19 wird ein Meßsignal M1+2 gebildet, das die Summe aus negati­ vem ersten Meßsignal M1 und positivem zweiten Meßsignal M2 darstellt, wobei auch durch die Meßwertverarbeitung mittels dieser Schaltung das Rauschen R eliminiert wird. Dabei führt das gleichzeitige Vorliegen der Bedingungen, daß nämlich eine negative Flanke vorliegt, daß die Meßspannung negativ ist und daß die Meßspannung kleiner als die Kompara­ torspannung der Baugruppe 20 ist, zu einer Triggerung. Das gleichzeitige Vorliegen der Bedingungen, daß eine negative Flanke vorliegt, daß die Meßspannung positiv ist und daß die Meßspannung größer als die Komparatorspannung ist, führt dagegen zum Reset. Ein Reset kann aber auch nach einem definierten Zeitintervall erfolgen.

Im Ausführungsbeispiel der Fig. 2 ist eine Meßpore dargestellt, bei der ein elektrisch leitender Zylinder 7 vorgesehen ist, der konzentrisch zur Meßpore und in Strö­ mungsrichtung gesehen vor den Meßschichten angeordnet ist. Der Zylinder 7 ist in einem elektrisch nichtleitenden Formkörper 8 angeordnet, der den Zylinder gegenüber der Meßpore isoliert. Der Formkörper 8 weist einen Abschnitt 8a mit einem konischen Durchgang für die zu ermittelnden Partikel auf, dem sich ein hohlzylindrischer Abschnitt 8b anschließt. Dieser endet in Strömungsrichtung in einem schichtförmigen Abschnitt 8c.

An den schichtförmigen Abschnitt 8c schließen sich abwech­ selnd elektrisch leitende Schichten 9, 11, 13 und nichtleitende Schichten 10, 12 an. Dabei liegen die Schichten 9 und 13 auf Massepotential, während die Schicht 11 als Meßelektrode dient. Diese Schichten 9 bis 13 sind mit Durchgangsöffnungen 9a bis 13a versehen, die den glei­ chen Querschnitt wie der Abschnitt 8b aufweisen.

Durch Anlegen einer elektrischen Spannung zwischen dem Zylinder 7 und der elektrisch leitenden Schicht 9 wird ein elektrische Feld derart ausgebildet, daß der die Meßpore durchfließende Elektrolyt, der der Träger der zu vermessenden Partikel ist, zur Wandung der Meßpore abgelenkt und dort abgebremst wird. Dadurch ergibt sich von der Wandung zur Mitte der Meßpore ein Geschwindigkeitsgra­ dient der Strömung. Damit wirkt in der Mitte der Pore auf die nichtleitenden zu vermessenden Partikel eine elektro­ nische Fokussierung.

Claims (10)

1. Verfahren zur Bestimmung von Parametern von Parti­ keln in Elektrolyten, insbesondere von biologischen Partikeln, wobei die zu bestimmenden Partikel durch eine Meßpore gespült werden, wobei die Partikel beim Durchlaufen der Meßpore abwechselnd unter­ schiedlichen elektrischen Potentialen ausgesetzt sind und wobei die aufgrund der Wechselwirkung der unterschiedlichen Potentiale mit den Partikeln ge­ wonnenen Signale anschließend miteinander verknüpft werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zeitlich versetzt gemessene Signale verknüpft werden und daß die resultierenden Signale unter­ schiedliche Vorzeichen aufweisen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß bei konstanter Strömungsgeschwindig­ keit des Elektrolyten die Laufzeitdifferenz des Partikels zwischen den unterschiedlichen Potentia­ len gemessen wird.

4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mittels eines der gemessenen Signale das gesamte Meßsignal getriggert wird.

5. Vorrichtung zur Bestimmung von Parametern von Par­ tikeln in Elektrolyten, insbesondere von biologi­ schen Partikeln, unter Verwendung einer Meßpore, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 4, wobei die Meßpore aus einem Multilayersystem gebildet ist, wobei abwechselnd elektrisch leitende (4, 6) und nichtleitende Schich­ ten (3, 5) angeordnet sind und wobei die Meßpore quer durch die verschiedenen Schichten verläuft.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeich­ net, daß die Meßpore senkrecht zu den verschiedenen Schichten verläuft.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die leitenden Schichten (4, 11) als Meßelektroden dienen.

8. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke der nichtleitenden Schichten geringer ist als die Partikelgröße.

9. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehen­ den Anspruche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Durchflußrichtung vor den Schichten (9-13) ein elektrisch leitender Hohlzylinder (7) vorgesehen ist, der konzentrisch zur Meßpore verläuft und gegenüber dieser durch eine elektrisch nicht leiten­ de Schicht (8a, 8b) isoliert ist.

10. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehen­ den Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden äußeren leitfähigen Schichten (1, 6) geerdet sind.