DE2219778C3 - Verfahren zur Ermittlung physiologischer Eigenschaften nativer Blutzellen und Anordnung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents
Verfahren zur Ermittlung physiologischer Eigenschaften nativer Blutzellen und Anordnung zur Durchführung des VerfahrensInfo
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Description
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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Ermittlung physiologischer Eigenschaften nativer Blutzellen,
die in einem Elektrolyten suspendiert sind.
Unter dem Namen seines Erfinders — Coulter — ist ein elektronisch arbeitendes Meßverfahren zur Bestimmung
der Volumengrößen von in einer elektrolytischen Untersuchungsflüssigkeit suspendierten Partikeln bekannt
geworden, das mit Hilfe von zwei Gefäßen arbeitet, die durch eine kleine Meßöffnung miteinander
verbunden sind. Die Untersuchungsflüssigkeit fließt durch diese Meßöffnung von dem einen Gefäß in das
andere. In die Untersuchungsflüssigkeit tauchen zu beiden Seiten der Meßöffnung Elektroden unterschiedlichen
Potentials ein, die an einen elektrischen Meßkreis angeschlossen sind. Die Leitfähigkeit der Untersuchungsflüssigkeit
zwischen den Elektroden ändert sich beim Durchtritt eines Partikels durch die Meßöffnung
proportional mit dem Volumen des Partikels, womit eine Volumenbestimmung der in der Untersuchungsflüssigkeit
suspendierten Partikel möglich ist
Die von Coulter angegebene Vorrichtung wurde inzwischen weiterentwickelt So ist z. B. aus der DE-AS
18 06 512 eine nach dem Coulter-Verfahren arbeitende
Verrichtung bekannt, bei der die Partikel nicht der Elektrolytflüssigkeit in dem Gefäß vor der Meßöffnung
beigemengt sind, sondern der Meßöffnung durch eine eigens dafür vorgesehene Zuführungseinrichtung zugeleitet
werden, die eine Austrittsöffnung in sehr geringem Abstand vor der Meßöffnung hat, so daß der in die
Meßöffnung einfließende Elektrolyt Probensuspension aus der Austrittsöffnung der Zuführungseinrichtung
heraussaugt Es findet dann ein hydrodynamischer Fokussiervorgang statt, wodurch bewirkt wird, daß alle
zu zählenden Partikel nahezu im Zentrum der Meßöffnung durch diese hindurch wandern. Durch eine
derartige Anordnung v/ird eine erhebliche Steigerung der Meßgenauigkeit erreicht
Bei der Bestimmung des mittleren Zellvolumens lebender Zeilen ergaben sich insbesondere bei der
Bestimmung von Säugetiererythrozyten Diskrepanzen zwischen der elektronischen Volumenbestimmung nach
dem Coulter-Verfahren und der physikalischen Bestimmung über Hämatokrit und Zellzahl. Es wurde eine
Unterbewertung der Zellvolumina bei der Messung mit dem Coulter-Verfahren festgestellt. Man hat dies
zunächst allein auf die Form und Verformbarkeit der zu untersuchenden Zellen zurückgeführt und entsprechende
Korrekturen in den Meßergebnissen vorgesehen, denn der Einfluß von Form und Verformbarkeit der
Zellen ist zweifellos gegeben. Dennoch wurden nach dieser Korrektur bei der Messung nativer Zellen noch
immer Diskrepanzen der genannten Art festgestellt, die bei der Messung fixierter Zellen jedoch nicht auftraten.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neuartiges Verfahren zur Ermittlung
physiologischer Eigenschaften nativer Blutzellen anzugeben, die in einem Elektrolyten suspendiert sind.
Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß der spezifische elektrische Widerstand der
Suspension als Funktion der elektrischen Feldstärke gemessan wird und jene diskreten Feldstärken bestimmt
werden, bei denen sprunghafte Änderungen des spezifischen elektrischen Widerstandes der Suspension
auftreten.
Es wurde eingangs schon erwähnt, daß man bei der Partikelvolumenanalyse nach dem Coulter-Verfahren in
dem bei einer Coulter-Anordnung verwendeten elektrischen Meßkreis volumenproportionale oder nahezu
volumenproportionale Stromänderungen beim Durchtritt eines Partikels durch die Meßöffnung erhält. In der
Praxis geht man dabei so vor, daß man eine bestimmte Potentialdifferenz zwischen den beiden Elektroden, die
zu beiden Seiten der Meßöffnung in der Elektrolytflüssigkeit angeordnet sind, einstellt, wodurch sich ein
bestimmter Strom, der durch die Elektrolytflüssigkeit von der einen Elektrode zur anderen durch die
Meßöffnung hindurchfließt, ergibt. Bei konstanter Potentialdifferenz zwischen den beiden Elektroden
ändert sich diese Stromstärke beim Durchtritt eines Panikeis durch die Meßöffnung, sofern die Leitfähigkeit
des Partikels eine andere ist als die Leitfähigkeit des das Partikel umgebenden Elektrolyten. Man mißt also im
Grunde einen bestimmten elektrischen Widerstand zwischen den beiden Elektroden, der sich verändert,
wenn ein Partikel sich in der Meßöffnung befindet. Dieser Widerstand ist selbstverständlich von der Art des
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verwendeten Elektrolyten und von der Konzentration der in diesem suspendierten Partikel abhängig.
Vergrößert man z. B. die Potentialdifferenz zwischen
den beiden Elektroden, so vergrößert sich linear hiermit auch der Strom durch den Elektrolytec, sofern nicht
dessen Leitfähigkeit durch eine durch höheren Strom bewirkte Erwärmung verändert wird.
Entsprechend der Stromvergrößerung im Elektrolyten vergrößern sich auch die Stromunterschiede im
Meßkreis beim Durchtritt eines Partikels durch die Meßöffnung. Hat man dem Elektrolyten z. B. Latexpartikel
beigemischt, so stellt man fest, daß die Stromänderungen
linear mit dem Strom im Meßkreis anwachsen. Bewertet man nur das Verhältnis von Stromänderungen
zu Strom im Meßkreis, so geht der absolute spezifische Widerstand des Meßkreises, d. h. der Elektrolytenstrekke
im Meßkreis, nicht mehr in die Messung ein. Einflüsse durch Temperaturerhöhungen des Elektrolyten sind
hiermit ausgeschaltet. Es findet damit eine Bewertung der relativen Änderung des spezifischen Widerstandes
der Elektrolytstrecke in der Meßöffnung statt Damit ist eine nach dem Coulter-Verfahren arbeitende Anordnung
in hervorragender Weise geeignet, zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Ermittlung
von physiologischen Eigenschaften nativer Blutzellen herangezogen zu werden. Führt man nämlich die soeben
am Beispiel von Latexpartikeln erläuterte Messung mit nativen Blutzellen durch, so stellt man fest, daß das
Verhältnis von Stromänderung zu Stromstärke für eine gegebene Partikelart, z. B. Erythrozyten nicht unabhängig
von der eingestellten Stromstärke ist. Das bedeutet, daß die Leitfähigkeit oder der spezifische Widerstand
des sich in der Meßöffnung befindenden Untersuchungsflüssigkeits-Volumens,
in dem ein Partikel enthalten ist, nicht unabhängig von der Stromstärke ist. Hiermit erklärt sich auch die eingangs erwähnte,
zwischen nativen und fixierten Zellen auftretende Diskrepanz.
Die genannten Stromänderungen werden beim Coulter-Verfahren als Impulse erfaßt. Man braucht also
nur die Impulshöhen über der Stromstärke aufzutragen, um festzustellen, in welcher Weise die Impulshöhen von
der eingestellten Stromstärke abhängig sind. Dabei stellt man fest, daß von der Stromstärke Null beginnend
die Impulse zunächst linear mit der Stromstärke anwachsen. Ab einer bestimmten Stromstärke wachsen
die Impulse jedoch nicht in gleichem Maße wie die Stromstärke an, sondern langsamer. Trägt man die
Funktion in einer Graphik auf, so stellt man fest, daß für jede Art von untersuchten Blutzellen ein ausgeprägter
Knick im Kurvenverlauf vorhanden ist. Die Lage dieses Knickpunktes läßt für die einzelne Blutzellart Rückschlüsse
auf deren Zustand zu. So wurde festgestellt, daß die Knickpunkte bei verschiedenen Personen bei
verschiedenen Stromstärken liegen. Es konnte auch festgestellt werden, daß die Knickpunkte für die
verschiedenen BlutzeHarten ebenfalls bei verschiedenen Stromstärken liegen.
Diese Phänomene, die bei fixierten Blutzellen nicht auftreten, können nur dadurch bedingt sein, daß bei
höheren Stromstärken, das bedeutet bei einer höheren Feldstärke, der die einzelne Blutzelle ausgesetzt ist, eine
Änderung im Isolationsverhalten der Blutzellen eintritt. Es wird vermutet, daß ein Ionendurchbruch durch die
Zellmembran stattfindet, und daß dadurch die Leitfähigkeit der untersuchten Blutzelle erhöht wird.
Der genannte Effekt, der gemäß der Erfindung für die Bestimmung physiologischer Eigenschaften nativer
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65 Blutzellen herangezogen werden soll, wurde bislang
noch nicht beobachtet Dies mag seine Ursache darin haben, daß bei den bislang verwendeten Methoden der
Leitfähigkeitsuntersuchung von Blut die hohen Feldstärken, die zu dem vermuteten Ionendurchbruch durch
die Zellmembran führen, nicht auftreten. Bei Messungen mit einer nach dem Coulter-Verfahren arbeitenden
Anordnung werden jedoch bereits bei verhältnismäßig niedrigen Spannungen, z. B. bei einer Potentialdifferenz
zwischen den beiden Elektroden von 20 Volt aufgrund aer geringen Abmessungen der Meßöffnung in dieser
Feldstärken von etwa 2 kV/cm hervorgerufen. Die Ströme, die dabei fließen, liegen in der Größenordnung
von etwa 1 mA. Die in Wärme umgesetzte Energie in der Meßöffnung ist daher denkbar gering. Eine nach
dem Coulter-Verfahren arbeitende Anordnung ist daher besonders geeignet, das Verfahren nach der Erfindung
zu vollziehen. Besonders vorteilhaft eignet sich hierzu eine nach- dem Coulter-Verfahren arbeitende Anordnung,
bei der die Partikel durch eine eigens dafür vorgesehene Zuführungseinrichtung der Meßöffnung
zugeleitet werden. Der Elektrolyt in dem Gefäß vor der Meßöffnung ist dabei partikelfrei. Die Zuführungseinrichtung
weist eine öffnung auf, die der Meßöffnung zugekehrt ist Die Partikel, die aus dieser Zuführungseinrichtung austreten, werden durch den in die
Meßöffnung einfließenden Elektrolyten hydrodynamisch in das Zentrum der Meßöffnung hineinfokussiert
Dabei kann gemäß der Lehre der DE-AS 18 06 512 der Abstand der Austrittsöffnung der Zuführungseinrichtung
zur Meßöffnung derart klein gemacht werden, daß der in die Meßöffnung einfließende Elektrolyt die
Probensuspension aus der Öffnung der Zuführungseinrichtung heraussaugt, wodurch die Fokussierung in das
Zentrum der Meßöffnung besonders gut wird. Die durch die hydrodynamische Fokussierung erreichten Meßgenauigkeitssteigerungen
sind erheblich.
Eine Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht daher aus einer der
bekannten nach dem Coulter-Verfahren arbeitenden Vorrichtungen mit oder ohne getrennte Partikelzuführung
und einer Einrichtung, mit der der genannte Potentialunterschied zwischen den Elektroden, die bei
diesen Anordnungen vorgesehen sind, veränderbar ist. Vorzugsweise ist im elektrischen Meßkreis eine
Auswerteeinrichtung vorzusehen, mit deren Hilfe die Impulsamplituden, d. h. die Stromänderungen entsprechend
der verschiedenen in der Probensuspension vorhandenen Blutzellpopulationen getrennt erfaßbar
sind und mit der eine Zuordnung der Impulsamplituden zu dem jeweils herrschenden Potentialunterschied
zwischen den Elektroden durchführbar ist. Mit einer solchen Anordnung wäre das Meßverfahren weitgehend
automatisierbar.
Wie bereits erwähnt, findet die Änderung im Leitfähigkeitsverhalten der Blutzellen sehr plötzlich
statt. In den Kurven, die man aufnehmen kann, äußert sich das in einem Knick. Dieser Knick liegt für eine
bestimmte Blutzellsorte für verschiedene Personen bei verschiedenen Feldstärken. Ebenso liegen die Knickpunkte
der verschiedenen Blutzellsorten ebenfalls bei verschiedenen Feldstärken. Hierauf wurde bereits
hingewiesen. Die Lage der Knickpunkte gibt daher Aufschlüsse über die Art und den Zustand der
verschiedenen Blutzellen. Man hat damit ein Mittel in der Hand, wie man z. B. den Medikamenteneinfluß auf
die Blutzellen kontrollieren kann.
Das Verfahren nach der Erfindung und eine
vorteilhafte Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens seien anhand der Zeichnungen noch einmal kurz erläutert.
F i g. 1 zeigt den Widerstandsverlauf einer mit Blutzellen vernetzten Elektrolytflüssigkeit, wenn man
ihn unter gegebenen Bedingungen bei verschiedenen Stromstärken -aufnimmt. Dabei zeigt sich, daß bei
verschiedenen Stromstärken, die in der F i g. 1 mit Z1 und
h bezeichnet, sind, eine sprunghafte Änderung des
Widerstandesjauftritt Die Ursache hierin wird — wie
bereits erwähnt — darin gesehen, daß die Leitfähigkeit der Blutzellen erhöht und damit der Widerstand der
gesamten Untersuchungsflüssigkeit herabgesetzt wird.
Die Fig.2 zeigt eine nach dem Coulter-Verfahren
arbeitende Anordnung mit getrennter Partikelzufühfung.
Von einem Gefäßraum ί fließt Elektrolytfiüssigkeit 2 durch eine kleine Meßöffnung 3 in einen
Gefäßraum 4. In geringem Abstand vor der Meßöffnung 3 ist die Austrittsöffnung einer Zuführungseinrichtung 5
vorgesehen, in der eine Blutprobe enthalten ist. Die in die Meßöffnung 3 einfließende Elektrolytflüssigkeit 2
saugt beim Vorbeifließen an der Austrittsöffnung der Zuführungseinrichtung 5 die Blutprobe aus dieser
Zuführungseinrichtung heraus und transportiert sie im Zentrum der Meßöffnung 3 durch diese hindurch. In die
Elektrolytflüssigkeit zu beiden Seiten der Meßöffnung tauchen Elektroden 6 und 7 ein, die gegeneinander
unterschiedliches Potential aufweisen und an einen elektrischen Meßkreis angeschlossen sind. Eine solche
Anordnung ist z. B. in der DE-AS 18 06 512 beschrieben. Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist jedoch in der elektrischen Einrichtung 8, mit Hilfe deren die Messungen durchgeführt werden, eine
Einrichtung vorgesehen, mit Hilfe der due Potentialdifferenz
zwischen den Elektroden 6 und 7 verändert werden kann. Weiterhin sind in der Einrichtung 8 Mittel
vorgesehen, mit deren Hilfe die durch das Hindurchtreten von Partikeln durch die Meßöffnung 3 hervorgerufenen
Stromänderungen bei jeder eingestellten Potentialdifferenz festgehalten werden können, um sie den
verschiedenen Blutzellarten zuordnen zu können. Weiterhin sind in der Einrichtung 8 Mittel vorgesehen,
die als Funktion der Potentialdifferenz zwischen den Elektroden 6 und 7 die absoluten oder relativen
Stromänderungen für die einzelnen Blutzellarten aufnehmen und diejenigen Potentiale festhalten, bei
denen für die einzelnen Zellarten eine sprunghafte Änderung im Verhalten der Stromänderungen bezüglich
der Potentialdifferenz festgestellt wird. Auf diese einzelnen Mittel braucht hier nicht eingegangen zu
werden, da sie für einen Fachmann, der mit derartigen
ίο elektronischen Meßproblemen vertraut ist, nichts
Ungewöhnliches darstellen.
In der F i g. 3 ist für verschiedene Partikel, die mit
einer solchen Vorrichtung untersucht wurden, der jeweils zugehörige Verlauf der sich ergebenden
Stromänderungsamplituden A über der Stromstärke / aufgezeichnet, in dieser Darstellung bedeutet die
gestrichelte Linie den Kurvenverlauf für native Erythrozyten, wie man ihn normalerweise erwartet.
Dieser Kurvenverlauf ist mit 9 bezeichnet. Dabei stellt man fest, daß ab einer bestimmten Stromstärke h dieser
Verlauf nicht mehr den Erwartungen folgt. Vielmehr werden die Stromänderungsamplituden A nicht mehr in
gleichem Umfange größer wie die Stromstärke. Im Kurvenverlauf bildet sich ein ausgesprochener Knick
heraus, der in der Darstellung durch einen Pfeil hervorgehoben ist. Der zugehörige Kurvenverlauf ist
mit 10 bezeichnet Der strichpunktierte Verlauf 11 gibt denjenigen an, den man bei der Messung fixierter
Erythrozyten erhält. Bei diesen Zellen läßt sich der erwähnte Effekt nicht feststellen, die Stromänderungsamplituden
beim Durchtritt der Partikel durch die Meßöffnung wachsen linear mit der eingestellten
Stromstärke. Die punktierte Linie 12 schließlich ist eine solche, wie sie bei der Messung von Latexpartikeln
gewonnen wird. Diese Partikel sind völlig neutral, daher zeigt die Kurve einen völlig linearen Verlauf. Bei
nativen Erythrozyten läßt — wie bereits erwähnt — die Lage des Knickpunktes Rückschlüsse auf die untersuchte
Zelle zu. Weiterhin ist in der Größe der Steigung nach dem Knickpunkt im Kurvenverlauf eine weitere
Beurteilungsmöglichkeit für die untersuchte Blutzellart gegeben.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
Claims (5)
1. Verfahren zur Ermittlung physiologischer Eigenschaften nativer Blutzellen, die in einem
Elektrolyten suspendiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische elektrische
Widerstand der Suspension als Funktion der elektrischen Feldstärke gemessen wird und jene
diskreten Feldstärken bestimmt werden, bei denen sprunghafte Änderungen des spezifischen elektrisehen
Widerstandes der Suspension auftreten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Anwendung des sogenannten Coulter-Verfahrens
in der Weise, daß die Impulsamplituden bei verschiedenen Feldstärken bestimmt werden.
3. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine
nach dem sogenannten Coulter-Verfahren arbeitende
Vorrichtung zum Zählen und Klassieren von in einer elektrolytischen Untersuchungsflüssigkeit suspendierten
Partikeln vorgesehen ist, bestehend aus zwei Gefäßen zur Aufnahme der Untersuchungsflüssigkeit,
die durch eine kleine Meßöffnung miteinander in Verbindung stehen, und einer Einrichtung zum
Erzeugen einer Druckdifferenz zwischen den Gefä-Ben und zwei in die Untersuchungsflüssigkeit in den
Gefäßen eintauchenden Elektroden unterschiedlichen Potentials, die an einen elektrischen Meßkreis
angeschlossen sind, und daß Mittel vorgesehen sind, mit denen der genannte Potentialunterschied veränderbar
ist.
4. Anordnung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrolytflüssigkeit in dem Gefäß
größeren Druckes partikclfrei ist und daß eine Zuführungseinrichtung für partikelhaltige Suspension
vorgesehen ist, die eine Austrittsöffnung stromaufwärts vor der Meßöffnung aufweist.
5. Anordnung nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dafi im elektrischen Meßkreis
eine Auswerteeinrichtung vorgesehen ist, mit deren Hilfe die Impulsamplituden entsprechend der
verschiedenen in der Probensuspension vorhandenen Blutzellpopulationen getrennt erfaßbar sind und
eine Zuordnung der Impulsamplituden zu dem jeweils herrschenden Potentialunterschied zwischen
den Elektroden durchführbar ist.
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