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"Verfahren zu Ermittlung physiologisher Eigenschaften nativer Blutzellen
und Anordnung zur Durchführung des Verfahrens" Die Erfindung bezieht sich auf ein
Verfahren zur Ermittlung physiologisher Eigenschaften nativer Blutzellen', die in
einer Untersuchungsflüssigkeit suspendiert sind.
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Unter dem Namen seines Erfinders - Coulter - ist ein elektronisch
arbeitendes Meßverfahren zur Bestimmung der Volumengrößen von in einer elektrolyschen
Untersuchungsflüssigkeit suspendierten Partikeln bekannt geworden, mit Hilfe von
zwei Gefäßen arbeitet, die durch eine kleine Heßöffnung miteinander verbunden sind.
Die Untersuchungsflüssigkeit fließt durch diese Meßöffnung von dem einen Gefäß in
das andere.
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n die Untersuchungsflüssigkeit tauchen zu beiden Seiten der Meßöffnung
Elektroden unterschiedlichen Potentials ein, die an einen elektrischen Meßkreis
angeschlossen sind. Die Lei-tfähigkeit der Untersuchungsflüssigkeit zwischen den
Elektroden
ändert sich beim Durchtritt eines Partikels durch die
Meßöffnung proportional mit dem Volumen des Partikeis, womit eine Volumenbestimmung
der in der Untersuchungsflüssigkeit suspendierten Partikel möglich is,t Die von
Coulter angegebene Vorrichtung wurde inzwischen weiterentwickelt. So ist z. B. aus
der DAS 1 806 512 eine nach dem Coulter-Verfahren arbeitende Vorrichtung bekannt,
bei der die Partikel nicht der Elektrolytflüssigkeit in den Gefäß vor der Meßöffnung
beigemengt sind, sondern der Meßöffnung durch eine eigens dafür vorgesehene Zuführungseinrichtung
zugeleitet werden, die eine Austrittsöffnung in sehr geringe Abstand vor der Neßöffnung
hat, so daß der in die Meßöffnung einfließende Elektrolyt Probensuspension aus der
Austrittsöffnung der Zuführungseinrichtung heraussaugt. Es findet dann ein hydrodynamischer
Fokussiervorgang statt, wodurch bewirkt wird, daß alle zu zählenden Partikel nahezu
im Zentrum der Meßöffnung durch diese hindurch wandern. Durch eine derartige Anordnung
wird eine erhebliche Steigerung der Meßgenauigkeit erreicht.
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Bei der Bestimmung des mittleren Zellvolunens lebender Zellen ergaben
sich insbesondere bei der Bestimmung von Säugetiererythrozyten Diskrepanzen zwischen
der elektronischen Volumenbestimmung
nach dem Coulter-Verfahren
und der physikalischen Bestimmung über Hämatokrit und Zellzehl. Es wurde eine Unterbewertung
der Zellvolumina bei der Messung mit dem Coulter-Verfahren festgestellt. ein hat
dies zunächst allein auf wie Form und Verformbarkeit der zu untersuchenden Zellen
zurückgeführt und entsprechende Korrekturen in den Meßergeonissen vorgesehen, denn
der Einfluß von Form und Verformbarkeit der Zellen ist zweifellos gegeben. Dennoch
wurden nach dierser Korrektur bei der Messung nativer Zellen noch immer Dikrepanzen
der genannten Art festgestellt, die bei der Messung fixierter Zellen jedoch nicht
auftraten.
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Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neuartiges
Verfahren zur Ermittlung physiologischer Eigenschaften nativer Blutzellen anzugeben,
die in einer Untersuchungsflüssigkeit suspendiert sind. Diese Aufgabe wird gemäß
der Erfindung dadurch gelöst, daß der spezifische eleetrische Widerstand der Untersuchungsflüssigkeit
als Funktion eines durch sie fließenden elektrischen Stromes aufgenommen wird und
äene diskreten Stromstärken für die weitere Auswertung verwendet werden, bei denen
eine merkliche änderung des sDezifischen elektrischen Widerstandes der Untersuchungsflüssigkeit
estgestellt wird.
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Es wurde eingangs schon erwännt, daß man bei der Partikelvolumenanalyse
nach dem Coulter-Verfahren in dem bei einer Coulter-Anordnung verwendeten elektrischen
Meßkreis volumenproportionale oder nahezu volumenproportionale Stromänderungen bein
Durchtritt eines Partikels durch die Meßöffnung erhält. In der Praxis geht man dabei
so vor, das. man eine Desti-te Potentialdifferenz zwischen den beider Elektroden,
die zu beiden Seiten der Heßöffnung in der Elektrolytflüssigkeit angeordnet sind,
einstellt, wodurch sich ein bestimmter Strom, der durch die Elektrolytflüssigkeit
von der einen Elektrode zur anderen durch die Neßöffnung hindurchfließt, ergibt.
Bei konstanter Potentialdifferenz zwischen den beiden Elektroden ändert sich diese
Stromstärke beim Durchtritt eines Partikels durch die Meßoffnung, sofern die Leitfähigkeit
des Partikels eine andere ist als die Leitfähigkeit des das Parti-:el umgebenden
Elektrolyten. Man mißt also im Grunde einen bestimmten elektrischen Widerstand zwischen
den beiden Ele:-troden, der sich verändert, wenn ein Partikel sich in der Meßöffnung
befindet. Dieser Widerstand ist selbstverständlich von der Art des verwendeten Elektrolyten
und von der Konzentration der in diesem suspendierten Partikel abhängig.
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Vergrö3ert man z. B. die Potentialdifferenz zwischen der beiden Elektroden,
so vergrößert sich linear hiermit auch der Strom durch den Elektrolyten, sofern
nicht dessen Leitfähigkeit durch eine durch höheren Strom bewirkte Erwärmung verändert
wird.
Entsprechend der Stromvergrößerung im Elektrolyten vergrößern
sich auch die Stromunterschiede im Meßkreis bein Durchtritt eines Partikels durch
die Meßöffnung. Hat man dem Elektrolyten z. B. Latexpartikel beigemischt, so stellt
man fest, daß die Stromänderungen linear mit dem Strom im Meßkreis anwachsen.
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Bewertet man nur das Verhältnis von Stromänderungen zu Strom im Meßkreis,
so geht der absolute spezifische Widerstand des Meßkreises, d.h. der Elektrolytenstrecke
im Meßkreis, nicht mehr in die Messung ein Einflüsse durch Temperaturerhähungen
des Elektrolyten sind hiermit ausgeschaltet. Es findet damit eine Bewertung der
relativen Änderung des spezifischen Widerstandes der Elektrolytstrecke in der Meßöffnung
statt. Damit ist eine nach dem Coulter-Verfahren arbeitende Anordnung in hervorragender
Weise geeignet, zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Ermittlung
von physiologischen Eigenschaften nativer Blutzellen her.angezogen zu werden. Führt
man nämlich die soeben am Beispiel von Latexparti-keln erläuterte Messung mit nativen
Blutzellen durch, so stellt man fest, daß das Verhältnis von Stromänderung zu Stromstärke
für eine gegebene Partikelart z. B. Erythrozyten nicht unabhängig von der e ngestellten
Stromstärke ist. Das bedeutet, daß die Leitfähigkeit oder der spezifische Widerstand
des sich in der Meßöffnung befindenden Untersuchungsflüssigkeits-Volumens, in den
ein Partikel enthalten ist, nicht unabhängig von der Stromstärke ist.
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hiermit erklärt sich auch die eingangs erwähnte, zwischen nativer
und fixierten Zellen auftretende Diskrepanz.
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Die genannten Stromänderungen werden beim Coulter-Verfahren ¢- s Impulse
erfaßt. Han braucht also nur die Impulshähen der Stromstärke aufzutragen, um festzustellen,
in welche Weise die Impulshöhen von der eingestellten Stromstärke gängig sind. Dabei
stellt man fest, daß von der Stromstärke Null beginnend die Impulse zunächst linear
mit der Stromstärke anwachsen. Ab einer bestimmten Stromstärke wachsen die Impulse
jedoch nicht in gleichem Haße wie die Stromstärke an, sondern langsamer. Trägt man
die Funktion in einer Graphik auf, so stellt man fest, daß für jede Art von untersuchten
Blutzellen ein ausgeprägter Knick im kurvenverlauf vorhanden ist. Die Lage dieses
Knickpunktes läßt für die einzelne Blutzellart Rückschlüsse auf deren Zustand zu.
So wurde festgestellt, daß die Knickpunkte bei verschiedenen Personen bei verschiedenen
Stromstärken liegen. Es konnte auch festgestellt werden, daß die Knickpunkte für
die verschiedenen Blutzellarten ebenfalls bei verschiedenen Stromstärken liegen.
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Diese Phänomene, die bei fixierten Blutzellen nicht auftreten, können
nur dadurch bedingt sein, daß bei höheren Stromstärken, das bedeutet bei einer höheren
Feldstärke, der die einzelne Blutzelle ausgesetzt ist, eine Anderung im Isolationsverhalten
der
Blutzellen eintritt. Es wird vermutet, daß ein Ioner durchbruch durch die Zellmembran
stattfindet, und daß dadurch die Leitfähigkeit der untersuchten Blutzelle erhölt
wird.
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Der genannte Effekt, der gemäß der Erfindung für die Bestimmung physiologischer
Eigenschaften nativer Blutzellen herangezogen werden soll, wurde bislang noch nicht
beobachtet.
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Dies mag seine Ursache darin haben, daß bei den bislang verwendeten
Methoden der Leitfähigkeitsuntersuchung von Blut die hohen Feldstärken, die zu dem
vermutete Ionendurchbruch durch die Zellmembran führen , nicht auf, treten.
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ei Messungen mit einer nach dem Coulter-Verfahren arbeitenbereits
den Anordnung werden jedoch/ bei verhältnismäßig niedrigen Spannungen, z. B. bei
einer Potentialdifferenz zwischen den beiden Elektroden von 20 Volt aufgrund der
geringen Abmessungen der Meßöffnung in dieser Feldstärken von etwa 2 kV/cm hervorgerufen.
Die Ströme, die dabei fließen, liegen in der Größenordnung von etwa 1 mA. Die in
Wärne umgesetzte Energie in der Meßöffnung ist daher denkbar gering. Eine nach den
Coulter-Verfahren arbeitende Anordnung ist daher besonders geeignet, das Verfahren
nach der Erfindung zu yollziehen.
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Besonders vorteilhaft eignet sich hierzu eine nach dem Coulter-Verfahren
arbeitende Anordnung, bei der die Partikel durch eine eigens dafür vorgesehene Zuführungseinrichtung
der
Meßoffnung zugeleitet werden. Der Elektrolyt in dem Gefäß von der Meßöffnung ist
dabei partikelfrei. Die Zu@üh rungseinrichtung weist eine öffnung auf, die der Meßöfinung
ungekehrt ist. Die Partikel, die aus diesser Zuführungseinrichtung austreten, werden
durch den-in die Meßöffnung e nfließenden Elektrolyten hydrodynamisch in das Zentrum
der Meßöffnung hineinfokussiert. Dabei kann gemä3 der i'hre der DAS 1 806 512 der
Abstand der Austrittsöffnung der Zuführungseinrichtung zur Meßöffnung derart klein
gemacht wer Den, daß der in die Neßöffnung einfließende Elektrolyt die obensuspension
aus der Öffnung der Zuführungseinrichtung heraufsaugt, wodurch die Fokussierung
in das Zentrum der Meßöffnung besonders gut wird. Die durch die hydrodynamische
Fokussierung erreichten Meßgenauigkeitssteigerungen sind erheblich.
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Eine Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht
daher aus einer der bekannten nach dem Coulter-Verfahren arbeitenden Vorrichtungen
mit oder ohne getrennte Partikelzuführung und einer Einrichtung, mit der der genannte
Potentialunterschied zwischen den Elektroden, die bei diesen Anordnungen vorgesehen
sind, veränderbar ist. Vorzugsweise ist im elektrischen Meßkreis eine Auswerteeinrichtung
vorzusehen, mit deren Hilfe die Impulsamplituden, d. h. die Stromänderungen entsprechend
der verschiedenen in der Probensustension
vorhandenen Blutzellpopulationen
getrennt erfaßbar sind und mit der eine Zuordnung der Impulsamplituden zu dem jeweils
herrschenden Potentialunterschied zwischen den Elektroden durchführbar ist Hit einer
solchen Anordnung wäre das Meßverfahren weitgehend automatisierbar.
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Wie bereits erwähnt, findet die Änderung in Leitfähigkeitsverhalten
der Blutzellen sehr plötzlich statt. In den Kurven, die man aufnehmen kann, äußert
sich das in einem Knick. Dieser Knick liegt für eine bestimmte Blutzellsorte für
verschiedene Personen bei verschiedenen Feldstärken. Ebenso liegen die knickpunkte
der verschiedenen Blutzellsorten ebenfalls bei verschiedenen Feldstaärken. Hierauf
wurde bereits hingewiesen. Die Lage der Knickpunkte gibt daher Aufschlüsse über
die Art und den Zustand der verschiedenen Blutzellen. Man hat damit ein Mittel in
der Hand, wie man z. B. den Medikamenteneifluß auf die Blutzellen kontrollieren
kann., Das Verfahren nach der Erfindung und eine vorteilhafte Anordnung zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens seien anhand der Zeichnungen noch einmal kurz erläutert.
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Figur 1 zeigt den Wiederstandsverlauf einer mit Blutzellen versetzten
Elektrolytflüssigkeit, wenn man ihn unter gegebenen
Bedingungen
bei vershiedenen Stromstärken @u@ninnt Dabei zeigt sich, daß bei verschiedenen Stromstärken,
die in der Figur 1 mit I1 und I2 bezeichnet sind, ein sprunghafte Änderung des Widerstandes
auftritt. Die Ursache hierin wird - wie bereits erwähnt - darin gesehen, daß die
Leitfähigkeit der Blutzellen erhöht und damit der Widerstand der gesammten Untersuchungsflüssigkeit
herabgesetzt wird.
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Die Figur 2 zeigt eine nach dem Goulter-Verfahren arbeitende Anordnung
mit getrennter Partikelzuführung. Von eine Gefäßraum 1 fließt Elektrolytflüssigkeit
2 durch eine kleine Meßöffnung 3 in einen Gefäßraum 4. in geringen abstand vor der
Meßöffnung 3 ist die Austrittsöffnung einer Zuführungseinrichtung 5 vorgesehen,
in der eine Blutprobe enthalten ist. Die in die Meßöffnung 3 einfließende Elektrolytflüssigkeit
2 saugt beim Vorbeifließen an der Austrittsöffnung der Zuführungseinrichtung, 5
die Blutprobe aus dieser Zuführungseinrichtung heraus und transportiert sie im Zentrum
der heS-öffnung 3 durch diese hindurch. In die Elektrolytflüssigkeit zu beiden Seiten
der Meßöffnung tauchen Elektroden 6 und 7 ein, die gegeneinander unterschiedliches
Potential aufweise und an einen elektrischen Meßkreis angeschlossen sind. Eine solche
Anordnung ist z. B. in der DAS 1 806 512 beschrieben.
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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist jedoch in der
elektrischen Einrichtung 8, mit Hilfe deren die Messung
durchgeführt
werden, eine Einrichtung vorgesehen, nie e der die Potentialdifferenz zwischen den
Elektroden 6 und 7 verändert werden kann. Weiterhin sind in der Einrichtung Mittel
vorgesehen, mit deren Hilfe die durch das Hindurchtreten von Partikeln durch die
Meßöffnung 3, hervorgerufenen Stronänderungen bei jeder eingestellten Potentialdifferenz
festgehalten werden können, um sie den verschiedenen Blutzellarten zuordnen zu können.
Weiterhin sind in der Einrichtung 8 Mittel vorgesehen, die als Funktion der Potentialabsoluten
oder differenz zwischen den Elektroden 6 und 7 die/relativen Stromänderungen für
die einzelnen Blutzellenarten~aufnehnen und diejenigen Potentiale festhalten, bei
denen für die einzelnen Zellarten eine sprunghafte änderung im Verhalten.
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der Stromänderungen bezüglich der Potentialdifferenz festgestellt
wird. Auf diese einzelnen Mittel braucht hier nicht eingegangen zu werden, da sie
für einen Fachmann, der mit derartigen elektronischen Meßproblemen vertraut ist,
nichts Ungewöhnliches darstellen.
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In der Figur 3 ist für verschiedene Partikel, die mit einer solchen
Vorrichtung untersucht wurden, der jeweils zugehörige Verlauf der sich ergebenden
Stromänderungsamplituden A über dem Stromstärke I aufgezeichnet. In dieser Darstellung
bedeutet die gestrichelte Linie den Kurvenverlauf für native E.ytnrozyten, wie man
ihn normalerweise erwartet. Dieser Eurvenverlauf
ist mit 9 bezeichnet.
Dabei stellt man @ast @@@ ab einer bestimmten Stromstärke Ik dieser Verlauf nicht
mehr den Erwantungen folgt. Vielmehr werden die Stromänderungsamplituden A nicht
mehr in gleichem Umfange größer wie die Stromstärke. Im Kurvenverlauf bildet sich
ein susgesprochener Knick heraus, der in der Darstellung durch einen Pfeil hervorgehohen
ist. Der zugehörige Kurvenverlauf ist mit 10 bezeichnet. Der strichpunktierte Verlauf
11 gibt denjenigen an, den man bei der Messung fixierter Erythrozyten erhält. Bei
diesen Zellen läßt sich der erwähnte Effekt nicht festellen, die Stromänderungsamplituden
beim Durchttitt der Partikel durch Meßöffnung wacksen Linear mit der eingenstellten
Stromstärke. Die punktierte Linie 12 schließlich ist eine solche, wie sie bei der
Messung von Latexpartikeln gewonnen wird. Diese Partikel sind völlig neutral, daher
zeigt die Kurve einen völlig linearen Verlauf. Bei nativen Erythrozyten läßt - wie
bereits er ömmtdie Lage des Knickpunktes Rückschlüsse auf die untersuchung Zelle
zu. Weiterhin ist in der Größe der Steingung nach den knickpunkt in Kurvenverlauf
eine weitere Beurteilungsmöglichkeit für die untersuchte Blutzellart gegeben.