CH640055A5 - Verfahren und vorrichtung zur bestimmung des dielektrischen durchbruches und der groesse von als umhuellung eine membran aufweisenden partikeln. - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich ferner auf eine Vorrichtung zur dabei so beschaffen sein, dass die Bestimmung der vorge-Durchführung des Verfahrens, bei der ein durch eine Zwi- nannten Grössen an einer Vielzahl von Partikeln in schneller schenwandung in Kammern geteilter Behälter aus elektrisch F°'8e durchgeführt werden kann, so dass in kurzer Zeit eine nichtleitendem Material mit in den Kammern angeordneter statistisch hinreichend belegte Aussage über eine Partikelart Elektrode und in der Zwischenwandung vorgesehener Mess- 10 erhalten wird. Es ist ferner Aufgabe der Erfindung, eine Voröffnung vorgesehen ist, wobei eine Kammer mit zumindest ei- richtung zur Durchführung des Verfahrens zu schaffen, ner Öffnung für die Zuführung von Elektrolytlösung und mit Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird bei ei-

einer auf die Messöffnung zur hydrodynamischen Fokussie- nem Verfahren der eingangs bezeichneten Art gemäss der Er-rung gerichteten Zuleitung für die Zuführung der die Parti- findung dadurch gelöst, dass die Partikeln bei ihrem Durch-keln enthaltenden Suspension und eine weitere Kammer mit 15 8anS durch die Messöffnung einem linear ansteigenden elek-zumindest einer Öffnung zum Abfliessen der Elektrolytlösung trischen Feld ausgesetzt werden, wobei die Geschwindigkeit vorgesehen sind und wobei die Elektroden mit einer eine der Partikeln unter Berücksichtigung der Längsabmessung

Spannung bis 100 Volt erzeugenden Einrichtung verbunden der Messöffnung sowie das elektrische Feld und dessen Ansind. stieg derart bemessen werden, dass der dielektrische Durch-

Ein Verfahren zur Bestimmung des dielektrischen Durch- 20 bruch der die Messöffnung einzeln passierenden Partikeln bruches ist beispielsweise aus der DE-AS 25 02 621 bekannt. während ihres Durchganges durch die Messöffnung erfolgt Bei diesem Verfahren werden die Partikeln, beispielsweise und dass zur Ermittlung des dielektrischen Durchbruches die-biologische Zellen, die in einer als Elektrolytlösung dienenden jeni8e Feldstärke bestimmt wird, bei der der durch die Messphysiologischen Flüssigkeit suspendiert sind, an Messöffnun- Öffnung fliessende Strom in seinem Anstieg von der Linearität gen fixiert und eine, an zu beiden Seiten der Messöffnungen 25 abweicht und dass zur Ermittlung der Grösse des die Messangeordneten Elektroden angelegte Spannung so lange er- Öffnung passierenden Partikels die Abweichung des Stromes höht, bis der dielektrische Durchbruch, der an der Änderung von der auf den linearen Anstieg der Spannung zurückzufüh-des Stromflusses erkennbar ist, erfolgt. Die Partikeln, für die renden Stromänderung vor erfolgtem dielektrischen Durch-der dielektrische Durchbruch bestimmt worden ist, müssen bruch und zur Ermittlung der virtuellen Grösse des Partikels sodann von den Messöffnungen durch Absaugen entfernt und 30 die Abweichung des Stromes von der auf den linearen Anstieg neue Partikeln an den Messöffnungen fixiert werden, wonach der Spannung zurückzuführenden Stromänderung nach ereine neue Messung erfolgen kann. Eine Bestimmung der folgtem dielektrischen Durchbruch bestimmt wird.

Grösse beziehungsweise des Volumens der Partikeln ist je- Das Verfahren gemäss der Erfindung erlaubt es somit, in doch auf diese Weise nicht möglich. Es ist jedoch bekannt, die einem einzigen Messvorgang, während dem sich das Partikel Grösse von Partikeln dadurch zu bestimmen, dass die elektri- 35 in der Messöffnung befindet, die zur Bestimmung der vorge-sche Widerstandserhöhung, die durch ein in einer Messöff- nannten Grössen erforderlichen Daten zu messen. Diese Da-nung befindliches Partikel hervorgerufen wird, bestimmt ten werden dabei zweckmässigerweise in einen Rechner einge-

wjr(j _ speist und simultan während des Messvorganges ausgewertet,

Derartige Verfahren dienen beispielsweise dazu, die Be- wobei im Rechner gespeicherte Eichdaten, die an Partikeln schaffenheit der Partikeln, insbesondere auch deren Membra- 40 vorbestimmter Grösse und Beschaffenheit ermittelt worden nen, auch unter Berücksichtigung des Einflusses von Fremd- sind, zur Rechnung herangezogen werden. Bei der Berech-stoffen zu untersuchen. Hierzu gehören beispielsweise die Un- nunS der Grösse der Partikeln sowie der virtuellen Grösse der tersuchung der Wirkung pharmazeutischer Mittel oder der Partikeln, die der Grösse oder zumindest der Beschaffenheit Wirkung von Giften oder von sonstigen Stoffen in für Zellen der intrazellulären Flüssigkeit zugeordnet werden kann, wird von Lebewesen unverträglicher Konzentration oder aber 45 dabei die Abweichung des Stromes von der auf den linearen auch die Untersuchung des Einflusses von Krankheiten auf Anstieg der Spannung zurückzuführenden Stromänderung, die Beschaffenheit lebender Zellen. Dabei werden Informatio- das heisst die Änderung der durch den Spannungsanstieg zu nen über den Zustand und den Aufbau der Membranen sowie erwartenden Stromänderung, als Anstieg desjenigen Anteils über die Grösse der Partikeln erhalten, die beispielsweise im des Stromes ermittelt, der auf den Einfluss des in der Messöff-Bereich der klinischen Anwendung als Aussagen über patho- 50 nung befindlichen Partikels zurückgeht.

logische Zellen von Bedeutung sein können. So kann bei- Eine sehr vorteilhafte Verfahrensvariante des Verfahrens spielsweise die Wirkung von Chemotherapeutika oder Phar- gemäss der Erfindung besteht darin, dass die Partikeln bei ih-mazeutika auf Erythrozyten oder auch Gewebezellen unter- rem Durchgang durch die Messöffnung zunächst einem konsucht werden. stanten elektrischen Feld ausgesetzt werden und dass die

Die bekannten Verfahren sind jedoch sehr langwierig, da 55 durch den Eintritt des Partikels in die Messöffnung hervorge-eine hinreichend genaue Bestimmung der vorgenannten Gros- rufene Stromänderung zur Bestimmung der Grösse des Partisen nur an einzelnen Partikeln möglich ist und eine statistisch kels herangezogen wird. Dabei wird in an sich bekannter begründete Aussage nur bei einer Vielzahl von Messungen ge- Weise die Grösse des Partikels bestimmt, was zu einer Vorgeben ist. So ist es beispielsweise notwendig, um eine verwert- auswahl von Partikeln genutzt werden kann. Denn auf diese bare Aussage über den dielektrischen Durchbrach einer be- 60 Weise ist es möglich, aus einer Vielzahl von durch die Messstimmten Art von Zellen von Lebewesen zu erhalten, zugleich Öffnung geschleusten Partikeln für die Bestimmung der inter-auch die Volumenverteilung der Zellen bei verschiedenen essierenden Grössen nur diejenigen Partikeln heranzuziehen,

Feldstärken zu ermitteln. Bei Anwendung der bekannten Ver- deren Grösse in einen vorgegebenen Grössenbereich fällt. Die fahren ist dies jedoch eine zeitraubende Untersuchung, die es ^ übrigen Partikeln werden dann von der Untersuchung ausge-nicht möglich macht - wie es beispielsweise im Bereich der kli- nommen.

nischen Anwendung wünschenswert sein kann -, in möglichst Unter Berücksichtigung der in der Praxis möglichen kurzer Zeit und mit einer geringeren Zahl von Zellen eine Schnelligkeit von Rechnern hat sich als zweckmässig erwie-

Aussage über pathologische Zellen zu erhalten. sen, dass die Geschwindigkeit der Partikeln durch die Mess-

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Öffnung derart bemessen wird, dass die Partikeln eine Zeitspanne von etwa 20 bis 200 Microsekunden in der Messöffnung verbleiben. Diese, für die Messung der zur Auswertung notwendigen Daten erforderliche Zeitspanne ist gegenüber den bei den bekannten Verfahren benötigten Zeitspannen äusserst gering, so dass bei Anwendung des Verfahrens gemäss der Erfindung schon nach unverhältnismässig kurzer Zeit Ergebnisse vorliegen, die auch statistischen Anforderungen entsprechen. Dabei ist es selbstverständlich möglich, für den Fall, dass die Auswertung in kürzerer Zeit vorgenommen werden kann, eine kürzere Zeitspanne für den Durchlauf der Teilchen durch die Messöffnung zu wählen.

Zur Durchführung des Verfahrens gemäss der Erfindung hat sich eine Vorrichtung der eingangs bezeichneten Art als sehr vorteilhaft erwiesen, die folgende Merkmale aufweist:

a) dass eine zweite Messöffnung zumindest mit einer dieser Messöffnung nachgeschalteten Kammer mit Öffnungen für den Durchfluss von Elektrolytlösung sowie mit in der nachgeschalteten Kammer angeordneter Elektrode vorgesehen ist, wobei die eine Messöffnung zum Durchfluss von Partikeln enthaltender Elektrolytlösung und die zweite Messöffnung zum Durchfluss von von Partikeln freier Elektrolytlösung dient,

b) dass beide Messöffnungen gleiche Abmessungen aufweisen, wobei die Länge der Messöffnungen etwa 50 bis 500 |xm beträgt, und der Durchmesser der Messöffnungen im Bereich von 20 bis 200 |im liegt,

c) dass die Elektroden mit der Einrichtung zur Erzeugung der elektrischen Spannung derart verbunden sind, dass beide Messöffnungen in gleicher Weise von den Stromlinien des elektrischen Feldes durchdrungen werden, wobei die Einrichtung zur Erzeugung der elektrischen Spannung zusätzlich zur Erzeugung eines linearen Anstiegs der Spannung vorgesehen ist,

d) dass die Elektroden mit Einrichtungen zur Bestimmung der über die beiden Messöffnungen fliessenden Ströme und zur Umwandlung der Ströme in Spannungen verbunden sind,

e) dass den Einrichtungen zur Messung und Umwandlung der Ströme in Spannungen eine Einrichtung nachgeschaltet ist, die zum Vergleich der beiden aus den Strömen resultierenden Spannungen und zur Erzeugung eines aus den beiden Spannungen gebildeten Differenzsignals und zur Weitergabe des Differenzsignals an eine der Weiterverarbeitung des Signals dienenden Einrichtung vorgesehen ist.

f) und dass ferner eine mit der Einrichtung zur Erzeugung der an den Elektroden angelegten Spannung und mit der Einrichtung zur Bildung des Differenzsignals in Verbindung stehende Steuereinrichtung vorgesehen ist, die nach der beim Eintritt eines Partikels in die eine der Messöffnungen erfolgten Stromänderung den linearen Anstieg der an den Elektroden angelegten Spannung und nach einer vorgegebenen Zeitspanne ein Einstellen der ursprünglich an den Elektroden anliegenden Spannung bewirkt.

Bei der Verwendung der Vorrichtung gemäss der Erfindung wird zusätzlich zu dem Strom- beziehungsweise Spannungssignal, das an der eigentlichen, von den Partikeln durchströmten Messöffnung gewonnen wird, an einer zweiten Messöffnung, die jedoch während des Messvorganges von Partikeln freibleibt, ein Referenzsignal gewonnen, wodurch apparativ bedingte Fehlerquellen ausgeschaltet werden. Dabei ist davon auszugehen, dass sich die Messbedingungen in beiden Behältern entsprechen. Auch sollen die Messöffnungen gleiche Abmessungen aufweisen, wobei davon auszugehen ist, dass die Länge der Messöffnung etwa 50 bis 500 (im beträgt und der Durchmesser der Messöffnung im Bereich von 20 bis 200 [im liegt, im übrigen je nach der Art der zu untersuchenden Partikeln gewählt wird.

Eine zweckmässige Weiterausgestaltung der Vorrichtung gemäss der Erfindung besteht darin, dass die Steuereinrichtung zusätzlich so ausgelegt ist, dass sie nach Eintritt eines Partikels in die eine der beiden Messöffnungen zunächst ein s Gleichbleiben der an den Elektroden angelegten Spannung bewirkt und erst nach einer vorbestimmten Verzögerungszeit den linearen Anstieg der Spannung auslöst. Mittels dieser Ausführungsform der Vorrichtung gemäss der Erfindung ist es möglich, die Verfahrensvariante durchzuführen, nach der io nur Partikeln der Messung zugeführt werden, deren Durchmesser in einen vorgegebenen Bereich fällt.

Eine sehr vorteilhafte Weiterausgestaltung der Vorrichtung gemäss der Erfindung besteht ausserdem darin, dass eine mit der Einrichtung zur Erzeugung der an den Elektroden an-15 gelegten Spannung, mit der Einrichtung zur Bildung des Differenzsignals sowie mit der Steuereinrichtung in Verbindung stehende Einrichtung vorgesehen ist, die für den Fall, dass die für den Durchgang von Partikeln vorgesehene Messöffnung frei von Partikeln ist, ein vorgegebenes Wechselspannungssi-20 gnal einer Frequenz im Bereich von 1 bis 10 kHz erzeugt und der an den Elektroden angelegten Spannung überlagert und zugleich einen derartigen Abgleich der Einrichtung zur Bildung des Differenzsignals bewirkt, dass aufgrund der an den Elektroden angelegten Wechselspannung kein Differenzsi-25 gnal erzeugt wird. Dabei ist zweckmässig, dass die Wechselspannung eine sinusförmige Wechselspannung ist. Mittels einer derartigen Einrichtung werden die in dem Behältersystem auftretenden und unvermeidlichen Temperaturschwankungen durch eine ständige Kontrolle kompensiert, so dass die ef-30 fektive Temperaturdrift weniger als 0,005 °C beträgt. Auf diese Weise wird erreicht, dass die durch Störungen im System hervorgerufene relative Widerstandsänderung an beiden Messöffnungen nicht mehr als 0,0001 beträgt.

Ein Ausführungsbeispiel der Vorrichtung gemäss der Er-35 findung ist in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im folgenden näher erläutert. Es zeigen

Figur 1 eine Darstellung des Behälterssystems der Vorrichtung in Verbindung mit einem Blockdiagramm der elektrischen Einrichtungen 40 Figur 2 ein Blockdiagramm der Vorrichtung gemäss der Erfindung mit einer Einrichtung zum Nullabgleich des Differenzsignals

Figur 3 eine Darstellung des Behältersystems mit einem Schaltungsbeispiel der elektrischen Einrichtungen

Figur 4 Darstellung der während eines Messvorganges an den Elektroden angelegten Spannung sowie der aus der Stromänderung resultierenden Spannung.

Bei der in Figur 1 dargestellten Ausführungsform der Vorrichtung ist Behälter 1 in drei voneinander getrennte 50 Kammern 2,3 und 4 unterteilt. Dabei sind in der Zwischenwandung, die die Kammer 2 von den Kammern 3 und 4 trennt, Messöffnungen 5a und 5b so angeordnet, dass sie die Kammern 3 und 4 mit der Kammer 2 verbinden. Die Kammer 2 weist einen Leitungsanschluss 6 für die Zuführung von 55 Elektrolytlösung und die Kammern 3 und 4 jeweils einen Leitungsanschluss 7a beziehungsweise 7b auf, über die die Elektrolytlösung abfliesst. Zur Zuführung von die Partikeln enthaltender Suspension ist ferner eine Leitung 8 vorgesehen, die auf die Messöffnung 5a gerichtet ist, so dass die Partikeln 60 zentriert durch die Messöffnung 5a gelangen. Die Strömung der Elektrolytlösung kann dabei dadurch eingestellt werden, dass Elektrolytlösung und Suspension unter Druck in die Kammer 2 eingeleitet oder aber Elektrolytlösung aus den Kammern 3 und 4 abgesaugt wird. In die Kammern ragen fer-65 ner Elektroden 9,9a und 9b hinein.

Nach dem in Figur 1 dargestellten Blockdiagramm stehen die Elektroden 9,9a und 9b mit elektrischen Einrichtungen in

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Verbindung, von denen der Funktionsgenerator 10 zur Erzeugung einer konstanten sowie einer sägezahnartig verlaufenden Spannung dient, die beim Durchgang eines Partikels durch die Messöffnung 5a an die Elektroden angelegt wird. Diese an die Elektroden angelegte Spannung führt zu einer entsprechenden elektrischen Feldstärke in den Messöffnungen 5a und 5b. Den Elektroden 9a und 9b ist ferner eine Einrichtung 11 nachgeschaltet, die aus zwei Stromspannungswandlern besteht. Von diesen werden die erzeugten Spannungssignale an einen nachgeschalteten Differenzverstärker 12 gegeben, der von dem der Messöffnung 5a zugehörigen Spannungssignal das der Messöffnung 5b zugehörige Spannungssignal subtrahiert. Das dadurch gebildete Differenzsignal wird sodann an einen Analog-Digital-Wandler 13 und von da an einen Rechner 14 weitergeleitet.

Bei Eintritt eines Partikels in die Messöffnung 5a resultiert aus der Widerstandsänderung in der Messöffnung ein Strom beziehungsweise (nach der Umwandlung in dem Stromspannungswandler 11) eine Spannungsänderung, die an den Differenzverstärker 12 und von diesem ausser an den Analog-Digital-Wandler 13 auch an eine Steuereinrichtung 15 weitergeleitet wird, welche den Analog-Digital-Wandler einschaltet und nach einer vorbestimmten Verzögerungszeit die von dem Funktionsgenerator 10 erzeugte Sägezahnspannung startet. Nach einer vorgegebenen Zeit kehrt die Spannung auf ihren Ausgangswert zurück, wonach der Analog-Digital-Wandler (über die Steuereinrichtung 15) wieder abgeschaltet wird. Die Vorrichtung gemäss der Erfindung ist nun wieder bereit für die Messung eines weiteren, die Messöffnung 5a passierenden Partikels.

Gegenüber der in Figur 1 dargestellten Ausführungsform der Vorrichtung weist die in Figur 2 als Blockdiagramm (das Behältersystem einschliesslich der Elektroden ist in diesem Fall als Block dargestellt) dargestellte Vorrichtung zusätzlich eine Einrichtung 16 auf, die dem Nullabgleich der das Differenzsignal erzeugenden Einrichtung dient. Dazu wird, ausgelöst von der Steuereinrichtung 15, für die Zeitspanne, in der kein Partikel die Messöffnung 5a passiert, der vom Funktionsgenerator 10 erzeugten konstanten Spannung eine hochfrequente Wechselspannung von beispielsweise 3 kHz überlagert. Beim Auftreten eines aus der Wechselspannung resultierenden Differenzsignals wird der Differenzverstärker 12 so abgeglichen, dass kein Differenzsignal mehr auftritt. Sobald jedoch ein Partikel in die Messöffnung 5a eintritt, wird das hieraus resultierende Spannungssignal, das sich aus der Stromänderung ergibt, von der Steuereinrichtung 15 aufgenommen und die von der Einrichtung 16 erzeugte Wechselspannung abgeschaltet und somit der automatische Null-punktabgleich beendet.

In der in Figur 3 gegebenen Darstellung sind die in den Figuren 1 und 2 mit 11,12 und 16 gezeichneten elektrischen Einrichtungen schaltungsmässig angegeben. Das in Figur 1 näher beschriebene Behältersystem ist dabei als aus zwei getrennten Behältern bestehend schematisch dargestellt. Wie aus Figur 3 hervorgeht, sind die Elektroden 9 über Abgleichwiderstände 17 und 18 mit dem Funktionsgenerator 10 verbunden. Der Abgleichwiderstand 17 ist regelbar bis 5 kQ, der Abgleichwiderstand 17 beträgt 2,5 kQ. Die aus zwei Strom-Spannungs-Wandlern bestehende Einrichtung 11 weist 2 Operationsverstärker 19 der Bezeichnung Intersil 2525 auf, die mit justierbaren Gleichstrom-Kompensatoren 20 von je 5 MQ verbunden sind. Die Operationsverstärker sind ausserdem zur Frequenzanpassung durch Trimmkondensatoren 21 von je 60 pF überbrückt. Die Widerstände 22 von je 35 kQ liefern den notwendigen Rückkoppelstrom.

In der Verbindungsleitung zwischen der Einrichtung 11 und der Einrichtung 12, die der Bildung des Differenzsignals dient, sind zur Wechselstromkopplung Kompensatoren 23

von je 1 (iF sowie Widerstände 24 von je 11 kQ vorgesehen. Diesen ist ein Differenzverstärker 25 der Bezeichnung Intersil 2525 mit einem zur Rückkopplung dienenden Widerstand 26 von 110 kQ nachgeschaltet.

5 Die Einrichtung 16, die dem Nullabgleich des Differenzsignales dient, weist einen in elektrischer Verbindung mit dem Differenzverstärker 25 stehenden Phase-Lock-Verstärker 16b und einen die hochfrequente Wechselspannung liefernden Generator 16a auf. Der Phase-Lock-Verstärker 16b ist dabei io über einen CMOS-FET 27 und einen hierzu in Serie geschalteten Widerstand 28 von 110 kQ mit einem der Eingänge des Differenzverstärkers 25 verbunden. Der Phase-Lock-Verstärker 16b steht über einen FET-Schalter (MC 140 16 CP) mit der Steuereinrichtung 15 in elektrischer Verbindung. In dieser 15 Schaltungsanordnung gelangt die vom Wechselspannungsgenerator 16a gelieferte Wechselspannung über die Messöffnungen 5a und 5b, wo jede Abweichung vom Nullabgleich zu phasenungleichen Signalen führt, was wiederum zur Folge hat, dass im Differenzverstärker 25 ein von Null unterschied-20 liches Differenzsignal gebildet wird. Dieses Signal gelangt in den Phase-Lock-Verstärker 16b, der die phasenabhängige, gleichgerichtete Wechselspannung integriert, bis die Spannung am «gate» des FET 27 so gross ist, dass der Differenz-stärker 25 phasengleiche Signale erhält. Das integrale Aus-25 gangssignal des Phase-Lock-Verstärkers 16b wird somit benutzt, um die Abweichung vom Nullabgleich durch Veränderung der Verstärkung im nichtinvertierenden Teil des Differenzverstärkers 25 mit Hilfe des FET 27 der im wesentlichen als elektrisch angepasster Widerstand benutzt wird, zu kom-30 pensieren. Sobald sich ein Partikel in der Messöffnung 5a befindet, und die Steuereinrichtung 15 das durch die Widerstandsänderung in der Messöffnung bedingte Signal erhält, werden der Wechselspannungsgenerator 16a und die Ab-gleichsautomatik abgeschaltet.

In Figur 4 ist im oberen Teil des Diagramms der zeitliche Verlauf der während eines Messvorganges an den Elektroden angelegten Spannung und im unteren Teil des Diagramms der Verlauf des Differenzsignals wiedergegeben. Aus dieser Darstellung ist erkennbar, dass zum Zeitpunkt 0, nämlich beim 40 Eintritt des Partikels in die Messöffnung, das Differenzsignal zu steigen beginnt. Über die Steuereinrichtung 15 wird dann die vom Generator 16a erzeugte Wechselspannung abgeschaltet und zunächst die an den Elektroden anliegende Spannung konstant gehalten. In diese Phase kann durch Pulshöhenana-45 lyse die Grösse des Partikels bestimmt werden, um entweder nur Partikel bestimmter Grösse für die weitere Analyse zuzulassen oder um Koinzidenzen auszuschalten. Erst nach 32 irsec wird im dargestellten Fall der vom Funktionsgenerator 10 erzeugte lineare Anstieg der Spannung gestartet. Wie aus 50 der Darstellung hervorgeht, folgt der Verlauf des Differenzsignals diesem Anstieg, bis bei erfolgtem dielektrischen Durchbruch - bei noch immer gleichbleibendem Anstieg der an den Elektroden angelegten Spannung - sich der Anstieg des Differenzsignals verringert. Nach 112 (xsec fällt die Spannung auf 55 den ursprünglichen Wert ab, so dass nach etwa 130 psec auch die vom Differenzverstärker 25 gelieferte Spannung auf ihren ursprünglichen Wert abgefallen ist. Der Wechselspannungsgenerator 16a sowie die Abgleichautomatik werden sodann wieder eingeschaltet.

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Ausführungsbeispiel In einer Vorrichtung der in den Figuren 2 und 3 wiedergegebenen Ausführungsform, bei der die Messöffnungen einen Durchmesser von 70 (am und eine Länge von 150 |im besas-65 sen, wurden Erythrozyten aus 1,6 ml menschlichem Blut, das mit einer aus 0,4 ml 3,8%-Tri-Natriumcitrat-5,5-Hydrat bestehenden Lösung als Antikoagulans versetzt worden war, untersucht.

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20 pi der vorgenannten Lösung wurden zu 10 ml einer isotonen phosphatgepufferten 138 mMol/lNaCl, 12,3 mMol/1 Na2HP04 und 2,7 mMol/1 NaH2P04 enthaltenden Lösung, die eine Leitfähigkeit von 0,0158 fì ~1 cm-1 aufwies, gegeben.

Zur Ermittlung der Eichdaten wurden Latexteilchen bekannten Durchmessers eingesetzt.

Es wurden etwa 105 Messvorgänge ausgewertet. Dabei wurden aus dem Anstieg des Differenzsignals vor dem dielektrischen Durchbruch die Grössenverteilung der Erythrozyten ermittelt. Aus dieser Verteilung wurde für die am häufigsten vorkommende Grösse unter Berücksichtigung des vorgegebenen Formfaktors von f = 1,09 das häufigste Volumen der Erythrozyten zu 85,1 p.m3 berechnet. Aus dem Verhältnis der Steigungen des Differenzsignales vor und nach dem dielektrischen Durchbruch ergab sich der Umrechnungsfaktor für das virtuelle häufigste Volumen der Erythrozyten zu 0,613 und damit ein fiktives Volumen von 52,2 |xm3.

Die kritische Potentialdifferenz über den Partikeln, die zum dielektrischen Durchbruch führt, wurde für den Zeitpunkt des Schnittpunktes der beiden Steigungen des Differenzsignales ermittelt. Diesem Schnittpunkt entspricht die kritische Feldstärke E in der Messöffnung, aus der mit Hilfe der integrierten Laplacegleichung unter Verwendung des Formfaktors f der Erythrozyten sowie der grossen Halbachse a die Potentialdifferenz Vmc aus der Beziehung

Vmc= fa E

errechnet wurde. Dabei ist für das häufigste Volumen der Erythrozyten (85,1 um3)

f= 1,09

a = 6,6 Jim und E = 1112 V/cm.

Das fiktive Volumen der Erythrozyten kann zur Berech-5 nung weiterer Grössen dienen, beispielsweise dazu, die Menge an Hämoglobin pro Zelle zu errechnen. Dies deshalb, weil der Zellinhalt von Erythrozyten im wesentlichen aus Hämoglobin besteht. Zur Ermittlung des zur Umrechnung erforderlichen Umrechnungsfaktors wurde daher aus 20 verschiede-io nen Blutproben der Hämoglobingehalt von Erythrozyten fotometrisch nach der Hämoglobin-Cyanit-Methode bestimmt. Der Umrechnungsfaktor ergab sich dabei zu 0,719 Hämoglobingehalt in pg pro Erythrozyt.

Die Zahl der Zellen, die sich aus dem Durchfluss eines be-15 stimmten Suspensionsvolumens der vorgenannten Suspension durch die Messöffnung ergab, betrug 34437 in 5,33 |il, was (unter Berücksichtigung eines Verdünnungsfaktors von 625,25) 4,5 Mio Zellen pro p.1 ergab. Die Hämoglobinkonzentration errechnete sich zu 15,2 g/100 ml.

20 Es wurden ferner als Ghostzellen zu bezeichnende Erythrozyten, die bereits dem dielektrischen Durchbruch unterworfen worden waren und deren intrazelluläre Flüssigkeit durch ein Medium der gleichen Leitfähigkeit wie das äussere Medium ausgetauscht worden war, untersucht. Die Untersu-25 chung dieser Erythrozyten führte dabei zu dem Ergebnis, dass das Differenzsignal nach erfolgtem dielektrischem Durchbruch parallel zur Zeitachse verlief, womit gezeigt wurde,

dass es bei Anwendung des Verfahrens gemäss der Erfindung möglich ist, die Leitfähigkeit innerhalb von Partikeln zu be-30 stimmen.

C

2 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

640 055 2 PATENTANSPRÜCHE b) dass beide Messöffnungen gleiche Abmessungen auf-

1. Verfahren zur Bestimmung des dielektrischen Durch- weisen, wobei die Länge der Messöffnungen 50 bis 500 um be-bruches von in einer Elektrolytlösung suspendierten, als Um- trägt, und der Durchmesser der Messöffnungen im Bereich hüllung eine Membran aufweisenden Partikeln, sowie zur Be- von 20 bis 200 |im liegt,

Stimmung der Grösse der Partikeln und der virtuellen Grösse s c) dass die Elektroden (9,9a, 9b) mit der Einrichtung ( 10) der durch erfolgten dielektrischen Durchbruch veränderten zur Erzeugung der elektrischen Spannung derart verbunden Partikeln, wobei die Partikeln zur Bestimmung ihrer Grösse sind, dass beide Messöffnungen (5a, 5b) in gleicher Weise von in eine von der Elektrolytlösung durchströmte und von den Stromlinien des elektrischen Feldes durchdrungen wer-Stromlinien eines elektrischen Feldes durchdrungene Mess- den, wobei die Einrichtung (10) zur Erzeugung der elektri-öffnung gegeben werden, wobei zur Erzeugung des elektri- io sehen Spannung zusätzlich zur Erzeugung eines linearen Ansehen Feldes an auf verschiedenen Seiten der Messöffnung in stiegs der Spannung vorgesehen ist.

die Elektrolytlösung ragenden Elektroden eine Spannung an- d) dass die Elektroden (9a, 9b) mit Einrichtungen ( 11 ) zur gelegt ist und wobei zur Bestimmung der Grösse der Partikeln Bestimmung der über die beiden Messöffnungen fliessenden die Stromänderung gemessen wird, die als Folge der durch Ströme und zur Umwandlung der Ströme in Spannungen ver-

das Partikel in der Messöffnung bewirkten Widerstandsände- 15 bunden sind.

rung auftritt, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikeln bei e) dass den Einrichtungen (11) zur Messung und Um-

ihrem Durchgang durch die Messöffnung (5a) einem linear Wandlung der Ströme in Spannungen eine Einrichtung ( 12)

ansteigenden elektrischen Feld ausgesetzt werden, wobei die nachgeschaltet ist, die zum Vergleich der beiden aus den Strö-

Geschwindigkeit der Partikeln unter Berücksichtigung der men resultierenden Spannungen und zur Erzeugung eines aus

Längsabmessung der Messöffnung sowie das elektrische Feld 20 den beiden Spannungen gebildeten Differenzsignals und zur und dessen Anstieg derart bemessen werden, dass der dielek- Weitergabe des Differenzsignals an eine der Weiterverarbei-

trische Durchbruch der die Messöffnung (5a) einzeln passie- tung des Signals dienenden Einrichtung (14) vorgesehen ist,

renden Partikeln während ihres Durchganges durch die Mess- f) und dass ferner eine mit der Einrichtung ( 10) zur Erzeu-

öffnung erfolgt und dass zur Ermittlung des dielektrischen gung der an den Elektroden angelegten Spannung und mit Durchbruches diejenige Feldstärke bestimmt wird, bei der der 25 der Einrichtung (12) zur Bildung des Differenzsignals in Ver-

durch die Messöffnung fliessende Strom in seinem Anstieg bindung stehende Steuereinrichtung (15) vorgesehen ist, die von der Linearität abweicht und dass zur Ermittlung der nach der beim Eintritt eines Partikels in die eine der Messöff-

Grösse des die Messöffnung passierenden Partikels die Ab- nungen (5a) erfolgten Stromänderung den linearen Anstieg weichung des Stromes von der auf den linearen Anstieg der der an den Elektroden angelegten Spannung und nach einer

Spannung zurückzuführenden Stromänderung vor erfolgtem 30 vorgegebenen Zeitspanne ein Einstellen der ursprünglich an dielektrischen Durchbruch und zur Ermittlung der virtuellen den Elektroden anliegenden Spannung bewirkt.

Grösse des Partikels die Abweichung des Stromes von der auf 5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeich-

den linearen Anstieg der Spannung zurückzuführenden net, dass die Steuereinrichtung (15) zusätzlich so ausgelegt ist,

Stromänderung nach erfolgtem dielektrischen Durchbruch dass sie nach Eintritt eines Partikels in die eine der beiden bestimmt wird. 35 Messöffnungen (5a) zunächst ein Gleichbleiben der an den

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Elektroden (9,9a, 9b) angelegten Spannung bewirkt und erst dass die Partikeln bei ihrem Durchgang durch die Messöff- nach einer vorbestimmten Verzögerungszeit den linearen An-nung (5a) zunächst einem konstanten elektrischen Feld ausge- stieg der Spannung auslöst.

setzt werden und dass die durch den Eintritt des Partikels in 6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekenn-

die Messöffnung hervorgerufene Stromänderung zur Bestim- 40 zeichnet, dass eine mit der Einrichtung (10) zur Erzeugung der mung der Grösse des Partikels herangezogen wird. an den Elektroden (9,9a, 9b) angelegten Spannung, mit der

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn- Einrichtung (12) zur Bildung des Differenzsignals sowie mit zeichnet, dass die Geschwindigkeit der Partikeln durch die der Steuereinrichtung (15) in Verbindung stehende Einrich-Messöffnung (5a) derart bemessen wird, dass die Partikeln tung (16) vorgesehen ist, die für den Fall, dass die für den eine Zeitspanne von 20 bis 200 Microsekunden in der Mess- 45 Durchgang von Partikeln vorgesehene Messöffnung (5a) frei Öffnung verbleiben. von Partikeln ist, ein vorgegebenes Wechselspannungssignal

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach ei- einer Frequenz im Bereich von 1 bis 10 kHz erzeugt und der nem der Ansprüche 1 bis 3, bei der ein durch eine Zwischen- an den Elektroden angelegten Spannung überlagert und zu-wandung in Kammern geteilter Behälter aus elektrisch nicht- gleich einen derartigen Abgleich der Einrichtung (12) zur Bil-leitendem Material mit in den Kammern angeordneter Elek- 50 dung des Differenzsignals bewirkt, dass aufgrund der an den trode und in der Zwischenwandung vorgesehener Messöff- Elektroden angelegten Wechselspannung kein Differenzsi-nung vorgesehen ist, wobei eine Kammer mit zumindest einer gnal erzeugt wird.

Öffnung für die Zuführung von Elektrolytlösung und mit ei- 7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich-

ner auf die Messöffnung zur hydrodynamischen Fokussie- net, dass die Wechselspannung eine sinusförmige Wechsel-

rung gerichteten Zuleitung für die Zuführung der die Parti- 55 Spannung ist.

kein enthaltenden Suspension und eine weitere Kammer mit zumindest einer Öffnung zum Abfliessen der Elektrolytlösung

vorgesehen sind und wobei die Elektroden mit einer eine

Spannung bis 100 Volt erzeugenden Einrichtung verbunden Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestim-

sind, dadurch gekennzeichnet, 60 mung des dielektrischen Durchbruches von in einer Elektro-

a) dass eine zweite Messöffnung (5b) zumindest mit einer lytlösung suspendierten, als Umhüllung eine Membran auf-

dieser Messöffnung nachgeschalteten Kammer (4) mit Öff- weisenden Partikeln, sowie zur Bestimmung der Grösse der nungen (6,7b) für den Durchfluss von Elektrolytlösung sowie Partikeln und der virtuellen Grösse der durch erfolgten di-

mit in der nachgeschalteten Kammer (4) angeordneter Elek- elektrischen Durchbruch veränderten Partikeln, wobei die trode (9b) vorgesehen ist, wobei die eine Messöffnung (5a) 65 Partikeln zur Bestimmung ihrer Grösse in eine von der Elek-

zum Durchfluss von Partikeln enthaltender Elektrolytlösung trolytlösung durchströmte und von Stromlinien eines elektri-

und die zweite Messöffnung (5b) zum Durchfluss von von sehen Feldes durchdrungene Messöffnung gegeben werden,

Partikeln freier Elektrolytlösung dient, wobei zur Erzeugung des elektrischen Feldes an auf verschie-

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denen Seiten der Messöffnung in die Elektrolytlösung ragen- Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen,

den Elektroden eine Spannung angelegt ist und wobei zur Be- das es ermöglicht, in einem einzigen Messvorgang an einem Stimmung der Grösse der Partikeln die Stromänderung ge- Partikel den dielektrischen Durchbruch, die Grösse des Partimessen wird, die als Folge der durch das Partikel in der Mess- kels sowie die virtuelle Grösse des Partikels nach erfolgtem Öffnung bewirkten Widerstandsänderung auftritt. s dielektrischen Durchbruch zu bestimmen. Das Verfahren soll