DE10202094A1

DE10202094A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Elektroporation biologischer Zellen

Info

Publication number: DE10202094A1
Application number: DE10202094A
Authority: DE
Inventors: Ulrich Zimmermann; Vladimir Sukhorukov; Kurt Lucas
Original assignee: Eppendorf SE
Current assignee: Eppendorf SE
Priority date: 2002-01-21
Filing date: 2002-01-21
Publication date: 2003-08-14
Anticipated expiration: 2022-01-22
Also published as: US7358077B2; DE10202094B4; US8465955B2; US20030148524A1; US20080220491A1

Abstract

Es werden Verfahren zur elektrischen Behandlung biologischer Zellen, insbesondere unter Verwendung von elektrischen Feldpulsen beschrieben, mit den Schritten: Anordnung der Zellen (1) an Öffnungen (2) eines festen, planaren Trägerelementes (3), das eine Messkammer (10) in zwei Kompartimente (11, 12) teilt, und zeitweilige Ausbildung eines elektrischen Behandlungsfeldes, das die Zellen durchsetzt, wobei an dem Trägerelement (3) eine Wechselstrom-Impedanzmessung erfolgt und aus dem Ergebnis der Wechselstrom-Impedanzmessung ein Bedeckungsgrad des Trägerelementes und/oder ein Ausheilen der Zellen nach der elektrischen Behandlung erfasst werden. Es werden auch Vorrichtungen zur Umsetzung der Verfahren beschrieben.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur elektrischen Behandlung biologischer Zellen, insbesondere zur Elektroporation oder Elektropermeabilisierung biologischer Zellen, die an einem festen Trägerelement angeordnet sind, und Elektroporationsvorrichtungen zur Durchführung der Verfahren.

Die Technik der Elektroporation (auch Elektropermeabilisierung, -injektion oder -transfektion genannt) stellt ein allgemein bekanntes Mittel zum Einschleusen membranimpermeabler Xenomoleküle (wie z. B. Farbstoffe, Medikamente, Hormone, Proteine, Plasmide usw.) in lebende Zellen oder zur kontrollierten Freisetzung intrazellulärer Stoffe aus den Zellen dar. Die Elektroporation hat eine weite Verbreitung und Anerkennung gefunden, da sie kontrollierbarer, reproduzierbarer und effizienter als andere (chemische oder virale) Methoden zum intrazellulären Transport von Fremdmolekülen ist. Die Technik der Elektroporation basiert auf einem zeitweisen Anstieg der Membranpermeabilität, welcher durch einen reversiblen elektrischen Durchbruch der Plasmamembran von Zellen bewirkt wird, die externen elektrischen Pulsen hoher Intensität und sehr kurzer Dauer (Feldstärken von wenigen kV/cm, Pulsdauern von einigen 10 µsec) ausgesetzt werden. Das angelegte elektrische Feld trennt Ladungsträger über die Zellmembran, so dass ein Transmembranpotential V_g induziert wird. Es ist bekannt, dass der Membrandurchbruch erfolgt, wenn die induzierte Membranspannung V_g bei Raumtemperatur einen Wert von V_g von ungefähr 1 Volt erreicht.

Für frei bewegliche, suspendierte Zellen hängt die induzierte Membranspannung V_g linear von der angelegten Feldstärke E₀ und vom Zellradius a ab und folgt der allgemein bekannten integrierten Laplace-Gleichung:

V_g = 1.5α.E₀.cosθ (1)

wobei θ der Winkel zur Richtung des elektrischen Feldes ist. Setzt man für den Zellradius einen mittleren Wert von z. B. 7 µm ein, kann die minimale kritische Feldstärke E_krit, die für den reversiblen elektrischen Durchbruch der den Elektroden zugewandten Membranbereiche (cos θ = 1) benötigt wird, mit Gleichung (1) berechnet werden: E_krit = V_c/(1.5.a) ≍ 1 kV/cm. Für kleinere Zellen werden entsprechend wesentlich höhere Feldstärken benötigt, um einen elektrischen Durchbruch ihrer Zellmembranen zu erzielen. So ist für Zellen mit einem mittleren Radius von z. B. 3 µm eine minimale kritische Feldstärke E_krit von ca. 2,5 kV/cm nötig. Sobald die Plasmamembran durch den Mechanismus des elektrischen Durchbruchs permeabilisiert wurde, können Fremdmoleküle über Diffusion (oder andere Mechanismen) in die Zelle eindringen oder intrazelluläre Moleküle ins Außenmedium ausfließen. Die theoretisch berechneten Werte für die kritische Feldstärke E_krit stimmen sehr gut mit experimentellen Ergebnissen überein, die in Elektropermeabiliserungsversuchen mit Fluoreszenzfarbstoffen wie z. B. Propidium Iodid oder anderen kleinen Reportermolekülen bestimmt wurden.

Zur effizienten Elektroinjektion von Makromolekülen (Proteine, Plasmide, DNA usw.) in frei suspendierte Zellen werden in der Praxis wesentlich höhere Feldstärken benötigt als die mittels Gleichung (1) berechneten. Die Elektropermeabilisierungsausbeute kann weiterhin durch die Anwendung nicht-physiologischer, schwach leitender Medien mit niedrigem Ionengehalt (und reduzierter Osmolarität) erhöht werden. Allerdings verringern sowohl sehr starke elektrische Felder als auch schwach leitende Medien die Überlebensfähigkeit der Zellen, was bei seltenen und wertvollen Zellen (wie z. B. genetisch veränderte Hybridomazellen oder dendritische Zellen) wiederum die Anzahl der zur Verfügung stehenden Zellen deutlich reduzieren kann. Deshalb sind für Suspensionszellen sehr sorgfältige und zeitaufwendige Optimierungen der Elektropermeabilisierungsprotokolle nötig.

Die Wirkung der Elektroporation auf Zellmembranen kann direkt durch Messung ihres elektrischen Widerstandes (oder der Impedanz) mittels intrazellulärer Elektroden bestimmt werden. Allerdings ist dieses Verfahren bei der Elektroporation von suspendierten Zellen auf ausreichend große Zellen (z. B. Riesenalgen, Xenopus-Oozyten) beschränkt und auf die meisten tierischen und pflanzlichen Zellen, die lediglich eine Größe von wenigen Mikrometern besitzen, nicht übertragbar. Die Anwendung extrazellulärer Elektroden zur Impedanzmessung von Zellsuspensionen setzt eine sehr hohe Zelldichte (d. h. 30-90% cytocrit-Wert (= Zellanteil an der Gesamtsuspension)) voraus. Diese Methode kann nicht zu Messungen in verdünnten Zellsuspensionen (cytocrit < 1%) eingesetzt werden, wie sie bei der Elektroporation an suspendierten Zellen vorgesehen sind.

Es ist bekannt, die Elektroporation an eingebetteten Zellen durchzuführen, die in oder an Mikroporen eines festen Trägerelementes aus einem elektrisch isolierenden Material eingebettet oder angeordnet sind. Die Elektroporation von Festphasen- adsorbierten Zellen besitzt den Vorteil, dass die elektrischen Feldlinien zwischen zwei Elektroden, die auf entgegengesetzten Seiten des Trägerelementes angeordnet sind, gezwungen werden, durch die Poren des Trägerelements und damit durch die Zellen zu fließen. Aus der Praxis sind Vorrichtungen zur Elektroporation von festphasen-adsorbierten Zellen vom Hersteller Equibio, Großbritannien, bekannt.

Beispielsweise in WO 93/03178 wird eine Vorrichtung zur Elektroporation und Elektrofusion adsorbierter biologischer Zellen beschrieben. Es ist eine zylinderförmige Kammer vorgesehen, die durch eine elektrisch isolierende Membran mit durchgehenden Poren in zwei Kompartimente getrennt ist. Durch Ausübung eines Flüssigkeitsdruckes werden suspendierte Zellen in oder an den Poren festgehalten und elektrischen Feldern ausgesetzt, die mit Elektroden in den Kompartimenten erzeugt werden. Diese Technik ermöglicht zwar die Elektroporation und Elektrofusion in hoch- oder niedrig-leitenden Lösungen. Nachteilig ist jedoch, dass die Anordnung der Zellen auf dem Trägerelement und das Ergebnis der elektrischen Behandlung nicht beobachtet oder überprüft werden können. Die aus WO 93/02178 bekannte Vorrichtung ist daher zur Behandlung insbesondere seltener oder wertvoller Zellen unter praktischen Bedingungen ungeeignet. Ein weiterer Nachteil der bekannten Vorrichtung besteht in der Kombination der Kammer mit einem geschlossenen Drucksystem. Der Aufbau der Vorrichtung ist aufwendig und die Handhabung in der Praxis kompliziert.

Von Y. Huang et al. wird in "Sensor and Actuators A", Band 89, 2001, Seiten 242 ff und in US 6 300 108 B1 die Elektroporation einzelner biologischer Zellen in Mikrosystemen und insbesondere die Einführung einer Impedanztechnik beschrieben. In einem Elektroporationschip, der auf der Grundlage von Halbleitermaterialen hergestellt ist, wird die Zelle auf einer Verbindungsöffnung in einer membranförmigen Wand zwischen zwei Kompartimenten durch Ausübung eines Flüssigkeitsdruckes gehalten. In den Kompartimenten sind jeweils Elektroden vorgesehen, mit denen ein Porationsfeld erzeugt werden kann, das die fixierte Zelle durchsetzt. Von Y. Huang et al. wird beschrieben, dass sich der Stromfluss über das Trägerelement verändert, je nach dem, ob die Verbindungsöffnung offen oder von einer intakten oder einer permeabilisierten Zelle besetzt ist. Zur Detektion der Elektroporation erfolgt während der Erzeugung des Porationsfeldes, d. h. während der Permeabilisierung der Zelle, eine Gleichstrommessung und eine Ermittlung von Strom-Spannungs-Verhältnissen.

Das Porationsergebnis kann optisch durch eine transparente Oberseite des Porationschips überwacht werden.

Das von Y. Huang et al. beschriebene System ermöglicht zwar eine Echtzeitbeobachtung des Porationsvorganges. Es ist jedoch für praktische Anwendungen nicht geeignet, bei denen eine Vielzahl biologischer Zellen behandelt werden sollen. Außerdem liefert die Gleichstrommessung lediglich eine Aussage über die Membraneigenschaften während der Elektroporation, ohne eine weitergehende Charakterisierung der behandelten Zelle für ggf. folgende Bearbeitungsschritte zu ermöglichen.

Weiterentwicklungen des Porationschips von Y. Huang et al. werden in WO 01/07585, WO 01/07584 und WO 01/07583 beschrieben. Die Weiterentwicklungen beziehen sich insbesondere auf die Möglichkeit, eine Vielzahl biologischer Zellen gleichzeitig zu behandeln. Die in den genannten WO-Publikationen beschriebene Technik besitzt die folgenden Nachteile. Zur Echtzeitüberwachung des Porationsergebnisses ist eine Strommessung gleichzeitig zur Elektroporation vorgesehen. Im Porationschip sind jeweils zwei Mess- und Porationselektroden vorgesehen, wodurch der Aufbau des Porationschips kompliziert wird. Die Echtzeitüberwachung des Porationsergebnisses ist lediglich auf den Beginn der Poration und die Erkennung irreversibler Schäden an den Zellen gerichtet. Diese Informationen sind jedoch für praktische Anwendungen der Elektroporation bspw. in der Medizin ungenügend. Eine weitere Charakterisierung der Zellen vor oder nach der Elektroporation muss mit optischen Mitteln erfolgen. Eine optische Beobachtung liefert jedoch nur qualitative Einschätzungen.

Generell besteht ein Problem darin, dass bei den herkömmlichen Techniken lediglich der Strom gemessen wird. Die elektrische Messung liefert nur beschränkt auswertbare Aussagen. Eine Spezifizierung von Messparametern, die zuverlässige Messergebnisse liefern, wird nicht gegeben. Das Messobjekt aus Elektrolyt und biologischer Zelle in der Messkammer stellt jedoch ein kompliziertes, durch Kapazitäten und Widerstände charakterisiertes Gebilde dar, das je nach Art der zu behandelnden Zellen andere Messparameter erfordert.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Verfahren zur elektrischen Behandlung biologischer Zellen, insbesondere zur Behandlung biologischer Zellen mit elektrischen Feldpulsen, anzugeben, mit denen die Nachteile der herkömmlichen Verfahren überwunden werden und die insbesondere eine reproduzierbare Echtzeitbeobachtung der gesamten Behandlung einschließlich der Vorbereitungsschritte und/oder des Behandlungsergebnisses ermöglichen. Die Erfindung soll insbesondere eine schnellere und genauere Optimierung von Elektroporationsprotokollen für spezielle Zelltypen ermöglichen. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, Vorrichtungen zur Umsetzung der Verfahren, insbesondere Verfahren zur Behandlung biologischer Zellen mit elektrischen Feldpulsen anzugeben, wobei die Vorrichtungen eine vollständige und reproduzierbare Beobachtung des Behandlungsverfahrens und -ergebnisses ermöglichen sollen.

Diese Aufgaben werden mit einem Verfahren und einer Vorrichtung mit den Merkmalen gemäß den Patentansprüchen 1 oder 8 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Die Grundidee der Erfindung ist es, herkömmliche Verfahren zur elektrischen Behandlung biologischer Zellen, die an einem Trägerelement Festphasen-adsorbiert sind, dahingehend weiter zu entwickeln, dass am Trägerelement eine Wechselstrom-Impedanzmessung zur Ermittlung des Bedeckungsgrades des Trägerelementes und/oder der elektrischen Eigenschaften der Zellen vor oder nach der elektrischen Behandlung erfolgt. Die Wechselstrom-Impedanz ist der komplexe, frequenzabhängige Wechselstromwiderstand des betrachteten Systems, dass resistive, kapazitive und/oder induktive Eigenschaften besitzt. Die genannten Maßnahmen besitzen zwei Gesichtspunkte. Einerseits wird erstmalig eine echte Impedanzmessung durchgeführt, die neben einer Aussage über den elektrischen Widerstand der Zellen vorteilhafterweise zusätzliche Informationen über kapazitive Eigenschaften der Zellen liefert. Die Impedanzmessung besitzt den besonderen Vorteil, frequenzabhängige Messergebnisse zu liefern. Es kann insbesondere in einem Versuch die optimale Messfrequenz ermittelt und/oder eine Messfrequenz verwendet werden, bei der eine minimale Schädigung der vermessenen Zellen oder Zellbestandteile auftritt. Diese Vorteile waren bei herkömmlichen Gleichstrommessungen nicht gegeben. Die Erfinder haben erkannt, dass bei herkömmlichen Messungen kapazitive Einflüsse der Zellen vernachlässigt wurden. Des Weiteren erfolgt die erfindungsgemäße Impedanzmessung nicht während der elektrischen Behandlung, sondern vor oder nach der jeweiligen Ausübung elektrischer Feldpulse auf die Zellen. Es werden reproduzierbare quantitative Parameter der Zellen und des Trägerelementes, insbesondere der Bedeckungsgrad des Trägerelementes, ggf. die Deformation der Zellen im Festphasen- adsorbierten Zustand und das Ergebnis der Zellbehandlung, erfasst. Vorteilhafterweise ist mit erfindungsgemäßen Verfahren die Behandlung einer Vielzahl von Zellen, wie es bspw. in der Biochemie oder Medizin gefordert wird, zelltypspezifisch, reproduzierbar und schonend möglich.

Die erfindungsgemäß behandelten und vermessenen festphasen- adsorbierten Zellen umfassen Zellen, die aus dem suspendierten Zustand auf einen festen Träger, ggf. unter Wirkung eines Flüssigkeitsdruckes, aufgebracht sind oder adhärente Zellen. Adhärente Zellen sind vor der Behandlung und Messung auf dem Trägerelement gewachsen oder kultiviert. Vorteilhafterweise ist die mechanische Vorbelastung von Zellen durch Anlegen eines Unterdrucks zur Erhöhung der Elektropermeabilisierung auch bei adhärenten Zellen möglich.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Wechselstrom-Impedanzmessung bei einer vorbestimmten Messfrequenz, die zelltypspezifisch in Bezug auf die Erfassung eines möglichst ausgeprägten Messsignals optimiert ist. Die Messfrequenz wird vorzugsweise durch einen Vorversuch bestimmt, der die Aufnahme einer Frequenzabhängigkeit der Wechselstrom-Impedanz festphasen-adsorbierter Zellen umfasst. Die Ermittlung einer optimalen Messfrequenz stellt einen wichtigen Vorteil gegenüber der herkömmlichen Gleichstrommessung dar, da erfindungsgemäß die Einstellung möglichst schonender Messparameter ermöglicht wird. Erfindungsgemäß können Messspannungen verwendet werden, deren Amplituden im Vergleich zur herkömmlich verwendeten Messspannung vermindert sind.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zur elektrischen Behandlung biologischer Zellen, insbesondere eine Elektroporationsvorrichtung, die mit einem Wechselstrom-Impedanzmessgerät ausgestattet ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird eine Messkammer durch ein festes Trägerelement mit einer Vielzahl von durchgehenden Öffnungen in zwei Kompartimente geteilt, wobei in jedem Kompartiment eine Elektrode vorgesehen ist, die wahlweise zur Impedanzmessung oder zur elektrischen Behandlung von Zellen auf dem Trägerelement eingerichtet ist. Im Unterschied insbesondere zu den herkömmlichen Porationschips ist vorteilhafterweise in der Messkammer lediglich ein Elektrodenpaar vorgesehen, das für Mess- und Behandlungszwecke doppelt genutzt wird. Gemäß einem weiteren vorteilhaften Gesichtspunkt ist die erfindungsgemäße Vorrichtung nicht mit einem geschlossenen Drucksystem verbunden. Das obere Kompartiment der Messkammer ist dem Umgebungsdruck ausgesetzt.

Die Erfindung besitzt die folgenden Vorteile. Es wird erstmalig ein für die routinemäßige Anwendung elektrischer Behandlungen biologischer Zellen geeignetes Verfahren bereitgestellt. Es können sowohl der Permeabilisierungsgrad der Zellen als auch die Kinetik des Ausheilens der Zellen nach der Behandlung (Resealing) erfasst werden. Durch eine nach der Behandlung andauernde Impedanzmessung kann kontrolliert werden, wie viele Zellen ausheilen. Damit ist eine Kontrolle des Stoffeintritts von der Suspension in die Zellen gegeben. Vorteilhafterweise müssen erfindungsgemäß nicht alle Öffnungen (Poren) des Trägerelementes von Zellen besetzt sein. Die erfindungsgemäße Impedanzmessung ermöglicht auch bei teilweise besetzten Trägerelementen quantitative Aussagen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit Vorteil in weitere standardmäßige Prozeduren zur Zellbehandlung integrierbar. An die elektrische Behandlung kann sich bspw. unmittelbar eine Kultivierung der behandelten Zellen anschließen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht simultan eine elektrische und eine optische Kontrolle des Behandlungsergebnisses und des Ausheilvorganges. Der Aufbau der erfindungsgemäß verwendeten Messkammer ist im Vergleich zu herkömmlichen Vorrichtungen vereinfacht.

Im Gegensatz zu konventionellen Elektropermeabilisierungsmethoden, welche sehr hohe Feldstärken und Eingangsspannungen benutzen, arbeitet das erfindungsgemäße Verfahren ggf. mit mittleren oder sogar geringen Eingangsspannungen. Dies ist dadurch möglich, dass das applizierte Feld durch die erfindungsgemäße Anordnung des Trägerelementes gezwungen wird, durch die in die Poren eingebetteten Zellen hindurchzufließen, was die Aufladung und den Durchbruch der Zellmembran begünstigt. Weiterhin bewirkt der kleine hydrostatische Unterdruck, dem die Zellen ausgesetzt sind, eine Deformation der Zellen in Feldrichtung. Dieser zusätzliche mechanische Stress führt vorteilhafterweise, wie unten illustriert wird, zu einer weiteren Verbesserung der Elektropermeabilisierungsausbeute. Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die Elektropermeabilisierung in physiologischen, d. h. salzreichen, Medien durchgeführt werden kann, wogegen konventionelle Methoden zur Elektropermeabilisierung von Suspensionszellen vor allem in niedrigleitenden Medien durchgeführt werden, da die Permeabilisierung in solchen Medien mit geringerem Ionengehalt effizienter abläuft. Durch den Gebrauch physiologischer Medien in Kombination mit der mechanisch bedingten Unterstützung durch das Trägerelement wird die Überlebensfähigkeit der Zellen nach einer Elektropermeabilisierung signifikant erhöht, ohne die Elektropermeabilisierungsausbeute signifikant zu beeinflussen.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden aus der Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen ersichtlich, die in den beigefügten Zeichnungen illustriert sind. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Teilansicht des Aufbaus einer erfindungsgemäß verwendeten Messkammer,
Fig. 2 eine Schnittansicht einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
Fig. 3 eine mikroskopische Abbildung eines Trägerelements, und
Fig. 4, 5 Kurvendarstellungen zur Illustration erfindungsgemäßer Impedanzmessungen.
Die Erfindung ist generell bei Elektromanipulationstechniken anwendbar, bei denen biologische Zellen oder Zellbestandteile elektrischen Feldpulsen ausgesetzt werden, bspw. um die genannte Permeabilisierung der Zellmembran oder eine anderweitige vorübergehende oder dauerhafte Behandlung der Zelle vorzunehmen. Im Folgenden wird die Erfindung am Beispiel der Elektroporation biologischer Zellen beschrieben, ohne auf diese Anwendung beschränkt zu sein. Für praktische Anwendungen besteht ein Interesse an der gleichzeitigen Behandlung einer Vielzahl von Zellen. Die Erfindung bezieht sich jedoch auch auf den speziellen Anwendungsfall, bei dem lediglich einzelne Zellen der elektrischen Behandlung ausgesetzt werden.
Fig. 1 zeigt in schematischer Schnittteilansicht die Grundbestandteile der Messkammer einer erfindungsgemäßen Elektroporationsvorrichtung. Die Messkammer 10 wird durch ein planares Trägerelement 3 aus einem elektrisch isolierenden Material in zwei Kompartimente 11, 12 geteilt, in denen jeweils entsprechend eine obere Elektrode 4 und eine untere Elektrode 5 angeordnet sind. Die Messkammer 10 ist mit einem Flüssigkeitsleitungssystem und einer Mess- und Steuereinrichtung verbunden, die beispielhaft in Fig. 2 dargestellt sind. Das Trägerelement 3 weist mindestens eine durchgehende Öffnung 2 auf, über die die Kompartimente 11, 12 in Verbindung stehen. Zur Behandlung einer Vielzahl von Zellen sind viele Öffnungen 2 vorgesehen. Allgemein ist eine Zelle 1 auf einer Pore 2 (wie dargestellt) oder auf mehrere Poren verteilt angeordnet. Es kann sich bspw. eine Zelle über rd. 20 bis 50 Poren im Trägerelement 3 erstrecken. Die Zellen sind auf das Trägerelement 3 aus der Suspension oder durch Wachstum aufgebracht.
Die Öffnungen 2 sind wie dargestellt als durchgehende Poren gebildet. Das Trägerelement 3 kann alternativ aus einem an sich porösen Material gebildet sein, dass eine Flüssigkeitsverbindung und somit einen Druckausgleich zwischen den Kompartimenten 11, 12 gewährleistet. Bei der Realisierung durchgehender Öffnungen oder Poren 2 ist das Trägerelement 3 vorzugsweise mit einer ebenen, platten-, scheiben- oder membranförmigen Gestalt gebildet. Bei Verwendung von porösem Material kann das Trägerelement 3 jedoch alternativ volumenförmig gebildet sein. In diesem Fall kann sich die untere Elektrode 5 unmittelbar auf der Unterseite des Trägerelementes 3 befinden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Trägerelement 3 durch einen Membranfilter aus elektrisch hochisolierendem Material gebildet. Es wird bspw. ein kommerziell verfügbarer Membranfilter aus Polycarbonat, Siliziumnitrit oder einem anderen elektrisch isolierenden Material mit einer vorbestimmten Porengröße- und -verteilung verwendet. Es wird vorzugsweise ein Membranfilter mit zylindrischen Mikroporen mit einem Durchmesser gewählt, der kleiner als der Durchmesser der zu behandelnden Zellen 1 ist und bspw. 0.01 µm bis 8 µm beträgt.
Die Elektroden 4, 5 sind optisch zumindest teilweise transparent. Sie bestehen bspw. aus einem Drahtgeflecht, das ggf. auf einem transparenten Träger angebracht ist, oder aus einem transparenten, leitfähigen Material, wie z. B. ITO (Indium-Zinn- Oxid). Die Elektroden 4, 5 können mehrere Aufgaben erfüllen. Sie dienen einerseits als Messelektroden zur Überwachung der Besetzung der Öffnung(en) 2 mit Zellen 1 vor der Elektroporation und zur Kontrolle des Verlaufs der Membranpermeabilisierung und des Ausheilens der Zellmembranen nach Pulsapplikation durch kontinuierliche Impedanzmessungen und anderseits als Porationselektroden zur Applikation elektrischer Feldpulse. Die transparenten Elektroden 4, 5 ermöglichen eine optische Kontrolle der Anordnung der Zellen auf dem Trägerelement 3 und des Verlaufs der Elektroporation. Die optische Kontrolle erfolgt vorzugsweise mit einem über der Messkammer 10 angeordneten Mikroskop unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen.
Weitere Einzelheiten der erfindungsgemäßen Porationsvorrichtung sind in Fig. 2 schematisch dargestellt. Die Messkammer 10 ist in einem Behältnis 13 gebildet, das einen zylindrischen Innenraum 14, ein Flüssigkeitsleitungssystem 15 und elektrische Anschlussleitungen 16 aufweist. Das Behältnis besteht vorzugsweise aus transparentem Kunststoff, z. B. PMMA. Der Innenraum 14 ist durch das Trägerelement 3 in das obere und untere Kompartiment 11, 12 unterteilt. Das Trägerelement 3 erstreckt sich als planare Wand über den Querschnitt der Messkammer 10. Es ist an den Innenwänden des Behältnisses 13 befestigt oder vorzugsweise (wie dargestellt) in das Behältnis 13 eingehängt. Hierzu wird ein zylinderförmiger Gewebekultureinsatz 6 (z. B. Hersteller: Nunc, 25 mm Durchmesser) verwendet, an den als Trägerelement 3 ein Polycarbonatfilter (Porengröße z. B. 8 µm) befestigt ist. Die Elektrode 4 des oberen Kompartimentes 11 wird vorzugsweise ebenfalls in das Behältnis 13 eingehängt oder an dessen oberen Rand lösbar befestigt. Als Elektrode 4 ist bspw. ein Edelstahldrahtgeflecht mit einer Maschenweite von ca. 50 µm an einer Halterung 7 vorgesehen. Die untere Elektrode 5 ist auf dem Boden des Behältnisses 13 angeordnet und wird ebenfalls durch ein Edelstahldrahtgeflecht gebildet. Der senkrechte Abstand der planar aufgespannten Netzelektroden 4, 5 beträgt z. B. 1 mm. Über das Flüssigkeitsleitungssystem 15 ist die Messkammer 10 mit einer schematisch illustrierten Druckeinrichtung verbunden. Mit der Druckeinrichtung 20 wird auf eine in der Messkammer 10 befindliche Flüssigkeit ein geringfügiger Unterdruck ausgeübt. Vorteilhafterweise genügt ein Unterdruck von einigen cm Wassersäule (z. B. 30 mbar) gegenüber dem Umgebungsdruck.
Die Elektroden 4, 5 sind mit einer Mess- und Steuereinrichtung 30 verbunden. Die Einrichtung 30 enthält einen Pulsgenerator 31 und ein Impedanzmessgerät 32, die wahlweise abwechselnd oder gleichzeitig über eine Schalteinrichtung 33 mit den Elektroden 4, 5 verbunden werden. Als Pulsgenerator 31 wird bspw. ein Multiporator (Hersteller: Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) verwendet, der mit einer Mikroprozessor-Einheit gesteuert wird. Der Multiporator erzeugt exponentiell abfallende Feldpulse mit Amplituden bis 1.2 kV und Zeitkonstanten im Bereich von 15 bis 500 µs. Mit der Mikroprozessor-Einheit können die Pulsbedingungen mit hoher Reproduzierbarkeit unabhängig von eventuellen Variationen in der Ionenzusammensetzung des Pulsmediums (der Suspension in der Messkammer) oder Änderungen in der Leitfähigkeit des Mediums eingestellt werden, wie sie durch Ionenflüsse aus dem Cytosol oder durch Zelllyse während der Pulsapplikation auftreten können. Als Impedanzmessgerät 32 wird vorzugsweise ein Impedanz-Analyzer (z. B. HP 4191A, Hersteller: Hewlett Packard, USA) verwendet, mit dem die Impedanz in einem Frequenzbereich von 100 Hz bis 13 MHz gemessen werden kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Schalteinrichtung 33 als Umschalter gebildet, mit dem entweder der Pulsgenerator 31 oder das Impedanzmessgerät 32 mit den Elektroden 4, 5 verbunden wird. Anwendungsabhängig kann jedoch auch eine dauerhafte elektrische Verbindung des Impedanzmessgerätes 32 mit den Elektroden 4, 5 vorgesehen sein, wobei die Schalteinrichtung 33 lediglich der Betätigung des Pulsgenerators 31 und der Ausübung der Feldpulse auf die adsorbierten Zellen 1 dient. Bei dieser Gestaltung kann die Impedanzmessung auch während der Behandlung der Zellen fortgesetzt werden.
Die Umsetzung der Erfindung ist nicht auf die beispielhaft angegebenen Teile der Einrichtung 30 beschränkt. Als Pulsgenerator kann auch ein anderer Generator verwendet werden, der in an sich bekannter Weise die zur jeweiligen Behandlung der Zellen erforderlichen Pulse liefert. Als Impedanzmessgerät kann jede Messeinrichtung, z. B. auf der Basis einer Messbrücke, verwendet werden, die eine vollständige Messung des Wechselstromwiderstandes ermöglicht.
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Behandlung biologischer Zellen kann abweichend von Fig. 2 auch durch ein Behältnis gebildet werden, in dem eine Vielzahl von Messkammern vorgesehen sind. Jede Messkammer ist analog zu Fig. 2 aufgebaut. Die Druck- und Pulsansteuerung der Messkammern kann gemeinsam oder einzeln vorgesehen sein.
Zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Messkammer 10 mit einem Pulsmedium befüllt. Das Pulsmedium ist z. B. eine Salzlösung mit anwendungsabhängig eingestellter Leitfähigkeit. Vorteilhafterweise kann erfindungsgemäß ein isoosmolares Pulsmedium verwendet werden, in dem die elektrische Behandlung der Zellen besonders schonend erfolgt. Anschließend wird von oben eine Suspension der zu behandelnden Zellen einpipettiert. Dies kann vorteilhafterweise durch die obere Elektrode erfolgen. Wenn die Messkammer 10 gemäß einer bevorzugten Gestaltung nach oben offen ist, kann die Zufuhr der Zellsuspension mit jeder an sich bekannten Pipettiereinrichtung erfolgen. Alternativ können die Zellen in einem Vorverfahren auf dem Trägerelement 3 gewachsen sein. Anschließend wird mit der Druckeinrichtung 20 der Unterdruck angelegt, so dass mit der Suspension die Zellen 1 auf das Trägerelement 3 gezogen und dort an den Öffnungen 2 fixiert werden. Unter der Wirkung des Unterdruckes werden die Zellen 1 geringfügig in die Poren 2 hineingezogen (siehe Fig. 1). Fig. 3 zeigt ein Trägerelement 3. Das Trägerelement 3 besitzt bspw. eine Dichte von 10⁸ Öffnungen (oder Poren) pro cm².
Anschließend erfolgt eine Impedanzmessung zur Ermittlung des Bedeckungsgrades des Trägerelementes 3 mit Zellen, die elektrische Behandlung der Zellen durch Porationspulse und die Impedanzmessung zur Beobachtung des Ausheilens der permeabilisierten Zellmembranen. Diese Verfahrensschritte werden im Folgenden unter Bezug auf ein Anwendungsbeispiel illustriert.

Anwendungsbeispiel

Zellen

Die Maus-Myelom-Zelllinie Sp2 wurde im RMPI 1640 Complete Growth Medium (CGM) mit 10% FCS (Fetal Calf Serum, PAA, Linz, Österreich) bei 37°C unter 5% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden durch dreimalige Subkultivierung pro Woche in der exponentiellen Wachstumsphase gehalten. Vor Beginn der Elektropermeabilisierung wurden die Zellen ein- bis zweimal mit Pulsmedium gewaschen und 10 min vor Pulsapplikation im Pulsmedium resuspendiert. Der mittlere Zelldurchmesser wurde durch elektronische Größenbestimmung mittels CASY (Schärfe Systems, Reutlingen, Deutschland) mit ca. 14 µm bestimmt.

Pulsmedien

Als Pulsmedium wurde ein Phosphatpuffer mit 1,15 mM K2HPO4/KH2PO4-Puffer, pH 7,2 verwendet. Als Leitsalz wurde KCl in einer Konzentration von 10 bzw. 30 mM hinzugesetzt. Die Osmolarität wurde durch Zugabe von Inosit auf 290 mOsm eingestellt, um eine isoosmolare Lösung zu erhalten.

Impedanzmessung vor der Elektroporation

Fig. 4A zeigt Impedanzspektren der mit Pulsmedium gefüllten Messkammer mit und ohne Zugabe einer Zellsuspension. Die Messkammer wurde mit einem niedrigleitenden, isoosmolaren Pulsmedium (1,25 mS/cm, 290 mOsm, pH 7,4) befüllt und die Impedanz wurde über den Frequenzbereich von 100 Hz bis 2,5 MHz bestimmt (offene Symbole). Die Impedanz bleibt über einen großen Frequenzbereich (1 kHz-1 MHz) relativ konstant bei einem Wert von ca. 20 Ω. Bei geringeren Frequenzen (< 1 kHz) ist eine deutliche Zunahme der Impedanz mit sinkender Frequenz zu beobachten, welche auf Elektrodenpolarisationsprozesse zurückgeführt wird. Nach Zugabe von 10⁶ Sp2-Zellen und anschließendes Einbetten der Zellen in die Poren 2 mittels des extern angelegten Unterdruckes (ca. 30 mbar) zeigte sich eine deutliche Erhöhung der Impedanz (geschlossene Symbole). Der Unterdruck bleibt während der folgenden Impedanzmessungen erhalten. Die Erhöhung der Impedanz bei Aufbringung der Zellen auf das Trägerelement 3 entspricht der an sich bekannten Erhöhung des Wechselstromwiderstandes zwischen den Elektroden durch eine Unterbrechung der Elektrolytverbindung zwischen den Kompartimenten und den mit Zellen besetzten Poren.
Die Erfinder haben festgestellt, dass die Impedanzerhöhung von der Messfrequenz abhängt. Gemäß einer besonders vorteilhaften Gestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher vor der eigentlichen Behandlung ein Vorversuch vorgesehen, bei dem zelltypspezifisch die optimale Messfrequenz ermittelt wird, für die die Impedanzerhöhung bei Belegung der Poren mit Zellen besonders stark ist. Dementsprechend werden die nachfolgen Messungen bei der vorab ermittelten optimalen Messfrequenz durchgeführt. Es kann auch vorgesehen sein, dass das Impedanzmessgerät auf eine vorbestimmte Messfrequenz eingestellt wird, die als optimaler Wert aus Tabellenwerten oder dergleichen ermittelt wird.
Beim dargestellten Beispiel wurden die nachfolgenden Messungen bei einer Frequenz von 10 kHz durchgeführt, da hier die Differenz zwischen besetzter und unbesetzter Filtermembran und somit die Empfindlichkeit am größten war (Pfeil in Fig. 4A). Der deutliche Anstieg der Impedanz im Frequenzbereich von 10³-10⁵ Hz ist auf die Besetzung der Mikroporen mit Zellen zurückzuführen, die ihrerseits isolierende Eigenschaften (in diesem Frequenzbereich) besitzen und die Porenöffnungen verschließen, so dass der Wechselstromwiderstand der gesamten Anordnung zunimmt.
Fig. 4B zeigt den zeitlichen Verlauf der Besetzung des Trägerelementes 3 mit Zellen 1. Die Kammer wurde mit dem Pulsmedium befüllt und die Impedanz bei 10 kHz gemessen (Z₀ ≍ 19 Ω). Nach 75 s (siehe Pfeil) wurden 10⁶ Zellen zugegeben und in die Porenöffnungen eingebettet (siehe Fig. 4A). Nach diesem Zeitpunkt ist ein kontinuierlicher Anstieg der Impedanz zu beobachten, der nach ca. 6 min in eine Sättigung übergeht (Z_e ≍ 28 Ω). Diese Erhöhung der Impedanz ist auf eine zunehmende Besetzung der Poren mit Zellen zurückzuführen, die bei Z_e ein Maximum erreicht. Der durch die Besetzung der Mikroporen mit Zellen verursachte Impedanzanstieg wird mit ΔZ_c bezeichnet.
Der sigmoidale Verlauf gemäß Fig. 4B entspricht dem Zeitverlauf der Besetzung der Poren 2 mit Zellen 1. Unmittelbar nach Zugabe der Zellen befinden sich nur relativ wenige Zellen in direkter Umgebung der Poren und können diese verschließen, so dass zunächst nur ein geringerer Anstieg der Impedanz zu beobachten ist. Durch den anliegenden Unterdruck werden mit zunehmender Dauer immer mehr Zellen, die sich ursprünglich in entfernteren Bereichen befanden, an die Poren hinbewegt und verschließen diese, was sich in einem schnellen Anstieg des Widerstandes zeigt. Ist schließlich die Membran maximal mit Zellen belegt, erreicht die Impedanz einen Sättigungswert (Z_e). Die Differenz ΔZ_c zwischen diesem Endwert Z_e und dem Startwert Z_o (Kammer ohne Zellen) wird durch die Zugabe der Zellen erzielt und ist somit ein exakt bestimmbares Maß für die Besetzung der Membran mit Zellen, d. h. für den Bedeckungsgrad des Trägerelementes. Der Bedeckungsgrad entspricht dem Anteil der Poren, die mit Zellen besetzt sind. Bei maximaler Bedeckung beträgt der Bedeckungsgrad 1.
Es wird darauf hingewiesen, dass die erfindungsgemäß ermittelte Wechselstrom-Impedanz allgemein eine komplexe Größe ist. Der in den Figuren illustrierte Absolutwert der Impedanz enthält sowohl Amplituden- als auch Phaseninformationen. Entsprechend ist er als physikalische Messgröße von herkömmlich gemessenen Strom- Spannungs-Verhältnissen zu unterscheiden.
Anwendungsabhängig ist bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, den Bedeckungsgrad des Trägerelementes 3 durch Ermittlung der Gesamtkinetik, die in Fig. 4B dargestellt ist, oder durch Messung einer aktuellen Impedanz und Berechnung der aktuellen Bedeckung aus diesem Impedanzwert und Vergleichswerten vorgesehen. Aus dem Bedeckungsgrad und geometrischen Parametern des verwendeten Trägerelementes kann die Zahl der nachfolgend durch Elektroporation behandelten Zellen ermittelt werden.

Impedanzmessung während oder nach der Elektroporation

In den Fig. 5A und 5B sind die Impedanzmessungen während und nach der Elektroporation illustriert. Im linken Teil von Fig.5A ist die Impedanzerhöhung durch die in Fig. 4B illustrierte Besetzung der Poren gezeigt. Nachdem die maximale Besetzung der Poren erreicht war, wurde die Impedanzmessung kurzfristig unterbrochen und mit dem Pulsgenerator 31 (siehe Fig. 2) ein Puls von 1 kV/cm Feldstärke und 40 µs Pulsdauer appliziert (siehe Pfeil). Die Impedanzmessung wurde fortgesetzt und es konnte zunächst eine deutliche Abnahme des Widerstandes unmittelbar nach Pulsapplikation beobachtet werden. Dies lässt sich durch den Verlust der isolierenden Eigenschaften der Zellen, der durch den pulsinduzierten Durchbruch der Zellmembranen hervorgerufen wird, erklären. Somit besteht mit der erfindungsgemäßen Elektroporationsvorrichtung die Möglichkeit, den elektrischen Membrandurchbruch mittels Impedanzmessung im Sekundenbereich quantitativ zu erfassen. Die Impedanz nahm im weiteren Verlauf, einer exponentiellen Kinetik folgend, wieder kontinuierlich zu, bis nach ca. 2 min der ursprüngliche Wert wieder nahezu erreicht wurde. Diese Resealing- oder Ausheilkinetik kann mit einer exponentiellen Sättigung erster Ordnung beschrieben werden, so dass die maximale pulsinduzierte Impedanzänderung ΔZ_Puls über eine Extrapolation relativ exakt bestimmt werden kann. Der Anstieg der Impedanz auf nahezu den Wert vor Pulsapplikation spiegelt das Resealing der Zellen wieder, d. h. in dieser Zeit heilen die Membranstörungen der Zelle aus und sie weist wieder isolierende Eigenschaften auf, was sich im Anstieg des Widerstandes zeigt. Des Weiteren kann aus dem Impedanzverlauf auch der Anteil von ggf. irreversibel permeabilisierten, d. h. toten Zellen ermittelt werden. Durch die kombinierte Impedanz- und Puls-Anordnung ist es also möglich, den gesamten Verlauf der Elektropermeabilisierung quantitativ in einer einzigen Kammer über einen relativ langen Zeitraum zu messen. Die Impedanzkinetiken oder zumindest einzelnen Impedanzwerte, die mit Referenzwerten in Bezug gesetzt werden, charakterisieren das Ausheilen der Zellen.
Fig. 5B zeigt den Einfluss der Feldstärke auf die pulsinduzierte Impedanzänderung: es wurden Elektroporationsexperimente mit Pulsdauern von 40 µs und Feldstärken von 0,3 bis 2,2 kV/cm in Pulsmedien unterschiedlicher Ionenzusammensetzung (10 mM KCl (1,25 mS/cm; offene Symbole) bzw. 30 mM KCl (3,5 mS/cm; geschlossene Symbole)) durchgeführt und ausgewertet (siehe oben). Die so ermittelten Werte für die pulsinduzierte Impedanzänderung ΔZ_Puls wurden auf die jeweilige Impedanz des mit Zellen besetzten Membranfilters ΔZ_c normiert. Aufgetragen sind die Mittelwerte dieser normierten pulsinduzierten Impedanzänderungen (± Standardfehler) aus jeweils 3 bis 5 Experimenten. Es ist eine Zunahme der Werte mit steigender Feldstärke zu beobachten, die auf eine zunehmende Anzahl permeabilisierter Zellen zurückzuführen ist. Die Elektropermeabilisierung in höherleitenden Medien (geschlossene Symbole) zeigt einen ähnlichen Verlauf wie die in schwächerleitenden Medien (offene Symbole).
Fig. 5B zeigt einen besonderen Vorteil der Erfindung. Bereits bei Feldstärken, die unter den theoretisch berechneten und in der Literatur genannten Feldstärken für frei suspendierte Zellen liegen, zeigen sich deutliche Effekte des elektrischen Feldpulses. Die Gründe für diese Herabsetzung der kritischen Feldstärke liegen einerseits in einer "Aufkonzentrierung" des elektrischen Feldes im Bereich der Filterporen und andererseits in einer zusätzlichen, durch den hydrostatischen Unterdruck bedingten, mechanischen Vorbelastung der Zellmembran in Feldrichtung. Sowohl der mechanische Stress als auch die elektromechanische Deformationskraft beeinflussen die Permeabilisierung von Zellen stark.
In erfindungsgemäßen Elektroporationsvorrichtung kann auch in isoosmolaren Medien höherer Leitfähigkeit effizient permeabilisiert werden. Dies zeigt der Vergleich der beiden Pulsmedien in Fig. 5B. Wie bereits erwähnt, begünstigen hochleitende, isoosmolare Medien die Überlebensfähigkeit elektropermeabilisierter Zellen. Somit ist mit dieser Anordnung eine effiziente Elektropermeabilisierung bei gleichzeitiger hoher Vitalität sogar in isoosmolaren, salzreichen Medien möglich.

Weitere Bearbeitungsschritte

Nach Auswertung des Behandlungsergebnisses kann sich erfindungsgemäß eine weitere elektrische Behandlung mit einem veränderten Pulsmedium oder eine Kultivierung der behandelten Zellen anschließen. Ein besonderer Vorteil des modularen Aufbaus der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, dass das Trägerelement aus der Messkammer entnommen und in eine Kultivierungseinrichtung überführt werden kann. In der Kultivierungseinrichtung werden die behandelten Zellen kultiviert. Die Kultivierung kann auch in der Messkammer selbst erfolgen.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

1. Verfahren zur elektrischen Behandlung biologischer Zellen, insbesondere unter Verwendung von elektrischen Feldpulsen, mit den Schritten:

- Anordnung der Zellen (1) an Öffnungen (2) eines festen, planaren Trägerelementes (3), das eine Messkammer (10) in zwei Kompartimente (11, 12) teilt, und

- zeitweilige Ausbildung eines elektrischen Behandlungsfeldes, das die Zellen durchsetzt,

dadurch gekennzeichnet, dass an dem Trägerelement (3) eine Wechselstrom-Impedanzmessung erfolgt und aus dem Ergebnis der Wechselstrom-Impedanzmessung ein Bedeckungsgrad des Trägerelementes und/oder ein Ausheilen der Zellen nach der elektrischen Behandlung erfasst werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Bedeckungsgrad des Trägerelementes durch Messung einer Impedanzkinetik während der Anordnung der Zellen an den Öffnungen (2) des Trägerelementes (3) oder durch Messung mindestens eines einzelnen Impedanzwertes und Berechnung des Bedeckungsgrades aus Vergleichswerten erfasst wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem das Ausheilen durch Messung einer Impedanzkinetik nach der elektrischen Behandlung der Zellen (1) oder durch Messung mindestens eines Impedanzwertes zu mindestens einem vorbestimmten Zeitpunkt und Vergleich mit Referenzwerten erfasst wird.

4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Wechselstrom-Impedanzmessung bei einer vorbestimmten Messfrequenz erfolgt, bei der die am Trägerelement (3) gemessene Impedanz durch die Anordnung der Zellen (1) maximal vergrößert pedanz durch die Anordnung der Zellen (1) maximal vergrößert wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem die Messfrequenz durch einen Vorversuch, bei dem eine Frequenzabhängigkeit der Impedanz aufgenommen wird, oder aus Referenzwerten ermittelt wird.

6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Anordnung der Zellen (1) und/oder das Ergebnis der elektrischen Behandlung optisch mit einem Mikroskop beobachtet werden.

7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Anordnung der Zellen (1) an den Öffnungen (2) eine Adsorption von Zellen aus einer Suspension oder ein adhärentes Wachstum von Zellen umfasst.

8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem nach der elektrischen Behandlung der Zellen (1) eine Kultivierung der Zellen (1) auf dem Trägerelement (3) erfolgt.

9. Vorrichtung zur elektrischen Behandlung biologischer Zellen (1), insbesondere Elektroporationsvorrichtung, die umfasst:
eine Messkammer (10) mit zwei Kompartimenten (11, 12), die durch ein festes Trägerelement (3) voneinander getrennt sind, das eine Vielzahl von Öffnungen (2) aufweist, wobei die Kompartimente (11, 12) jeweils eine Elektrode (4, 5) zur Ausbildung eines elektrischen Behandlungsfeldes aufweisen, das das Trägerelement (3) durchsetzt, und
eine Mess- und Steuereinrichtung (30), die einen Pulsgenerator (31) zur Erzeugung elektrischer Feldpulse und ein Messgerät (32) aufweist,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Messgerät (32) ein Wechselstrom-Impedanzmessgerät ist, dass zur Messung der Wechselstrom-Impedanz am Trägerelement (3) eingerichtet ist.

10. Vorrichtung gemäß Anspruch 9, bei der die Mess- und Steuereinrichtung (30) eine Schalteinrichtung (33) zur wechselweisen Verbindung der Elektroden (4, 5) mit dem Pulsgenerator (31) oder dem Impedanzmessgerät (32) aufweist.

11. Vorrichtung gemäß Anspruch 9 oder 10, bei der das Trägerelement durch einen Membranfilter gebildet wird.

12. Vorrichtung gemäß Anspruch 11, bei der der Membranfilter einen mittleren Porendurchmesser von 0.01 bis 8 µm aufweist.

13. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12, bei der die Elektroden (4, 5) zumindest teilweise lichtdurchlässig sind.

14. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 13, bei dem das obere Kompartiment (11) nach oben für eine Proben- oder Flüssigkeitszufuhr offen ist.