DE102005029414B4 - Verfahren zur Bestimmung des durch Elektroporation bewirkenden Aufschlussgrades biologischer Zellen - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Bestimmung des durch Elektroporation bewirkenden Aufschlussgrades biologischer Zellen über die Messung der elektrischen Leitfähigkeit eines in einem Rohr/Kanal in einer Transportflüssigkeit geführten Massenstroms aus biologischen Zellen/Zellverbänden entweder mit einer Messzelle für ein resistiv-kapazitives Messen aus zwei sich in definierter Position gegenüberstehenden Messelektroden,
oder
einer Messzelle für ein induktives Messen aus mindestens einer Spule, wobei im Falle mehrerer Spulen die Spulenachsen zusammenfallen,
bestehend aus den Schritten:
– die Messzelle wird über einen Signalgenerator unter einen zeitveränderlichen Strom und eine zeitveränderliche Spannung gesetzt, Impedanzmessung,
– der Strom durch die Messzelle und die Spannung über der Messzelle werden bei einer ausgewählten Frequenz oder einer Frequenz aus einem ausgewählten Frequenzbereich/band gemessen und der Phasenwinkel zwischen gemessenem Strom und Spannung mit einer elektronischen Signalverarbeitungseinrichtung ermittelt und zur Anzeige und Dokumentierung des Zustandes des Elektroporationsguts sowie Steuerung und Regelung der Elektroporationsanlage weiterverwendet.
oder
einer Messzelle für ein induktives Messen aus mindestens einer Spule, wobei im Falle mehrerer Spulen die Spulenachsen zusammenfallen,
bestehend aus den Schritten:
– die Messzelle wird über einen Signalgenerator unter einen zeitveränderlichen Strom und eine zeitveränderliche Spannung gesetzt, Impedanzmessung,
– der Strom durch die Messzelle und die Spannung über der Messzelle werden bei einer ausgewählten Frequenz oder einer Frequenz aus einem ausgewählten Frequenzbereich/band gemessen und der Phasenwinkel zwischen gemessenem Strom und Spannung mit einer elektronischen Signalverarbeitungseinrichtung ermittelt und zur Anzeige und Dokumentierung des Zustandes des Elektroporationsguts sowie Steuerung und Regelung der Elektroporationsanlage weiterverwendet.
Description
- Die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des durch Elektroporation bewirkenden Aufschlussgrades biologischer Zellen über die Messung der elektrischen Leitfähigkeit eines in einem Rohr/Kanal in einer Transportflüssigkeit geführten Massenstroms aus biologischen Zellen/Zellverbänden.
- Bei der Elektroporation pflanzlicher Zellen in großen Massenströmen ist es sinnvoll, den Elektroporationsgrad im Prozess am strömenden Elektroporationsgut zu überwachen, um eine Regelgröße für die energieoptimale Einstellung der Anlage zu erhalten.
- In Prozess Technologie, 42 (1997) 4 LVT, Sn. 195–200 LVT, ist von Angersbach et al. eine Methode zur Messung des Elektroporationsgrads beschrieben, bei der die Änderung des ohmschen Widerstands im unteren Frequenzbereich im Verhältnis zum ohmschen Widerstand im oberen Frequenzbereich ausgewertet wird. Die Messung erfolgt dabei über ein Vier-Elektroden-System, das in das zu messende Zellgewebe eingestochen wird.
- Die Einstechmethode eignet sich nur für Stichprobenuntersuchungen und ist daher ungeeignet, um kontinuierlich Messwerte für eine Anlagenregelung zu liefern.
- Aus der
US 5,150,062 ist eine Messzelle (z. B.1 und6d darin) zur Messung der komplexen elektrischen Leitfähigkeit bekannt, die für ein resistiv/kapazitives Messen aufgebaut ist und aus zwei sich in definierter Position gegenüberstehenden Messelektroden besteht. - Zum Merkmal, wonach die Messzelle für induktives Messen aufgebaut ist und aus mindestens einer Spule besteht, wobei im Falle mehrerer Spulen die Spulenachsen zusammen fallen, sei hier dazu noch die
DE 41 16 468 C2 zitiert. - Die Messung bei zwei unterschiedlichen Frequenzen samt Amplitudenbestimmung ist schaltungstechnisch aufwendiger als die Bestimmung des Phasenwinkels bei nur einer Frequenz. Für die Phasenwinkelbestimmung genügt eine Zeitmessung zwischen den Nulldurchgängen von Strom und Spannung, während für die Amplitudenbestimmung eine Strom- und Spannungsmessung erforderlich ist.
- Für Zuckerrüben liegt der obere Frequenzbereich bei einigen Megahertz, die Frequenz maximaler Phasenverschiebung bei ca. 50 kHz. Bei dieser Frequenz beeinflussen die Zuleitungsinduktivitäten bei moderaten Leitungslängen das Messergebnis noch nicht nennenswert, wobei im Megahertz-Bereich eine Impedanzkorrektur notwendig erscheint.
- Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine industrieanlagentaugliche Messzelle und ein damit industrietaugliches Verfahren bereitzustellen mit dem der durch Elektroporation bewirkte Aufschlussgrad großer Massenströme an in einer Transportflüssigkeit geführter biologischen Zellen oder Zellverbände gemessen und daraus ein Steuer- und/oder Regelsignal zum energetisch optimalen Führen einer Elektroporationsanlage abgeleitet werden kann. Die Aufgabe wird durch ein Messverfahren gemäß den Verfahrensschritten des Anspruchs 1 gelöst.
- Der Aufschlussgrad der Zellen wird aus dem Rückgang des gemessenen Phasenwinkels gegenüber einer Vergleichsmessung an unbehandelten Zellen bestimmt. Daher besteht das Verfahren zur Bestimmung des durch Elektroporation bewirkenden Aufschlussgrades biologischer Zellen über die Messung der elektrischen Leitfähigkeit eines in einem Rohr/Kanal in einer Transportflüssigkeit geführten Massenstroms aus biologischen Zellen/Zellverbänden aus den folgend beschriebenen Schritten: Das Messgerät wird über einen Signalgenerator unter einen zeitveränderlichen Strom und eine zeitveränderliche Spannung gesetzt. Dies kann wahlweise mittels einer Spannungsquelle oder einer Stromquelle erfolgen. Der Strom durch die Messzelle und die Spannung über der Messzelle werden bei einer ausgewählten Frequenz oder einem ausgewählten Frequenzbereich gemessen und der Phasenwinkel oder der Verlauf des Phasenwinkels im Frequenzbereich zwischen dem Strom durch die Messzelle und der Spannung über der Messzelle mit einer elektronischen Signalverarbeitungseinrichtung ermittelt. Der Phasenwinkel oder sein frequenzabhängiger Verlauf wird als Maß für den Aufschlussgrad der Zellen angezeigt und dokumentiert, aber auch daraus ein Signal zur Steuerung und Regelung der Einrichtung zur Elektroporation abgeleitet.
- Nach Anspruch 2 wird der prinzipielle Messfehler aufgrund eines Stromanteils, der an den Zellen durch die die Zellen umgebende Transportflüssigkeit vorbeifließt, dadurch kompensiert, dass dieser Stromanteil aus dem Füllgrad, der Leitfähigkeit der Transportflüssigkeit und den Geometriedaten der Messstrecke in einem Rechner der Signalverarbeitungseinrichtung errechnet und phasenrichtig vom Messstrom subtrahiert wird.
- Die Messzelle zur Bestimmung des Aufschlussgrades biologischer Zellen besteht aus einem Aufbau, der zur Messung von zumindest einem Teilstrom des Massenstroms durchflossen werden kann. Die Messzelle ist entweder für ein resistiv/kapazitives Messen aufgebaut und besteht dann aus zwei sich positioniert gegenüberstehenden Elektroden, dem Messelektrodenpaar, zwischen denen zumindest ein Teil des Massenstroms durchströmt. Oder sie ist für ein induktives Messen aufgebaut und besteht dann aus mindestens einer Spule in einfacher solenoidaler Form, die den Querschnitt des Massenstroms zumindest teilweise umfasst. Im Falle mehrerer Spulen sind die Spulen der Messzelle koaxial zueinander angeordnet.
- Die Messzelle ist an einen Signalgenerator angeschlossen, um mit einem zeitveränderlichen Strom und einer zeitveränderlichen Spannung betrieben zu werden. Die Messzelle kann handhabbar ausgeführt sein. Hierzu sind die beiden Messelektroden, zwischen denen beim Messen zumindest ein Teil des Massenstroms hindernisfrei hindurchströmt, in ein dielektrisches Gestell/Rohr montiert, in dem sie sich in definierter Position bezüglich der Längsachse gegenüberstehen. Dieser Aufbau wird beispielsweise über einen an dem Gestell/Rohr angebauten Hebel in den Massenstrom gehalten, so dass der Wirkungsquerschnitt der Messzelle im Strömungsquerschnitt des Massenstroms liegt.
- Eine Messzelle mit fest eingebauten Messelektroden ist ebenfalls resistiv/kapazitiv aufgebaut und bildet einen Abschnitt des Transportrohrs/-kanals. In der dielektrischen Kanalwand dieses Abschnitts sind die beiden Messelektroden eingebaut/eingelassen, und zwar so, dass sie keinen Strömungswiderstand für den vorbeiziehenden Massenstrom bilden. Bezüglich der Strömungs-/Längsachse im Rohr/Kanal stehen sich die beiden Messelektroden, mit ihrer Stirn aufeinander ausgerichtet, spiegelbildlich gegenüber. Die beiden Messelektroden können stiftförmig oder plattenförmig sein und folgen mit ihrer exponierten Fläche der Kanalkontur stetig oder glatt.
- Die Messzelle für induktives Messen kann ebenfalls handhabbar aufgebaut sein. Sie besteht dann aus einer Spule oder aus zwei zueinander koaxialen Spulen, einer Erreger- und einer Messspule, die in den Massenstrom gehalten werden kann oder können, sodass der Wirkungsquerschnitt der Messzelle im Strömungsquerschnitt liegt.
- Die stationär eingebaute induktive Messzelle bildet einen Abschnitt des Transportrohrs/-kanals und besteht hierzu aus einer Spule oder aus zwei zueinander koaxialen Spulen, einer Erreger- und einer Messspule. Der Wirkungsquerschnitt der Messzelle überdeckt dann auf jeden Fall den Strömungsquerschnitt des Massenstroms.
- Der Messwert des Aufschlussgrades zu Steuerung und Regelung der Verarbeitungszeit und/oder der benötigten Energie wird einbezogen und die den bei der Elektroporation den Aufschlussgrad bestimmenden Betriebsparameter, wie elektrische Feldstärke, Pulslänge, Pulsanzahl pro Volumenelement, Temperatur, Anzahl der Durchläufe durch den Zellaufschlussreaktor, Lagerzeit der Zellsuspension zwischen zwei Elektroporationsdurchgängen oder zwischen Elektroporation und Extraktion, nach einem Kennlinienfeld auf der Grundlage der Messung des Aufschlussgrades wird eingestellt. Die Messung, kontinuierliche oder intervallweise, erfolgt über höchstens den Querschnitt des Massenstroms, der Zellsuspension aus biologischen Zellen oder solchen Zellverbänden und der Trägerflüssigkeit stattfindet.
- Zur Messung der Leitfähigkeit des Massenstroms wird eine periodische Kurvenform des Stromes/der Spannung aus dem Signalgenerator an die Messeinrichtung gelegt. Eine an der Kurvenform beteiligte Sinusschwingung mit zumindest starkem Auftritt der Phasenverschiebung wird zur Messung ausgewertet.
- Zur Messung der Phasenverschiebung wird ein impulsförmiger, aperiodisch oder periodisch gedämpfter Kurvenverlauf benutzt. Durch Umsetzung in den Frequenzbereich mit üblichen Zeit Frequenz-Transformationsverfahren, vorzugsweise mittels schneller Fourier-Transformation, FFT, eine Frequenz mit stärkstem Auftritt der Phasenverschiebung oder ein schmalbandiger Frequenzbereich mit starkem Auftritt der Phasenverschiebung zur Messung ausgewertet wird.
- Zur resistiv/kapazitiven Einkopplung des Messsignals werden die gleichen Elektroden verwendet wie zur Elektroporation und die Messung wird in Elektroporationspausen vorgenommen. Die Messzelle ist dann unmittelbarer Bestandteil der Elektroporationsstrecke. Die Umschaltung zwischen dem Signalgenerator und dem Messgerät erfolgt dabei über eine Umschaltvorrichtung oder Ankoppeleinheit.
- Eine Verfeinerung des Verfahrens besteht darin, wenn an der Elektroporationsstrecke gleichzeitig an mehreren Stellen gemessen wird. Es lässt sich so dann bei mehreren Messstellen eine Aussage über den Elektroporationsverlauf längs der Messstrecke machen.
- Statt eines Messimpulses kann auch der Elektroporationsimpuls selbst zur Messung herangezogen werden. Dazu muss dieser Impuls im für die Phasenmessung empfindlichen Frequenzbereich ausreichend große Frequenzanteile aufweisen.
- Über einen Vergleich der Aufschlussgrade vor und nach dem Elektroporationsreaktor, wie ihn die Anordnung zweier Messgeräte ermöglicht, kann der Betriebspunkt der Anlage an den bereits vor dem Elektroporationsdurchgang vorhandenen Aufschlussgrad der Zellen angepasst werden. Die Anpassung geschieht mittels eines Kennlinienfeldes.
- Zusammengefasst:
- Es wird nur der Phasenwinkel zwischen Strom und Spannung über einem Zellverband bei einer Frequenz mit möglichst großer Phasenverschiebung zur Bestimmung des Elektroporationsgrads gemessen und ausgewertet.
Claims (2)
- Verfahren zur Bestimmung des durch Elektroporation bewirkenden Aufschlussgrades biologischer Zellen über die Messung der elektrischen Leitfähigkeit eines in einem Rohr/Kanal in einer Transportflüssigkeit geführten Massenstroms aus biologischen Zellen/Zellverbänden entweder mit einer Messzelle für ein resistiv-kapazitives Messen aus zwei sich in definierter Position gegenüberstehenden Messelektroden, oder einer Messzelle für ein induktives Messen aus mindestens einer Spule, wobei im Falle mehrerer Spulen die Spulenachsen zusammenfallen, bestehend aus den Schritten: – die Messzelle wird über einen Signalgenerator unter einen zeitveränderlichen Strom und eine zeitveränderliche Spannung gesetzt, Impedanzmessung, – der Strom durch die Messzelle und die Spannung über der Messzelle werden bei einer ausgewählten Frequenz oder einer Frequenz aus einem ausgewählten Frequenzbereich/band gemessen und der Phasenwinkel zwischen gemessenem Strom und Spannung mit einer elektronischen Signalverarbeitungseinrichtung ermittelt und zur Anzeige und Dokumentierung des Zustandes des Elektroporationsguts sowie Steuerung und Regelung der Elektroporationsanlage weiterverwendet.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Kompensation eines prinzipiellen Messfehlers der an den Zellen durch die die Zellen umgebende Transport flüssigkeit vorbei fließende Stromanteil aus dem Füllgrad, der Leitfähigkeit der Transportflüssigkeit und den Geometriedaten der Messstrecke in einem Rechner der Signalverarbeitungseinrichtung errechnet und phasenrichtig vom Messstrom subtrahiert wird.
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