EP1893998A1 - Messzelle und damit durchgeführtes verfahren zur bestimmung des durch elektroporation bewirkenden aufschlussgrades biologischer zellen - Google Patents

Messzelle und damit durchgeführtes verfahren zur bestimmung des durch elektroporation bewirkenden aufschlussgrades biologischer zellen

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EP1893998A1
EP1893998A1 EP06754357A EP06754357A EP1893998A1 EP 1893998 A1 EP1893998 A1 EP 1893998A1 EP 06754357 A EP06754357 A EP 06754357A EP 06754357 A EP06754357 A EP 06754357A EP 1893998 A1 EP1893998 A1 EP 1893998A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
measuring
measurement
measuring cell
electroporation
cell
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06754357A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Martin Sack
Hansjoachim Bluhm
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Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Original Assignee
Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Karlsruhe GmbH filed Critical Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Publication of EP1893998A1 publication Critical patent/EP1893998A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F1/46—Treatment of water, waste water, or sewage by electrochemical methods
    • C02F1/4608—Treatment of water, waste water, or sewage by electrochemical methods using electrical discharges
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/02—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance
    • G01N27/023—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance where the material is placed in the field of a coil
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2103/00—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated
    • C02F2103/32—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated from the food or foodstuff industry, e.g. brewery waste waters

Definitions

  • the invention relates to a measuring cell and a method that can be carried out therewith for determining the degree of digestion of biological cells by electroporation by measuring the electrical conductivity of a mass flow of biological cells / cell assemblies guided in a tube / channel in a transport liquid.
  • / 1 / a method for measuring the degree of electroporation is described, in which the change in the ohmic resistance in the lower frequency range is evaluated in relation to the ohmic resistance in the upper frequency range.
  • the measurement is carried out via a four-electrode system, which is inserted into the cell tissue to be measured.
  • the piercing method is only suitable for sampling and is therefore unsuitable for continuously supplying measured values for a plant control.
  • the measurement at two different frequencies including amplitude determination is circuitry more complex than the determination of the phase angle at only one frequency.
  • a time measurement between the zero crossings of current and voltage is sufficient, while a current and voltage measurement is required for the amplitude determination.
  • the upper frequency range is a few megahertz, the frequency of maximum phase shift is about 50 kHz. At this frequency, the lead inductances at moderate line lengths do not significantly affect the measurement result, with an impedance correction appearing necessary in the megahertz range.
  • the object of the invention is to provide an industrial-scale measuring cell and a process suitable for industrial use with which the degree of digestion of large mass flows caused by electroporation of biological cells or cell assemblies guided in a transport fluid is reached and from this a control and / or regulating signal for optimal energetic guiding of an electroporation system can be derived.
  • the object is achieved by a measuring cell according to the features of claim 1 and a measuring method which can be carried out in accordance with the method steps of claim 7.
  • the measuring cell for determining the degree of digestion of biological cells consists according to claim 1 of a structure which can be flowed through for measuring at least a partial flow of the mass flow.
  • the measuring cell is constructed either for a resistive / capacitive measurement and then consists of two oppositely positioned electrodes, the pair of measuring electrodes, between which flows at least part of the mass flow. Or it is constructed for an inductive measuring and then consists of at least one coil in a simple solenoidal form, which at least partially comprises the cross-section of the mass flow. In the case of several coils, the coils of the measuring cell are arranged coaxially with each other.
  • the degree of digestion of the cells is determined from the decrease in the measured phase angle compared to a comparison measurement on untreated cells. Therefore, the method for determining the digestion degree caused by electroporation is more biological Cells via the measurement of the electrical conductivity of a mass flow of biological cells / cell aggregates guided in a tube / channel in a transport liquid according to claim 7 from the following steps:
  • the meter is set by a signal generator under a time-varying current and a time-varying voltage. This can be done either by means of a voltage source or a power source.
  • the current through the measuring cell and the voltage across the measuring cell are measured at a selected frequency or a selected frequency range and the phase angle or the course of the phase angle in the frequency range between the current through the measuring cell and the voltage across the measuring cell with an electronic signal processing device determined ,
  • the phase angle or its frequency-dependent profile is displayed and documented as a measure of the degree of digestion of the cells, but also derived therefrom a signal for controlling and regulating the device for electroporation.
  • the fundamental measurement error due to a proportion of current flowing past the cells through the transport liquid surrounding the cells is compensated for by calculating this current component from the degree of filling, the conductivity of the transport liquid and the geometry data of the measurement path in a computer of the signal processing device and subtracting it from the measurement current in the correct phase becomes.
  • the measuring cell is connected to a signal generator to be operated with a time-varying current and a time-varying voltage.
  • the measuring cell is manageable.
  • the two measuring electrodes, between which at least a part of the mass flow flows without obstruction when measuring mounted in a dielectric frame / tube in which they face each other in a defined position with respect to the longitudinal axis.
  • This construction will held for example via a mounted on the frame / tube lever in the mass flow, so that the cross-section of the measuring cell in the flow cross-section of the mass flow is.
  • the measuring cell is also of resistive / capacitive design and forms a section of the transport tube / channel.
  • the two measuring electrodes are installed / recessed in such a way that they do not form a flow resistance for the passing mass flow.
  • the two measuring electrodes face each other with their forehead in mirror image.
  • the two measuring electrodes may be pin-shaped or plate-shaped and follow with their exposed surface of the channel contour steadily or smoothly.
  • the measuring cell is also described as manageable and constructed for inductive measuring.
  • it consists of a coil or two coaxial coils, an excitation and a measuring coil, which can be held in the mass flow or can, so that the cross section of the measuring cell is located in the flow cross-section.
  • the stationary installation of the inductive measuring cell is described in claim 6.
  • the inductive measuring cell forms a portion of the transport tube / channel and consists for this purpose of a coil or of two mutually coaxial coils, an excitation and a measuring coil.
  • the cross section of the measuring cell then covers the flow cross section of the mass flow in any case.
  • the measured value of the degree of digestion for controlling and regulating the processing time and / or the required energy is included and the operating parameters determining the degree of digestion during electroporation, such as electric field strength, pulse length, number of pulses per volume element, temperature, number of passes through the cell disruption reactor, storage time of the cell suspension between two electroporation passages or between electroporation and extraction, according to a characteristic field based on the measurement of the Digestion set.
  • the measurement, continuous or intermittent, takes place over at most the cross section of the mass flow, the cell suspension of biological cells or such cell aggregates and the carrier liquid takes place (claim 9).
  • a periodic waveform of the current / voltage from the signal generator is applied to the measuring device.
  • a sine wave involved in the waveform with at least strong occurrence of the phase shift is evaluated for measurement.
  • a pulse-shaped, aperiodically or periodically damped curve profile is used according to claim 11.
  • a frequency with the strongest occurrence of the phase shift or a narrowband frequency range with a strong occurrence of the phase shift is evaluated for measurement.
  • the electroporation pulse itself can also be used for the measurement.
  • this pulse must have a sufficiently large frequency components in the frequency range sensitive to the phase measurement.
  • the operating point of the system can be adapted to the present before the electroporation passage degree of digestion of the cells.
  • the adaptation is done by means of a characteristic field, as described in claim 8.
  • a method for correcting a parallel resistance of the suspension water by means of additional conductivity and filling degree measurement is specified. To minimize energy, a waiting period between electroporation and extraction is maintained. The control is performed on the basis of a characteristic field.
  • the proposed electroporation meter is a conductivity meter which measures the complex conductivity of a cell suspension at the frequency at which the phase shift between current and voltage is ideally greatest and, as described above, evaluates this phase shift. With the continuous measurement of the degree of electroporation in large mass flows the energy-optimized system control is possible. By installing the measuring device before the
  • Electroporation distance can be concluded from the initial degree of digestion of the cells. For example, the cells of frosted sugar beets are already open-minded. The minimum energy consumption is given by waiting time and setting of the optimal operating point according to the characteristic field.
  • Figures show, on the one hand, the schematic structure of the measuring instrument and, on the other hand, experimental results at the end. It shows:
  • FIG. 1 shows the resistive / capacitive measuring cell
  • FIG. 2 shows the inductive transformer measuring cell
  • FIG. 3 shows the inductive measuring cell
  • FIG. 4 shows the equivalent circuit diagram of the cell tissue
  • FIG. 5 shows the course of the complex impedance
  • FIG. 6 shows the complex impedance at 50 kHz
  • FIG. 8a R s / R p as a function of the waiting time 12 min;
  • FIG. 1 schematically shows the situation for the resistive / capacitive measurement.
  • the mass flow is indicated by the arrow as the direction of flow in the pipe 7.
  • the two measuring electrodes 1 are exposed so that they do not form a flow obstacle, but directly touch the passing cell suspension. This can be embedded in the pipe wall plates or rods.
  • the two electrodes 1 are connected to the voltage source 3, the signal generator.
  • the complex impedance 2 is representative of that of the electrical measuring circuit.
  • the electrodes are connected to the evaluation unit 4.
  • the current measurement takes place indirectly at the shunt 5.
  • FIG. 2 shows in the same schematic way the inductive type of measurement with only one coil 6, the transformer coupling which comprises the tube 7 with the mass flow flowing therein and thus does not form a flow obstacle.
  • the complex impedance of an association of intact biological cells shows a capacitive component in the middle frequency range, while at low and high frequencies the impedance 2 is almost ohmic.
  • a simplistic equivalent circuit diagram of the biological cell tissue is used (FIG. 4).
  • the capacitance C represents the effective capacity of the cell membranes
  • the parallel resistance R P the effective ohmic resistance of the cell membranes
  • the series resistance R s the effective resistance of the cell interior.
  • the sum of R 5 and R P acts in the lower frequency range and only Rp in the upper frequency range.
  • FIG. 5 confirms the informative value of the detection of the phase shift for the degree of electroporation.
  • and the phase angle ⁇ are plotted against the frequency f before and after the electroporation by the equivalent circuit diagram (FIG. 4). The largest phase angle occurs at about 50 kHz.
  • Tab. 1 shows the pressing results in comparison to the phase angle at the beginning of the pressing. Since, due to the preparatory work for the pressing, the phase angle could only be measured up to approx. 5 min before the pressing, the expected phase angle was extrapolated on the basis of the curves. The degree of digestion determined by pressing correlates with the decrease of the phase angle within the scope of natural scattering and measurement uncertainties.
  • the test results also show that the waiting time between electroporation and pressing off plays a decisive role in the level of digestion.
  • the diagrams Fign. 7 and fig. 8 show the decrease of the resistance R P and the decrease of the phase angle after single pulses. For this purpose, waiting times of about 2 minutes (figure 7) and about 12 minutes (figure 8) were recorded between the individual pulses. held. Clearly the pulse-dependent decrease of R P and ⁇ can be recognized on the second pulse. Only after each 1st pulse was no decrease in these parameters visible, sometimes a slight increase in Rp.

Abstract

Eine Messzelle zur Bestimmung des durch Elektroporation bewirkenden Aufschlussgrades biologischer Zellen ist für ein resistiv / kapazitives Messen aufgebaut oder für ein induktives Messen aufgebaut. Das mit ihr betriebene Verfahren besteht aus folgenden Schritten: -Die Messzelle wird über einen Signalgenerator unter einen zeitveränderlichen Strom und eine zeitveränderliche Spannung gesetzt. -Der Strom durch die Messzelle und die Spannung über der Messzelle werden bei einer ausgewählten Frequenz oder einem ausgewählten Frequenzbereich gemessen und der Phasenwinkel zwischen gemessenem Strom und Spannung mit einer elektronischen Signalverarbeitungseinrichtung ermittelt .

Description

Messzelle und damit durchgeführtes Verfahren zur Bestimmung des durch Elektroporation bewirkenden Aufschlussgrades biologischer Zellen
Die Erfindung betrifft eine Messezelle und ein damit durchführbares Verfahren zur Bestimmung des durch Elektroporation bewirkenden Aufschlussgrades biologischer Zellen über die Messung der elektrischen Leitfähigkeit eines in einem Rohr/Kanal in einer Transportflüssigkeit geführten Massenstroms aus biologischen Zellen/Zeilverbänden.
Bei der Elektroporation pflanzlicher Zellen in großen Massenströmen ist es sinnvoll, den Elektroporationsgrad im Prozess am strömenden Elektroporationsgut zu überwachen, um eine Regelgröße für die energieoptimale Einstellung der Anlage zu erhalten.
In /1/ ist eine Methode zur Messung des Elektroporationsgrads beschrieben, bei der die Änderung des ohmschen Widerstands im unteren Frequenzbereich im Verhältnis zum ohmschen Widerstand im oberen Frequenzbereich ausgewertet wird. Die Messung erfolgt dabei über ein Vier-Elektroden-System, das in das zu messende Zellgewebe eingestochen wird.
Die Einstechmethode eignet sich nur für Stichprobenuntersuchungen und ist daher ungeeignet, um kontinuierlich Messwerte für eine Anlagenregelung zu liefern.
Die Messung bei zwei unterschiedlichen Frequenzen samt Amplitudenbestimmung ist schaltungstechnisch aufwendiger als die Bestimmung des Phasenwinkels bei nur einer Frequenz. Für die Phasenwinkelbe- stimmung genügt eine Zeitmessung zwischen den Nulldurchgängen von Strom und Spannung, während für die Amplitudenbestimmung eine Strom- und Spannungsmessung erforderlich ist. Für Zuckerrüben liegt der obere Frequenzbereich bei einigen Megahertz, die Frequenz maximaler Phasenverschiebung bei ca. 50 kHz. Bei dieser Frequenz beeinflussen sich die Zuleitungsinduktivitäten bei moderaten Leitungslängen das Messergebnis noch nicht nennenswert, wobei im Megahertz-Bereich eine Impedanzkorrektur notwendig erscheint .
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine industrieanlagentaugliche Messzelle und ein damit industrietaugliches Verfahren bereitzustellen mit dem der durch Elektroporation bewirkte Aufschlussgrad großer Massenströme an in einer Transportflüssigkeit geführter biologischen Zellen oder Zellverbände geraessen und daraus ein Steuer- und/oder Regelsignal zum energetisch optimalen Führen einer Elektroporationsanlage abgeleitet werden kann. Die Aufgabe wird durch eine Messzelle gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1 und einem damit durchführbaren Messverfahren gemäß den Verfahrensschritten des Anspruchs 7 gelöst.
Die Messzelle zur Bestimmung des Aufschlussgrades biologischer Zellen besteht nach Anspruch 1 aus einem Aufbau, der zur Messung von zumindest einem Teilstrom des Massenstroms durchflössen werden kann. Die Messzelle ist entweder für ein resistiv / kapazitives Messen aufgebaut und besteht dann aus zwei sich positioniert gegenüberstehenden Elektroden, dem Messelektrodenpaar, zwischen denen zumindest ein Teil des Massenstroms durchströmt. Oder sie ist für ein induktives Messen aufgebaut und besteht dann aus mindestens einer Spule in einfacher solenoidaler Form, die den Querschnitt des Massenstroms zumindest teilweise umfasst. Im Falle mehrerer Spulen sind die Spulen der Messzelle koaxial zueinander angeordnet .
Der Aufschlussgrad der Zellen wird aus dem Rückgang des gemessenen Phasenwinkels gegenüber einer Vergleichsmessung an unbehandelten Zellen bestimmt. Daher besteht das Verfahren zur Bestimmung des durch Elektroporation bewirkenden Aufschlussgrades biologischer Zellen über die Messung der elektrischen Leitfähigkeit eines in einem Rohr/Kanal in einer Transportflüssigkeit geführten Massenstroms aus biologischen Zellen/Zellverbänden nach Anspruch 7 aus den folgend beschriebenen Schritten:
Das Messgerät wird über einen Signalgenerator unter einen zeitveränderlichen Strom und eine zeitveränderliche Spannung gesetzt. Dies kann wahlweise mittels einer Spannungsquelle oder einer Stromquelle erfolgen. Der Strom durch die Messzelle und die Spannung über der Messzelle werden bei einer ausgewählten Frequenz o- der einem ausgewählten Frequenzbereich gemessen und der Phasenwinkel oder der Verlauf des Phasenwinkels im Frequenzbereich zwischen dem Strom durch die Messzelle und der Spannung über der Messzelle mit einer elektronischen Signalverarbeitungseinrichtung ermittelt. Der Phasenwinkel oder sein frequenzabhängiger Verlauf wird als Maß für den Aufschlussgrad der Zellen angezeigt und dokumentiert, aber auch daraus ein Signal zur Steuerung und Regelung der Einrichtung zur Elektroporation abgeleitet. Der prinzipielle Messfehler aufgrund eines Stromanteils, der an den Zellen durch die die Zellen umgebende Transportflüssigkeit vorbeifließt, wird dadurch kompensiert, dass dieser Stromanteil aus dem Füllgrad, der Leitfähigkeit der Transportflüssigkeit und den Geometriedaten der Messstrecke in einem Rechner der Signalverarbeitungseinrichtung errechnet und phasenrichtig vom Messstrom subtrahiert wird.
In den abhängigen Ansprüchen 2 bis 6 sind Eigenschaften / Bauweisen der Messzelle spezifiziert:
Nach Anspruch 2 ist die Messzelle an einen Signalgenerator angeschlossen ist, um mit einem zeitveränderlichen Strom und einer zeitveränderlichen Spannung betrieben zu werden.
Nach Anspruch 3 ist die Messzelle handhabbar. Hierzu sind die beiden Messelektroden, zwischen denen beim Messen zumindest ein Teil des Massenstroms hindernisfrei hindurchströmt, in ein dielektrisches Gestell/Rohr montiert, in dem sie sich in definierter Position bezüglich der Längsachse gegenüberstehen. Dieser Aufbau wird beispielsweise über einen an dem Gestell / Rohr angebauten Hebel in den Massenstrom gehalten, so dass der Wirkungsquerschnitt der Messzelle im Strömungsquerschnitt des Massenstroms liegt.
Ein fester Einbau der Messelektroden des Messgeräts ist in Anspruch 4 beschrieben. Die Messzelle ist ebenfalls resistiv / kapazitiv aufgebaut und bildet einen Abschnitt des Transportrohrs/- kanals. In der dielektrischen Kanalwand dieses Abschnitts sind die beiden Messelektroden eingebaut/eingelassen, und zwar so, dass sie keinen Strömungswiderstand für den vorbeiziehenden Massenstrom bilden. Bezüglich der Strömungs-/Längsachse im Rohr/Kanal stehen sich die beiden Messelektroden, mit ihrer Stirn aufeinander ausgerichtet, spiegelbildlich gegenüber. Die beiden Messelektroden können stiftförmig oder plattenförmig sein und folgen mit ihrer exponierten Fläche der Kanalkontur stetig oder glatt.
In Anspruch 5 ist die Messzelle ebenfalls als handhabbar beschrieben und für induktives Messen aufgebaut. Sie besteht hierzu aus einer Spule oder aus zwei zueinander koaxialen Spulen, einer Erreger- und einer Messspule, die in den Massenstrom gehalten werden kann oder können, so dass der Wirkungsquerschnitt der Messzelle im Strömungsquerschnitt liegt.
Der stationäre Einbau der induktiven Messzelle ist in Anspruch 6 beschrieben. Die induktive Messzelle bildet einen Abschnitt des Transportrohrs/-kanals und besteht hierzu aus einer Spule oder aus zwei zueinander koaxialen Spulen, einer Erreger- und einer Messspule. Der Wirkungsquerschnitt der Messzelle überdeckt dann auf jeden Fall den Strömungsquerschnitt des Massenstroms.
In den dem Verfahrensanspruch 7 untergeordneten Verfahrensansprüche 8 bis 13 sind verschiedene Schritte beschrieben, mit denen das Verfahren je nach dem betrieben werden kann. In Anspruch 8 wird der Messwert des Aufschlussgrades zu Steuerung und Regelung der Verarbeitungszeit und/oder der benötigten Energie einbezogen und die den bei der Elektroporation den Aufschlussgrad bestimmenden Betriebsparameter, wie elektrische Feldstärke, Pulslänge, Pulsanzahl pro Volumenelement, Temperatur, Anzahl der Durchläufe durch den Zeilaufschlussreaktor, Lagerzeit der Zellsuspension zwischen zwei Elektroporationsdurchgängen oder zwischen Elektroporation und Extraktion, nach einem Kennlinienfeld auf der Grundlage der Messung des Aufschlussgrades eingestellt. Die Messung, kontinuierliche oder intervallweise, erfolgt über höchstens den Querschnitt des Massenstroms, der Zellsuspension aus Biologischen Zellen oder solchen Zellverbänden und der Trägerflüssigkeit, stattfindet (Anspruch 9) .
In Anspruch 10 ist festgehalten, dass zur Messung der Leitfähigkeit des Massenstroms eine periodische Kurvenform des Stromes/der Spannung aus dem Signalgenerator an die Messeinrichtung gelegt wird. Eine an der Kurvenform beteiligte Sinusschwingung mit zumindest starkem Auftritt der Phasenverschiebung wird zur Messung ausgewertet .
Zur Messung der Phasenverschiebung wird nach Anspruch 11 ein im- pulsförmiger, aperiodisch oder periodisch gedämpfter Kurvenverlauf benutzt. Durch Umsetzung in den Frequenzbereich mit üblichen Zeit Frequenz-Transformationsverfahren, vorzugsweise mittels Schneller Fourier-Transformation, FFT, eine Frequenz mit stärkstem Auftritt der Phasenverschiebung oder ein schmalbandiger Frequenzbereich mit starkem Auftritt der Phasenverschiebung zur Messung ausgewertet wird.
In Anspruch 12 ist beschrieben, dass zur resistiv/kapazitiven Ein- kopplung des Messsignals die gleichen Elektroden verwendet werden wie zur Elektroporation und die Messung in Elektroporationspausen vorgenommen wird. Die Messzelle ist dann unmittelbarer Bestandteil der Elektroporationsstrecke. Die Umschaltung zwischen dem Signalgenerator und dem Messgerät erfolgt dann über eine Umschaltvorrichtung oder Ankoppeleinheit. Das Verfahren kann nach Anspruch 13 verfeinert werden, wenn an der Elektroporationsstrecke gleichzeitig an mehreren Stellen gemessen wird. Es lässt sich so dann bei mehreren Messstellen eine Aussage über den Elektroporationsverlauf längs der Messtrecke machen.
Nach Anspruch 14 kann statt eines Messimpulses auch der Elektroporationsimpuls selbst zur Messung herangezogen werden. Dazu muss dieser Impuls im für die Phasenmessung empfindlichen Frequenzbereich ein ausreichend große Frequenzanteile aufweisen.
Über einen Vergleich der Aufschlussgrade vor und nach dem Elektro- porationsreaktor, wie ihn die Anordnung zweier Messgeräte nach Anspruch 15 ermöglicht, kann der Betriebspunkt der Anlage an den bereits vor dem Elektroporationsdurchgang vorhandenen Aufschlussgrad der Zellen angepasst werden. Die Anpassung geschieht mittels eines Kennlinienfeldes, wie in Anspruch 8 beschrieben.
Zusammengefasst :
Es wird nur der Phasenwinkel zwischen Strom und Spannung über einem Zellverband bei einer Frequenz mit möglichst großer Phasenverschiebung zur Bestimmung des Elektroporationsgrads gemessen und ausgewertet.
Es wird eine Methode zur Korrektur eines Parallelwiderstands des Suspensionswassers mittels zusätzlicher Leitfähigkeits- und Füllgradmessung angegeben. Zur Energieminimierung wird eine Wartezeit zwischen Elektroporation und Extraktion eingehalten. Die Regelung wird anhand eines Kennlinienfeldes vollführt.
Das vorgeschlagene Elektroporationsmessgerät ist ein Leitfähigkeitsmessgerät, das die komplexe Leitfähigkeit einer Zellsuspension bei der Frequenz misst, bei der die Phasenverschiebung zwischen Strom und Spannung idealerweise am größten ist, und, wie oben beschrieben, diese Phasenverschiebung auswertet. Mit der kontinuierlichen Messung des Elektroporationsgrads in großen Massenströmen ist die energieoptimierte Anlagenregelung möglich. Durch den Einbau der Messeinrichtung auch vor der
Elektroporationsstrecke kann auf den anfänglichen Aufschlussgrad der Zellen geschlossen werden. Beispielsweise sind die Zellen von gefrosteten Zuckerrüben bereits vorab aufgeschlossen. Der energieminimale Betrieb ist durch Wartezeit und Einstellung des optimalen Arbeitspunktes nach dem Kennlinienfeld gegeben.
Die Erfindung wird anhand der Zeichnung und am Beispiel der E- lektroporation von Zuckerrübenwürfeln noch näher beschrieben. Die
Figuren zeigen einerseits den schematischen Aufbau des Messgeräts und andrerseits am Schluss experimentelle Ergebnisse. Es zeigt:
Figur 1 die resistive/kapazitive Messzelle;
Figur 2 die induktive transformatorische Messzelle;
Figur 3 die induktiv Messzelle;
Figur 4 das Ersatzschaltbild des Zellgewebes;
Figur 5 Verlauf der komplexen Impedanz;
Figur 6 die komplexe Impedanz bei 50 kHz;
Figur 7a Rs, Rp in Abhängigkeit der Wartezeit 2 min;
Figur 7b C, φ in Abhängigkeit der Wartezeit 2 min;
Figur 8a Rs/ Rp in Abhängigkeit der Wartezeit 12 min;
Figur 8b C, φ in Abhängigkeit der Wartezeit 12 min.
In Figur 1 ist schematisiert die Situation für die resistiv / kapazitive Messung dargestellt. Der Massenstrom ist punktiert mit dem Pfeil als Strömungsrichtung im Rohr 7 angedeutet. Im Rohr 7 sind die beiden Messelektroden 1 so exponiert, dass sie kein Strömungshindernis bilden, aber die vorbeiströmende Zellsuspension unmittelbar berühren. Das können in die Rohrwand eingelassene Platten oder Stäbe sein. Die beiden Elektroden 1 sind an die Spannungsquelle 3, den Signalgenerator, angeschlossen. Die komplexe Impedanz 2 steht repräsentativ für die des elektrischen Messkreises. Zur Strom und Spannungsmessung sind die Elektroden an die Auswerteeinheit 4 angeschlossen. Die Strommessung erfolgt indirekt an dem Shunt 5. Figur 2 zeigt in derselben schematisierten Art die induktive Messart mit nur einer Spule 6, die transformatorische Kopplung, die das Rohr 7 mit dem darin strömenden Massenstrom umfasst und damit kein Strömungshindernis bildet. Strom- und Spannungsmessung sowie Auswertung gehen wie zu Figur 1 beschrieben. Die weitere induktive Variante mit zwei Spulen 6, eine für den Signalempfang (links im Bild) zur Spannungsmessung und die andere als Sendespule für die indirekte Strommessung über den Shunt 5 zeigt Figur 3. Beide Spulen 6 umfassen das Rohr 7 ebenfalls und bilden kein Strömungshindernis .
Die komplexe Impedanz eines Verbandes intakter biologischer Zellen zeigt im mittleren Frequenzbereich einen kapazitiven Anteil, während bei niederen und hohen Frequenzen die Impedanz 2 nahezu ohmsch ist. Zur Beschreibung dieses frequenzabhängigen elektrischen Verhaltens wird ein stark vereinfachtes Ersatzschaltbild des biologischen Zellgewebes herangezogen (Fig. 4) . In diesem Ersatzschaltbild repräsentiert die Kapazität C die effektive Kapazität der Zellmembranen, der Parallelwiderstand RP den effektiven ohm- schen Widerstand der Zellmembranen und der Serienwiderstand Rs den effektiven Widerstand des Zellinneren. Dabei wirkt im unteren Frequenzbereich die Summe aus R5 und RP und im oberen Frequenzbereich nur Rp.
Bei elektroporierten Zellen geht der kapazitive Anteil der Impedanz im mittleren Frequenzbereich stark zurück, gleichzeitig sinkt der ohmsche Widerstand im unteren Frequenzbereich. Wird im mittleren Frequenzbereich die komplexe Impedanz eines intakten Zellverbands gemessen, besteht, bedingt durch den kapazitiven Impedanzanteil im mittleren Frequenzbereich, eine Phasenverschiebung zwischen Messspannung und Messstrom. Aus dem Rückgang des Phasenwinkels mit zunehmendem Elektroporationsgrad kann somit auf den E- lektroporationsgrad zurückgeschlossen werden. Figur 5 bestätigt die Aussagefähigkeit der Detektion der Phasenverschiebung für den Elektroporationsgrad. Die Betragsimpedanz |Z| und der Phasenwinkel φ sind anhand des Ersatzschaltbildes (Fig. 4) über der Frequenz f jeweils vor und nach der Elektroporation aufgetragen. Der größte Phasenwinkel tritt bei etwa 50 kHz auf.
In einer Suspension liegt der komplexen Impedanz der Zellverbände der ohmsche Widerstand des Suspensionswassers parallel. Dieser Widerstand variiert mit der Leitfähigkeit des Suspensionswassers und der Dichte der Suspension. Der Stromanteil durch diesen Widerstand bewirkt bei der Impedanzmessung einen höheren Wirkstromanteil und damit eine Reduktion des gemessenen Phasenwinkels. Dieser Einfluss kann jedoch rechnerisch kompensiert werden, wenn Füllgrad und Leitfähigkeit des Suspensionswassers bekannt sind. Diese beiden Messgrößen werden im Prozess bereits für andere Regel- und Überwachungszwecke erfasst. Zur Kompensation wird beispielsweise aus Füllgrad, Leitfähigkeit des Suspensionswassers und Geometriedaten der Messstrecke der Stromanteil durch den Parallelwiderstand berechnet und phasenrichtig vom Messstrom subtrahiert. Arbeitet die Anlage mit hoher Fülldichte und/oder konstanter Leitfähigkeit des Suspensionswassers (Regelung der Leitfähigkeit ist fabrikseitig vorgesehen) , kann auf eine Phasenwinkelkorrektur u. U. auch verzichtet werden. Labor-Experimente an Rübenwürfeln zeigen, dass es für einen energieoptimalen Betrieb sinnvoll ist, im Elektroporati- onsreaktor eine kleine Anzahl an Impulsen zu applizieren und das Elektroporationsgut vor der Extraktion der Inhaltsstoffe eine gewisse Zeit zwischen zu lagern. Bei dieser Betriebsart ist das E- lektroporationsgut beim Austritt aus dem Elektroporationsreaktor noch nicht vollständig aufgeschlossen. Anhand eines zuvor ermittelten Kennlinienfeldes, in dem der Zeitverlauf des Aufschlussgrads in Abhängigkeit von den beeinflussenden Parametern, wie Temperatur, Pulsparameter etc., aufgetragen ist, kann dann die Regelung des Elektroporationsreaktors erfolgen. Bisher wurden Labormessungen an Zuckerrübenwürfeln durchgeführt. Dazu wurden aus Zuckerrüben würfelförmige Stücke mit ca. 5,5 cm Kantenlänge geschnitten und in einem homogenen elektrischen Feld mit einem aperiodisch gedämpftem Feldstärkeverlauf bei einer Spitzenfeldstärke von 6 kV/cm und einer Pulshalbwertsbreite von 1,3 μs mit 5 Pulsen im Abstand von 3 Sekunden bepulst. Vor der Bepulsung sowie danach über einen längeren Zeitraum wurde eine Spannung von ca. 3 V aus einem Funktionsgenerator angelegt und bei den Frequenzen 500 Hz, 50 kHz sowie 5 MHz fortlaufend Spannung, Strom durch die Probe sowie Phasenwinkel zwischen Strom und Spannung gemessen. Anschließend erfolgte eine Umrechnung in die Werte R5, Rp und C des einfachen Ersatzschaltbilds. Die Experimente zeigten, dass im Verlauf der Wartezeit nach der Bepulsung der Phasenwinkel, sowie RP abnahmen, während die errechnete Kapazität C zunahm. Rs blieb nahezu konstant (Figuren 7 und 8). Die Experimente wurden nach unterschiedlichen Wartezeiten abgebrochen und der Rübenwürfel schnellstmöglich geschnitten und 15 min. gepresst. Fig. 6 zeigt den komplexen Widerstand, gemessen bei 50 kHz. Zunächst wurden 5 Impulse im Abstand von 3 Sekunden appliziert (grauer Balken) und die Proben anschließend nach unterschiedlichen Wartezeiten gepresst (farbige Balken) (Presszeit: 15 min) . Tab. 1 zeigt die Abpressergebnisse im Vergleich zum Phasenwinkel zu Beginn der Pressung. Da wegen der vorbereitenden Arbeiten für die Pressung der Phasenwinkel nur bis ca. 5 min vor der Pressung gemessen werden konnte, wurde der erwartete Phasenwinkel anhand der Kurvenverläufe extrapoliert. Der durch Abpressung ermittelte Aufschlussgrad korreliert im Rahmen der naturbedingten Streuungen und Messunsicherheiten mit der Abnahme des Phasenwinkels.
Die Versuchsergebnisse zeigen auch, dass die Wartezeit zwischen Elektroporation und Abpressung eine entscheidende Rolle für den Aufschlussgrad spielt. Die Diagramme Fign. 7 und Fign. 8 zeigen die Abnahme des Widerstands RP und den Rückgang des Phasenwinkels nach einzelnen Pulsen. Dazu wurde zwischen den einzelnen Pulsen Wartezeiten von ca. 2 min (Fign. 7) und ca. 12 min (Fign. 8) ein- gehalten. Deutlich ist der pulsabhängige Rückgang von RP und φ an dem 2. Puls zu erkennen. Nur nach dem jeweils 1. Puls war keine Abnahme dieser Parameter sichtbar, manchmal eher eine leichte Zunahme von Rp.
Tab. 1: Abpressergebnisse im Vergleich zum Phasenwinkel bei 50 kHz
Bezugszeichenliste
1. Messelektrode
2. Impedanz
3. Spannungsquelle
4. Auswerteeinheit
5. Shunt
6. Spule
7. Rohr

Claims

Patentansprüche :
1. Messzelle zur Bestimmung des durch Elektroporation bewirkenden Aufschlussgrades biologischer Zellen über die Messung der komplexen elektrischen Leitfähigkeit eines in einem Rohr/Kanal in einer Transportflüssigkeit geführten Massenstroms aus biologischen Zellen/Zellverbänden, wobei der Wirkungsquerschnitt der Messzelle beim Messen zumindest über einen Teil des Strömungsquerschnitts des Massenstroms geht, dadurch gekennzeichnet, dass: die Messzelle entweder für ein resistiv / kapazitives Messen aufgebaut ist und dann aus zwei sich in definierter Position gegenüberstehenden Messelektroden besteht, oder für ein induktives Messen aufgebaut ist und aus mindestens einer Spule besteht, wobei im Falle mehrerer Spulen, die Spulenachsen zusammenfallen.
2. Messzelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die resistiv / kapazitive oder induktive Messzelle zur frequenzspezifischen Messung der Phasenverschiebung zwischen Strom und Spannung an einen Signalgenerator angeschlossen ist.
3. Messgerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die resistiv/kapazitive Messzelle handhabbar ist und hierzu ihre beiden Messelektroden in ein dielektrisches, in den Massenstrom haltbares Gestell/Rohr eingebaut sind.
4. Messgerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die resistiv / kapazitive Messzelle einen Abschnitt des Trans- portrohrs/-kanals bildet, in dessen Innenwand die beiden Messelektroden eingelassen/eingebaut sind und sich bezüglich der Strömungs-/Längsachse spiegelbildlich gegenüber stehen.
5. Messgerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die induktive Messzelle handhabbar ist und hierzu aus einer Spule oder aus zwei zueinander koaxialen Spulen, einer Erreger- und einer Messspule, besteht, die in den Massenstrom gehalten werden kann.
6. Messgerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die induktive Messzelle einen Abschnitt des Transportrohrs/- kanals bildet und hierzu aus einer Spule oder aus zwei zueinander koaxialen Spulen, einer Erreger- und einer Messspule, besteht, die von dem Massenstrom durchströmt wird oder werden.
7. Verfahren zur Bestimmung des durch Elektroporation bewirkenden Aufschlussgrades biologischer Zellen über die Messung der elektrischen Leitfähigkeit eines in einem Rohr/Kanal in einer Transportflüssigkeit geführten Massenstroms aus biologischen Zellen/Zellverbänden mit einer in den Ansprüchen 3 und 4 oder 5 und 6 beschriebenen Messzelle, bestehend aus den Schritten:
- die Messzelle wird über einen Signalgenerator unter einen zeitveränderlichen Strom und eine zeitveränderliche Spannung gesetzt,
- der Strom durch die Messzelle und die Spannung über der Messzelle werden bei einer ausgewählten Frequenz oder einem ausgewählten Frequenzbereich gemessen und der Phasenwinkel zwischen gemessenem Strom und Spannung mit einer elektronischen Signalverarbeitungseinrichtung ermittelt und zur Anzeige und Dokumentierung des Zustandes des Elektroporationsguts sowie Steuerung und Regelung der Elektroporationsanlage weiterverwendet, - der prinzipielle Messfehler aufgrund eines Stromanteils, der an den Zellen durch die die Zellen umgebende Transportflüssigkeit vorbeifließt, wird dadurch kompensiert, dass dieser Stromanteil aus dem Füllgrad, der Leitfähigkeit der Transportflüssigkeit und den Geometriedaten der Messstrecke in einem Rechner der Signalverarbeitungseinrichtung errechnet und phasenrichtig vom Messstrom subtrahiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Messwert des Aufschlussgrades zu Steuerung und Regelung der Verarbeitungszeit und/oder der benötigten Energie einbezogen wird und die den bei der Elektroporation den Aufschlussgrad bestimmenden Betriebsparameter, wie elektrische Feldstärke, Pulslänge, Pulsanzahl pro Volumenelement, Temperatur, Anzahl der Durchläufe durch einen Elektroporationsreaktor, Lagerzeit der Zellsuspension zwischen zwei Reaktordurchläufen oder zwischen Elektroporation und Extraktion, nach einem Kennlinienfeld auf der Grundlage der Messung des Aufschlussgrades eingestellt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die kontinuierliche oder intervallweise Messung über höchstens den Querschnitt des Massenstroms stattfindet.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass zur Messung der Leitfähigkeit des Massenstroms eine periodische Kurvenform des Stromes/der Spannung aus dem Signalgenerator an die Messeinrichtung gelegt wird, wobei eine an der Kurvenform beteiligte Sinusschwingungen mit stärkstem Auftritt der Phasenverschiebung zur Messung ausgewertet wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein impulsförmiger, aperiodisch oder periodisch gedämpfter Kurvenverlauf zur Messung benutzt wird, wobei durch Umsetzung vom Zeit- in den Frequenzbereich eine Frequenz mit stärkstem Auftritt der Phasenverschiebung oder ein schmalbandiger Frequenzbereich mit starkem Auftritt der Phasenverschiebung zur Messung ausgewertet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zur resistiv / kapazitiven Einkopplung des Messsignals die gleichen Elektroden verwendet werden wie zur Elektroporation und die Messung in Elektroporationspausen vorgenommen wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung des Aufschlussgrades an mindestens einer Stelle einer Elektroporationsstrecke vorgenommen wird.
H.Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Elektroporationsimpuls selbst zur Messung herangezogen wird.
15. Verfahren nach den Ansprüchen 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine Messung unmittelbar vor dem Einlass einer E- lektroporationsstrecke und eine weitere Messung unmittelbar nach dem Auslass derselben durchgeführt wird und aus dem Unterschied/der Differenz ein Steuer-/Regelsignal zur Einstellung der Elektroporationsanlage für den vollständigen ZeIl- aufschluss des Prozessmaterials abgeleitet wird.
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