DE102008024803B4 - Vorrichtung und Verfahren zur Bestimmung von Resonanzfrequenzen einer Zellprobe - Google Patents

Abstract

Vorrichtung zur Bestimmung von wenigstens einer Resonanzfrequenz einer Zellprobe, insbesondere von Tumorzellen, umfassend
eine in einer Halteeinrichtung (4) angeordnete Zellprobe (1),
wenigstens einen ersten Frequenzgenerator (8), der eine Trägerschwingung mit einer Trägerfrequenz von 13,56 MHz bereitstellt,
wenigstens eine Beobachtungseinrichtung (11) zur Ermittlung der Vitalität der Zellprobe (1), und
der Halteeinrichtung (4) zugeordnete Einbringungsmittel (7) zum Einbringen der Trägerwelle in die Zellprobe (1),
wobei die Einbringungsmittel zwei Elektroden (7) umfassen und die Zellprobe (1) zwischen den beiden Elektroden (7) angeordnet ist,
wobei ein zweiter Frequenzgenerator (9) vorhanden ist, der eine Modulationsschwingung mit variabler Frequenz bereitstellt, und
wobei die Modulationsschwingung mit der Trägerschwingung gekoppelt ist.

Description

• Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Bestimmung von wenigstens einer Resonanzfrequenz einer Zellprobe, insbesondere von Tumorzellen. Zwischen normalen und kranken Zellen, wie zum Beispiel Tumorzellen, sowie ihrer unmittelbaren Zellumgebung bestehen messbare Unterschiede. Dabei weist die extrazellulare Flüssigkeit, die jede Zelle umgibt, bei Tumorzellen gegenüber gesunden Zellen ein verändertes Schwingungsverhalten auf, wenn die Zellen extern zum Schwingen angeregt werden.
• Möglichkeiten, Zellen in Schwingung zu versetzen, sind in den vergangenen Jahrzehnten viele bekannt geworden. So existiert eine große Anzahl von Veröffentlichungen, die eine mechanische Schwingungsanregung, etwa mit Ultraschall, zum Gegenstand haben. Bei größeren Zellverbänden ist bei der Übertragung von mechanischer Schwingungsenergie aber immer nachteilig, dass alle Zellen der Schwingung ausgesetzt werden müssen.
• Das Schwingungsverhalten der Zellen ist durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Eigenschaften der Zellen sowie ihrer unmittelbaren Zellumgebung bestimmt. Insbesondere wird das spezifische Schwingungsverhalten der Zellen durch deren Steifigkeit und die Beschaffenheit des Zytoskeletts sowie durch die Viskosität des Zytoplasmas, durch die Plasmamembran, die Kernflüssigkeit, die Kern/Plasma Relation, den osmotischen Druck, die Steifigkeit und Beschaffenheit der extrazellulären Matrix; die Viskosität und die Zusammensetzung der extrazellulären Flüssigkeit und die Geschwindigkeit der zellulären Aggregationsprozesse bestimmt. Je nach Art der Schwingungsanregung tragen jeweils unterschiedliche Zellkomponenten zum Schwingungsverhalten bei.
• Ein gravierender, struktureller Unterschied zwischen gesunden und kranken Zellen ist insbesondere dadurch gegeben, dass kranke Zellen eine veränderte Organisation der zellulären und der extrazellulären Filamentnetze aufweisen. Bei gesunden Zellen sind die zellulären Filamente gebunden und geordnet, wobei hingegen in kranken Zellen die Filamente diffus und nicht gebunden angeordnet sind. Das führt dazu, dass bei kranken Zellen der zelluläre Kraftfluss weitgehend über gebündelte Aktinstränge erfolgt. Durch diese Störung der Aktinbündelung und der makromolekularen Verbindungsproteine ist ein Verlust der funktionellen Zellsteifigkeit und damit eine deutliche Veränderung des Schwingungsverhalten der kranken Zelle bzw. der extrazellularen Flüssigkeit der Zelle gegeben.
• Ferner ist durch die Störung der Aktinbündelung eine Reduzierung der Viskosität der kranken Zelle gegenüber einer gesunden Zelle gegeben, wodurch die kranken Zellen eine deutlich stärkere Schwingungsamplitude gegenüber den gesunden Zellen aufweisen.
• Ein weiterer wesentlicher Unterschied betrifft die extrazelluläre Flüssigkeit. Die extrazelluläre Flüssigkeit umgibt die Zellmembran und versorgt die Zelle mit den nötigen Nährstoffen sowie mit Sauerstoff, außerdem führt sie die verbrauchten Stoffe ab. Damit dies geschieht, bestehen zwischen dem Inneren der Zellen und der extrazellulären Flüssigkeit Konzentrationsunterschiede sowie ein Konzentrationsgradient. Der Konzentrationsunterschied bildet hierbei das treibende Gefälle, welches nötig ist, damit die Stoffe durch die Zellmembran hindurch diffundieren können. Entlang dieser Diffusionswege besteht ein Konzentrationsgradient, dessen Steigung dem jeweiligen Fließgleichgewicht für den jeweiligen Stoff entspricht. Da es sich bei vielen der mit der Zelle ausgetauschten Stoffe um Ionen handelt, die eine elektrische Ladung aufweisen, verläuft entsprechend den Konzentrationsgradienten auch ein Ladungsgradient, der typisch für die jeweilige Versorgungssituation für die Zelle ist, wobei eine typische, gesunde Zelle eine Ladung von ca. +70 mV im Zellinneren sowie eine negative Ladung in der extrazellulären Flüssigkeit aufweist.
• Bei kranken Zellen ist die Versorgungssituation deutlich verändert, bei Tumorzellen beträgt die Ladung in der Zelle oft –30 mV und in der extrazellulären Flüssigkeit +30 mV. Auch ist die Nährstoffsituation erheblich verändert und die Konzentrationsgradienten sind anders. Dies führt auch zu einer veränderten Reaktion auf Schwingungsanregungen sowie zu einem veränderten Schwingungsverhalten.
• Durch diese Unterschiede des Schwingungsverhaltens sind für kranke Zellen, insbesondere Tumorzellen, bestimmte Frequenzen gegeben, die die extrazelluläre Flüssigkeit der kranken Tumorzelle derart in Schwingung versetzen, dass sie zerstört wird. Hierbei handelt es sich um die Resonanzfrequenz für das System der kranken Zellen, so dass die kranke Zelle mittels dieser durch die Resonanzfrequenz induzierten Resonanzkatastrophe zerstört wird. Durch die Schwingung in der Resonanz wird die Zellmembran der kranken Zelle zerstört. Die Art und Weise, wie die Zerstörung der Zellmembran erfolgt, ist aber stark abhängig von der Methode der Schwingungsanregung. Verschiedene Arten der Schwingungsanregung führen auch zu unterschiedlichen Resonanzfrequenzen.
• Aufgrund der physikalischen sowie physiologischen und elektromagnetischen Unterschiede von kranken und gesunden Zellen sind die Resonanzfrequenzen der kranken Zellen, insbesondere der Tumorzellen, verschieden zu den Resonanzfrequenzen der gesunden Zellen. Durch diesen Unterschied ist es möglich, eine Schwingung mit einer entsprechenden Resonanzfrequenz an die kranke Zelle einzubringen, ohne die gesunden Zellen zu beeinflussen, so dass die kranken Zellen zerstört werden und die gesunden Zellen nicht in Mitleidenschaft gezogen werden.
• Unterschiedliche Arten von kranken Zellen, insbesondere von Tumorzellen, weisen entsprechend ihrer physikalischen sowie physiologischen und elektromagnetischen Eigenschaften ganz unterschiedliche Resonanzfrequenzen auf, was auch zu Diagnosezwecken genutzt werden kann. Es hat daher in der Vergangenheit nicht an Versuchen gefehlt, sich diese unterschiedlichen Eigenschaften diagnostisch oder therapeutisch zunutze zu machen.
• So zeigt die US 4,767,611 A eine Behandlung von Krebs, bei der der Organismus einer relativ niedrigen Frequenz eines elektromagnetischen Feldes ausgesetzt wird. Durch das elektromagnetische Feld wird Energie in den Organismus eingebracht, die die kranken Zellen selektiv erhitzt, jedoch die gesunden Zellen nicht beeinflussen soll. Hierzu werden dem Zellorganismus, bevor dieser in das elektromagnetische Feld angeordnet wird, sogenannte Minutenteilchen zugeführt. Hierbei handelt es sich um Teilchen, die einen durchschnittlichen Durchmesser von weniger als einem Mikrometer aufweisen. Diese Teilchen weisen die Eigenschaft auf, in die kranke Zelle einzudringen, jedoch die gesun den Zellen zu meiden. Auch bei diesem Verfahren ist von Nachteil, dass zunächst ein Aktivierungsteilchen in die Zelle eingebracht werden muss, so dass dieses Behandlungsverfahren sehr aufwendig ist, da die Menge der einzubringenden Aktivierungsteilchen vorher genau bestimmt werden muss.
• Die US 4,472,506 A zeigt ein Verfahren und eine Vorrichtung, die es ermöglicht, den elektrischen Zusammenbruch der Zellmembran einer Zellprobe zu bestimmen. Der Zusammenbruch der Zellmembran ist hierbei durch eine Umkehrung des elektrischen Zellwiderstandes gekennzeichnet. Hierzu wird eine bestimmte Zusammenbruchspannung für die Zellen verwendet. Die Zellen werden hierzu in ein elektrisches Feld gebracht, wobei die Zellen in dem elektrischen Feld bewegt werden, sodass sich in den Zellen ein entsprechender elektrischer Feldgradient ergibt. Das elektrische Feld wird gepulst und weist vorbestimmte Spannungen auf, die in vorherigen Testverfahren ermittelt worden sind, den sogenannten Zusammenbruchspannungen. Durch den Feldgradienten des elektrischen Feldes wird ein elektrischer Strom in der Zelle erzeugt. Durch An- und Abschalten dieses elektrischen Feldes mit einer bestimmten Pulsfrequenz wird bei einer bestimmten Größe des elektrischen Stroms der Zellwiderstand durch den Stromfluss überwunden und es kommt zu einer Umkehrung bzw. zu freien Stromfluss in der Zelle ohne jeglichen Widerstand, was gleichbedeutend mit dem Zusammenbruch der Zellmembran ist. Nachteilig bei dieser Art von Vorrichtung und Verfahren ist die Tatsache, dass die Zellen in dem elektrischen Feld bewegt werden müssen, um einen entsprechenden Gradienten des elektrischen Feldes in der Zellprobe und einen damit verbundenen Stromfluss zu erhalten. Dadurch wird der Aufbau der Vorrichtung entsprechend aufwendig und funktionsanfällig. Zudem ist von Nachteil, dass durch das elektrische Feld die Zellen derart erwärmt werden, dass auch gesunde Zellen des Organismus entsprechend erwärmt werden, was zu negativen Einflüssen für die gesunden Zellen führt. Auch wird nicht die Frequenz, sondern die Spannungsamplitude variiert, so dass keineswegs gesichert ist, dass die Resonanzfrequenz getroffen wurde.
• Die US 5,087,336 A , US 5,143,588 A , US 5,215,633 A , US 5,215,642 A und die US 5,312,534 A beschreiben eine Schwingungsanregung mittels eines fluktuierenden magnetischen Feldes. Diese Art der Anregung zielt auf die Resonanzfrequenz bestimmter Ionen, beispielsweise Ca++ oder Mg++, wobei das Ladungs-/Massenverhältnis der Zyklotronresonanzfrequenz entspricht. Diese Ionen können bei Anlegen derartiger Frequenzen durch die Zellmembran wandern, wodurch therapeutische Effekte erreicht werden können. Allerdings ist die Erzeugung derartiger magnetischer Felder sehr aufwändig. Auch sind die Diagnosemöglichkeiten beschränkt, da die Resonanzfrequenzen nicht auf den Gesundheitszustand der Zelle abstellen, sondern auf die Wanderung bestimmter Ionen.
• Die WO 99/11771 A1 beschreibt ein Verfahren zur Reinigung einer Zellkultur, bei der alle Zellen außer einer bestimmten Art von Zellen, beispielsweise Stammzellen, aus einer Kultur oder während einer Blutwäsche, etwa bei Blutkrebs, herausselektiert werden sollen, wobei alle übrigen Zellen verworfen bzw. zerstört werden können. Hierbei wird ein gepulstes elektrisches Feld eingesetzt, wobei Rechteckwellen bevorzugt werden, die Pulsdauer ist im Bereich von Millisekunden. Durch Wahl geeigneter Parameter bezüglich angelegter Spannung, Zeitdauer und Anzahl der Pulse und der Ionenkonzentration in der Lösung können hohe Reinheiten erreicht werden. So wird vorgeschlagen, ein elektrisches Feld anzulegen, welches eine Feldstärke von 20 kV/cm erreicht, sowie eine Pulsdauer von 2–20 μs und Pulsfrequenzen von 0 bis 20 kHz. Eine Resonanzfrequenz wird jedoch nicht eingestellt und die Frequenz wird auch nicht variiert.
• Es ist die somit Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, bei dem mittels der Vitalität einer Zellprobe, insbesondere einer Tumorzelle, die Resonanzfrequenz der Zellprobe genau bestimmt wird. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit den Merkmalen des Anspruch 1 sowie mit den Merkmalen des Anspruchs 12 gelöst.
• Um nun einzelne Resonanzfrequenzen für verschiedene kranke Zellen, insbesondere für unterschiedliche Tumorzellen, zu bestimmen, ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass eine entnommene Zellprobe in einer Halteeinrichtung angeordnet ist, wobei die Zellprobe zweckmäßig in einer Messschale angeordnet ist. Mittels eines ersten Frequenzgenerators wird eine elektromagnetische Welle bzw. Schwingung mit einer bestimmten Trägerfrequenz bereitgestellt. Die Trägerwelle bzw. Trägerschwingung wird mit einer elektromagnetischen Modulationswelle bzw. Modulationsschwingung gekoppelt, die mittels eines zweiten Frequenzgenerators bereitgestellt wird. Mittels der Halteeinrichtung zugeordneten Einbringungsmitteln wird die gekoppelte Schwingung aus Trägerschwingung und Modulationsschwingung an die Zellprobe gebracht. Die Zellprobe wird mittels einer Beobachtungseinrichtung beobachtet und deren Vitalität ermittelt. Die Frequenz der Modulationswelle wird mittels des zweiten Frequenzgenerators variiert. Während der Variation der Frequenz der Modulationswelle wird die Zellprobe weiter beobachtet und deren Vitalität ermittelt. Durch die Modulationsschwingung wird die Zellprobe – bzw. die extrazelluläre Flüssigkeit der Tumorzelle – in Schwingung versetzt. Wird nun während der Variation der Modulationsfrequenz für die Zellvitalität ermittelt, dass diese plötzlich abfällt und keine Vitalität in der Zelle mehr beobachtet wird, so bedeutet dies, dass die mit der Trägerschwingung eingebrachte Modulationsschwingung eine Frequenz aufweist, die die Zellprobe derart in Schwingung versetzt, dass deren Zellmembran durch die Schwingung zerstört worden ist. Bei dieser Frequenz handelt es sich um die Resonanzfrequenz für die Zellprobe, die in dem System der Zellprobe zu der die Zelle zerstörenden Resonanzkatastrophe führt. Damit wird durch die Ermittlung der abfallenden und verschwindenden Vitalität der Zellprobe die Resonanzfrequenz für die Zellprobe bestimmt (Frequenzsensitivitätstest).
• Die Wirkung ist hierbei die, dass das elektrische Feld Energie auf die Zellmembran und die sie umgebende extrazelluläre Flüssigkeit überträgt und diese Region erwärmt. Zwar beträgt die Erwärmung nur ca. 0,01°C, aufgrund der sehr kleinen räumlichen Abmessungen entspricht dies aber einem sehr großen Temperaturgradienten, der zu entsprechender Thermodiffusion führt und dabei die Zellmembran und damit die Tumorzelle zerstört.
• Die Variation der Frequenz der Modulationsschwingung erfolgt bevorzugt kontinuierlich, wodurch sichergestellt ist, dass bei der Variation der Frequenz der Modulationsschwingung die Resonanzfrequenz der Zellprobe erreicht wird, wobei die Frequenz der Modulationsschwingung zweckmäßig zwischen 1 Hz und 10.000 kHz liegt. Beispielsweise kann die Frequenz in Schritten von 1 Hz kontinuierlich erhöht werden.
• Es versteht sich, dass auch Frequenzen der Modulationsschwingung über 10.000 kHz hinaus verwendet werden können, wobei die Bereitstellung einer Schwingung bis 10.000 kHz jedoch ohne größeren Aufwand erfolgt. Bei Modulationsschwingungen mit Frequenzen im MHz oder GHz Bereich sind auch Resonanzen für die Zellproben zu messen, hierbei handelt es sich dann um die höheren Eigenmoden des Systems der Zellprobe. Diese sind ebenfalls durch die Ermittlung der Vitalität der Zellprobe messbar, da die physikalischen Eigenschaften dem Grunde nach dieselben sind wie bei den niedrigen Eigenmoden, insbesondere der Resonanzfrequenz im Bereich von 1 Hz bis 10.000 KHz.
• Es versteht sich ferner, dass die Variation der Frequenz der Modulationsschwingung auch diskret erfolgen kann, wobei der Abstand zwischen den einzelnen Frequenzen durch die gewünschte Genauigkeit für die Bestimmung der Resonanzfrequenz der Zellprobe bestimmt ist.
• Zur Ermittlung der Vitalität der Zellprobe ist vorteilhaft wenigstens eine Beobachtungseinrichtung vorgesehen.
• Aufgrund der vielseitigen Unterschiede zwischen kranken und gesunden Zellen umfasst die Beobachtungseinrichtung verschiedene Mittel zur Beobachtung und Ermittlung der Vitalität der Zellprobe. Hierbei ist bevorzugt vorgesehen, dass die Beobachtungseinrichtung optische Mittel umfasst. Durch die optischen Mittel wird erreicht, dass die Folgen der Schwingung der Zellprobe, in welche diese durch der Modulationswelle angeregt wird, sehr genau beobachtbar ist, da durch die optischen Mittel die Folgen der Schwingung der Zellprobe 1:1 abgebildet wird. Durch diese genaue Beobachtung des Schwingungsverhaltens der Zellprobe ist eine genaue Ermittlung der Vitalität der Zellprobe gegeben, so dass der Abfall der Vitalität der Zellprobe und die den Abfall bewirkende Frequenz der Modulationsschwingung genau ermittelt wird, wodurch die genaue Bestimmung der Resonanzfrequenz für die Zellprobe weiter sichergestellt ist.
• Die Beobachtungseinrichtung umfasst vorteilhaft Aufzeichnungsmittel, wie zum Beispiel eine Video- oder CCD-Kamera, die die Folgen der Schwingung der angeregten Zellprobe über einen bestimmten Zeitraum aufzeichnet. Die Variation der Frequenz der Modulationsschwingung nimmt einen bestimmten Zeitraum in Anspruch, so dass während dieses Beobachtungszeitraums die Modulationsfrequenz mittels des zweiten Frequenzgenerators variiert und mittels der Kopplung mit der Trägerschwingung in die Zellprobe eingebracht wird. Um nun sicherzustellen, dass die Vitalität der Zellprobe in dem gesamten Beobachtungszeitraum genau ermittelt wird, wird das Schwingungsverhalten der Zellprobe durch die Aufzeichnungsmittel während des gesamten Beobachtungszeitraums aufgezeichnet. Durch die Aufzeichnung des Schwingungsverhaltens der Zellprobe ist ferner vorteilhaft erreicht, dass das Schwingungsverhalten der Zellprobe beständig festgehalten und nachträglich Bild für Bild analysiert wird, wodurch die genaue Bestimmung der Resonanzfrequenz der Zellprobe gewährleistet ist. Zudem ist eine mehrfache Analyse des Schwingungsverhaltens der Zellprobe möglich.
• Die Aufzeichnungsmittel sind vorteilhaft mit dem zweiten Frequenzgenerator gekoppelt, so dass eine eindeutige Zuordnung der Frequenz der Modulationswelle zu dem beobachteten Schwingungsverhalten der Zellprobe möglich ist. Hierzu wird zum Beispiel kontinuierlich die Frequenz der Modulationsschwingung in die Aufzeichnungsmittel eingespielt, so dass beim nachträglichen Betrachten der Aufzeichnung des Schwingungsverhaltens zu jedem Zeitpunkt die Frequenz der Modulationsschwingung zu erkennen und der Schwingung der Zellprobe zuzuordnen ist. Dadurch wird die Auswertung und Analyse des beobachteten Schwingungsverhaltens der Zellprobe und die Bestimmung der Resonanzfrequenz erleichtert.
• Zweckmäßigerweise umfasst die Beobachtungseinrichtung wenigstens ein Mikroskop, wodurch die Beobachtung der angeregten Zellen weiter sichergestellt wird, da mittels der vergrößerten Darstellung der Zellprobe durch das Mikroskop eine genaue Beobachtung der Zellprobe möglich ist. Ein Mikroskop bietet hierzu den Vorteil, dass die zu beobachtende Zellprobe entsprechend vergrößert dargestellt wird. So ist dadurch ebenfalls möglich, dass lediglich ein bestimmter Ausschnitt der Zellprobe mittels der Beobachtungseinrichtung beobachtet wird, an dem die Vitalität genau ermittelt wird. So ist zum Beispiel möglich, dass lediglich ein Teilstück der Zellmembran einer bestimmten Zelle der Zellprobe, in die die Modulationsschwingung eingebracht wird, mittels des Mikroskops in einer Vergrößerung beobachtet wird. Der Abfall der Vitalität der Zelle ist durch die Zerstörung der Zellmembran gekennzeichnet, so dass bei einer vergrößerten und damit sehr genauen Beobachtung der Zellmembran eine genaue Ermittlung für den Abfall bzw. Verlust der Zellvitalität gegeben ist. Dadurch ist die genaue Bestimmung der Resonanzfrequenz für die Zellen weiter sichergestellt.
• Es ist ferner vorteilhaft vorgesehen, dass zur Ermittlung der Vitalität der Zellprobe ein so genannter ATP(Adenosintriphosphat)-Test erfolgt. ATP ist eine universelle Form unmittelbar verfügbarer Energie in der Zelle, die bei Bedarf freigesetzt werden kann. Zweckmäßig ist die Zellprobe in einer Nährflüssigkeit oder in einem Nährmedium in der Halteeinrichtung zum Beispiel in einer Petrischale angeordnet. Die Zellprobe – bzw. die extrazelluläre Flüssigkeit der Tumorzelle – wird nun mittels der durch die Trägerwelle eingebrachten Modulationswelle in Schwingung versetzt. Wird bei der Variation der Frequenz der Modulationswelle die Resonanzfrequenz für die Zellprobe erreicht, d. h. befindet sich die Zellprobe in der Resonanzkatastrophe, wird die Zellmembran der Zelle zerstört. Dadurch tritt ATP aus der Zelle aus, wobei das ATP in das Nährmedium gelangt. Das ATP führt nun zu einer Umfärbung des Nährmediums. Durch die Umfärbung des Nährmediums ist somit ein Indikator für die Zerstörung der Zellmembran und somit für den Abfall bzw. den Verlust der Zellvitalität der Zellprobe gegeben. Das bedeutet, dass durch die Umfärbung des Nährmediums die Resonanzfrequenz für die Zellprobe bestimmbar ist.
• Durch Einbringen der Trägerwelle und der Modulationswelle wird die extrazelluläre Flüssigkeit erwärmt. Dabei werden Ionen von der extrazellulären Flüssigkeit in die Zelle transportiert, so dass sich der Ladungsunterschied zwischen dem Zellinneren und der extrazellulären Flüssigkeit verändert und die Zelle unter Stress steht. Wird nun während der Variation der Frequenz der Modulationsschwingung die Resonanzfrequenz der entsprechenden Zellprobe erreicht, so wird die Zellmembran zerstört und die Ionenwanderung von der extrazellulären Flüssigkeit in das Zellinnere erfolgt ohne Behinderung durch die Zellmembran, so dass die Ladungsänderung zwischen der extrazellulären Flüssigkeit und dem Zellinneren sprunghaft stattfindet. Diese sprunghafte Ladungsänderung ist messbar. Damit ist durch die Messung der Ladungsänderung eine Ermittlung des mit der Zerstörung der Zellmembran einhergehenden Abfalls der Zellvitalität gegeben und somit eine Bestimmung der Resonanzfrequenz der Zellprobe möglich.
• Die Zellprobe ist zweckmäßig in einem Nährmedium in einer Petrischale angeordnet, wodurch auch die Messung der Temperatur des Nährmediums zur Bestimmung der Resonanzfrequenz der Zellprobe verwendet werden kann. Hierzu wird die Temperatur des Nährmediums mittels eines entsprechenden Thermometers während der Variation der Frequenz der Modulationsschwingung gemessen. Diese Temperatur ist im Wesentlichen konstant. Wird nun die Zellprobe – bzw. die extrazelluläre Flüssigkeit der Tumorzelle – mit der Resonanzfrequenz in Schwingung versetzt und die Zellmembran zerstört, wird das Nährmedium erwärmt, wobei dieser Temperaturanstieg gemessen wird. Wird nun dieser Temperaturanstieg in dem Nährmedium gemessen, bedeutet das, dass die Zellmembran zerstört und die Zellprobe mit der Resonanzfrequenz zum Schwingen angeregt worden ist, so dass durch die Ermittlung des Temperaturanstiegs in dem Nährmedium die Resonanzfrequenz der Zellprobe bestimmbar ist.
• Gegenüber der Messung der inneren Zelltemperatur ist die Messung der Temperatur des Nährmediums wesentlich einfacher, da hierzu gewöhnliche Thermometer verwendet werden können, wobei hingegen bei der Messung der inneren Zelltemperatur Spezialthermometer in die Zelle eingebracht werden müssten, was einen erheblichen technischen Aufwand bedeutet.
• Zudem wird durch die Ionenwanderung in die Zelle der innere Druck in der Zelle erhöht, so dass auch die Änderung des Drucks gemessen werden kann. Wird der Druck in der Zelle zu groß, so wird auch dadurch die Zellmembran der Zeile zerstört und ein plötzlicher Abfall des Drucks kennzeichnet den Abfall bzw. den Verlust der Zellvitalität, so dass auch durch eine Druckmessung im Inneren der Zelle eine genaue Bestimmung der Resonanzfrequenz der Zellprobe gegeben ist.
• In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung weist die Beobachtungseinrichtung ein Interferometer auf, mittels dem eine Spektralanalyse während der Modulation der Frequenz der Modulationsschwingung bzw. Modulationswelle der Zellprobe erstellt wird.
• Es versteht sich, dass die vorbeschriebenen Vorgehensweisen zur Bestimmung der Resonanzfrequenz der Zellprobe mittels Ermittlung der Vitalität der Zellprobe sowohl jeweils einzeln als auch in Kombination vorgesehen sein können. Es ist bevorzugt, dass zumindest zwei der Mess- und Ermittlungsverfahren der Vitalität der Zellprobe miteinander kombiniert werden, um eine effiziente Kontrolle der Messung der Resonanzfrequenz zu erhalten.
• Die mit der Trägerschwingung gekoppelte Modulationsschwingung wird durch die Einbringungsmittel an die Zellprobe gebracht. Die Einbringungsmittel weisen vorteilhaft wenigstens zwei Elektroden auf, wobei die Zellprobe zwischen den beiden Elektronen angeordnet ist. Dadurch wird sichergestellt, dass die Modulationswelle sicher in die Zellprobe eingebracht wird. Hierbei ist zum Beispiel vorgesehen, dass die beiden Elektroden an der Petrischale, in dem die Zellprobe vorgesehen ist, angeordnet sind.
• Die Frequenz der Trägerwelle weist immer eine Frequenz von 13,56 MHz auf, dadurch wird ermöglicht, dass die Trägerfrequenz in die Zellprobe eindringt und die Modulationswelle mit der Modulationsfrequenz an die kranken Zellen gebracht wird und diese zu entsprechenden Schwingung angeregt werden.
• Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen sowie aus der nachfolgenden Beschreibung.
• Die Erfindung wird nachstehend anhand eines bevorzugten Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf die anliegende Zeichnung näher erläutert.
• 1 zeigt eine Seitenansicht eines bevorzugten Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Bestimmung wenigstens einer Resonanzfrequenz einer Zellprobe.
• In 1 ist ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Bestimmung wenigstens einer Resonanzfrequenz einer Zellprobe, insbesondere einer Tumorzellprobe, gezeigt. Die Zellprobe 1 ist in einem Nährmedium 2 vorgesehen, die in einer eine Petrischale 3 umfassenden Halteeinrichtung 4 angeordnet ist. Das mit der Zellprobe 1 gemischte Nährmedium 2 ist ungefähr bis zur Hälfte in der Petrischale 3 vorgesehen.
• Die Petrischale 3 umfasst einen Boden 5 und eine nach oben gerichtete Seitenwand 6, wobei der Boden 5 vorzugsweise eine kreisförmige Grundfläche aufweist. Es versteht sich, dass der Boden 5 der Petrischale 3 auch jede andere Art von Grundfläche, zum Beispiel rechteckig, aufweisen kann.
• An der nach oben gerichteten Seitenwand 6 sind gegenüberliegend zwei Elektroden 7 an der Petrischale 3 angeordnet. Die beiden Elektroden 7 sind mit einem ersten Frequenzgenerator 8 über zwei Leitungen 8a verbunden. Der erste Frequenzgenerator 8 stellt eine Trägerwelle bzw. Trägerschwingung bereit. Die Trägerschwingung weist eine Frequenz von 13,56 MHz auf.
• Mit dem ersten Frequenzgenerator 8 ist ein zweiter Frequenzgenerator 9 gekoppelt. Der erste Frequenzgenerator 8 stellt eine Modulationsschwingung bereit, wobei die Frequenz der Modulationsschwingung mittels des zweiten Frequenzgenerators 9 Variierbar ist. Es versteht sich, dass der zweite Frequenzgenerator 9 mit dem ersten Frequenzgenerator 8 in einem Gehäuse gemeinsam angeordnet sein kann.
• Die Trägerschwingung des ersten Frequenzgenerators 8 wird mit der Modulationsschwingung des zweiten Frequenzgenerators 9 gekoppelt. Hierzu ist ein Applikator 10 in dem ersten Frequenzgenerator 8 vorgesehen. Es versteht sich, dass der Applikator zur Kopplung der Trägerschwingung mit der Modulationsschwingung auch separat vorgesehen sein kann.
• Die gekoppelte Schwingung von Trägerschwingung und Modulationsschwingung wird über die beiden Elektroden 7 in die in der Petrischale 3 angeordnete Zellprobe 1 eingebracht, wodurch die Zellprobe 1 in Schwingung versetzt wird.
• Oberhalb der Petrischale 3 ist eine Beobachtungseinrichtung 11 zum Beobachten der Zellprobe 1 in dem Nährmedium 2 vorgesehen. Die Beobachtungseinrichtung 11 umfasst optische Mittel 12, die ein Mikroskop 13 aufweisen. Das Mikroskop 13 weist ein Objektiv 14 auf, das auf die in der Petrischale 3 angeordnete Zellprobe 1 gerichtet ist. Das Mikroskop 13 ist mit einer Kamera 15, vorzugsweise einer CCD-Kamera, verbunden. Durch die CCD-Kamera 15 wird ermöglicht, dass während eines bestimmten längeren Zeitraums die Zellprobe 1 ununterbrochen in der Petrischale 3 beobachtet wird.
• Das Verfahren zur Bestimmung wenigstens einer Resonanzfrequenz einer Zellprobe funktioniert nun wie folgt:
  Die Zellprobe 1 wird in dem Nährmedium 2 eingebracht und in der Petrischale 3 bereit gestellt. Dann werden die beiden Frequenzgeneratoren 8 und 9 betätigt, so dass durch den ersten Frequenzgenerator 8 die Trägerschwingung mit der Frequenz von 13,56 MHz und durch den zweiten Frequenzgenerator 9 die Modulationsfrequenz zum Beispiel mit einer Frequenz von 1 Hz bereit gestellt ist.
• Die durch den Applikator 10 gekoppelte Schwingung der Trägerschwingung und der Modulationsschwingung wird mittels der beiden seitlich an der Petrischale 3 angeordneten Elektroden 7 in die Zellprobe 1 eingebracht.
• Die durch die eingebrachte Schwingung in Schwingung versetzte Zellprobe 1 wird mittels des Mikroskops 13 beobachtet. Die mit dem Mikroskop 13 gekoppelte CCD-Kamera 15 zeichnet das Schwingungsverhalten der Zellprobe 1 während des gesamten Beobachtungszeitraums auf, in dem die Frequenz der Modulationsschwingung mittels des zweiten Frequenzgenerators 9 variiert wird. Die Kamara weist zur Speicherung der Aufzeichnung eine Speichereinheit 15a auf. Es versteht sich, dass die Speichereinheit zur Aufzeichnung des Schwingungsverhaltens der Zellprobe auch separat vorgesehen sein kann, zum Beispiel ein Speichermedium bzw. eine Speicherkarte oder Festplatte in einem Computer.
• Nun wird die Frequenz der Modulationsschwingung mittels des zweiten Frequenzgenerators 9 variiert, wobei die Frequenz kontinuierlich erhöht wird, vorzugsweise in Schritten von 1 Hz. Durch die kontinuierliche Aufzeichnung des Schwingungsverhaltens durch die CCD-Kamera 15 wird die Schwingung der Zellprobe 1 bei jeder Frequenz der eingebrachten Modulationsschwingung aufgezeichnet, so dass ein vollständiges Bild des Schwingungsverhaltens der Zellprobe erhalten wird.
• Erreicht nun die Frequenz der Modulationsschwingung die Resonanzfrequenz der Zellprobe 1, gerät diese in die Resonanzkatastrophe und schwingt derart, dass die Zellmembran der Zellprobe 1 zerstört wird. Durch das Mikroskop 13 wird die Zellpro be 1 beobachtet, so dass zum Beispiel die Zerstörung der Zellmembran der Zellprobe 1 optisch ermittelt wird.
• Die Erfindung ist vorstehend anhand eines Ausführungsbeispiels näher beschrieben worden, bei dem die Beobachtungsmittel ein Mikroskop und eine CCD-Kamera umfassen, um den Abfall bzw. den Verlust der Vitalität der Zellprobe optisch zu ermitteln, wobei die Zellmembran der Zellprobe durch die Schwingung zerstört wird. Es versteht sich, dass auch weitere Messmethoden zur Ermittlung der Vitalität der Zellprobe vorgesehen sein können, wie zum Beispiel die ATP-Messung oder die Temperaturmessung des Nährmediums.
• Es versteht sich ferner, dass die weiteren Ermittlungsarten zur Ermittlung der Vitalität der Zellprobe auch mit den optischen Mitteln wie dem Mikroskop gekoppelt sein können, wie zum Beispiel die Messung des ATP. Insbesondere eine ATP-Messung und eine damit gekoppelte Fluoreszenzmessung ist auf bevorzugte Weise vorgesehen, da sowohl die ATP-Messung als auch die Fluoreszenzmessung optisch über das Mikroskop messbar sind und mittels der CDD-Kamera aufgezeichnet werden.

Claims (21)

1. Vorrichtung zur Bestimmung von wenigstens einer Resonanzfrequenz einer Zellprobe, insbesondere von Tumorzellen, umfassend eine in einer Halteeinrichtung (4) angeordnete Zellprobe (1), wenigstens einen ersten Frequenzgenerator (8), der eine Trägerschwingung mit einer Trägerfrequenz von 13,56 MHz bereitstellt, wenigstens eine Beobachtungseinrichtung (11) zur Ermittlung der Vitalität der Zellprobe (1), und der Halteeinrichtung (4) zugeordnete Einbringungsmittel (7) zum Einbringen der Trägerwelle in die Zellprobe (1), wobei die Einbringungsmittel zwei Elektroden (7) umfassen und die Zellprobe (1) zwischen den beiden Elektroden (7) angeordnet ist, wobei ein zweiter Frequenzgenerator (9) vorhanden ist, der eine Modulationsschwingung mit variabler Frequenz bereitstellt, und wobei die Modulationsschwingung mit der Trägerschwingung gekoppelt ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Beobachtungseinrichtung (11) optische Mittel (12) umfasst.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Beobachtungseinrichtung (11) Aufzeichnungsmittel (15) umfasst.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Beobachtungseinrichtung (11) ein Mikroskop (13) umfasst.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Beobachtungseinrichtung (11) Mittel zur ATP-Messung umfasst.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Beobachtungseinrichtung (11) Mittel zur Fluoreszenz-Messung umfasst.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Beobachtungseinrichtung (11) Mittel zur Messung einer Ladungsänderung der Zellprobe (1) umfasst.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Beobachtungseinrichtung (11) ein Interferometer umfasst.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Halteeinrichtung (4) für die Zellprobe (1) eine Petrischale (3) umfasst.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Zellprobe (1) in einem Nährmedium (2) bzw. einer Nährflüssigkeit enthalten ist.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Beobachtungseinrichtung (11) Mittel zur Messung der Temperatur der Nährlösung der Zellprobe (1) umfasst.
12. Verfahren zur Bestimmung von einer Resonanzfrequenz einer Zellprobe, insbesondere von Tumorzellen, umfassend das Bereitstellen einer Zellprobe (1) in einer Haltereinrichtung (4), Bereitstellen einer Trägerschwingung mit 13,56 MHz Trägerfrequenz mittels eines ersten Frequenzgenerators (8), Bereitstellen einer Modulationsschwingung mittels eines zweiten Frequenzgenerators (9), wobei die Modulationsschwingung eine variable Frequenz aufweist, Koppeln der Modulationswelle mit der Trägerwelle, Einbringen der mit der Modulationsschwingung gekoppelten Trägerschwingung mittels zweier Elektroden (7) in die Zellprobe (1), wobei die Zellprobe (1) zwischen den beiden Elektroden (7) angeordnet ist, Variieren der Frequenz der Modulationsschwingung, und Ermittlung der Vitalität der Zellprobe (1) mittels einer Beobachtungseinrichtung (11).
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Ermittlung der Vitalität der Zellprobe (1) durch eine optische Messung erfolgt.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei die Ermittlung der Vitalität der Zellprobe (1) durch eine Messung der ATP-Aktivität erfolgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die Ermittlung der Vitalität der Zellprobe (1) durch eine Messung der Fluoreszenz der Zellprobe (1) erfolgt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die Ermittlung der Vitalität der Zellprobe (1) durch eine Messung der Temperatur der Nährlösung der Zellprobe (1) erfolgt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, wobei die Ermittlung der Vitalität der Zellprobe (1) durch eine Messung der Ladungsänderung der Zellprobe (1) erfolgt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 17, wobei die Ermittlung der Vitalität der Zellprobe (1) durch eine Messung der Schwingung der Zellprobe (1) erfolgt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Messung der Schwingung der Zellprobe (1) durch ein Interferometer erfolgt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 19, wobei die Frequenz der Modulationsschwingung kontinuierlich variiert wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 20, wobei die Variation der Frequenz der Modulationsschwingung in einem Bereich von 1 Hz bis 10.000 kHz erfolgt.