DE102005030859A1

DE102005030859A1 - Elektrodenanordnung, deren Verwendung sowie Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE102005030859A1
Application number: DE102005030859A
Authority: DE
Inventors: Dirk Dr. Zimmermann; Ernst Prof. Dr. Bamberg; Ulrich Prof. Dr. Zimmermann
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV; Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Priority date: 2005-07-01
Filing date: 2005-07-01
Publication date: 2007-01-04
Also published as: US20100038247A1; EP1899724A2; WO2007003398A2; WO2007003398A3

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Elektrodenanordnung (10) für elektrophysiologische Untersuchungen biologischer Zellen (Z) und dergleichen. Die Elektrodenanordnung (10) weist einen Kontaktbereich (40k) zum Kontaktieren der Elektrodenanordnung (10) mit einer biologischen Zelle (Z) oder dergleichen sowie einen Anschlussbereich (40A) zur externen elektrischen Kontaktierung der Elektrodenanordnung (10) auf. Der Kontaktbereich (40K) ist mit einer oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet, die sich vom Anschlussbereich (40a) her erstrecken und eine geometrische Gestalt aufweisen, die im Betrieb ein ansonsten zerstörungsfreies Eindringen in eine biologische Zelle (Z) oder dergleichen über deren Membran (M) in das Zellinnere (I) erlaubt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Elektrodenanordnung, deren Verwendung sowie – insbesondere elektrochemische – Verfahren zu deren Herstellung.

Zur Untersuchung und/oder zur Manipulation biologischer Spezies oder Zellen und dergleichen sind unterschiedliche Verfahren und Mess- bzw. Manipulationsanordnungen bekannt.

Zum einen ist ein äußeres Kontaktieren der Membran der Spezies oder Zelle durch Anlagern der entsprechenden Spezies oder Zelle an eine Elektrode denkbar, wobei ein direkter Zugriff auf das Innere der Spezies oder Zelle oder dergleichen in diesem Fall nicht möglich ist, da die Membran der Spezies oder Zelle der nicht durchdrungen wird.

Andererseits sind verschiedene Patch- und Voltage-Clamp-Techniken bekannt, mit deren Hilfe auch ein Zugriff auf das Innere der Spezies oder Zelle möglich ist, um diese zu manipulieren und/oder elektrisch abzugreifen.

Nachteilig bei den bekannten Verfahren sind zum einen die vergleichsweise indirekte Ableitung und der indirekte Zugriff auf das Innere der Spezies oder Zelle und zum anderen die geringe Reproduzierbarkeit der Manipulationen und der entsprechenden Messergebnisse sowie ferner die Instabilität der Anordnung aus Spezies oder Zelle und manipulierender oder messender Einrichtung und der Stress für die Spezies oder Zelle selbst.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Elektrodenanordnung für elektrophysiologische Untersuchungen biologischer Spezies oder Zellen und dergleichen, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie entsprechende Verwendungen anzugeben, bei welchen sich ein Zugriff auf das Innere einer Spezies oder Zelle auf besonders einfache, zuverlässige, schonende und reproduzierbare Art und Weise realisieren lässt.

Gelöst wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bei einer Elektrodenanordnung erfindungsgemäß durch die Merkmale des unabhängigen Patentanspruchs 1. Des Weiteren wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe durch ein Herstellungsverfahren erfindungsgemäß mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 43 gelöst. Ferner wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe durch Verwendungen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung gemäß den unabhängigen Patentansprüchen 54 und 55 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind jeweils Gegenstand der abhängigen Unteransprüche.

Im Sinne der Erfindung werden unter einer biologischen Spezies oder Zelle jeweils subsumiert eine biologische Zelle im engeren Sinne, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle, ein Liposom, ein Vesikel, eine micelläre Struktur, deren Bestandteile oder Fragmente sowie deren Verbände oder Aggregate, wobei auch so genannte Fusionsspezies oder Fusionszellen, im Hinblick auf Quer- und Längsfusion, mit umfasst sein sollen. Erfindungsgemäß kann dem jeweiligen System zur Untersuchung eine jede dieser Spezies zugrunde gelegt werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Elektrodenanordnung für elektrophysiologische Untersuchung an biologischen Spezies, insbesondere an biologischen Zellen oder dergleichen geschaffen. Die erfindungsgemäße Elektrodenanordnung ist mit einem Kontaktbereich ausgebildet zum Kontaktieren der Elektrodenanordnung mit mindestens einer biologischen Spezies, einer biologischen Zelle oder dergleichen. Des Weiteren ist ein Anschlussbereich ausgebildet zum externen elektrischen Anschließen der Elektrodenanordnung. Der Kontaktbereich ist mit einer Elektrodenspitze oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen als Elektroden ausgebildet, die sich vom Anschlussbereich der Elektrodenanordnung her erstrecken. Die Elektrodenspitzen sind jeweils mit einer geometrischen Gestalt ausgebildet, die im Betrieb ein ansonsten zerstörungsfreies Eindringen der Elektrodenspitzen in eine biologische Spezies oder Zelle oder dergleichen über deren Membran in deren Inneres erlaubt.

Es ist somit eine Kernidee, bei einer Elektrodenanordnung den Kontaktbereich mit einer Elektrodenspitze oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen auszubilden. Die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen sind geeignet, eine Membran der biologischen Spezies, insbesondere einer biologischen Zelle, zerstörungsfrei zu durchdringen, um einen Zugriff auf das Innere der biologischen Spezies oder Zelle zu erlangen.

Bei einer Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen sich jeweils vom Anschlussbereich her monoton oder streng monoton verjüngend erstreckend ausgebildet sind.

Alternativ oder zusätzlich kann es vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen sich jeweils vom Anschlussbereich her zylindrisch oder quaderförmig verlaufend und am vom Anschlussbereich abgelegenen und distalen Ende der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen mit einer sich monoton oder streng monoton verjüngenden Spitze ausgebildet sind. Das heißt insbesondere, dass sich die Elektrodenspitze vom proximalen zum distalen Ende hin gleichförmig verjüngt.

Bei einer anderen alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektroden spitzen mit einem Querschnitt ausgebildet sind, der rund, kreisförmig, elliptisch, rechteckig oder quadratisch ist.

Bei einer bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen mit einem dem Anschlussbereich zugewandten oder den Anschlussbereich bildenden ersten und proximalen Ende ausgebildet sind.

Bei einer vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass der Durchmesser der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen am proximalen Ende im Bereich von etwa 50 nm bis etwa 5000 nm ausgebildet ist.

Bei einer besonders bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass der Durchmesser der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen am proximalen Ende unterhalb von etwa 1/10 des Durchmessers einer zu kontaktierenden Spezies oder Zelle liegt.

Bei einer besonders vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen mit einem vom Anschlussbereich abgewandten zweiten und distalen Ende ausgebildet sind.

Dabei kann es in diesem Fall gemäß einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung vorgesehen sein, dass die Durchmesser der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen am distalen Ende im Bereich von 1/10 des Durchmessers einer zu kontaktierenden Spezies oder Zelle ausgebildet sind.

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen am distalen Ende mit einem Krümmungsradius im Bereich von etwa 5 nm bis etwa 50 nm ausgebildet sind.

Dabei ist der Krümmungsradius der Elektrodenspitze insbesondere der Radius derjenigen Kugel, welche die Elektrodenspitze an ihrem distalen Ende am besten approximiert.

Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen im Bereich der distalen Enden mit einem spitzen Winkel im Bereich von etwa 10° bis etwa 50° als Öffnungswinkel der jeweiligen Spitze ausgebildet sind.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen vom Anschlussbereich her eine Länge im Bereich von etwa 4/5 dem Durchmesser einer zu kontaktierenden Spezies aufweisen.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass der Kontaktbereich mit einer Mehrzahl Elektrodenspitzen ausgebildet ist.

Bei einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitzen geometrisch gleich und/oder gleich wirkend ausgebildet sind.

Bei einer anderen Fortbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass der Anschlussbereich als materiell zusammenhängende Basis mit einer Oberfläche und einer Unterseite ausgebildet ist.

Bei einer weiteren Fortbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen sich von der Oberfläche der Basis aus erstreckend ausgebildet sind.

Bei einer besonders bevorzugten Fortbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen sich von der Oberfläche der Basis aus senkrecht oder im Wesentlichen senkrecht erstreckend ausgebildet sind, zumindest lokal.

Bei einer anderen vorteilhaften Fortbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitzen zueinander gleich orientiert und parallel oder im Wesentlichen parallel ausgerichtet ausgebildet sind, zumindest lokal.

Denkbar ist es auch, dass die Elektrodenspitzen gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung alternativ oder zusätzlich in Form einer Reihe, Matrix oder senkrechten Matrix auf der Oberseite der Basis angeordnet ausgebildet sind.

Möglich ist es auch, dass die Elektrodenspitzen gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung mit gleichen paarweisen Abständen direkt benachbarter Elektrodenspitzen in den Hauptachsenrichtungen ihrer Anordnung angeordnet ausgebildet sind.

Auch ist es denkbar, dass die Oberfläche der Basis planar ausgebildet ist, zumindest lokal.

Ferner ist es möglich, dass die Basis und die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen miteinander einstückig als integraler materieller Bereich ausgebildet sind.

Bei einer bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Basis und die Elektrodenspitzen oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen einteilig miteinander verbunden ausgebildet sind.

Bei einer vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Basis und die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen aus demselben, insbesondere elektrisch leitfähigen Material ausgebildet sind.

Bei einer besonders bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen als elektrochemisch geätzte Strukturen ausgebildet sind.

Bei einer besonders vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass ein Träger mit einer Oberfläche und einer Unterseite aus einem elektrisch isolierenden Material ausgebildet ist.

Dabei kann es in diesem Fall gemäß einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung vorgesehen sein, dass die proximalen Enden der Elektrodenspitzen und gegebenenfalls die Basis im Träger eingebettet und echt unterhalb der Oberfläche des Trägers und die distalen Enden der Elektrodenspitzen echt oberhalb der Oberfläche des Trägers ausgebildet sind.

Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Oberfläche des Trägers vollständig oder lokal konform und insbesondere parallel zur Oberfläche der Basis verlaufend ausgebildet ist.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Oberfläche des Trägers vollständig oder lokal planar, konvex und/oder konkav ausgebildet ist.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Oberfläche des Trägers planar oder im Wesentlichen planar und mit konkaven Vertiefungen im Bereich der proximalen Enden der Elektrodenspitzen ausgebildet ist.

Es ist auch möglich, dass die Unterseite der Basis an der Unterseite des Trägers zumindest zum Teil vom Trägermaterial unbedeckt ausgebildet ist, um einen externen elektrischen Abgriff zu ermöglichen.

Denkbar ist auch, dass elektrisch isoliert zum Kontaktbereich und zum Anschlussbereich eine Gegenelektrodenanordnung und/oder eine Referenzelektrodenanordnung ausgebildet sind.

Die Gegenelektrodenanordnung kann mit einer oder einer Mehrzahl Gegenelektroden ausgebildet sein.

Die Gegenelektrodenanordnung oder ein Teil davon und/oder die Referenzelektrodenanordnung können auf der Oberfläche des Trägers ausgebildet sein.

Bei einer besonders bevorzugten Fortbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die räumliche Anordnung und/oder die Geometrie der Gegenelektrodenanordnung zur Erzeugung eines gesteuert inhomogenen elektrischen und/oder elektromagnetischen Feldes ausgebildet sind.

Bei einer anderen vorteilhaften Fortbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Gegenelektrodenanordnung oder ein Teil davon der Elektrodenspitze oder der Mehrzahl Elektrodenspitzen gegenüberliegend ausgebildet sind.

Denkbar ist es auch, dass die Gegenelektrodenanordnung oder ein Teil davon in einem Abstand im Bereich von etwa 15 μm bis etwa 1 cm von der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen ausgebildet sind.

Auch ist es denkbar, dass eine Gegenelektrode der Gegenelektrodenanordnung mit einer flächenhaften Geometrie ausgebildet ist.

Bei einer besonders bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass eine Gegenelektrode der Gegenelektrodenanordnung eine Größe und/oder eine Fläche aufweist, die groß sind im Verhältnis zur Größe/Fläche der Elektrodenspitzen, insbesondere in einem Verhältnis im Bereich von etwa 5:1 oder im Bereich von etwa 100:1 oder darüber.

Die Elektrodenspitzen und/oder die Basis können z.B. aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe gebildet sind, die besteht aus Silber, Gold, Platin, Wolfram, Legierungen, Legierungen dieser Metalle, Platin-Iridium-Legierungen und Gold-Iridium-Legierungen.

Bei einer vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass eine Mehrzahl Basen mit jeweils einer oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen ausgebildet ist.

Auch ist dabei es denkbar, dass die Basen einzeln oder gruppenweise voneinander elektrisch isoliert und/oder räumlich getrennt ausgebildet sind.

Bei einer bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass als Träger ein Materialbereich mit oder aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe ausgebildet ist, die besteht aus Gläsern, glasähnlichen Materialien, organischen Polymeren und Fotolacken.

Durch die vorliegende Erfindung wird des Weiteren ein Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung geschaffen.

Dabei ist es erfindungsgemäß vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen durch ein elektrochemisches Ätzverfahren ausgebildet werden.

Bei einer ersten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass dem elektrochemischen Ätzen ein einzelner oder eine Mehrzahl feiner Drähte zugrunde gelegt werden.

Die kann vorzugsweise unter Verwendung einer Bondingmaschine geschehen.

Bei einer anderen Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es zusätzlich oder alternativ vorgesehen, dass dem elektrochemischen Ätzverfahren feine Drähte mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 5 μm bis etwa 50 μm zugrunde gelegt werden. Denkbar ist auch, mit Drähten mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 300 μm bis etwa 500 μm zu beginnen.

Bei einer weiteren zusätzlicher oder alternativen Fortbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass dem elektrochemischen Ätzverfahren feine Drähte aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe zugrunde gelegt werden, die besteht aus Silber, Gold, Platin, Wolfram, Legierungen, Legierungen dieser Metalle, Platin-Iridium-Legierungen und Gold-Iridium-Legierungen.

Denkbar ist, dass dem elektrochemischen Ätzverfahren so genannte Bonddrähte oder Drähte zugrunde gelegt werden, die in ihren Eigenschaften Bonddrähten entsprechen.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass zunächst ein oder mehrere feine Drähte durch einen entsprechenden elektrochemischen Ätzprozess behandelt werden und dass dann die so behandelten Drähte in eine Haltevorrichtung eingebracht werden, insbesondere durch Haltern der als proximale Enden für die Elektrodenspitzen bestimmten Enden der Drähte in der Haltevorrichtung, wobei dann der Draht oder die Mehrzahl Drähte in ein isolierendes Material für einen Träger eingefasst wird bzw. werden.

Dabei kann als isolierendes Material für den Träger z.B. ein viskoses Polymer oder ein Glas verwendet werden.

Ferner ist es alternativ oder zusätzlich denkbar, dass das Material für den Träger und insbesondere das viskose Polymer durch Oberflächenspannung oder durch externe Felder beim Einfassen des Drahtes oder der Mehrzahl Drähte in der Haltevorrichtung gehaltert wird.

Bei einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es zusätzlich oder alternative vorgesehen, dass nach Einfassen des Drahtes oder der Drähte durch das isolierende Material für den Träger in der Haltevorrichtung der Draht oder die Drähte gesteuert mikropositioniert werden, um dabei insbesondere die freiliegende Länge für die auszubildende Elektrodenspitze oder für die auszubildenden Elektrodenspitzen einzustellen.

Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es zusätzlich oder alternative vorgesehen, dass – insbesondere nach dem Mikropositionieren – das isolierende Material für den Träger und insbesondere das viskose Polymer ausgehärtet wird, insbesondere durch Strahlung, UV-Licht, durch Temperaturerhöhung und/oder durch andere physikalische und/oder chemische Prozesse.

Es ist auch denkbar, dass als isolierendes Material für den Träger ein Glas vorgesehen wird und dass, insbesondere nach der Mikropositionierung, das Glas durch Erstarren durch Abkühlen ausgehärtet wird.

Durch die Erfindung werden auch Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung und Anwendungen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung geschaffen.

Die erfindungsgemäße Elektrodenanordnung kann erfindungsgemäß zur elektrophysiologischen Untersuchung und/oder Manipulation einer Spezies aus der Gruppe verwendet werden, die gebildet wird von biologischen Zellen, Liposomen, Vesikeln, micellären Strukturen, Bakterien, Viren, Fusionszellen, Organellen, genetischen, molekularbiologischen und/oder biochemischen Derivaten davon, Bestandteilen dieser Spezies und Verbänden dieser Spezies.

Die erfindungsgemäße Elektrodenanordnung kann erfindungsgemäß auch zur Mikroinjektion einer Substanz in eine Spezies aus der Gruppe verwendet werden, die gebildet wird von biologischen Zellen, Liposomen, Vesikeln, micellären Strukturen, Bakterien, Viren, Fusionszellen, Organellen, genetischen, molekularbiologischen und/oder biochemischen Derivaten davon, Bestandteilen dieser Spezies und Verbänden dieser Spezies.

Im letzteren Fall können vor der Mikroinjektion die Spitze der Elektrodenspitze oder die Spitzen der Elektrodenspitzen mit der zu injizierenden Substanz beaufschlagt werden.

Die Beaufschlagung kann insbesondere auch durch Applizierung von elektrischen Feldern geschehen, z.B. bei elektrisch geladenen Substanzen, z.B. bei DNA.

Es ist von besonderem Vorteil, wenn die Elektrodenanordnung in eine Mikrostruktur eingebettet vorgesehen wird.

Es ist auch denkbar, dass die Elektrodenanordnung in einer Lap-on-the-Chip-Struktur vorgesehen wird.

Ferner ist es möglich, dass die Elektrodenanordnung in oder für einen Assay vorgesehen wird, insbesondere für High-Throughput-Anwendungen.

Es kann bei diesen Verwendungen und Anwendungen auch vorgesehen sein, dass bei ruhender Elektrodenanordnung die zu untersuchende und/oder zu behandelnde Spezies oder eine Mehrzahl davon auf die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen zu geführt werden.

Dabei kann es vorgesehen sein, dass das Bewegen der zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies auf die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen zu durch Kraftausübung auf die entsprechende Spezies bewirkt wird.

Denkbar ist, dass die Kraftausübung bewirkt wird durch eine dielektrophoretische Kraft.

Dabei kann es vorgesehen sein, dass die dielektrophoretische Kraft erzeugt wird durch das Erzeugen eines – insbesondere hochfrequenten – inhomogenen elektrischen Wechselfeldes zwischen der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen und der vorgesehenen Gegenelektrodenanordnung mit den Gegenelektroden.

Dabei kann es von Vorteil sein, dass die Elektrodenspitzen mit einer Wechselspannung im Bereich von etwa 10 mV bis etwa 300 V und/oder im Frequenzbereich von etwa 100 Hz bzw. etwa 60 MHz beaufschlagt werden, um die dielektrophoretische Kraft zu erzeugen.

Alternativ oder zusätzlich ist es denkbar, dass ein elektrischer Zellkäfig zur Mikropositionierung der Spezies während der dielektrophoretischen Annäherung verwendet wird.

Ferner kann es zusätzlich oder alternativ zur Erleichterung der Zellkontaktierung vorgesehen werden, dass die zu kontaktierende Zelle durch isoosmolare Lösungen prall aufgefüllt wird.

Durch Versteifungsreagentien können – z.B. durch EDTA oder Pluronium – können die Membran versteift und das Penetrieren der Elektrodenspitze erleichtert werden.

Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend weiter erläutert: Nachfolgend wird die erfindungsgemäße Elektrodenanordnung synonym auch als Fakirelektroden bezeichnet. Die Erfindung betrifft also insbesondere auch so genannte Fakirelektroden, deren Herstellung und deren Verwendung.

Problemstellung

Mit Hilfe elektrophysiologischer Techniken können die elektrischen Parameter von biologischen Systemen untersucht und manipuliert werden. Angewendet werden diese Techniken auf Zellverbände, einzelne Zellen, Fragmente von Zellmembranen und Liposomen und Proteoliposomen, letztere u.a. mit Hilfe von Techniken, die auf so genannten künstlichen Membranen beruhen). Im Folgenden wird das Spektrum dieser biologischen Systeme verkürzt „Zellen" genannt. All diesen elektrophysiologischen Techniken ist gemein, dass sie auch zur Untersuchung der Funktionseigenschaften bzw. zur Manipulation von (Membran)-Proteinen und den sie umgebenden Membranen eingesetzt werden.

Ein entscheidendes Problem der existierenden elektrophysiologischen Technologien, z.B. bei Voltage-, Current- und Patch-Clamp-Techniken, ist, dass mit diesen nur direkte elektrische Ableitungen an Zellen ab bestimmter Größe – z.B. mit einem Durchmesser größer als 10 μm – möglich sind, andererseits wobei an lebenden Zellen irreversible Schädigungen durch die Mikroelektroden erzeugt werden. Darüber hinaus sind diese Technologien bei mechanischen Einwirkungen instabil. Dies führt nach kurzem Zeitraum zu einer Zerstörung der Zelle. Es lässt sich auch feststellen, dass alle existierenden elektrophysiologischen Techniken den – insbesondere für kommerzielle Applikationen – schwerwiegenden Nachteil aufweisen, dass sie äußerst kompliziert sind und dadurch eine Automatisierung der Prozessführung bei diesen Techniken aufwendig und sehr fehleranfällig ist.

Die hier vorgestellte Erfindung weist die oben besagten Nachteile existierender Technologien nicht auf. Sie zeichnet sich durch eine hohe Robustheit, Flexibilität in der Anwendung aus und erlaubt sowohl indirekte wie auch direkte (reversible) elektrische Ableitungen an den eingesetzten Zellen.

Idee

Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem insbesondere eine elektrophysiologische Messanordnung für Zellen, Fusionszellen, Liposomen, Membranfragmente und Zellverbände – im Folgenden einfach als Zellen zusammengefasst – vor.

Die elektrische Manipulation der Zellen erfolgt durch eine oder mehrere Elektroden, die direkt in die Zellen eindringen. Die Größe der Elektroden hängt dabei vom verwendeten zellulären System ab. Die Elektrode wird bei sehr kleinen Zellen – Durchmesser im Bereich von 15 μm – einen sehr kleinen Durchmesser haben, z.B. im bereich von etwa 900 nm, und nur eine geringe Länge aufweisen, z.B. im Bereich von etwa 5 μm. Wichtig ist auch, dass die Fakirelektroden eine feine Spitze haben, z.B. kleiner als etwa 500 nm, um das zelluläre System beim Eindringen möglichst wenig zu verletzen.

1 zeigt eine mögliche elektrophysiologische Anordnung der hier vorgestellten Fakirtechnologie. Dargestellt ist eine Zelle, kontaktiert durch eine Fakirelektrode mit mehrfachen Spitzen.

Herstellungsarten der Fakirelektrode

Wichtige Eigenschaften der hier vorgestellten Fakir-Elektroden sind bei einigen Ausführungsformen

a) ihre geometrischen Abmessungen und/oder
b) das elektrisch isolierende Trägermaterial für die Elektrode.

Durch das Trägermaterial wird die freiliegende Länge der Elektrode bestimmt. Die Herstellung solcher Fakirelektroden aus Nanoelektrodenstrukturen und Trägermaterial ist Teil der hier vorgestellten Erfindung.

Wie in (1) ausgeführt, müssen die verwendeten Fakirelektroden bei einigen Anwendungen sowohl in ihrer Geometrie als auch in ihrer Länge Dimensionen in der Größenordnung von Nano- und Mikrometern aufweisen, und zwar abhängig vom verwendeten zellulären System: Der Durchmesser muss zwischen etwa 50 nm und etwa 5000 nm liegen, die Länge zwischen etwa 500 nm und etwa 250 μm. Die Fakirelektroden bestehen aus leitfähigen Materialien, vorzugsweise Metallen aus Silber, Gold, Platin, Wolfram und/oder Legierungen wie z.B. Pt-Ir und Au-Ir.

Herstellungsverfahren

Die Herstellung soll durch elektrisches oder elektrochemisches Ätzen z.B. von feinster Drähte, z.B. Durchmesser etwa 5 μm bis etwa 50 μm, z.B. eines entsprechenden Metalls oder einer entsprechenden Legierung erfolgen.

Ein Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von feinsten Ausgangsdrähten, z.B. von so genannten Bonddrähte oder von Drähten, die in ihren Eigenschaften diesen ähneln, weil der Ätzprozess bei kleinen Anfangsdurchmessern einfacher durchgeführt werden kann und bessere Ergebnisse erzielt werden können. Es können jedoch auch Drähte größeren Durchmessers als Ausgangsmaterial verwendet werden. Dieses Vorgehen erschwert jedoch den Ätzprozess. Durch den Ätzprozess werden Metalldrähte erhalten, die feinste Metallspitzen aufweisen. Diese derart geätzten Spitzen der Metalldrähte werden dann z.B. in eine geeignete Haltevorrichtung eingeführt, z.B. in einen Ring, ein Gitter, eine Kanüle, so dass der Draht von einem viskösen Polymer umfasst werden kann. Das visköse Polymer wird dabei durch Oberflächenspannung oder durch Felder in der Haltevorrichtung gehalten. Wichtig in diesem Zusammenhang ist, dass der Draht in die Haltevorrichtung eingeführt wird bevor das Polymer hinzu gegeben wird. Dies hat zur Folge, dass die feine Spitze des Drahtes nicht in Kontakt mit dem Polymer kommen kann und sich daher auch keine Ablagerungen des elektrisch isolierenden Polymers auf der Elektrode bilden können.

Anschließend erfolgt ein Mikropositionieren des Metall-Drahtes im Polymer, so dass die freiliegende Länge der geätzten Metallspitze die gewünschten Abmessungen hat. Anschließend wird das Polymer durch UV-Licht, durch Temperatur-Erhöhung oder andere physikalisch/chemische Prozesse ausgehärtet. Bei Bedarf kann während des Aushärteprozesses die Position der Metallspitze nachjustiert werden.

Die Detektion der freiliegenden Spitze erfolgt dabei z.B. über visuelle Mikroskopkontrolle oder bei automatisierter Prozessführung durch Laserabtastung bzw. andere Messsysteme. Die Justierung des Drahtes kann manuell oder automatisiert ablaufen, z.B. in Rückkopplung mit der optischen Kontrolle bzw. der Laserabtastung. Es werden Polymerwerkstoffe verwendet, die über hohe Viskosität verfügen, nur geringen Volumenänderungen während des Aushärteprozesses unterworfen sind und sich durch UV-Licht, Temperatur oder andere chemisch/physikalische Prozesse erhärten lassen.

Dieser Prozess kann auch mit mehreren voneinander unabhängigen geätzten Metalldrähten durchgeführt werden. Auf diesem Weg wird ein „Rasen" von elektrisch unabhängigen Elektroden erhalten.

Es ist auch Herstellungsverfahren mit Glas anstatt mit einem Polymer Denkbar. Dazu kann die Haltevorrichtung aus einer elektrischen Glühwendel bestehen. Dieses kann genutzt werden das Glas so zu erhitzen und zu verflüssigen, dass anschließend der Draht mikropositioniert werden kann. Das System kann dann darüber hinaus über ein Zuflusssystem für flüssiges und erhitztes Glas verfügen, so dass auch in diesem Fall der geätzte Draht zuerst durch die Haltevorrichtung geschoben werden kann und die freiliegende Spitze nicht mit flüssigem Glas in Kontakt kommt.

Kontaktierung von Zellen an Nanofakirelektroden

Die in oben vorgestellten Fakirelektroden sollen in Zellen eindringen, damit diese elektrisch ableitbar werden. Teil der hier vorgestellten Erfindung ist, dass die Elektroden nicht wie bei herkömmlichen System zur Zelle gebracht werden, sondern die Zelle zur Fakirelektrode. Dies soll durch das Applizieren einer dielektrophoretischen Kraft erreicht werden. Diese Kraft kann durch das Anlegen hochfrequenter, stark inhomogener Wechselfelder erzeugt werden und bewirkt bei geeigneten dielektrischen Eigenschaften der Zelle – in Bezug auf die dielektrischen Eigenschaften des Mediums – eine Wanderung der Zelle in Richtung der Fakirelektrode. Sie endet erst, wenn die Fakirelektrode im Inneren der Zelle ist. Dadurch wird die Zelle an die Fakirelektrode kontaktiert. Theoretische Erklärung: Bei konstanter Feldstärke nimmt die Kraft mit der Inhomogenität des Feldes zu, so dass bei elektrischen Feldern, die zwischen einer Spitze und einer planaren Referenzelektrode (daher rührt die Inhomogenität des Feldes her) existieren, die Kräfte so groß werden können, dass die Zelle auf atomaren Abstand an die Elektrode heran gezogen werden kann. Die Kraft auf die Zelle in einem solchen inhomogenen Wechselfeld nimmt weiterhin mit fallendem Abstand zur Fakir-Elektrode stark zu. Dies hat zur Folge, dass die Kontaktierung sehr schnell verläuft und das Eindringen der Metallspitze ein für die Membran der Zelle relativ stressfreier Vorgang ist. Dieser auf den ersten Blick verwirrender Befund lässt sich darauf zurückführen, dass die Membran aufgrund der Schnelligkeit des Heranführens an die Spitze schnell penetriert wird und sich dem Aufprall kaum widersetzt. Dies hat zur Folge, dass die Zelle den Prozess ohne Verlust ihrer Vitalität überstehen kann und der entstehende Komplex aus Elektrode und Zelle extrem stabil gegen mechanische Beeinflussungen ist.

Nanoinjektion von DNA und/oder von anderen Substanzen

Die beschriebene Kontaktierung der Zelle kann auch zur Nano- oder Mikroinjektion von bioaktiven Substanzen in zelluläre Systeme verwendet werden.

Dazu werden die Fakirelektroden vorher mit diesen Substanzen gecoated oder beschichtet. Dies kann z.B. bei Substanzen, die elektrischen Ladungen tragen (DNA), auch durch Anlegen entsprechender elektrischer Felder geschehen, die Kräfte auf die Partikel erzeugen und eine Bewegung zur Fakirelektrodenoberfläche bewirken. Wird die Zelle anschließend mit der Fakir-Elektrode kontaktiert, dann befindet sich die bioaktive Substanz in der Zelle. Vorteile bei diesem Verfahren sind einerseits der geringe Verbrauch bioaktiver Substanz, die beim „Animpfen" der Zelle verwendet wird, und die einfache Selektion der angeimpften Zellen von jenen, denen nichts injiziert wurde. Letzteres ist möglich, wenn man nach Kontaktierung das Zellmedium gegen ein zellfreies Medium austauscht und die Tochterzellen der angeimpften, kontaktierten Zellen erntet". Über die Messung der elektrischen Parameter der kontaktierten Zelle lässt sich zudem der Vitalitätszustand der Zellen bestimmen und es ist dadurch möglich optimal die Ernährung der Zellen zu steuern bzw. den Erntevorgang abzubrechen, falls die kontaktierten Zellen ihre Vitalität verlieren.

Herstellung eines Hybridsensorkopfes zur elektrischen Ableitung

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Nutzung von Fakirelektroden zu direkten oder intrazellulären elektrischen Ableitungen.

Dafür ist es erforderlich, dass die Fakirelektrode einen sehr hohen Abdichtungswiderstand gegenüber der Badlösung aufweist. Dadurch wird gewährleistet, dass der von der Fakirspitze gegen eine Referenzelektrode gemessene Widerstand (bzw. andere elektrische Parameter des Systems) ausschließlich von der Leitfähigkeit der „Zell"-Membran der mit der Fakir-Elektrode kontaktierten Zelle bestimmt wird. Die Etablierung eines hohen Abdichtwiderstandes ist also ein sehr wichtiger Bestandteil unser Erfindung.

Zunächst muss die Fakir-Elektrode (bzw. die Fakirbrett-Elektrode) bis auf die Spitzen der Fakir-Nadeln elektrisch abgedichtet werden. In (2) ist beschrieben wie dies bei unserer Erfindung erreicht wird.

Nach der Kontaktierung der Fakirspitzen mit den besagten Systemen ist es notwendig die Flächen der Fakir-Elektrode, die noch zur Badlösung freiliegen, abzudichten.

a) Dies kann durch nachträgliche Lipidbeschichtung dieser freiliegenden Elektrodenflächen erfolgen.
b) Eine andere Methode ist es Liposomen (50 nm bis 1 μm) mit Hilfe geeigneter hochfrequenter Wechselfelder anzuziehen bis alles Elektrodenmaterial abgedichtet ist.

Theoretische Erklärung: Das Verfahren beruht darauf, dass bei geeignet gewählten Bedingungen dielektrophoretische Kräfte nur auf Objekte bestimmten Durchmessers wirken. Bei Wahl geeigneter Frequenzen ist es daher möglich selektiv Objekte kleiner Größe anzuziehen (z.B. kleine Liposomen von 50 nm bis 1 μm) wobei große Objekte (z.B. Zellen von 20 μm Durchmesser) keine Kraft erfahren.

c) Auch Fusion weiterer Zellen oder Liposome an das System, das bereits kontaktiert ist, kann dazu verwendet werden den Abdichtwiderstand der Fakir-Elektrode zu erhöhen. Die Fusion kann durch moderate μs-Hochspannungspulse erreicht werden (um mehrere lateral oder vertikal dielektrophoretisch angeordnete Zellen elektrisch zu einem Fusionsprodukt zu verschmelzen, so genannte Elektrofusion, Dadurch entstehen gleichzeitig „Sensorköpfe" mit sehr großen, intakten Membranflächen.

Durch Verwendung von elektrischen Zellkäfigen soll der Prozess der Kontaktierung automatisiert werden.

Elektrische Messungen an Hybridsensorkopfen

Die elektrische Parameter der Zelle können über verschiedene elektrische Verfahren ermittelt werden:

a) Impedanzverfahren,
b) Voltageclampverfahren und
c) Currentclampverfahren.

Beim Voltageclampverfahren ist es erforderlich reversibel arbeitende Elektroden wie die Ag/AgCl-Elektrode zu verwenden. Eine Chlorierung der Silberfakirelektrode soll vorher und bei Bedarf auch nach Kontaktierung erfolgen. Im letzten Fall wird dafür das intrazellulär vorhandene Chlorid verwendet. Um Verunreinigungen oder Störungen bei diesem Prozess zu vermeiden, soll die Fakirelektrode in diesem Fall durch eine intrazelluläre Salzbrücke vom Zytosol abgetrennt sein. Diese Salzbrücke kann z.B. aus Hydrogelen, wie z.B. Alginat, bestehen, die mit Cl-haltigen Salzen dotiert sind.

Abhängig vom Verfahren müssen verschiedene Elektrodenmaterialien verwendet werden (siehe dazu (1) und (2)). Es sollen je nach Zweck verschiedene Verfahrensweise angewandt werden a) Verwendung einer einzeln Fakir-Elektrode zur Kontaktierung einer Zelle b) Verwendung mehrerer Fakir-Elektroden zur Kontaktierung einer Zelle d) Verwendung mehrerer Fakir-Elektroden zur Kontaktierung mehrerer Zellen. Im letzten Fall sollen die Fakirelektroden einerseits zusammen, andererseits einzeln abgegriffen werden.

Generell hat der Einsatz mehrerer Fakir-Elektroden den Vorteil, dass der Ausfall von einer oder mehreren Elektroden durch z.B. eine eventuelle Ablagerung von zytoplasmatischen Lipid- und Proteinkomponenten oder von Membrankomponenten bei der Penetrierung aufgrund des redundanten Systems kompensiert werden kann. Der Vorteil mehrerer unabhängige abgegriffener Fakirelektroden hat zusätzlich den Vorteil, dass parallel mehrere unterschiedliche Zellen simultan abgegriffen werden können und dadurch bei Einsatz äußerst geringer Lösungsvolumina viele voneinander unabhängige Ergebnisse ermittelt werden können.

Etablierung der Langzeitvitalität des Hybridsensorkopfes

Für kommerzielle Applikationen der hier vorgestellten Erfindung ist es von entscheidender Bedeutung nicht nur ein mechanisch stabiles System zu erzeugen, sondern gleichzeitig auch die Funktion des Systems über einen langen Zeitraum aufrecht zu erhalten. Die Grundvoraussetzungen hierfür sind weiter oben bereits geschildert. Eine weitere Maßnahme zur Erhöhung der mechanischen Stabilität des Komplexes aus Fakir-Elektrode und kontaktierte Zelle ist die Einbettung dieses Komplexes (des „Hybrid-Sensorkopfes) in eine vernetzte Hydrogelmatrix (die z.B. aus einer mit Ba²⁺-Ionen vernetzten Alginatmatrize besteht). Diese Immobilisierung des Komplexes gewährleistet gleichzeitig eine Langzeit-Vitalität des Komplexes und erleichtert auch die (Kryo-)Konservierung der Hybrid-Sensorköpfe.

Anwendungsgebiete des Hybridsensorkopfes

Die hier vorgestellte Erfindung könnte bestehende elektrophysiologische Technologien komplementär ergänzen. Sie soll in verschiedenen Variationen zur Anwendung kommen. Hintergrund hierfür liegt darin, dass zum Beispiel der Transmembran-Widerstand (ein wichtiger elektrischen Parameter des Zelle) von den Ionenkanälen in der Membran eines Systems abhängt, deren elektrische Leitfähigkeit spezifisch über ein breites Spektrum von Analyten (Liganden, Inhibitoren etc.) beeinflusst wird/werden kann.

Deshalb kann die Fakir-Technologie in Screeningtools (z.B. High-Throughput-Drug-Target-Verfahren) eingesetzt werden. Dazu werden so genannte Targets (z.B. Membranproteine wie Ionenkanäle, siehe oben) in die Membran des Sensorkopfes eingebaut (durch z.B. heterologe Überexpression von Proteinen oder Dotierung mit rekonstituierten Proteinen). Derartige, aus Fakirelektroden und kontaktierten Zellen entstandene Hybrid-Sensorköpfe erlauben das Screenen eines breiten Spektrums von Wirkstoffen in analytischen Laboratorien („High throughput-Screening", „Lab on the Chip") sowie unter insitu-Bedingungen (als „Lab in the Probe" im humanen/tierischen und pflanzlichen System). Zusätzlich zu nativen Zellen sollen tierische und pflanzliche Sensorzellen verwendet werden, die über spezifische heterologe Überexpression von Transportern oder Zell-Zell- bzw. Zell-Membranfusion maßgeschneidert hergestellt werden können. Spezifisch auslegbare Sensorköpfe können als Disposables zur universellen elektronischen Peripherie vorgehalten werden. Die Sensoreinheiten können sowohl einzeln als auch in Form von Mikromodulen, vergleichbar mit Mikrotiterplatten, hergestellt werden. Letztere Konfiguration garantiert durch die Möglichkeit redundanter Messungen mit vergleichbaren Sensorköpfen unter identischen Messbedingungen eine sehr hohe Zuverlässigkeit der Analytik. Darüber hinaus können bei Verwendung unterschiedlicher maßgeschneiderter Sensorköpfe auf demselben Modul auch komplexe Nachweise multipler Komponenten in kleinen Probenvolumina, z.B. zum Zweck von Drugscreenings, mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden.

Für in-situ-Anwendungen muss der Sensorkopf in eine Sonde integriert werden – lab-in-the-probe – die den direkten, minimalinvasiven Zugang zu flüssigkeitsgefüllten Kompartimenten pflanzlicher oder tierischer/menschlicher Systeme ermöglicht. Für die Ableitung der Signale und für die Versorgung der Zellen mit geeigneten Medien soll die neue Sensorkopf-Technologie mit einem miniaturisierten Schlauch/Drucksensor/Kathetersystem verbunden werden. Für die schnelle und routinemäßige Vermessung von Wirkstoffkonzentrationen in intakten Pflanzen ist außerdem die Integration der Sensorkopf-/Katheteranordnung in einen Messautomaten nach dem Prinzip einer Gürtellochzange geplant.

Aspekte des Kontaktierens

Ein wichtige Voraussetzung, Zellen erfolgreich kontaktieren zu können, sind die Form der Spitze der Elektrodenspitze 40s und insbesondere deren Radius oder Krümmungsradius Ks am distalen Ende 40d der Elektrodenspitze 40s, dieser sollte nicht über 1/10 des Durchmessers Dz der zu penetrierenden Zelle Z liegen.

Weiterhin ist es von Vorteil, wenn die Zellmembran M gespannt ist, sprich die Zelle Z gefüllt ist. Dies kann durch Verwendung nicht isoosmolare Lösungen erreicht werden, in denen die Zellen Z inkubiert werden oder die als Messmedien 30 verwendet werden.

Für ein erfolgreiches Kontaktieren ist weiterhin hilfreich, dass – passend zum Durchmesser Dz der Zelle Z und zum Abstand der Zelle Z von der Fakirelektrode 40s die richtige dielektrophoretische Kraft erzeugt wird. Die Parameter für diesen Prozess werden für jeden Zelltyp abhängig von oben genannten Bedingungen gewählt. Sie liegen in den angegebenen Bereichen. Nicht notwendig, aber günstig ist die Applikation eines modulierten Wechselfeldes, d.h. eines elektrischen Feldes, welches sich in vorprogrammierter Weise während des Anziehexperiments verändert. Der Zeitbereich zur Erzeugung der anziehenden Kraft liegt bei etwa 10 μs bis etwa 30 s.

Die Modulation des Wechselfeldes kann über die Amplitude – Erniedrigung der Amplitude, z.B. als Rampenprotokoll, insbesondere linear oder exponentiell – oder über die Frequenz erfolgen.

Theoretischer Hintergrund

Die dielektrophoretische Kraft umgekehrt proportional zur fünften Potenz des Abstandes zwischen der Zelle Z und der Fakirelektrode 40s. Der Anziehungsprozess ist so beschaffen, dass zunächst durch Wahl geeigneter Frequenzen und hoher Amplituden eine relativ geringe Kraft auf die Zelle Z erzeugt wird. Nähert sich die Zelle Z der Elektrode 40s, so wird die Kraft schnell größer und die Zelle Z kann – wenn die ursprünglichen Feldparameter beibehalten werden – drastisch beschleunigt werden. Dies kann zu einer zu schnellen Bewegung der Zelle und zur Zerstörung der Zelle Z, z.B. durch Platzen, bei der Kontaktierung führen. Hingegen führen zu niedrige Anziehkräfte dazu, dass die Zelle Z nicht durch die Fakirelektrode 40s penetriert wird, weil der mechanische Widerstand der Membran M der Zelle dann nicht überwunden werden kann.

Herstellung von Fakirelektroden

Eine weitere Möglichkeit eine Art von Fakirelektroden kostengünstig im industriellen Maßstab herzustellen ist unter Verwendung von automatisierten Bonding-Maschinen gegeben. Diese werden heutzutage vor allem bei der Kontaktierung von Computerplatinen/Chips eingesetzt. Ausgehend von einer aus Isolator-Material bestehendem Wafer (Kunststoff, Glas, etc.), der mit elektrisch ableitbaren Flächen versehen ist, können diese individuell mit einem Bonddraht versehen werden. Dieser Bonddraht, einseitig mit den elektrisch leitenden Stellen des „Chips" kontaktiert, kann in einem Folgeschritt automatisiert an seinem zweiten Ende durch eine entsprechend automatisierte Applikation elektrischer Felder elektrochemisch geätzt werden. Alternativ kann eine entsprechende Bonding-Prozedur gewählt werden, die den Bonddraht mit geeigneten geometrischen Proportionen (Länge, Dicke, Spitze) an den Chip anbringt. Die elektrisch leitenden Stellen, die einzeln abgreifbar sein sollen, des Chips sollen einen Durchmesser haben, der geringer als der der eingesetzten Zelle (oder Fusionszelle) ist. D.h. er sollte im Normalfall im Bereich von etwa 5 μm bis etwa 100 μm liegen. Wird als Trägermaterial Glas, z.B. Borosilicat, gewählt, so ist zu erwarten, dass die Zellen sehr gut kontaktieren (vergleiche Patch-Clamp-Technik). Dies ist auch zu erwarten bei der Verwendung von geeigneten Kunststoffen. Techniken zum nachträglichen Abiso lieren – wie sie bereits beschrieben wurden – können bei Bedarf ebenfalls zum Einsatz kommen.

Automatisierter Einsatz der Fakirelektrode in Kombination mit Zellkäfigen

Der automatisierte Einsatz der Fakirelektrode in maschinellen Systemen (Sensorsysteme, High-Throughput-Systeme, etc.) soll dadurch erreicht werden, dass der Chip. der die Fakir-Elektroden trägt, in eine Mikrofluidikkammer eingesetzt werden kann. Diese Kammer soll durch geeignete Systeme, basierend auf dem Prinzip der elektrischen Zellkäfige, gewährleisten, dass Zellen automatisch und in Hinblick auf die einzelnen Fakir-Spitzen exakt gegenüber den Fakirelektroden positioniert werden können. Dies soll gewährleisten, dass das System mit automatisch applizierten Dielektrophoresprotokollen Zellen – wie bereits beschrieben – kontaktiert werden können. Das Mikrofluidiksystem soll auch die Möglichkeit des Lösungswechsels zulassen.

Weitere Aspekte des elektrochemischen Herstellens

Im Folgenden sind mögliche Bedingungen für das elektrochemische Ätzen im Rahmen einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens angegeben.

Vorbereiten der Chips

• Glaskapillare auf ca. 3 mm Länge brechen, und zwar mit möglichst glatter Bruchkante.
• Kapillare in Chiphalterung einsetzen.
Kapillarende mit feinem Sandpapier, z.B. (Körnung 1200, abschleifen bis Bruchkante glatt und scharf ist. Kapillare entnehmen und gewendet einsetzen.
• Kapillarende mit feinem Sandpapier, z.B. (Körnung 1200, abschleifen bis Bruchkante glatt und scharf ist.
• Kapillare in gewünschte Position bringen.
• Kapillare mit UV-Kleber befestigen.
• In Trockenschrank bei 105°C oder unter UV-Lampe härten.

Herstellung des Elektrodenrohlings (z.B. unter einem Binokular)

• Drahtstück, z.B. aus Ag, von 25 μm Durchmesser z.B. auf ca. 1,5 cm ablängen.
• Auf einer sauberen Fläche glätten, z.B. mit Fingerspitze. • Chip-Rohling in den Chiphalter einspannen.
• Drahtstück durch die Glaskapillare fädeln, z.B. mit Pinzette und/oder auf maximal 4 mm herausragend.
• Hinteres Ende des Drahtes am Metall des Chiphalters verankern, z.B. mit Leitsilber.
• Zwei Minuten trocknen lassen.
• Dann Chiphalter z.B. am Mikromanipulator anbringen.
• Stromklemme an Chiphalter anbringen.

Dann folgt die eigentliche

Elektrochemische Behandlung des Elektrodenrohlings (z.B. unter einem Binokular)

• Drahtende in der Mitte des Blickfeldes fixieren.
• Einen Tropfen Ätz-Lösung (z.B. Perchlorsäure:Methanol = 1:4) in Ätzöse einhängen.
• Spannung anlegen (z.B. 2 V Gleichspannung, Öse negativ, Draht positiv).
• Die Lösung mit Hilfe der Schubschrauben kurz über das Drahtende schieben und direkt wieder zurückziehen.
• Vorgang solange wiederholen bis die gewünschte Spitzenform erreicht ist. So lassen sich unter Beobachtung die Spitzen quasi feilen.
• Eventuell Draht mit Schrauben des Chiphalters nachschieben

Manufakturstation - Variante-1-Chips

• Chiphalter am rechten Manipulator anbringen.
• Ende der Kapillare im Blickfeld zentrieren.
• Drahtspitze 1–2 mm herausschauen lassen und in der Kapillare zentrieren.
• Abzugshaube nähern.
• Spritze mit UV-Kleber in Position bringen.
• Kleber durch Kapillarkräfte in die Kapillare ziehen lassen, überlaufen vermeiden.
• Draht vorsichtig zurückziehen und dabei eventuell Position korrigieren, bis die Drahtspitze nur noch wenige μm übersteht (40er-Objektiv).
• UV-Licht zum Aushärten einschalten und die ersten 2 Minuten beobachten. Eventuell korrigieren.
• Objektiv wechseln, damit Chip vollständig von UV-Licht bestrahlt wird und eine halbe Stunde aushärten lassen.

Fertigstellung - Variante-1-Chips

• Mikroskopische Aufnahmen der Spitze machen.
• Draht aus dem Chiphalter lösen und Drahtende durch Leitsilber mit Metall des Chips verbinden.
• 5 Minuten warten.
• Mit UV-Kleber Kontaktstelle versiegeln 1 h bei 105°C im Trockenofen härten.
• Fertigen Chip in die Kammer einsetzen oder bis zur Verwendung aufbewahren.

Manufakturstation - Variante-2-Chips

• Chiphalter am rechten Manipulator anbringen.
• Chip an der Halterung des linken Mikromanipulators anbringen.
• Bohrloch ins Blickfeld bringen und linke Seite des Chips im Blickfeld zentrieren.
• Mit Hilfe des rechten Manipulators und dem Chiphalters Drahtspitze durch das Bohrloch des Chips manövrieren und 1– 2 mm herausschauen lassen.
• Im Bohrloch zentrieren.
• Abzugshaube nähern.
• Spritze mit UV-Kleber in Position bringen.
• Kleber durch Kapillarkräfte in das Bohrloch ziehen lassen, überlaufen vermeiden.
• Draht vorsichtig zurückziehen, bis die Drahtspitze nur noch wenige μm übersteht (40er-Objektiv).
• UV-Licht zum Aushärten einschalten und die ersten 2 Minuten beobachten.
• Eventuell korrigieren.
• Objektiv wechseln, damit Chip vollständig von UV-Licht bestrahlt wird und eine halbe Stunde aushärten lassen.
• Mikroskopische Aufnahmen der Spitze herstellen.

Fertigstellung Variante 2-Chips

• Draht aus dem Chiphalter lösen und Drahtende am Chip mit Leitsilber beträufeln
• Fertigen Chip in die Kammer einsetzen oder bis zur Verwendung aufbewahren.

Im Folgenden sind noch einige Bedingungen in einer Tabelle angegeben, die bei der Spitzenherstellung berücksichtigt werden können. Die Publikationen sind im Abschnitt zitierte Literatur im Detail angegeben.

Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend anhand der beigefügten Figuren erläutert, welche exemplarisch Ausführungsformen der Erfindung zeigen:
1 ist eine schematische und geschnittene Seitenansicht einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung mit einer Elektrodenspitze.
2 ist eine schematische und geschnittene Seitenansicht einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung mit einer Mehrzahl Elektrodenspitzen.
3A, 3B sind schematische und geschnittene Seitenansicht einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung, einmal mit und einmal ohne kontaktierte biologische Zelle.
4A–4D sind schematische und geschnittene Seitenansichten verschiedener weiterer Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung.
5A, 5B demonstrieren in Form einer schematischen und geschnittenen Seitenansicht bzw. einer schematischen Draufsicht auf eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung bestimmte Details der Erfindung.
6 ist eine schematische Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung.
7 ist eine schematische und geschnittene Seitenansicht einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung.
8–10 zeigen in Form mikroskopischer Aufnahmen bestimmte Anwendungsfälle, wie sie für die erfindungsgemäße Elektrodenanordnung in Frage kommen.
Nachfolgend werden strukturell und/oder funktionell ähnliche oder äquivalente Strukturen oder Verfahrensschritte mit denselben Bezugszeichen bezeichnet. Nicht in jedem Fall ihres Auftretens wird eine Detailbeschreibung der strukturellen Elemente oder Verfahrensschritte wiederholt.
1 ist eine schematische und geschnittene Seitenansicht, welche eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 und deren Anwendung bei der Untersuchung einer Zelle Z beschreibt.
Die Ausführungsform der hier gezeigten erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 basiert auf einem Träger 20 oder Trägersubstrat 20 mit einer Oberfläche 20a und einer Unterseite 20b. In den Träger 20 sind ein Kontaktbereich 40K zum Teil und der Anschlussbereich 40A vollständig integriert ausgebildet, und zwar derart, dass die den Kontaktbereich 40K der Elektrodenanordnung 10 bildende Elektrodenspitze 40s mit ihrem dem Anschlussbereich 40A zugewandten oder proximalen Ende 40p vollständig unterhalb der Oberfläche 20a des Trägers 20 und mit ihrem distalen Ende 40d, welches vom Anschlussbereich 40A abgewandt ist, strikt oberhalb der Oberfläche 40a des Trägers 40 ausgebildet ist. Der Anschlussbereich 40A wird von einer Basis 40b gebildet, die einen einstückigen Materialbereich – hier in Form einer planaren Platte – realisiert, dessen Oberseite 40ba mit dem proximalen Ende 40p der Elektrodenspitze 40s kontaktiert ist und deren Unterseite 40bb bündig mit der Unterseite 20b des Trägers 20 abschließt und somit eine externe Kontaktierung erlaubt.
Über den Kontaktbereich 40K mit der Elektrodenspitze 40s und deren distalem Ende 40d erfolgt ein elektrischer Abgriff in das Innere I einer kontaktierten Zelle Z, indem das distale Ende 40d der Elektrodenspitze 40s durch die Zellmembran M hindurch in das Innere I der Zelle Z eindringt und so über die Leitfähigkeit der Elektrodenspitze 40s einen entsprechenden elektrischen Abgriff realisiert. Somit kann über den äußeren Messkreis 60 und die Anschlussleitungen 61 und 62 eine Strommessung oder Spannungsmessung erfolgen, so dass durch das transmembrane Protein P verschobene Ladungsträger als entsprechende Verschiebungsströme I(t) als Funktion der Zeit gemessen werden können, wobei die Elektrodenspitze 40s als erste Elektrode der Elektrodenanordnung 10 und eine in der Oberfläche 20a vorgesehene Referenzelektrode R als entsprechende zweite Messelektrode ausgebildet sind, wobei der Stromkreis durch das entsprechend vorzusehende wässrige Messmedium 30 geschlossen wird.
Dabei ist wichtig, dass über den elektrisch isolierenden Träger 20 and den mechanischen Kontaktstellen X zwischen Zelle Z und Träger 20 ein hoher elektrischer Abdichtwiderstand realisiert ist, um die Elektrodenanordnung 10 nicht kurz zu schließen.
Die Referenzelektrode R kann, wie eben gezeigt wurde, als Messelektrode dienen. Denkbar ist aber auch, dass diese Referenzelektrode R zur dielektorphoretischen Annäherung und Kontaktierung der Zelle Z mit dem Kontaktbereich 40K genutzt wird, indem diese eine Gegenelektrode 51 einer Gegenelektrodenanordnung 50 bildet.
Alternativ oder zusätzlich kann die Gegenelektrodenanordnung 50 auch eine Gegenelektrode 51 aufweisen, welche der Elektrodenspitze 40s des Kontaktbereichs gegenübersteht, wie dies durch eine gestrichelte Darstellung angedeutet ist.
Die Ausführungsform der 1 wird mit nur einer einzigen Elektrodenspitze 40s im Kontaktbereich 40K definiert.
Es sind jedoch auch Ausführungsformen denkbar, bei welchen der Kontaktbereich 40K der Elektrodenanordnung 10 über eine Mehrzahl, insbesondere gleichartiger oder gleich wirkender, Elektrodenspitzen 40s definiert wird.
Die Anordnung der 2 zeigt eine solche Ausführungsform mit mehreren gleichartigen Elektrodenspitzen 40s im Kontaktbereich 40K.
Die Ausführungsform der hier gezeigten erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 basiert auf einem Träger 20 oder Trägersubstrat 20 mit einer Oberfläche 20a und einer Unterseite 20b. In den Träger 20 sind wieder ein Kontaktbereich 40K zum Teil und ein Anschlussbereich 40A vollständig integriert ausgebildet, und zwar derart, dass die den Kontaktbereich 40K der Elektrodenanordnung 10 bildende Elektrodenspitze 40s mit ihrem dem Anschlussbereich 40A zugewandten oder proximalen Ende 40p vollständig unterhalb der Oberfläche 20a des Trägers 20 und mit ihrem distalen Ende 40d, welches vom Anschlussbereich 40A abgewandt orientiert ist, strikt oberhalb der Ober fläche 40a des Trägers 40 liegt. Der Anschlussbereich 40A wird ebenfalls von einer so genannten Basis 40b gebildet, die einen einstückigen Materialbereich realisiert, dessen Oberseite 40ba mit dem proximalen Ende 40p der Elektrodenspitze 40s kontaktiert ist und deren Unterseite 40bb bündig mit der Unterseite 20b des Trägers 20 abschließt und somit wieder eine externe Kontaktierung erlaubt.
Über den Kontaktbereich 40K, hier mit einer Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s, und den distalen Enden 40d der Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s erfolgt ein elektrischer Abgriff in das Innere I einer kontaktierten Zelle Z, indem die distalen Enden 40d der Elektrodenspitzen 40s durch die Zellmembran M hindurch in das Innere I der Zelle Z eindringen und so über die Leitfähigkeit der Elektrodenspitzen 40s als Elektrode einen entsprechenden elektrischen Abgriff realisieren. Somit kann über den äußeren Messkreis 60 und die Anschlussleitungen 61 und 62 eine Strommessung oder Spannungsmessung erfolgen, so dass durch das transmembrane Protein P verschobene Ladungsträger als entsprechende Verschiebungsströme I(t) als Funktion der Zeit gemessen werden können, wobei die Elektrodenspitze 40s als erste Elektrode der Elektrodenanordnung 10 und eine in der Oberfläche 20a vorgesehene Referenzelektrode R als entsprechende zweite Messelektrode ausgebildet ist, wobei der Stromkreis durch das entsprechend vorzusehende wässrige Messmedium 30 geschlossen wird.
Die Referenzelektrode R kann wieder als Messelektrode dienen. Denkbar ist aber auch wieder, dass diese Referenzelektrode R zur dielektorphoretischen Annäherung und Kontaktierung der Zelle Z mit dem Kontaktbereich 40K genutzt wird, indem diese eine Gegenelektrode 51 einer Gegenelektrodenanordnung 50 bildet. Alternativ oder zusätzlich kann die Gegenelektrodenanordnung 50 auch eine Gegenelektrode 51 aufweisen, welche den Elektrodenspitzen 40s des Kontaktbereichs gegenübersteht, wie dies durch eine gestrichelte Darstellung angedeutet ist.
Die in den 3A und 3B dargestellte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 unterscheidet sich nur dadurch von der Ausführungsform, welche in 2 dargestellt ist, dass die Oberfläche 20a des Trägers 20 nicht strikt planar verläuft, sondern im Bereich der Elektrodenspitzen 40s eine konkave Vertiefung 22 bilden, insbesondere in Form einer Mulde, so dass, wie das im Übergang vom Zustand der 3A zum Zustand der 3B deutlich wird, eine sich annähernde Zelle Z besser an die Oberfläche 20a im Bereich der Ausnehmung 22 an die Oberfläche anschmiegen kann, so dass bessere Abdichtwiderstände an den Stellen X gegenüber dem vorgesehenen Messmedium 30 zur Vermeidung von Kurzschlüssen möglich sind.
Die 4A bis 4D zeigen in schematischer und geschnittener Seitenansicht verschiedene Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10.
Diese Ausführungsformen sind jeweils ohne einen Träger 20 oder Trägersubstrat 20 dargestellt und zeigen ausschließlich den Kontaktbereich 40K in Form einer oder mehrerer Elektrodenspitzen 40s und den Anschlussbereich 40A jeweils in Form einer einstückig ausgebildeten Basis 40b nach Art einer planaren Platte mit einer Oberseite 40ba und einer Unterseite 40bb.
Bei der Ausführungsform der 4A ist eine einzelne Elektrodenspitze 40s vorgesehen, die den Kontaktbereich 40K der Elektrodenanordnung 10 definiert und die mit ihrem proximalen Ende 40p an der Oberseite 40ba angebracht und kontaktiert ist. Die Elektrodenspitze 40s und die Basis 40b als Anschlussbereich 40A sind einstückig ausgebildet.
Im Gegensatz dazu ist in der 4B dargestellt, dass eine einzelne und separate Elektrodenspitze 40s, die den Kontakt bereich 40K der Elektrodenanordnung 10 bilden soll, auch in einem nachgeschalteten Vorgang an der Oberseite 40ba der Basis 40b angebracht werden kann, so dass sich eine einteilige Struktur ergibt, wie dies in 4B dargestellt ist.
Die 4C zeigt ebenfalls eine einstückige Ausgestaltungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10, diesmal aber mit einer Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s, die jeweils mit ihren proximalen Enden auf der Oberseite 40a des Trägers 40b ausgebildet sind.
Im Gegensatz dazu ist in der 4D wieder eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 gezeigt, bei welcher keine Einstückigkeit vorliegt zwischen den Elektrodenspitzen 40s und der Basis 40b. Vielmehr sind die Elektrodenspitzen 40s, welche den Kontaktbereich 40K der Elektrodenanordnung 10 der 4D bilden sollen, auf der Oberseite 40ba in einem nachgeschalteten Prozess aufgebracht, elektrisch und mechanisch kontaktiert.
Die Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10, die in den 5A und 5B in Form einer schematischen und geschnittenen Seitenansicht bzw. in Form einer schematischen Draufsicht dargestellt ist, zeigt eine Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s, die in einer Reihe auf der Basis 40b in Form einer planaren Platte angeordnet sind, und zwar in nicht einstückiger Art und Weise. Es sind auch hier noch einmal die distalen Enden 40d und die proximalen Enden 40p der Elektrodenspitzen 40s dargestellt, die von der Oberseite 40ba der Basis 40b abgewandt bzw. zugewandt und mit dieser in Kontakt stehend ausgebildet sind. Die in den 5A und 5B gezeigten Elektrodenspitzen 40s weisen eine Länge Ls auf und sind paarweise zueinander äquidistant beabstandet mit gleichen Abständen dd, ds. Auch ist ihre geometrische Ausgestaltung gleich. Das bedeutet, dass sie den gleichen quadratischen Querschnitt mit einer Kantenlänge Dp und einem entsprechenden Durchmesser Dp im Bereich des distalen Endes 40p besitzen. Die Elektrodenspitzen 40s sind gleich lang und erstrecken sich streng monoton verjüngend bis zu ihrer Spitze hin.
6 zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung, bei welcher eine Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s, welche den Kontaktbereich 40K der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 bilden, in Form einer quadratischen Matrix angeordnet sind mit einem gleichen Abstand dd, ds voneinander sowie mit einem identischen Durchmesser Dp, welcher hier den Durchmesser des mit kreisförmigem Querschnitt versehenen proximalen Endes 40p der jeweiligen Elektrodenspitzen 40s beschreibt.
Die 7 zeigte eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung, bei welcher eine Art Rasen einer Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s auf der Basis 40b der Elektrodenanordnung 10 vorgesehen ist.
Die 8 bis 10 zeigen mikroskopische Aufnahmen entsprechender Anwendungen einer erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 mit einer einzelnen Elektrodenspitze 40s, die mit einer Testzelle Z in Kontakt steht.
Zitierte Literatur

[1] Iwami et al., "Preparation of silver tips for scanning tunneling microscopy imaging", Rev. Sci. Instr. Vol. 69, Nr. 11, S. 4010–4011, 1998.
[2] Libioulle et al., "Very sharp platinum tips for scanning tunneling microscopy", Rev. Sci. Instr. Vol. 66, Nr. 1, S. 97–100, 1995.
[3] Melmed, Alan J., "The art and science and other aspects of making sharp tips", J. Vac. Sci. Technol. B Vol. 9, Nr. 2, S. 601–608, 1991.
[4] Oliva et al., "Electrochemical preparation of tungsten tips for a scanning tunneling microscope", Rev. Sci. Instr. Vol. 67, Nr. 5, S. 1917–1920, 1996.

10: erfindungsgemäße Elektrodenanordnung
20: Träger, Trägersubstrat
20a: Oberfläche, Oberflächenbereich, Oberseite
20b: Unterseite
30: Messmedium
40A: Anschlussbereich
40b: Basis, Basisbereich
40ba: Oberfläche, Oberflächenbereich, Oberseite
40bb: Unterseite
40d: distales Ende
40K: Kontaktbereich
40p: proximales Ende
40s: Elektrodenspitze
50: Gegenelektrodenanordnung
51: Gegenelektrode
60: Messkreis
61: Messleitung
62: Messleitung
Dd: Durchmesser der Elektrodenspitze am distalen
: Ende 40d
dd: Abstand der Spitzen oder distalen Enden 40d
: der Elektrodenspitzen
Dp: Durchmesser der Elektrodenspitze am proxima
: len Ende 40p
dp: Abstand der proximalen Enden 40d der Elektro
: denspitzen
ds: Abstand der Spitzen der Elektrodenspitzen
Dz: Durchmesser der Zelle oder Spezies
I: Innenraum der Zelle oder Spezies
Ks: Krümmungsradius der Spitzen der Elektroden
: spitzen
Ls: Länge der Elektrodenspitze
M: Zellmembran
P: Transmembranprotein
Z: biologische Zelle, Spezies
αs: Öffnungswinkel der Spitzen der Elektroden
: spitzen

Claims

Elektrodenanordnung (10) für elektrophysiologische Untersuchungen biologischer Zellen und dergleichen – welche mit einem Kontaktbereich (40K) ausgebildet ist zum elektrischen Kontaktieren der Elektrodenanordnung (10) mit mindestens einer biologischen Spezies (Z) oder Zelle (Z) oder dergleichen und – welche mit einem Anschlussbereich (40A) ausgebildet ist zum externen elektrischen Anschließen der Elektrodenanordnung (10), – wobei der Kontaktbereich (40K) mit einer Elektrodenspitze (40s) oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) als Elektroden ausgebildet ist, die sich vom Anschlussbereich (40A) der Elektrodenanordnung (10) her erstrecken, und – wobei die Elektrodenspitzen (40s) jeweils mit einer geometrischen Gestalt ausgebildet sind, die im Betrieb ein ansonsten zerstörungsfreies Eindringen in eine biologische Spezies (Z) oder Zelle (Z) oder dergleichen über deren Membran (M) in deren Inneres (I) erlaubt.
Elektrodenanordnung nach Anspruch 1, – bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) sich jeweils vom Anschlussbereich (40A) her monoton oder streng monoton verjüngend erstreckend ausgebildet sind oder – bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) sich jeweils vom Anschlussbereich (40a) her zylindrisch oder quaderförmig verlaufend und am vom Anschlussbereich (40a) abgelegenen und distalen Ende (40d) der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) mit einer sich monoton oder streng monoton verjüngenden Spitze ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) mit einem Querschnitt ausgebildet sind, der rund, kreisförmig, elliptisch, rechteckig oder quadratisch ist.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) mit einem dem Anschlussbereich (40A) zugewandten oder den Anschlussbereich (40A) bildenden ersten und proximalen Ende (40p) ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach Anspruch 4, bei welcher der Durchmesser (Dp) der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) am proximalen Ende (40p) im Bereich von etwa 50 nm bis etwa 5000 nm ausgebildet ist.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 4 oder 5, bei welcher der Durchmesser (Dp) der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) am proximalen Ende (40p) unterhalb von etwa 1/10 des Durchmessers (Dz) einer zu kontaktierenden Spezies (Z) liegt.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) mit einem vom Anschlussbereich (40A) abgewandten zweiten und distalen Ende (40d) ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach Anspruch 7, bei welcher der Durchmesser (Dd) der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) am distalen Ende (40d) im Bereich von 1/10 des Durchmessers (Dz) einer zu kontaktierenden Spezies (Z) ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 7 oder 8, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) am distalen Ende (40d) mit einem Krümmungsradius (Ks) im Bereich von etwa 5 nm bis etwa 50 nm ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 7 bis 9, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) im Bereich der distalen Enden (40d) mit einem spitzen Winkel (αs) im Bereich von etwa 10° bis etwa 50° als Öffnungswinkel der jeweiligen Spitze ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) vom Anschlussbereich (40a) her eine Länge (Ls) im Bereich von etwa 4/5 dem Durchmesser (Dz) einer zu kontaktierenden Spezies (Z) aufweisen.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher der Kontaktbereich (40K) mit einer Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet ist.
Elektrodenanordnung nach Anspruch 12, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) geometrisch gleich und/oder gleich wirkend ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher der Anschlussbereich (40A) als materiell zusammenhängende Basis (40b) mit einer Oberfläche (40ba) und einer Unterseite (40bb) ausgebildet ist.
Elektrodenanordnung nach Anspruch 14, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) sich von der Oberfläche (40ba) der Basis (40b) aus erstreckend ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 14 oder 15, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) sich von der Oberfläche (40ba) der Basis (40b) aus senkrecht oder im Wesentlichen senkrecht erstreckend ausgebildet sind, zumindest lokal.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 12 bis 16, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) zueinander gleich orientiert und parallel oder im Wesentlichen parallel ausgerichtet ausgebildet sind, zumindest lokal.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 12 bis 17, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) in Form einer Reihe Matrix oder senkrechten Matrix auf der Oberseite (40ba) der Basis (40b) angeordnet ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 12 bis 17, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) mit gleichen paarweisen Abständen (dd, dp) direkt benachbarter Elektrodenspitzen (40s) in den Hauptachsenrichtungen ihrer Anordnung angeordnet ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 19, bei welcher die Oberfläche (40ba) der Basis (40b) planar ausgebildet ist, zumindest lokal.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 20, bei welcher die Basis (40b) und die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) miteinander einstückig als integraler materieller Bereich ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 20, bei welcher die Basis (40b) und die Elektrodenspitzen (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen einteilig miteinander verbunden ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 22, bei welcher die Basis (40b) und die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) aus demselben, insbesondere elektrisch leitfähigen Material ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) als elektrochemisch geätzte Strukturen ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher ein Träger (20) mit einer Oberfläche (20a) und einer Unterseite (20b) aus einem elektrisch isolierenden Material ausgebildet ist.
Elektrodenanordnung nach Anspruch 25, bei welcher die proximalen Enden (40p) der Elektrodenspitzen (40s) und gegebenenfalls die Basis (40b) im Träger (20) eingebettet und echt unterhalb der Oberfläche (20a) des Trägers (20) und die distalen Enden (40d) der Elektrodenspitzen (40s) echt oberhalb der Oberfläche (20a) des Trägers (20) ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 25 oder 26, bei welcher die Oberfläche (20a) des Trägers (20) vollständig oder lokal konform und insbesondere parallel zur Oberfläche (40ba) der Basis (40b) verlaufend ausgebildet ist.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 25 bis 27, bei welcher die Oberfläche (20a) des Trägers (20) vollständig oder lokal planar, konvex und/oder konkav ausgebildet ist.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 25 bis 28, bei welcher die Oberfläche (20a) des Trägers (20) planar oder im Wesentlichen planar und mit konkaven Vertiefungen (22) im Bereich der proximalen Enden (40p) der Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet ist.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 25 oder 29, bei welcher die Unterseite (40bb) der Basis (40b) an der Unterseite (20b) des Trägers (20) zumindest zum Teil vom Trägermaterial unbedeckt ausgebildet ist, um einen externen elektrischen Abgriff zu ermöglichen.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher elektrisch isoliert zum Kontaktbereich (40K) und zum Anschlussbereich (40A) eine Gegenelektrodenanordnung (50) und/oder eine Referenzelektrodenanordnung (R) ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach Anspruch 31, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) mit einer oder einer Mehrzahl Gegenelektroden (51) ausgebildet ist.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 oder 32, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) oder ein Teil (51) davon und/oder die Referenzelektrodenanordnung (R) auf der Oberfläche (20a) des Trägers (20) ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 33, bei welcher die räumliche Anordnung und/oder die Geometrie der Gegenelektrodenanordnung (50) zur Erzeugung eines gesteuert inhomogenen elektrischen und/oder elektromagnetischen Feldes ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 34, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) oder ein Teil (51) davon der Elektrodenspitze (40s) oder der Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) gegenüberliegend ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 35, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) oder ein Teil (51) davon in einem Abstand im Bereich von etwa 50 μm bis etwa 500 μm von der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 36, bei welcher eine Gegenelektrode (51) der Gegenelektrodenanordnung (50) mit einer flächenhaften Geometrie ausgebildet ist.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 37, bei welcher eine Gegenelektrode (51) der Gegenelektrodenanordnung (50) eine Größe und/oder eine Fläche aufweist, die groß sind im Verhältnis zur Größe/Fläche der Elektrodenspitzen (40s), insbesondere in einem Verhältnis im Bereich von etwa 5:1 oder im Bereich von etwa 100:1 oder darüber.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) und/oder die Basis (40b) aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe gebildet sind, die besteht aus Silber, Gold, Platin, Wolfram, Legierungen, Legierungen dieser Metalle, Platin-Iridium-Legierungen und Gold-Iridium-Legierungen.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher eine Mehrzahl Basen (40b) mit jeweils einer oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet ist.
Elektrodenanordnung nach Anspruch 40, bei welcher die Basen (40b) einzeln oder gruppenweise voneinander elektrisch isoliert und/oder räumlich getrennt ausgebildet sind.
Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher als Träger (20) ein Materialbereich mit oder aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe ausgebildet ist, die besteht aus Gläsern, glasähnlichen Materialien, organischen Polymeren und Fotolacken.
Verfahren zum Herstellen einer Elektrodenanordnung (10) nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 42, bei welchem die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) durch ein elektrochemisches Ätzverfahren ausgebildet werden.
Verfahren nach Anspruch 43, bei welchem dem elektrochemischen Ätzen ein einzelner oder eine Mehrzahl feiner Drähte zugrunde gelegt werden, insbesondere unter Verwendung einer Bondingmaschine.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 43 oder 44, bei welchem dem elektrochemischen Ätzverfahren feine Drähte mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 5 μm bis etwa 50 μm zugrunde gelegt werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 43 bis 45, bei welchem dem elektrochemischen Ätzverfahren feine Drähte aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe zugrunde gelegt werden, die besteht aus Silber, Gold, Platin, Wolfram, Legierungen, Legierungen dieser Metalle, Platin-Iridium-Legierungen und Gold-Iridium-Legierungen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 43 bis 46, bei welchem dem elektrochemischen Ätzverfahren so genannte Bonddrähte oder Drähte zugrunde gelegt werden, die in ihren Eigenschaften Bonddrähten entsprechen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 44 bis 47, – bei welchem zunächst ein oder mehrere feine Drähte durch einen entsprechenden elektrochemischen Ätzprozess behandelt werden und – bei welchem dann die so behandelten Drähte in eine Haltevorrichtung eingebracht werden, insbesondere durch Haltern der als proximale Enden (40p) für die Elektrodenspitzen (40s) bestimmten Enden der Drähte in der Haltevorrichtung, – wobei dann der Draht oder die Mehrzahl Drähte in ein isolierendes Material für einen Träger (20) eingefasst wird bzw. werden.
Verfahren nach Anspruch 48, bei welchem als isolierendes Material für den Träger (20) ein viskoses Polymer oder ein Glas verwendet werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 48 oder 49, bei welchem das Material für den Träger (20) und insbesondere das viskose Polymer durch Oberflächenspannung oder durch externe Felder beim Einfassen des Drahtes oder der Mehrzahl Drähte in der Haltevorrichtung gehaltert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 48 bis 50, bei welchem nach Einfassen des Drahtes oder der Drähte durch das isolierende Material für den Träger (20) in der Haltevorrichtung der Draht oder die Drähte gesteuert mikropositioniert werden, um dabei insbesondere die freiliegende Länge für die auszubildende Elektrodenspitze (40s) oder für die auszubildenden Elektrodenspitzen (40s) einzustellen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 48 bis 51, bei welchem – insbesondere nach dem Mikropositionieren – das isolierende Material für den Träger (20) und insbesondere das viskose Polymer ausgehärtet wird, insbesondere durch Strahlung, UV-Licht, durch Temperaturerhöhung und/oder durch andere physikalische und/oder chemische Prozesse.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 48 bis 51, – bei welchem als isolierendes Material für den Träger (20) ein Glas vorgesehen wird und – bei welchem, insbesondere nach der Mikropositionierung, das Glas durch Erstarren durch Abkühlen ausgehärtet wird.
Verwendung einer Elektrodenanordnung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 42 zur elektrophysiologischen Untersuchung und/oder Manipulation einer Spezies (Z) aus der Gruppe, die gebildet wird von biologischen Zellen, Liposomen, Vesikeln, micellären Strukturen, Bakterien, Viren, Fusionszellen, Organellen, genetischen, molekularbiologischen und/oder biochemischen Derivaten davon, Bestandteilen dieser Spezies (Z) und Verbänden dieser Spezies (Z).
Verwendung einer Elektrodenanordnung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 42 zur Mikroinjektion einer Substanz in eine Spezies (Z) aus der Gruppe, die gebildet wird von biologischen Zellen, Liposomen, Vesikeln, micellären Strukturen, Bakterien, Viren, Fusionszellen, Organellen, genetischen, molekularbiologischen und/oder biochemischen Derivaten davon, Bestandteilen dieser Spezies (Z) und Verbänden dieser Spezies (Z).
Verwendung nach Anspruch 55, bei welcher vor der Mikroinjektion die Spitze der Elektrodenspitze (40s) oder die Spitzen der Elektrodenspitzen (40s) mit der zu injizierenden Substanz beaufschlagt werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 54 bis 56, bei welcher die Elektrodenanordnung (10) in einer Mikrostruktur eingebettet vorgesehen wird.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 54 bis 57, bei welcher die Elektrodenanordnung (10) in einer Lap-on-the-Chip-Struktur vorgesehen wird.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 54 bis 58, bei welcher die Elektrodenanordnung (10) in oder für einen Assay vorgesehen wird, insbesondere für High-Throughput-Anwendungen.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 54 bis 59, bei welcher bei ruhender Elektrodenanordnung (10) die zu untersuchende und/oder zu behandelnde Spezies (Z) oder eine Mehrzahl davon auf die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) zu geführt werden.
Verwendung nach Anspruch 60, bei welcher das Bewegen der zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies (Z) auf die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) zu durch Kraftausübung auf die entsprechende Spezies (Z) bewirkt wird.
Verwendung nach Anspruch 61, bei welcher die Kraftausübung bewirkt wird durch eine dielektrophoretische Kraft.
Verwendung nach Anspruch 62, bei welcher die dielektrophoretische Kraft erzeugt wird durch das Erzeugen eines – insbesondere hochfrequenten – inhomoge nen elektrischen Wechselfeldes zwischen der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) und der vorgesehenen Gegenelektrodenanordnung (50) mit den Gegenelektroden (51).
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 62 oder 63, bei welchem die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) mit einer Wechselspannung im Bereich von etwa 10 mV bis etwa 300 V und/oder im Frequenzbereich von etwa 100 Hz bzw. etwa 60 MHz beaufschlagt werden, um die dielektrophoretische Kraft zu erzeugen.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 62 bis 64, bei welcher ein elektrischer Zellkäfig zur Mikropositionierung der Spezies (Z) oder Zelle (Z) während der dielektrophoretischen Annäherung verwendet wird.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 54 bis 65, bei welcher zur Erleichterung der Zellkontaktierung die zu kontaktierende Spezies (Z) oder Zelle (Z) durch isoosmolare Lösungen prall aufgefüllt wird.