WO2007003398A2 - Elektrodenanordnung, deren verwendung sowie verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Elektrodenanordnung, deren verwendung sowie verfahren zu deren herstellung Download PDF

Info

Publication number
WO2007003398A2
WO2007003398A2 PCT/EP2006/006459 EP2006006459W WO2007003398A2 WO 2007003398 A2 WO2007003398 A2 WO 2007003398A2 EP 2006006459 W EP2006006459 W EP 2006006459W WO 2007003398 A2 WO2007003398 A2 WO 2007003398A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
electrode
tips
tip
species
electrode arrangement
Prior art date
Application number
PCT/EP2006/006459
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2007003398A3 (de
Inventor
Dirk Zimmermann
Ernst Bamberg
Ulrich Zimmermann
Original Assignee
MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Julius-Maximilians-Universität Würzburg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., Julius-Maximilians-Universität Würzburg filed Critical MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Priority to US11/922,971 priority Critical patent/US20100038247A1/en
Priority to EP06776116A priority patent/EP1899724A2/de
Publication of WO2007003398A2 publication Critical patent/WO2007003398A2/de
Publication of WO2007003398A3 publication Critical patent/WO2007003398A3/de

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/145—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue
    • A61B5/14546—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue for measuring analytes not otherwise provided for, e.g. ions, cytochromes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/68—Arrangements of detecting, measuring or recording means, e.g. sensors, in relation to patient
    • A61B5/6846—Arrangements of detecting, measuring or recording means, e.g. sensors, in relation to patient specially adapted to be brought in contact with an internal body part, i.e. invasive
    • A61B5/6847—Arrangements of detecting, measuring or recording means, e.g. sensors, in relation to patient specially adapted to be brought in contact with an internal body part, i.e. invasive mounted on an invasive device
    • A61B5/685—Microneedles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/02—Electrical or electromagnetic means, e.g. for electroporation or for cell fusion
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B2562/00—Details of sensors; Constructional details of sensor housings or probes; Accessories for sensors
    • A61B2562/02—Details of sensors specially adapted for in-vivo measurements
    • A61B2562/028—Microscale sensors, e.g. electromechanical sensors [MEMS]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B2562/00—Details of sensors; Constructional details of sensor housings or probes; Accessories for sensors
    • A61B2562/12—Manufacturing methods specially adapted for producing sensors for in-vivo measurements
    • A61B2562/125—Manufacturing methods specially adapted for producing sensors for in-vivo measurements characterised by the manufacture of electrodes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/15—Devices for taking samples of blood
    • A61B5/150007—Details
    • A61B5/150015—Source of blood
    • A61B5/150022—Source of blood for capillary blood or interstitial fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/15—Devices for taking samples of blood
    • A61B5/150007—Details
    • A61B5/150206—Construction or design features not otherwise provided for; manufacturing or production; packages; sterilisation of piercing element, piercing device or sampling device
    • A61B5/150274—Manufacture or production processes or steps for blood sampling devices
    • A61B5/150282—Manufacture or production processes or steps for blood sampling devices for piercing elements, e.g. blade, lancet, canula, needle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/15—Devices for taking samples of blood
    • A61B5/150969—Low-profile devices which resemble patches or plasters, e.g. also allowing collection of blood samples for testing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/15—Devices for taking samples of blood
    • A61B5/150977—Arrays of piercing elements for simultaneous piercing
    • A61B5/150984—Microneedles or microblades

Definitions

  • Electrode assembly its use and method for their preparation
  • the present invention relates to an electrode assembly, its use and - in particular electrochemical - process for their preparation.
  • the invention has for its object to provide an electrode assembly for electrophysiological examinations of biological species or cells and the like, a process for their preparation and corresponding uses in which access to the interior of a species or cell on especially to realize a simple, reliable, gentle and reproducible way.
  • a biological species or cell subsumes a biological cell in the strict sense, a bacterium, a virus, an organelle, a liposome, a vesicle, a micellar structure, their constituents or fragments and their associations or aggregates
  • so-called fusion species or fusion cells should be included. Erfmdungsgeriff the respective system for the investigation of each of these species can be used.
  • an electrode assembly for electrophysiological examination of biological species, particularly biological cells or the like is provided.
  • the erfmdungsgeselle electrode assembly is formed with a contact region for contacting the electrode assembly with at least one biological species, a biological cell or the like.
  • a connection region is formed for external electrical connection of the electrode arrangement.
  • the contact region is formed with an electrode tip or a plurality of electrode tips as electrodes, which extend from the connection region of the electrode arrangement.
  • the electrode tips are each formed with a geometric shape, which in operation an otherwise non-destructive Permeation of the electrode tips into a biological species or cell or the like via the membrane in the interior thereof.
  • the electrode tip or the plurality of electrode tips are suitable for penetrating a membrane of the biological species, in particular a biological cell, without destruction in order to gain access to the interior of the biological species or cell.
  • the electrode tip or the plurality of electrode tips are each formed monotonically or strictly monotonically tapering from the connection region.
  • the electrode tip or plurality of electrode tips are each cylindrical or cuboid running from the terminal region and at the remote from the terminal portion and distal end of the electrode tip or plurality of electrode tips are formed with a monotonously or strictly monotone tapering tip. This means, in particular, that the electrode tip tapers uniformly from the proximal to the distal end.
  • the electrode tip or a plurality of electrode tips are formed with a cross section which is round, circular, elliptical, rectangular or square.
  • the electrode tip or a plurality of electrode tips are formed with a first and proximal end facing the connection region or forming the connection region.
  • the diameter of the electrode tip or a plurality of electrode tips is formed at the proximal end in the range from approximately 50 nm to approximately 5000 nm.
  • the diameter of the electrode tip or a plurality of electrode tips at the proximal end is below about 1/10 of the diameter of a species or cell to be contacted.
  • the electrode tip or a plurality of electrode tips are formed with a second and distal end facing away from the connection region.
  • the diameters of the electrode tip or plurality of electrode tips are formed at the distal end in the range of 1/10 of the diameter of a species or cell to be contacted.
  • the electrode tip or plurality of electrode tips are formed at the distal end with a radius of curvature in the range from about 5 nm to about 50 nm.
  • the radius of curvature of the electrode tip is in particular the radius of that sphere which best approximates the electrode tip at its distal end.
  • the electrode tip or plurality of electrode tips are formed in the region of the distal ends at an acute angle in the range of about 10 ° to about 50 ° as the opening angle of the respective tip.
  • the electrode tip or plurality of electrode tips from the terminal area have a length in the range of about 4/5 the diameter of a species to be contacted.
  • the contact region is formed with a plurality of electrode tips.
  • the electrode tips are formed geometrically equal and / or the same effect.
  • connection area is formed as a materially coherent base with a surface and a bottom.
  • the electrode tip or the plurality of electrode tips are formed extending from the surface of the base.
  • the electrode tip or the plurality of electrode tips project from the surface of the base vertically or horizontally.
  • the electrode tips are oriented identically to one another and are designed to be parallel or substantially parallel, at least locally.
  • the electrode tips according to another preferred embodiment of the inventive electrode arrangement are alternatively or additionally arranged in the form of a row, matrix or vertical matrix arranged on top of the base.
  • the electrode tips are formed according to a further preferred embodiment of the inventive electrode arrangement with the same pairwise distances directly adjacent electrode tips arranged in the main axis directions of their arrangement arrangement.
  • the surface of the base is planar, at least locally.
  • the base and the electrode tip or the plurality of electrode tips are integrally formed with each other as an integral material region.
  • the base and the electrode tips or the plurality of electrode tips are formed integrally connected to one another.
  • the base and the electrode tip or the plurality of electrodes rod tips are formed from the same, in particular electrically conductive material.
  • the electrode tip or the plurality of electrode tips are formed as structures etched with electrochemical etching.
  • a carrier having a surface and a bottom side is formed from an electrically insulating material.
  • the proximal ends of the electrode tips and optionally the base are embedded in the carrier and actually below the surface of the carrier and the distal ends of the electrode tips actually above the surface of the carrier are formed.
  • the surface of the carrier is designed to be completely or locally compliant and, in particular, to run parallel to the surface of the base.
  • inventive dungsgesellen electrode arrangement it may be alternatively or additionally borrowed provided that the surface of the carrier is formed completely or locally planar, convex and / or concave.
  • the surface of the carrier is designed to be planar or essentially planar and with concave depressions in the region of the proximal ends of the electrode tips. It is also possible that the underside of the base is formed on the underside of the carrier at least partially uncovered by the carrier material to allow an external electrical tap.
  • a counter electrode arrangement and / or a reference electrode arrangement are formed electrically insulated from the contact area and the connection area.
  • the counter-electrode arrangement may be formed with one or a plurality of counter-electrodes.
  • the counter electrode arrangement or a part thereof and / or the reference electrode arrangement can be formed on the surface of the carrier.
  • the spatial arrangement and / or the geometry of the counter electrode arrangement are designed to generate a controlled inhomogeneous electric and / or electromagnetic field.
  • the counter-electrode arrangement or a part thereof is formed opposite the electrode tip or the plurality of electrode tips.
  • the counterelectrode arrangement or a part thereof can be formed at a distance in the range from approximately 15 ⁇ m to approximately 1 cm from the electrode tip or a plurality of electrode tips.
  • a counter electrode of the counter electrode arrangement is formed with a flat geometry.
  • a counterelectrode of the counterelectrode arrangement has a large and / or flat area which are large in relation to the size / area of the electrode tips, in particular in a ratio in the range of approximately 5 : 1 or in the range of about 100: 1 or above.
  • the electrode tips and / or the base may e.g. are formed from a material or a combination of materials from the group consisting of silver, gold, platinum, tungsten, alloys, alloys of these metals, platinum-iridium alloys and gold-iridium alloys.
  • a plurality of bases is formed, each with one or a plurality of electrode tips.
  • the bases individually or in groups are electrically isolated from each other and / or spatially separated.
  • a material region with or made from a material or a combination of materials from the group consisting of glasses, glass-like materials, organic polymers and photoresists is formed as a carrier.
  • the present invention further provides a method for producing the electrode arrangement according to the invention. It is erfmdungsgetool provided that the electrode tip or the plurality of electrode tips are formed by an electrochemical etching process.
  • the electrochemical etching is based on a single or a plurality of fine wires.
  • the electrochemical Atzvon fine wires are used with a diameter in the range of about 5 microns to about 50 microns. It is also conceivable to start with wires having a diameter in the range of about 300 microns to about 500 microns.
  • the electrochemical etching process fine wires of a material or a combination of materials from the group are based, which consists of silver, gold, platinum, tungsten , Alloys, alloys of these metals, platinum-iridium alloys and gold-iridium alloys.
  • the electrochemical etching process is based on so-called bonding wires or wires which correspond in their properties to bonding wires.
  • the erfmdungsge- specializeden method for producing the erfmdungsge18en electrode arrangement it is provided that initially em or more fine wires by a corresponding electrochemical etching process are treated and then that the treated wires are introduced into a holding device, in particular by holding the intended as proximal ends for the electrode tips ends of the wires in the holding device, in which case the wire or the plurality of wires is enclosed in an insulating material for a carrier or be.
  • the insulating material for the carrier e.g. a viscous polymer or a glass are used.
  • the material for the carrier and in particular the viscous polymer is held by surface tension or by external fields when the wire or the plurality of wires are enclosed in the holding device.
  • the wire or wires are controlled in a micropositioned manner after the wire or the wires have been insulated by the insulating material for the carrier in the holding device, in particular the set the exposed length for the electrode tip to be formed or for the electrode tips to be formed.
  • the inventive method for producing the electrode arrangement according to the invention it is additionally or alternatively provided that - especially after the micropositioning - the insulating material for the support and in particular the viscous polymer is cured, in particular by radiation, UV light, by increasing the temperature and / or by other physical and / or chemical processes.
  • a glass is provided as insulating material for the carrier and that, in particular according to the
  • the glass is cured by solidification by cooling.
  • the invention also provides methods using the erfmdungsge186en electrode assembly and applications of the inventive dungsgedorfen electrode assembly.
  • the electrode arrangement according to the invention can be used for the electrophysiological examination and / or manipulation of a species which is formed by biological cells, liposomes, vesicles, micellar structures, bacteria, viruses, fusion cells, organelles, genetic, molecular biological and / or biochemical derivatives thereof, components of these species and associations of these species.
  • the electrode arrangement according to the invention can also be used for the microinjection of a substance m a species of the group formed by biological cells, liposomes, vesicles, micellar structures, bacteria, viruses, fusion cells, organelles, genetic, molecular biological and / or or biochemical derivatives thereof, components of these species and associations of these species.
  • the tip of the electrode tip or the tips of the electrode tips can be charged with the substance to be injected before the micromixing.
  • the application can also take place by application of electric fields, e.g. for electrically charged substances, e.g. in DNA.
  • the electrode arrangement is provided embedded in a microstructure.
  • the electrode arrangement is provided in a lap-on-the-chip structure. Furthermore, it is possible for the electrode arrangement to be provided in or for an assay, in particular for high throughput applications.
  • the movement of the species to be examined and / or treated to the electrode tip or plurality of electrode tips is effected by force exerted on the corresponding species.
  • the dielectrophoretic force is generated by generating a - in particular high-frequency - inhomogeneous alternating electric field between the electrode tip or plurality of electrode tips and the proposed counter electrode arrangement with the counter electrodes.
  • the electrode tips can be exposed to an alternating voltage in the range of about 10 mV to about 300 V and / or in the frequency range of about 100 Hz or about 60 MHz in order to generate the dielectrophoretic force.
  • an electrical cell cage is used for the micropositioning of the species during the dielectrophoretic approximation.
  • the cell to be contacted is bulged up by iso-osmolar solutions.
  • stiffening reagents eg by EDTA or Pluronium - the membrane can be stiffened and the penetration of the electrode tip facilitated.
  • an electrode arrangement in which the counter-electrode arrangement 50 or a part 51 thereof according to one of the preceding claims is formed, in particular to enable a dielectric contacting of biological cells in a type of sandwich system, in which the biological cell to be examined after electrical contacting and fusion allows bridging between the two electrodes.
  • a counterelectrode 51 of the counterelectrode arrangement 50 has a large and / or flat area that is large in relation to the size / area of the electrode tips 40s, in particular in a ratio in the range of about 5: 1 or Range of about 100: 1 or above, preferably in the range of about 10000: 1.
  • an electrode arrangement in which the electrodes are modified by a chemical reaction such that an electrophysiological examination of biological cells is made possible, facilitated or more sensitive, wherein the chemical reaction is mainly an electrochemical oxidation of the aforementioned metals with a halogen, wherein the chemical reaction takes place in particular before or after the contacting of the biological cell, wherein in the latter case the halogen is obtained from the cytosol of the cell and / or supplied.
  • an electrode arrangement in which the electrode arrangement is combined with a pressure measuring probe, which is in particular an external pressure measuring probe located outside, or an invasive pressure measuring probe located within a measuring object.
  • a pressure measuring probe which is in particular an external pressure measuring probe located outside
  • an invasive pressure measuring probe located within a measuring object.
  • the electrode tip 40s or a plurality of electrode tips 40s having an alternating voltage in the range of about 10 mV to about 300 V and / or in the frequency range of about 100 Hz or about 100 MHz, preferably of about 100 Hz or about 60 MHz, more preferably about 100 Hz or about 40 MHz are applied to generate the dielectrophoretic force.
  • an electrical insulation is not contacted with cells, free electrodes but made such that a solution of liposomes of defined size, the minimum diameter 100 nm and the maximum diameter is 5 microns, spooled across the electrode surface and by applying an alternating current is contacted on the said free electrode tips.
  • a method for electrically contacting a species Z to be examined and / or treated, in particular a biological cell or the like, with an electrode tip 40s of an electrode arrangement 10, in which a patch pipette or patch electrode as an electrode tip 40s is used or has the electrode tip 40s and in which the electrode assembly 10 controlled in such a manner with an electrical see field is applied that a dielectrophoretic force is applied to the examined and / or treated species Z such that the to be examined and / or or species Z to be treated and approximated to the electrode tip 40s and contacted with this.
  • the focusing or contacting of the electrophysiologically to be examined biological cells is preferably carried out dielectrically by modulation of the frequencies, the frequencies to be applied in the range of at least 100 Hz to a maximum of 100 MHz, especially in the range of 100 kHz to 40 MHz.
  • a special embodiment provides for a combination of the electrode arrangement described above with a pressure measuring probe, which is an external pressure measuring probe outside or an invasive pressure measuring probe located inside a measuring object.
  • an electrode arrangement in which the electrodes are modified by a chemical reaction such that an electrophysiological examination of biological cells is made possible, facilitated or made more sensitive, the aforementioned chemical reaction being mainly an electrochemical oxidation of the aforementioned metals with a halogen.
  • This chemical reaction can take place before or after the "contacting" of the biological cell, in the latter case the halogen is obtained from the cytosol of the cell.
  • a possible use is conceivable in which an electrical insulation is not made with cells contacted, free electrodes of the kind that a solution of liposomes of defined size, wherein the minimum diameter 100 nm and the maximum diameter is 5 microns, spooled over the electrode surface and is contacted by applying an alternating current to the said free electrode tips.
  • the dielectrophoretic contacting may also be possible with a construction resembling a normal patch pipette.
  • An electrode - hereafter referred to as A - is surrounded by a micro-glass capillary, which in turn is associated with a physiological
  • the electrode arrangement according to the invention will be synonymously referred to as fakir electrodes.
  • the invention thus also relates in particular to so-called fakir electrodes, their production and their use.
  • electrophysiological techniques the electrical parameters of biological systems can be examined and mampulated. These techniques are applied to cell assemblies, single cells, fragments of cell membranes and liposomes and proteoliposomes, the latter i.a. with the help of techniques based on so-called artificial membranes). In the following, the spectrum of these biological systems is abbreviated to "cells.” All these electrophysiological techniques have in common that they are also used to investigate the functional properties or for the manipulation of (membrane) proteins and the surrounding membranes.
  • a crucial problem of existing electrophysiological technologies eg in voltage, current and patch clamp tech- niques, is that with these only direct electrical discharges are possible. gene on cells of a certain size - eg with a diameter greater than 10 microns - are possible, on the other hand being produced on living cells irreversible damage by the microelectrodes. In addition, these technologies are unstable with mechanical effects. This leads to a destruction of the cell after a short period of time. It can also be stated that all existing electrophysiological techniques have the serious disadvantage, in particular for commercial applications, that they are extremely complicated and that automation of the process control in these techniques is complicated and very error-prone.
  • the invention presented here does not have the above-mentioned disadvantages of existing technologies. It is characterized by a high robustness, flexibility in the application and allows both indirect and direct (reversible) electrical discharges to the cells used.
  • the present invention provides, in particular, an electrophysiological measuring arrangement for cells, fusion cells, liposomes, membrane fragments and cell aggregates - in the following simply summarized as cells.
  • the electrical manipulation of the cells is carried out by one or more electrodes that penetrate directly into the cells.
  • the size of the electrodes depends on the cellular system used.
  • the electrode will have a very small diameter for very small cells - diameter in the range of 15 microns, for example in the range of about 900 nm, and only have a small length, for example in the range of about 5 microns.
  • the fakir electrodes have a fine tip, for example smaller than about 500 nm, in order to cause minimal damage to the cellular system during penetration.
  • 1 shows a possible electrophysiological arrangement of the fakir technology presented here. Shown is a cell contacted by a fakir electrode with multiple peaks.
  • the carrier material determines the exposed length of the electrode.
  • the fakir electrodes used in some applications must have dimensions in the order of nanometers and microns, both in their geometry and in their length, depending on the cellular system used:
  • the diameter must be between about 50 nm and about 5000 nm, the length between about 500 nm and about 250 microns.
  • the fakir electrodes are made of conductive materials, preferably metals of silver, gold, platinum, tungsten and / or alloys such as e.g. Pt-Ir and Au-Ir.
  • the preparation should be carried out by electrical or electrochemical etching, for example of very fine wires, eg diameter about 5 microns to about 50 microns, for example, a corresponding metal or a corresponding alloy.
  • Em aspect of the invention is the use of finest starting wires, such as so-called bonding wires or wires, the properties of which are similar, because the etch process can be carried out easier at small initial diameters and better results can be achieved.
  • larger diameter wires may also be used as the starting material.
  • This procedure makes the etching process more difficult.
  • the etch process results in metal wires that have the finest metal tips.
  • a suitable holding device for example in a ring, a grid, a cannula
  • the wire can be comprised of a viscous polymer.
  • the viscous polymer is held by surface tension or by fields in the holding device.
  • the wire is inserted into the fixture before the polymer is added. This has the consequence that the fine tip of the wire can not come into contact with the polymer and therefore can not form deposits of the electrically insulating polymer on the electrode.
  • the polymer is cured by UV light, by increasing the temperature or by other physical / chemical processes. If necessary, the position of the metal tip can be readjusted during the curing process.
  • the detection of the exposed tip is carried out, for example, by visual microscope inspection or by automated process control by means of laser scanning or other measuring systems.
  • the adjustment of the wire can be done manually or automatically, eg in feedback with the optical control or laser scanning.
  • Polymer materials are used which have high viscosity, are subject to only small volume changes during the curing process and can be cured by UV light, temperature or other chemical / physical processes. This process can also be carried out with several independent potted metal wires. In this way, a "lawn" of electrically independent electrodes is obtained.
  • the holding device may consist of an electric glow filament. This can be used to heat and liquefy the glass so that subsequently the wire can be micropositioned. The system can then have a liquid and heated glass inflow system over it, so that in this case too, the etched wire can be pushed through the fixture and the exposed tip does not come into contact with liquid glass.
  • the fakir electrodes presented above should penetrate cells so that they become electrically conductive.
  • Part of the invention presented here is that the electrodes are not brought to the cell as in conventional systems, but the cell to the fakir electrode. This should be achieved by applying a dielectrophoretic force.
  • This force can be generated by the application of high-frequency, highly inhomogeneous alternating fields and causes, with suitable dielectric properties of the cell - with respect to the dielectric properties of the medium - a migration of the cell in the direction of the fakir electrode. It does not end until the fakir electrode is inside the cell. This contacts the cell to the fakir electrode.
  • the described contacting of the cell can also be used for nano- or microinjection of bioactive substances into cellular systems.
  • the fakir electrodes are previously coated or coated with these substances. This can e.g. In the case of substances which carry electrical charges (DNA), they can also be done by applying corresponding electric fields which generate forces on the particles and bring about a movement to the fakir electrode surface. If the cell is then contacted with the fakir electrode, then the bioactive substance is in the cell. Advantages of this method are on the one hand the low consumption of bioactive substance, which is used with the "inoculation" of the cell, and the simple selection of the inoculated cells of those, which were not injected, the latter is possible, if one after contacting the cell medium against a cell-free Exchange medium and harvest the daughter cells of the inoculated, contacted cells. " By measuring the electrical parameters of the contacted cell, it is also possible to determine the vitality status of the cells and it is thus possible to optimally control the nutrition of the cells or to stop the harvesting process if the contacted cells lose their vitality.
  • Another aspect of the present invention is the use of fakir electrodes for direct or intracellular electrical conduction.
  • the fakir electrode has a very high sealing resistance against the bath solution. This ensures that the resistance (or other electrical parameters of the system) measured by the fakir tip against a reference electrode is determined solely by the conductivity of the "cell" membrane of the cell contacted with the fakir electrode So a very important part of our invention.
  • the fakir electrode (or the fakir board electrode) must be electrically sealed except for the tips of the fakir needles.
  • (2) is described how this is achieved in our invention.
  • Another method is to attract liposomes (50 nm to 1 ⁇ m) using suitable high-frequency alternating fields until all the electrode material has been sealed.
  • Theoretical explanation is based on the fact that under suitably chosen conditions the dielectrophoretic forces act only on objects of certain diameters. With suitable frequencies it is therefore possible selectively to attract smaller sized objects (eg small liposomes of 50 nm to 1 ⁇ m), whereas large objects (eg cells of 20 ⁇ m diameter) do not experience any force. c) Fusion of other cells or liposomes to the system already contacted can also be used to increase the sealing resistance of the fakir electrode.
  • the fusion can be achieved by moderate ⁇ s high-voltage pulses (to merge several laterally or vertically dielectrophoretically arranged cells electrically into a fusion product, so-called electrofusion, thereby simultaneously creating "sensor head" with very large, intact membrane surfaces.
  • the electrical parameters of the cell can be determined by various electrical methods:
  • the fakir electrode in this case should be separated from the cytosol by an intracellular salt bridge.
  • This salt bridge can e.g. hydrogels, e.g. Alginate, which are doped with Cl-containing salts.
  • the use of multiple fakir electrodes has the advantage that the failure of one or more electrodes is reduced by e.g. it is possible to compensate for possible deposition of cytoplasmic lipid and protein components or membrane components during penetration due to the redundant system.
  • the advantage of having several independently picked off Fakirelektroden has the additional advantage that in parallel several different cells can be tapped simultaneously and thus when using extremely small solution volumes many independent results can be determined.
  • the transmembrane resistance (an important electrical parameter of the cell) depends on the ion channels in the membrane of a system whose electrical conductivity is specifically influenced by a broad spectrum of analytes (ligands, inhibitors, etc.) / can be.
  • the fakir technology can be used in scanning tools (e.g., high throughput drug targeting methods).
  • scanning tools e.g., high throughput drug targeting methods.
  • targets for example membrane proteins such as ion channels, see above
  • membrane proteins such as ion channels, see above
  • Such hybrid sensor heads formed from fakir electrodes and contacted cells allow the screening of a wide range of drugs in analytical laboratories ("high throughput screening", “lab on the chip”) as well as under in situ conditions (as " Lab in the sample "in the human / animal and plant system)
  • high throughput screening "lab on the chip”
  • Lab in the sample in the human / animal and plant system
  • animal and plant sensor cells are to be used, which are tailored by specific heterologous overexpression of transporters or cell-cell or cell-membrane fusion
  • Specifically designed sensor heads can be provided as disposables for universal electronic peripherals
  • the sensor units can be manufactured either individually or in the form of micromodules, comparable to microtiter plates, the latter configuration being guaranteed by the possibility of redundant measurements with comparable sensor heads identical measuring conditions a very high reliability of the analysis.
  • using different custom sensor heads on the same module complex detection of multiple components in small sample volumes, e.g. for the purpose of drug screening, to be performed with high accuracy.
  • the sensor head For m-situ applications, the sensor head must be probed into a probe - lab-m-the-probe - which provides direct, mimmalmvive access to liquid-filled compartments of plant or animal / human systems.
  • the new sensor head technology is to be connected to a miniaturized hose / pressure sensor / catheter system for the purpose of supplying the signals and supplying the cells with suitable media.
  • the integration of the sensor head / catheter assembly into a measuring machine based on the principle of a belt hole punch is also planned.
  • the cell membrane M is stretched, that is, the cell Z is filled. This can be achieved by using non-isoosmolar solutions in which the cells Z are incubated or used as measuring media 30.
  • the correct dielektphoreti- see force is generated.
  • the parameters for this process are chosen for each cell type depending on the above conditions. They are in the specified ranges. Not necessary but convenient is the application of a modulated alternating field, i. an electric field which changes in a preprogrammed manner during the attracting experiment.
  • the time range for generating the attractive force is about 10 ⁇ s to about 30 s.
  • the modulation of the alternating field can be effected via the amplitude-reduction of the amplitude, for example as a ramp protocol, in particular linear or exponential-or via the frequency.
  • the dielectrophoretic force is inversely proportional to the fifth power of the distance between the cell Z and the fakselode 40s.
  • the attraction process is such that initially, by choosing appropriate frequencies and high amplitudes, a relatively small force is generated on cell Z.
  • the force quickly increases and the cell Z can be drastically accelerated if the original field parameters are maintained. This can lead to too fast movement of the cell and destruction of the cell Z, e.g. by bursting, at the contact réelle lead.
  • too low a tightening force leads to the fact that the cell Z is not penetrated by the fakir electrode 40s because the mechanical resistance of the membrane M of the cell can then not be overcome.
  • This bonding wire which is contacted on one side with the electrically conductive points of the "chip", can be electrochemically etched in a subsequent step at its second end by a correspondingly automated application of electric fields Alternatively, a corresponding Bondmg procedure can be selected which includes the bonding wire with suitable geometrical proportions (length, thickness, tip) to the chip
  • the electrically conductive sites, which should be individually accessible, of the chip should have a diameter which is smaller than that of the inserted cell (or fusion line) it should normally be in the range of about 5 ⁇ m to about 100 microns lie. If glass, eg borosilicate, is chosen as the carrier material, then it is to be expected that the cells will contact each other very well (compare patch-clamp technique). This is also to be expected when using suitable plastics. Post-stripping techniques - as already described - can also be used if required.
  • the automated use of the fakir electrode in mechanical systems is to be achieved in that the chip carrying the fakir electrodes can be inserted into a microfluidic chamber.
  • This chamber is to ensure by suitable systems, based on the principle of the electrical Zellkafige, that cells can be positioned automatically with respect to the individual Fakir-Spit zen exactly opposite the Fakirelektroden. This is to ensure that the system can be contacted with automatically applied dielectrophoresis protocols - as already described.
  • the microfluidic system should also allow the possibility of change of the solution.
  • Electrode Blank e.g., Under a Binocular
  • wire stucco e.g. Ag, 25 ⁇ m in diameter, e.g. to approx. 1.5 cm.
  • Thread wire stucco through the glass capillary e.g. with tweezers and / or to a maximum of 4 mm outstanding.
  • anchor the rear end of the wire to the metal of the chip holder, e.g. with conductive silver.
  • chip holder e.g. attach to the micromanipulator.
  • Electrochemical treatment of the electrode blank for example under a binocular
  • FIG. 1 is a schematic and sectional side view of a first embodiment of the erfmdungsgedorfen electrode assembly with a E- lektrodenspitze.
  • Fxg. 2 is a schematic and sectional side view of another embodiment of the inventive electrode assembly having a plurality of electrode tips.
  • FIGS. 3A, 3B are schematic and sectional side views of another embodiment of the inventive electrode arrangement, once with and once without a contacted biological cell.
  • FIGS. 4A-4D are schematic and sectional side views of various other embodiments of the inventive electrode arrangement.
  • FIGS. 5A, 5B demonstrate certain details of the invention in the form of a schematic and sectional side view and / or a schematic plan view of an embodiment of the electrode arrangement according to the invention.
  • 6 is a schematic plan view of a further embodiment of the inventive electrode arrangement.
  • FIG. 7 is a schematic and sectional side view of another embodiment of the inventive electrode arrangement.
  • FIGS. 8-10 show, in the form of microscopic photographs, specific application cases, such as are suitable for the electrode arrangement according to the invention.
  • Figs. IIA-12B show other uses of the present invention.
  • Fig. 1 is a schematic and sectional side view, which describes a first embodiment of the erfmdungsgedorfen electrode arrangement 10 and its application in the investigation of a cell Z.
  • the embodiment of the inventive electrode arrangement 10 shown here is based on a carrier 20 or carrier substrate 20 with a surface 20a and a bottom 20b.
  • a contact portion 40K in part and the terminal portion 40A are formed completely integrated, in such a way that the electrode tip 40s forming the contact region 4OK of the electrode assembly 10s with its terminal portion 4OA or proximal end 40p completely below the surface 20a of the carrier 20 and with its distal end 40d, which faces away from the terminal area 4 OA, strictly above the surface 40a of the carrier 40 is formed.
  • connection region 4 OA is formed by a base 40b, which realizes a one-piece material region - here in the form of a planar plate, whose upper side 40ba is in contact with the proximal end 40p of the electrode tip 40s and whose lower side 40bb is flush with the lower side 20b of the Tragers 20 closes and thus allows external contact.
  • an electrical tap is made in the interior I of a contacted cell Z, in that the distal end 40d of the electrode tip 40s penetrates through the cell membrane M into the interior I of the cell Z and so on the conductivity of the electrode tip 40s realized a corresponding electrical tap.
  • a current measurement or voltage measurement can take place via the outer measuring circuit 60 and the connection lines 61 and 62 so that charge carriers displaced by the transmembrane protein P can be measured as corresponding displacement currents I (t) as a function of time, the electrode tip 40s being referred to as
  • the first electrode of the electrode assembly 10 and provided in the surface 20 a reference electrode R are formed as a corresponding second measuring electrode, wherein the circuit is closed by the correspondingly to be envisaged aqueous measuring medium 30.
  • the reference electrode R can serve as a measuring electrode. It is also conceivable, however, for this reference electrode R to be used for the approximation and contacting of the cell Z with the contact region 4OK by forming a counterelectrode 51 of a counterelectrode arrangement 50. Alternatively or additionally, the counter-electrode arrangement 50 can also have a counter electrode 51, which faces the electrode tip 40s of the contact region, as indicated by a dashed representation.
  • FIG. 1 The embodiment of FIG. 1 is defined with only a single electrode tip 40s in the contact region 40K.
  • the contact region 4OK of the electrode arrangement 10 is defined by way of a plurality, in particular of identical or equivalent, electrode tips 40s.
  • FIG. 2 shows such an embodiment with a plurality of similar electrode tips 40s in the contact region 4OK.
  • the embodiment of the inventive electrode arrangement 10 shown here is based on a carrier 20 or carrier substrate 20 with a surface 20a and a bottom 20b.
  • a contact region 4OK in part and a connection region 4OA are again formed integrally in the carriers 20 in such a way that the electrode tip 40s forming the contact region 4OK of the electrode assembly 10s is completely below the surface 40a facing the connection region 4OA or proximal end 40p below the surface 20a of FIG Carrier 20 and with its distal end 4Od, which is oriented away from the terminal portion 4OA, strictly above the surface 40a of the carrier 40 is located.
  • connection region 4OA is also formed by a so-called base 40b, which realizes an emstuckigen material region, the top 40ba is contacted with the proximal end 40p of the electrode tip 40s and the bottom 40bb flush flush with the bottom 20b of the carrier 20 and thus again an external Contact allowed.
  • an electrical tap is made in the interior I of a contacted cell Z, in that the distal ends 4Od of the electrode tips 40s penetrate through the cell membrane M into the interior I of the cell Z and thus via the conductivity of the electrode tips 40s as electrode a corresponding electrical tap realize.
  • a current measurement or voltage measurement can take place via the outer measuring circuit 60 and the connection lines 61 and 62 so that charge carriers displaced by the transmembrane protein P can be measured as corresponding displacement currents I (t) as a function of time, with the electrode tip 40s as first electrode of the electrode assembly 10 and provided in the surface 20 a reference electrode R is designed as a corresponding second measuring electrode, wherein the circuit is closed by the correspondingly to be envisaged aqueous measuring medium 30.
  • the reference electrode R can again serve as a measuring electrode. However, it is also conceivable that this reference electrode R is used for the reflector-approximation and contacting of the cell Z with the contact region 4OK by forming a counter-electrode 51 of a counter-electrode arrangement 50. Alternatively or additionally, the counter-electrode arrangement 50 can also have a counter electrode 51, which faces the electrode tips 40s of the contact region, as indicated by a dashed representation.
  • the embodiment of the electrode arrangement 10 according to the invention shown in FIGS. 3A and 3B only differs from the embodiment shown in FIG. 2 in that the surface 20a of the support 20 does not run strictly planar, but in the region of the electrode tips 40s a concave one Form recess 22, in particular in the form of a trough, so that, as is clear in the transition from the state of Fig. 3A to the state of Fig. 3B, an approaching cell Z better to the surface 20a in the region of the recess 22 to the surface snugly so that better sealing resis- X are possible with respect to the intended measuring medium 30 to avoid short circuits.
  • FIGS. 4A to 4D show diagrammatic and sectional side views of different embodiments of the electrode arrangement 10 according to the invention.
  • a single electrode tip 40s is provided which defines the contact region 40K of the electrode assembly 10 and which is attached and contacted at its proximal end 40p to the top surface 40ba.
  • the electrode tip 40s and the base 40b as a terminal portion 4OA are formed emstuckig.
  • a single and separate electrode tip 40s which is to form the contact region 40K of the electrode assembly 10 can also be attached to the upper side 40ba of the base 40b in a subsequent process, so that gives a one-piece structure, as shown in Fig. 4B.
  • FIG. 4C likewise shows an emstuckige embodiment of the inventive electrode assembly 10, but this time with a plurality of electrode tips 40s, which are each formed with their proximal ends on the upper side 40ba of the carrier 40b.
  • FIG. 4D again shows an embodiment of the electrode arrangement 10 according to the invention, in which there is no stimulation between the electrode tips 40s and the base 40b. Rather, the electrode tips 40s, which are to form the contact region 4OK of the electrode arrangement 10 of FIG. 4D, are applied to the upper side 40ba in a downstream process, contacted electrically and mechanically.
  • the embodiment of the inventive electrode arrangement 10 which is illustrated in FIGS. 5A and 5B in the form of a schematic and sectional side view or in the form of a schematic plan view, shows a plurality of electrode tips 40s, which are arranged in a row on the base 40b in the form of a planar plate are arranged, and not in emstuckiger manner.
  • the distal ends 40d and the proximal ends 40p of the electrode tips 40s are shown, which face away from the upper side 40ba of the base 40b and are in contact therewith.
  • the electrode tips 40s shown in Figures 5A and 5B have a length Ls and are equidistant from each other in pairs equidistant from each other dd, ds.
  • FIG. 6 shows an embodiment of the inventive electrode arrangement, in which a plurality of electrode tips 40s, which form the contact region 40K of the inventive electrode arrangement 10, are arranged in the form of a square matrix with an equal spacing dd, ds from each other and with an identical diameter Dp, which here describes the diameter of the circular cross-section proximal end 40p of the respective electrode tips 40s.
  • FIG. 7 shows an embodiment of the inventive electrode arrangement, in which a type of lawn of a plurality of electrode tips 40s is provided on the base 40b of the electrode arrangement 10.
  • FIGS. 8 to 10 show microscopic photographs of corresponding applications of an electrode arrangement 10 according to the invention with a single electrode tip 40s, which is in contact with a test cell Z.
  • base 40ba surface, surface area, top

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Electromagnetism (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Elektrodenanordnung (10) für elektrophysiologische Untersuchungen biologischer Zellen (Z) und dergleichen. Die Elektrodenanordnung (10) weist einen Kontaktbereich (40k) zum Kontaktieren der Elektrodenanordnung (10) mit einer biologischen Zelle (Z) oder dergleichen, sowie einen Anschlussbereich (40A) zur externen elektrischen Kontaktierung der Elektrodenanordnung (10) auf. Der Kontaktbereich (40K) ist mit einer oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet, die sich vom Anschlussbereich (40a) her erstrecken und eine geometrische Gestalt aufweisen, die im Betrieb ein ansonsten zerstörungsfreies Eindringen in eine biologische Zelle (Z) oder dergleichen über deren Membran (M) in das Zellinnere (I) erlaubt.

Description

Elektrodenanordnung, deren Verwendung sowie Verfahren zu deren Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Elektrodenanordnung, deren Verwendung sowie - insbesondere elektrochemische - Verfahren zu deren Herstellung.
Zur Untersuchung und/oder zur Manipulation biologischer Spezies oder Zellen und dergleichen sind unterschiedliche Verfahren und Mess- bzw. Manipulationsanordnungen bekannt.
Zum einen ist ein äußeres Kontaktieren der Membran der Spezies oder Zelle durch Anlagern der entsprechenden Spezies oder Zelle an eine Elektrode denkbar, wobei ein direkter Zugriff auf das Innere der Spezies oder Zelle oder dergleichen in diesem Fall nicht möglich ist, da die Membran der Spezies oder Zelle der nicht durchdrungen wird.
Andererseits sind verschiedene Patch- und Voltage-Clamp-Techmken bekannt, mit deren Hilfe auch ein Zugriff auf das Innere der Spezies oder Zelle möglich ist, um diese zu manipulieren und/oder elektrisch abzugreifen.
Nachteilig bei den bekannten Verfahren sind zum einen die ver- gleichsweise indirekte Ableitung und der indirekte Zugriff auf das Innere der Spezies oder Zelle und zum anderen die geringe
Reproduzierbarkeit der Manipulationen und der entsprechenden
Messergebnisse sowie ferner die Instabilität der Anordnung aus
Spezies oder Zelle und manipulierender oder messender Einrichtung und der Stress für die Spezies oder Zelle selbst.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Elektrodenanordnung für elektrophysiologische Untersuchungen biologischer Spezies oder Zellen und dergleichen, ein Verfahren zu deren Herstel- lung sowie entsprechende Verwendungen anzugeben, bei welchen sich ein Zugriff auf das Innere einer Spezies oder Zelle auf besonders einfache, zuverlässige, schonende und reproduzierbare Art und Weise realisieren lasst.
Gelost wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bei einer Elektrodenanordnung erfmdungsgemaß durch die Merkmale des unabhängigen Patentanspruchs 1. Des Weiteren wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe durch ein Herstellungsverfahren erfmdungsgemaß mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 43 gelost. Ferner wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe durch Verwendungen der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung gemäß den unabhängigen Patentansprüchen 54 und 55 gelost. Vorteilhafte Weiterbildungen sind jeweils Gegenstand der abhangigen Unteranspruche .
Im Sinne der Erfindung werden unter einer biologischen Spezies oder Zelle jeweils subsumiert eine biologische Zelle im engeren Sinne, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle, ein Liposom, ein Vesikel, eine micellare Struktur, deren Bestandteile oder Fragmente sowie deren Verbände oder Aggregate, wobei auch so genannte Fusionsspezies oder Fusionszellen, im Hinblick auf Quer- und Langsfusion, mit umfasst sein sollen. Erfmdungsgemaß kann dem jeweiligen System zur Untersuchung eine jede dieser Spezies zugrunde gelegt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Elektrodenanordnung für elektrophysiologische Untersuchung an biologischen Spezies, insbesondere an biologischen Zellen oder dergleichen geschaffen. Die erfmdungsgemaße Elektrodenanordnung ist mit einem Kontaktbereich ausgebildet zum Kontaktieren der Elektrodenanordnung mit mindestens einer biologischen Spezies, einer biologischen Zelle oder dergleichen. Des Weiteren ist ein Anschlussbereich ausgebildet zum externen elektrischen Anschließen der Elektrodenanordnung. Der Kontaktbereich ist mit einer Elektrodenspitze oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen als Elektroden ausgebildet, die sich vom Anschlussbereich der Elektrodenanordnung her erstrecken. Die Elektrodenspitzen sind jeweils mit einer geometrischen Gestalt ausgebildet, die im Betrieb ein ansonsten zerstörungsfreies Eindringen der Elektrodenspitzen in eine biologische Spezies oder Zelle oder dergleichen über deren Membran in deren Inneres erlaubt.
Es ist somit eine Kernidee, bei einer Elektrodenanordnung den Kontaktbereich mit einer Elektrodenspitze oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen auszubilden. Die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen sind geeignet, eine Membran der biologischen Spezies, insbesondere einer biologischen Zelle, zersto- rungsfrei zu durchdringen, um einen Zugriff auf das Innere der biologischen Spezies oder Zelle zu erlangen.
Bei einer Weiterbildung der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elekt- rodenspitzen sich jeweils vom Anschlussbereich her monoton oder streng monoton verjüngend erstreckend ausgebildet sind.
Alternativ oder zusatzlich kann es vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen sich jeweils vom Anschlussbereich her zylindrisch oder quaderförmig verlaufend und am vom Anschlussbereich abgelegenen und distalen Ende der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen mit einer sich monoton oder streng monoton verjungenden Spitze ausgebildet sind. Das heißt insbesondere, dass sich die Elektrodenspitze vom proximalen zum distalen Ende hin gleichförmig verjüngt.
Bei einer anderen alternativen oder zusatzlichen Weiterbildung der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen mit einem Querschnitt ausgebildet sind, der rund, kreisförmig, elliptisch, rechteckig oder quadratisch ist.
Bei einer bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen mit einem dem Anschlussbereich zugewandten oder den Anschlussbereich bildenden ersten und proximalen Ende ausgebildet sind. -A-
Bei einer vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass der Durchmesser der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen am proximalen Ende im Bereich von etwa 50 nm bis etwa 5000 nm ausgebildet ist.
Bei einer besonders bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass der Durchmesser der Elektrodenspitze oder Mehr- zahl Elektrodenspitzen am proximalen Ende unterhalb von etwa 1/10 des Durchmessers einer zu kontaktierenden Spezies oder Zelle liegt .
Bei einer besonders vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen mit einem vom Anschlussbereich abgewandten zweiten und distalen Ende ausgebildet sind.
Dabei kann es in diesem Fall gemäß einer anderen Ausfuhrungsform der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung vorgesehen sein, dass die Durchmesser der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen am distalen Ende im Bereich von 1/10 des Durchmessers einer zu kontaktierenden Spezies oder Zelle ausgebildet sind.
Bei einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen am distalen Ende mit einem Krümmungsradius im Bereich von etwa 5 nm bis etwa 50 nm ausgebildet smd.
Dabei ist der Krümmungsradius der Elektrodenspitze insbesondere der Radius derjenigen Kugel, welche die Elektrodenspitze an ihrem distalen Ende am besten approximiert.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausfuhrungsform der erfindungs- gemaßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen im Bereich der distalen Enden mit einem spitzen Winkel im Bereich von etwa 10° bis etwa 50° als Öffnungswinkel der jeweiligen Spitze ausgebildet sind.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausfuhrungsform der erfin- dungsgemaßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusatzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen vom Anschlussbereich her eine Lange im Bereich von etwa 4/5 dem Durchmesser einer zu kontaktierenden Spezies aufweisen .
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusatzlich vorgesehen sein, dass der Kontaktbereich mit einer Mehrzahl Elektrodenspitzen ausgebildet ist.
Bei einer anderen vorteilhaften Ausfuhrungsform der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusatzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitzen geometrisch gleich und/oder gleich wirkend ausgebildet sind.
Bei einer anderen Fortbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusatzlich vorgesehen sein, dass der Anschlussbereich als materiell zusammenhängende Basis mit einer Oberflache und einer Unterseite ausgebildet ist.
Bei einer weiteren Fortbildung der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusatzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen sich von der Oberflache der Basis aus erstreckend ausgebildet sind .
Bei einer besonders bevorzugten Fortbildung der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusatzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspit- zen sich von der Oberflache der Basis aus senkrecht oder im We- sentlichen senkrecht erstreckend ausgebildet sind, zumindest lokal.
Bei einer anderen vorteilhaften Fortbildung der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusatzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitzen zueinander gleich orientiert und parallel oder im Wesentlichen parallel ausgerichtet ausgebildet sind, zumindest lokal.
Denkbar ist es auch, dass die Elektrodenspitzen gemäß einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung alternativ oder zusatzlich in Form einer Reihe, Matrix oder senkrechten Matrix auf der Oberseite der Basis angeordnet ausgebildet sind.
Möglich ist es auch, dass die Elektrodenspitzen gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung mit gleichen paarweisen Abstanden direkt benachbarter Elektrodenspitzen in den Hauptachsenrichtungen ihrer Anord- nung angeordnet ausgebildet sind.
Auch ist es denkbar, dass die Oberfläche der Basis planar ausgebildet ist, zumindest lokal.
Ferner ist es möglich, dass die Basis und die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen miteinander einstückig als integraler materieller Bereich ausgebildet sind.
Bei einer bevorzugten alternativen oder zusatzlichen Weiterbil- düng der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Basis und die Elektrodenspitzen oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen einteilig miteinander verbunden ausgebildet sind.
Bei einer vorteilhaften alternativen oder zusatzlichen Weiterbil- düng der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Basis und die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elekt- rodenspitzen aus demselben, insbesondere elektrisch leitfahigen Material ausgebildet sind.
Bei einer besonders bevorzugten alternativen oder zusatzlichen Weiterbildung der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen als elektrochemisch geatzte Strukturen ausgebildet sind.
Bei einer besonders vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass ein Trager mit einer Oberflache und einer Unterseite aus einem elektrisch isolierenden Material ausgebildet ist.
Dabei kann es in diesem Fall gemäß einer anderen Ausfuhrungsform der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung vorgesehen sein, dass die proximalen Enden der Elektrodenspitzen und gegebenenfalls die Basis im Trager eingebettet und echt unterhalb der Oberflache des Tragers und die distalen Enden der Elektrodenspitzen echt ober- halb der Oberflache des Tragers ausgebildet sind.
Bei einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusatzlich vorgesehen sein, dass die Oberflache des Tragers vollständig oder lokal konform und insbesondere parallel zur Oberflache der Basis verlaufend ausgebildet ist.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausfuhrungsform der erfin- dungsgemaßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusatz- lieh vorgesehen sein, dass die Oberflache des Tragers vollständig oder lokal planar, konvex und/oder konkav ausgebildet ist.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Oberflache des Tragers planar oder im Wesentlichen planar und mit konkaven Vertiefungen im Bereich der proximalen Enden der Elektrodenspitzen ausgebildet ist. Es ist auch möglich, dass die Unterseite der Basis an der Unterseite des Tragers zumindest zum Teil vom Tragermaterial unbedeckt ausgebildet ist, um einen externen elektrischen Abgriff zu ermöglichen.
Denkbar ist auch, dass elektrisch isoliert zum Kontaktbereich und zum Anschlussbereich eine Gegenelektrodenanordnung und/oder eine Referenzelektrodenanordnung ausgebildet sind.
Die Gegenelektrodenanordnung kann mit einer oder einer Mehrzahl Gegenelektroden ausgebildet sein.
Die Gegenelektrodenanordnung oder ein Teil davon und/oder die Referenzelektrodenanordnung können auf der Oberflache des Tragers ausgebildet sein.
Bei einer besonders bevorzugten Fortbildung der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die räumliche Anordnung und/oder die Geometrie der Gegenelektrodenanordnung zur Erzeugung eines gesteuert inhomogenen elektrischen und/oder elektromagnetischen Feldes ausgebildet sind .
Bei einer anderen vorteilhaften Fortbildung der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Gegenelektrodenanordnung oder ein Teil davon der Elektrodenspitze oder der Mehrzahl Elektrodenspitzen gegenüberliegend ausgebildet sind.
Denkbar ist es auch, dass die Gegenelektrodenanordnung oder ein Teil davon in einem Abstand im Bereich von etwa 15 μm bis etwa 1 cm von der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen ausgebildet sind.
Auch ist es denkbar, dass eine Gegenelektrode der Gegenelektrodenanordnung mit einer flachenhaften Geometrie ausgebildet ist. Bei einer besonders bevorzugten alternativen oder zusatzlichen Weiterbildung der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass eine Gegenelektrode der Gegenelektrodenanordnung eine Große und/oder eine Flache aufweist, die groß sind im Verhältnis zur Große/Flache der Elektrodenspitzen, insbesondere in einem Verhältnis im Bereich von etwa 5:1 oder im Bereich von etwa 100:1 oder darüber.
Die Elektrodenspitzen und/oder die Basis können z.B. aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe gebildet sind, die besteht aus Silber, Gold, Platin, Wolfram, Legierungen, Legierungen dieser Metalle, Platin-Iridium- Legierungen und Gold-Iridium-Legierungen .
Bei einer vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass eine Mehrzahl Basen mit jeweils einer oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen ausgebildet ist.
Auch ist dabei es denkbar, dass die Basen einzeln oder gruppenweise voneinander elektrisch isoliert und/oder räumlich getrennt ausgebildet sind.
Bei einer bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass als Trager ein Materialbereich mit oder aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe ausgebildet ist, die besteht aus Glasern, glasahnlichen Materialien, organi- sehen Polymeren und Fotolacken.
Durch die vorliegende Erfindung wird des Weiteren ein Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung geschaffen . Dabei ist es erfmdungsgemaß vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen durch ein elektrochemisches Atzverfahren ausgebildet werden.
Bei einer ersten Weiterbildung des erfmdungsgemaßen Verfahrens zum Herstellen der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass dem elektrochemischen Atzen ein einzelner oder eine Mehrzahl feiner Drahte zugrunde gelegt werden.
Die kann vorzugsweise unter Verwendung einer Bondingmaschine geschehen .
Bei einer anderen Weiterbildung des erfmdungsgemaßen Verfahrens zum Herstellen der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es zusätzlich oder alternativ vorgesehen, dass dem elektrochemischen Atzverfahren feine Drahte mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 5 μm bis etwa 50 μm zugrunde gelegt werden. Denkbar ist auch, mit Drahten mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 300 μm bis etwa 500 μm zu beginnen.
Bei einer weiteren zusätzlicher oder alternativen Fortbildung des erfmdungsgemaßen Verfahrens zum Herstellen der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass dem elektrochemischen Atzverfahren feine Drahte aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe zugrunde gelegt werden, die besteht aus Silber, Gold, Platin, Wolfram, Legierungen, Legierungen dieser Metalle, Platm-Iridium-Legierungen und GoId- Iridium-Legierungen .
Denkbar ist, dass dem elektrochemischen Atzverfahren so genannte Bonddrahte oder Drahte zugrunde gelegt werden, die in ihren Eigenschaften Bonddrahten entsprechen.
Bei einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfmdungsge- maßen Verfahrens zum Herstellen der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass zunächst em oder mehrere feine Drahte durch einen entsprechenden elektrochemischen Atzprozess behandelt werden und dass dann die so behandelten Drahte in eine Haltevorrichtung eingebracht werden, insbesondere durch Haltern der als proximale Enden für die Elektrodenspitzen bestimmten Enden der Drahte in der Haltevorrichtung, wobei dann der Draht oder die Mehrzahl Drahte in ein isolierendes Material für einen Trager eingefasst wird bzw. werden.
Dabei kann als isolierendes Material für den Trager z.B. ein viskoses Polymer oder ein Glas verwendet werden.
Ferner ist es alternativ oder zusatzlich denkbar, dass das Material für den Trager und insbesondere das viskose Polymer durch Oberflachenspannung oder durch externe Felder beim Einfassen des Drahtes oder der Mehrzahl Drahte in der Haltevorrichtung gehal- tert wird.
Bei einer weiteren Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es zusatzlich oder alternative vorgesehen, dass nach Einfassen des Drahtes oder der Drahte durch das isolierende Material für den Trager in der Haltevorrichtung der Draht oder die Drahte gesteuert mikropositioniert werden, um dabei insbesondere die freiliegende Lange für die auszubildende Elektrodenspitze oder für die auszubildenden Elektrodenspitzen einzustellen.
Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es zusatzlich oder alternative vorgesehen, dass - insbesondere nach dem Mikropositionieren - das isolierende Material für den Träger und insbesondere das viskose Polymer ausgehartet wird, insbesondere durch Strahlung, UV-Licht, durch Temperaturerhöhung und/oder durch andere physikalische und/oder chemische Prozesse.
Es ist auch denkbar, dass als isolierendes Material für den Tra- ger ein Glas vorgesehen wird und dass, insbesondere nach der
Mikropositionierung, das Glas durch Erstarren durch Abkühlen ausgehartet wird. Durch die Erfindung werden auch Verfahren unter Verwendung der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung und Anwendungen der erfin- dungsgemaßen Elektrodenanordnung geschaffen.
Die erflndungsgemaße Elektrodenanordnung kann erfmdungsgemaß zur elektrophysiologischen Untersuchung und/oder Manipulation einer Spezies aus der Gruppe verwendet werden, die gebildet wird von biologischen Zellen, Liposomen, Vesikeln, micellaren Strukturen, Bakterien, Viren, Fusionszellen, Organellen, genetischen, moleku- larbiologischen und/oder biochemischen Derivaten davon, Bestandteilen dieser Spezies und Verbanden dieser Spezies.
Die erfmdungsgemaße Elektrodenanordnung kann erfmdungsgemaß auch zur Mikroin]ektion einer Substanz m eine Spezies aus der Gruppe verwendet werden, die gebildet wird von biologischen Zellen, Liposomen, Vesikeln, micellaren Strukturen, Bakterien, Viren, Fusionszellen, Organellen, genetischen, molekularbiologi- schen und/oder biochemischen Derivaten davon, Bestandteilen die- ser Spezies und Verbanden dieser Spezies.
Im letzteren Fall können vor der Mikrom] ektion die Spitze der Elektrodenspitze oder die Spitzen der Elektrodenspitzen mit der zu injizierenden Substanz beaufschlagt werden.
Die Beaufschlagung kann insbesondere auch durch Applizierung von elektrischen Feldern geschehen, z.B. bei elektrisch geladenen Substanzen, z.B. bei DNA.
Es ist von besonderem Vorteil, wenn die Elektrodenanordnung in eine Mikrostruktur eingebettet vorgesehen wird.
Es ist auch denkbar, dass die Elektrodenanordnung in einer Lap- on-the-Chip-Struktur vorgesehen wird. Ferner ist es möglich, dass die Elektrodenanordnung in oder für einen Assay vorgesehen wird, insbesondere für High-Throughput-An- wendungen .
Es kann bei diesen Verwendungen und Anwendungen auch vorgesehen sein, dass bei ruhender Elektrodenanordnung die zu untersuchende und/oder zu behandelnde Spezies oder eine Mehrzahl davon auf die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen zu gefuhrt werden .
Dabei kann es vorgesehen sein, dass das Bewegen der zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies auf die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen zu durch Kraftausubung auf die entsprechende Spezies bewirkt wird.
Denkbar ist, dass die Kraftausubung bewirkt wird durch eine die- lektrophoretische Kraft.
Dabei kann es vorgesehen sein, dass die dielektrophoretische Kraft erzeugt wird durch das Erzeugen eines - insbesondere hochfrequenten - inhomogenen elektrischen Wechselfeldes zwischen der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen und der vorgesehenen Gegenelektrodenanordnung mit den Gegenelektroden.
Dabei kann es von Vorteil sein, dass die Elektrodenspitzen mit einer Wechselspannung im Bereich von etwa 10 mV bis etwa 300 V und/oder im Frequenzbereich von etwa 100 Hz bzw. etwa 60 MHz beaufschlagt werden, um die dielektrophoretische Kraft zu erzeugen .
Alternativ oder zusätzlich ist es denkbar, dass ein elektrischer Zellkafig zur Mikropositionierung der Spezies wahrend der die- lektrophoretischen Annäherung verwendet wird.
Ferner kann es zusätzlich oder alternativ zur Erleichterung der Zellkontaktierung vorgesehen werden, dass die zu kontaktierende Zelle durch isoosmolare Losungen prall aufgefüllt wird. Durch Versteifungsreagent ien können - z.B. durch EDTA oder Pluro- nium - können die Membran versteift und das Penetπeren der E- lektrodenspitze erleichtert werden.
Es wird ferner eine Elektrodenanordnung vorgeschlagen, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung 50 oder ein Teil 51 davon nach einem der vorangehenden Ansprüche ausgebildet ist, um insbesondere eine dielektrische Kontaktierung biologischer Zellen in einer Art von Sandwichsystem zu ermöglichen, bei der die zu untersu- chende biologische Zelle nach elektrischer Kontaktierung und Fusion eine Überbruckung zwischen den beiden Elektroden ermöglicht.
Es wird auch eine Elektrodenanordnung vorgeschlagen, bei welcher eine Gegenelektrode 51 der Gegenelektrodenanordnung 50 eine Große und/oder eine Flache aufweist, die groß sind im Verhältnis zur Große/Flache der Elektrodenspitzen 40s, insbesondere in einem Verhältnis im Bereich von etwa 5:1 oder im Bereich von etwa 100:1 oder darüber, vorzugsweise im Bereich von etwa 10000:1.
Denkbar ist auch eine Elektrodenanordnung bei welcher die Elektroden durch eine chemische Reaktion derart modifiziert sind, dass eine elektrophysiologische Untersuchung von biologischen Zellen ermöglicht, erleichtert oder sensitiver ist, wobei die chemische Reaktion insbesondere hauptsächlich eine elektrochemische Oxida- tion der vorgenannten Metalle mit einem Halogen ist, wobei die chemische Reaktion insbesondere zeitlich vor oder nach der Kontaktierung der biologischen Zelle erfolgt, wobei im letzteren Fall das Halogen aus dem Zytosol der Zelle gewonnen und/oder geliefert wird.
Ferner kann auch eine Elektrodenanordnung vorgesehen sein, bei welcher die Elektrodenanordnung mit einer Druckmesssonde kombiniert ist, wobei es sich dabei insbesondere um eine externe, außen an einem Messobjekt, oder eine invasive, sich innerhalb eines Messobjektes befindliche Druckmesssonde handelt. Auch ist eine andere Verwendung vorgesehen, bei welcher die E- lektrodenspitze 40s oder Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s mit einer Wechselspannung im Bereich von etwa 10 mV bis etwa 300 V und/oder im Frequenzbereich von etwa 100 Hz bzw. etwa 100 MHz, vorzugswei- se von etwa 100 Hz bzw. etwa 60 MHz, weiter bevorzugt von etwa 100 Hz bzw. etwa 40 MHz beaufschlagt werden, um die dielektrophoretische Kraft zu erzeugen.
Bei einer anderen Verwendung wird eine elektrische Isolation nicht mit Zellen kontaktierter, freier Elektroden sondern derart vorgenommen, dass eine Losung von Liposomen definierter Große, wobei der minimale Durchmesser 100 nm und der maximale Durchmesser 5 μm betragt, über die Elektrodenflache gespult und durch Anlegen eines Wechselstroms auf die besagten freien Elektroden- spitzen kontaktiert wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum elektrischen Kontaktieren einer zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies Z, insbesondere einer biologi- sehen Zelle oder dergleichen, mit einer Elektrodenspitze 40s einer Elektrodenanordnung 10 vorgeschlagen, bei welchem eine Patchpipette oder Patchelektrode als Elektrodenspitze 40s verwendet wird oder die Elektrodenspitze 40s aufweist und bei welchem die Elektrodenanordnung 10 derart gesteuert mit einem elektri- sehen Feld beaufschlagt wird, dass ein dielektrophoretische Kraft auf die zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies Z derart ausgeübt wird, dass die zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies Z an die Elektrodenspitze 40s angenähert und mit dieser kontaktiert wird.
Dabei kann die Elektrodenspitze 40s oder eine Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s mit einer Wechselspannung im Bereich von etwa 10 mV bis etwa 300 V und/oder im Frequenzbereich von etwa 100 Hz bzw. etwa 100 MHz, vorzugsweise von etwa 100 Hz bzw. etwa 60 MHz, weiter bevorzugt von etwa 100 Hz bzw. etwa 40 MHz beaufschlagt werden, um die dielektrophoretische Kraft zu erzeugen. Die Fokussierung bzw. Kontaktierung der elektrophysiologisch zu untersuchenden biologischen Zellen erfolgt vorzugsweise diee- lektrisch durch Modulation der Frequenzen, wobei die dazu applizierenden Frequenzen im Bereich von mindestens 100 Hz bis maximal 100 MHz, besonders im Bereich von 100 kHz bis 40 MHz liegen.
Eine besondere Ausfuhrung sieht eine Kombination der vorgehend beschriebenen Elektrodenanordnung mit einer Druckmesssonde vor, wobei es sich dabei um eine externe, außen an einem Messob]ekt oder eine invasive, sich innerhalb eines Messobjektes befindliche Druckmesssonde handelt.
Vorgesehen sein kann auch eine Elektrodenanordnung, bei welcher die Gegenelektrode ebenfalls als Fakirelektrode ausgebildet ist und somit eine dielektrische Kontaktierung biologischer Zellen in einer Art von „Sandwich"System ermöglicht bei der die zu untersuchenden biologischen Zellen nach elektrischer Kontaktierung und Fusion eine Überbruckung zwischen den beiden Elektroden ermöglichen. Dies ist in den Figuren IIA und IIB sowie 12A und 12B ge- zeigt.
Auch ist denkbar eine Elektrodenanordnung, bei welcher die Elektroden durch chemische Reaktion derart modifiziert werden, dass eine elektrophysiologische Untersuchung von biologischen Zellen ermöglicht, erleichtert oder sensitiver gestaltet wird, wobei vorgenannte chemische Reaktion hauptsächlich eine elektrochemische Oxidation der vorgenannten Metalle mit einem Halogen ist. Diese chemische Reaktion kann zeitlich vor oder nach der „Kontaktierung" der biologischen Zelle geschehen. Im letzteren Fall wird das Halogen aus dem Zytosol der Zelle gewonnen/geliefert.
Ein mögliche Verwendung ist denkbar, bei welcher eine elektrische Isolation nicht mit Zellen kontaktierter, freier Elektroden vorgenommen wird der Art, dass eine Losung von Liposomen definierter Große, wobei der minimale Durchmesser 100 nm und der maximale Durchmesser 5 μm betragt, über die Elektrodenflache gespult und durch Anlegen eines Wechselstroms auf die besagten freien Elektrodenspitzen kontaktiert wird.
Die dielektrophoretische Kontaktierung kann auch mit einer Kon- struktion möglich sein, die einer normalen Patch-Pipette ähnelt.
Eine Elektrode - in Folge mit A bezeichnet - die von einer Mikro- glaskapillare umgeben ist, die wiederum mit einer physiologischen
Losung gefüllt ist. Die anziehende Kraft auf die Zelle wird - bei geeigneter Gegenelektrode B - in Richtung der Elektrode A erfol- gen. Dadurch wird die Zelle gleichzeitig in Richtung der Mikro- glaskapillare beschleunigt und von dieser „aufgespießt" .
Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend weiter erläutert:
Nachfolgend wird die erfmdungsgemaße Elektrodenanordnung synonym auch als Fakirelektroden bezeichnet. Die Erfindung betrifft also insbesondere auch so genannte Fakirelektroden, deren Herstellung und deren Verwendung.
Problemstellung
Mit Hilfe elektrophysiologischer Techniken können die elektrischen Parameter von biologischen Systemen untersucht und mampu- liert werden. Angewendet werden diese Techniken auf Zeilverbande, einzelne Zellen, Fragmente von Zellmembranen und Liposomen und Proteoliposomen, letztere u.a. mit Hilfe von Techniken, die auf so genannten künstlichen Membranen beruhen) . Im Folgenden wird das Spektrum dieser biologischen Systeme verkürzt „Zellen" ge- nannt . All diesen elektrophysiologischen Techniken ist gemein, dass sie auch zur Untersuchung der Funktionseigenschaften bzw. zur Manipulation von (Membran) -Proteinen und den sie umgebenden Membranen eingesetzt werden.
Em entscheidendes Problem der existierenden elektrophysiologischen Technologien, z.B. bei Voltage-, Current- und Patch-Clamp- Techmken, ist, dass mit diesen nur direkte elektrische Ableitun- gen an Zellen ab bestimmter Große - z.B. mit einem Durchmesser großer als 10 μm - möglich sind, andererseits wobei an lebenden Zellen irreversible Schädigungen durch die Mikroelektroden erzeugt werden. Darüber hinaus sind diese Technologien bei mechani- sehen Einwirkungen instabil. Dies fuhrt nach kurzem Zeitraum zu einer Zerstörung der Zelle. Es lasst sich auch feststellen, dass alle existierenden elektrophysiologischen Techniken den - insbesondere für kommerzielle Applikationen - schwerwiegenden Nachteil aufweisen, dass sie äußerst kompliziert sind und dadurch eine Automatisierung der Prozessfuhrung bei diesen Techniken aufwendig und sehr fehleranfallig ist.
Die hier vorgestellte Erfindung weist die oben besagten Nachteile existierender Technologien nicht auf. Sie zeichnet sich durch eine hohe Robustheit, Flexibilität in der Anwendung aus und erlaubt sowohl indirekte wie auch direkte (reversible) elektrische Ableitungen an den eingesetzten Zellen.
Idee
Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem insbesondere eine elektrophysiologische Messanordnung für Zellen, Fusionszellen, Liposomen, Membranfragmente und Zellverbande - im Folgenden einfach als Zellen zusammengefasst - vor.
Die elektrische Manipulation der Zellen erfolgt durch eine oder mehrere Elektroden, die direkt in die Zellen eindringen. Die Große der Elektroden hangt dabei vom verwendeten zellularen System ab. Die Elektrode wird bei sehr kleinen Zellen - Durchmesser im Bereich von 15 μm - einen sehr kleinen Durchmesser haben, z.B. im bereich von etwa 900 nm, und nur eine geringe Lange aufweisen, z.B. im Bereich von etwa 5 μm. Wichtig ist auch, dass die Fakirelektroden eine feine Spitze haben, z.B. kleiner als etwa 500 nm, um das zellulare System beim Eindringen möglichst wenig zu ver- letzen. Fig. 1 zeigt eine mögliche elektrophysiologische Anordnung der hier vorgestellten Fakirtechnologie. Dargestellt ist eine Zelle, kontaktiert durch eine Fakirelektrode mit mehrfachen Spitzen.
Herstellungsarten der Fakirelektrode
Wichtige Eigenschaften der hier vorgestellten Fakir-Elektroden sind bei einigen Ausfuhrungsformen
a) ihre geometrischen Abmessungen und/oder
b) das elektrisch isolierende Tragermaterial für die Elektrode .
Durch das Tragermaterial wird die freiliegende Lange der Elektrode bestimmt. Die Herstellung solcher Fakirelektroden aus Nanoe- lektrodenstrukturen und Tragermaterial ist Teil der hier vorgestellten Erfindung.
Wie in (1) ausgeführt, müssen die verwendeten Fakirelektroden bei einigen Anwendungen sowohl in ihrer Geometrie als auch in ihrer Lange Dimensionen in der Größenordnung von Nano- und Mikrometern aufweisen, und zwar abhangig vom verwendeten zellularen System:
Der Durchmesser muss zwischen etwa 50 nm und etwa 5000 nm liegen, die Lange zwischen etwa 500 nm und etwa 250 μm. Die Fakirelektroden bestehen aus leitfahigen Materialien, vorzugsweise Metallen aus Silber, Gold, Platin, Wolfram und/oder Legierungen wie z.B. Pt-Ir und Au-Ir.
Herstellungsverfahren
Die Herstellung soll durch elektrisches oder elektrochemisches Atzen z.B. von feinster Drahte, z.B. Durchmesser etwa 5 μm bis etwa 50 μm, z.B. eines entsprechenden Metalls oder einer entsprechenden Legierung erfolgen. Em Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von feinsten Ausgangsdrahten, z.B. von so genannten Bonddrahte oder von Drahten, die in ihren Eigenschaften diesen ahnein, weil der Atzprozess bei kleinen Anfangsdurchmessern einfacher durchgeführt werden kann und bessere Ergebnisse erzielt werden können. Es können jedoch auch Drahte größeren Durchmessers als Ausgangsmaterial verwendet werden. Dieses Vorgehen erschwert jedoch den Atzprozess. Durch den Atzprozess werden Metalldrahte erhalten, die feinste Metallspitzen aufweisen. Diese derart geatzten Spitzen der Metalldrahte werden dann z.B. in eine geeignete Haltevorrichtung eingeführt, z.B. in einen Ring, ein Gitter, eine Kanüle, so dass der Draht von einem viskosen Polymer umfasst werden kann. Das viskose Polymer wird dabei durch Oberflachenspannung oder durch Felder in der Haltevorrichtung gehalten. Wichtig in diesem Zusammenhang ist, dass der Draht in die Haltevorrichtung eingeführt wird bevor das Polymer hinzu gegeben wird. Dies hat zur Folge, dass die feine Spitze des Drahtes nicht in Kontakt mit dem Polymer kommen kann und sich daher auch keine Ablagerungen des elektrisch isolierenden Polymers auf der Elektrode bilden können.
Anschließend erfolgt ein Mikropositionieren des Metall-Drahtes im Polymer, so dass die freiliegende Lange der geatzten Metallspitze die gewünschten Abmessungen hat. Anschließend wird das Polymer durch UV-Licht, durch Temperatur-Erhöhung oder andere physika- lisch/chemische Prozesse ausgehartet. Bei Bedarf kann wahrend des Ausharteprozesses die Position der Metallspitze nachjustiert werden .
Die Detektion der freiliegenden Spitze erfolgt dabei z.B. über visuelle Mikroskopkontrolle oder bei automatisierter Prozessfuh- rung durch Laserabtastung bzw. andere Messsysteme. Die Justierung des Drahtes kann manuell oder automatisiert ablaufen, z.B. in Ruckkopplung mit der optischen Kontrolle bzw. der Laserabtastung. Es werden Polymerwerkstoffe verwendet, die über hohe Viskosität verfugen, nur geringen Volumenanderungen wahrend des Ausharteprozesses unterworfen sind und sich durch UV-Licht, Temperatur oder andere chemisch/physikalische Prozesse erharten lassen. Dieser Prozess kann auch mit mehreren voneinander unabhängigen geatzten Metalldrahten durchgeführt werden. Auf diesem Weg wird ein „Rasen" von elektrisch unabhängigen Elektroden erhalten.
Es ist auch Herstellungsverfahren mit Glas anstatt mit einem Polymer Denkbar. Dazu kann die Haltevorrichtung aus einer elektrischen Gluhwendel bestehen. Dieses kann genutzt werden das Glas so zu erhitzen und zu verflüssigen, dass anschließend der Draht mikropositioniert werden kann. Das System kann dann darüber hm- aus über ein Zuflusssystem für flüssiges und erhitztes Glas verfugen, so dass auch in diesem Fall der geatzte Draht zuerst durch die Haltevorrichtung geschoben werden kann und die freiliegende Spitze nicht mit flussigem Glas in Kontakt kommt.
Kontaktierung von Zellen an Nanofakirelektroden
Die in oben vorgestellten Fakirelektroden sollen in Zellen eindringen, damit diese elektrisch ableitbar werden. Teil der hier vorgestellten Erfindung ist, dass die Elektroden nicht wie bei herkömmlichen System zur Zelle gebracht werden, sondern die Zelle zur Fakirelektrode. Dies soll durch das Applizieren einer die- lektrophoretischen Kraft erreicht werden. Diese Kraft kann durch das Anlegen hochfrequenter, stark inhomogener Wechselfelder erzeugt werden und bewirkt bei geeigneten dielektrischen Eigen- schatten der Zelle - in Bezug auf die dielektrischen Eigenschaften des Mediums - eine Wanderung der Zelle in Richtung der Fakirelektrode. Sie endet erst, wenn die Fakirelektrode im Inneren der Zelle ist. Dadurch wird die Zelle an die Fakirelektrode kontaktiert. Theoretische Erklärung: Bei konstanter Feldstarke nimmt die Kraft mit der Inhomogenität des Feldes zu, so dass bei elektrischen Feldern, die zwischen einer Spitze und einer planaren Referenzelektrode (daher rührt die Inhomogenität des Feldes her) existieren, die Kräfte so groß werden können, dass die Zelle auf atomaren Abstand an die Elektrode heran gezogen werden kann. Die Kraft auf die Zelle in einem solchen inhomogenen Wechselfeld nimmt weiterhin mit fallendem Abstand zur Fakir-Elektrode stark zu. Dies hat zur Folge, dass die Kontaktierung sehr schnell ver- lauft und das Eindringen der Metallspitze ein für die Membran der Zelle relativ stressfreier Vorgang ist. Dieser auf den ersten Blick verwirrender Befund lasst sich darauf zurückfuhren, dass die Membran aufgrund der Schnelligkeit des Heranfuhrens an die Spitze schnell penetriert wird und sich dem Aufprall kaum widersetzt. Dies hat zur Folge, dass die Zelle den Prozess ohne Verlust ihrer Vitalität überstehen kann und der entstehende Komplex aus Elektrode und Zelle extrem stabil gegen mechanische Beeinflussungen ist.
Nanoinj ektion von DNA und/oder von anderen Substanzen
Die beschriebene Kontaktierung der Zelle kann auch zur Nano- oder Mikroin] ektion von bioaktiven Substanzen in zellulare Systeme verwendet werden.
Dazu werden die Fakirelektroden vorher mit diesen Substanzen gecoated oder beschichtet. Dies kann z.B. bei Substanzen, die elektrischen Ladungen tragen (DNA), auch durch Anlegen entspre- chender elektrischer Felder geschehen, die Kräfte auf die Partikel erzeugen und eine Bewegung zur Fakirelektrodenoberflache bewirken. Wird die Zelle anschließend mit der Fakir-Elektrode kontaktiert, dann befindet sich die bioaktive Substanz in der Zelle. Vorteile bei diesem Verfahren sind einerseits der geringe Verbrauch bioaktiver Substanz, die beim „Animpfen" der Zelle verwendet wird, und die einfache Selektion der angeimpften Zellen von jenen, denen nichts injiziert wurde. Letzteres ist möglich, wenn man nach Kontaktierung das Zellmedium gegen ein zellfreies Medium austauscht und die Tochterzellen der angeimpften, kontak- tierten Zellen erntet". Über die Messung der elektrischen Parameter der kontaktierten Zelle lasst sich zudem der Vitalitatszu- stand der Zellen bestimmen und es ist dadurch möglich optimal die Ernährung der Zellen zu steuern bzw. den Erntevorgang abzubrechen, falls die kontaktierten Zellen ihre Vitalität verlieren.
Herstellung eines Hybridsensorköpfes zur elektrischen Ableitung Em weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Nutzung von Fakirelektroden zu direkten oder intrazellularen elektrischen Ableitungen .
Dafür ist es erforderlich, dass die Fakirelektrode einen sehr hohen Abdichtungswiderstand gegenüber der Badlosung aufweist. Dadurch wird gewährleistet, dass der von der Fakirspitze gegen eine Referenzelektrode gemessene Widerstand (bzw. andere elektrische Parameter des Systems) ausschließlich von der Leitfähigkeit der „Zell"-Membran der mit der Fakir-Elektrode kontaktierten Zelle bestimmt wird. Die Etablierung eines hohen Abdichtwiderstandes ist also ein sehr wichtiger Bestandteil unser Erfindung.
Zunächst muss die Fakir-Elektrode (bzw. die Fakirbrett-Elektrode) bis auf die Spitzen der Fakir-Nadeln elektrisch abgedichtet werden. In (2) ist beschrieben wie dies bei unserer Erfindung erreicht wird.
Nach der Kontaktierung der Fakirspitzen mit den besagten Systemen ist es notwendig die Flachen der Fakir-Elektrode, die noch zur Badlosung freiliegen, abzudichten.
a) Dies kann durch nachträgliche Lipidbeschichtung dieser freiliegenden Elektrodenflachen erfolgen.
b) Eine andere Methode ist es Liposomen (50 nm bis 1 μm) mit Hilfe geeigneter hochfrequenter Wechselfelder anzuziehen bis alles Elektrodenmaterial abgedichtet ist.
Theoretische Erklärung: Das Verfahren beruht darauf, dass bei geeignet gewählten Bedingungen dielektrophoretische Kräfte nur auf Objekte bestimmten Durchmessers wirken. Bei Wahl geeigneter Frequenzen ist es daher möglich selektiv Objekte kleiner Große anzuziehen (z.B. kleine Liposomen von 50 nm bis 1 μm) wobei große Objekte (z.B. Zellen von 20 μm Durchmesser) keine Kraft erfahren. c) Auch Fusion weiterer Zellen oder Liposome an das System, das bereits kontaktiert ist, kann dazu verwendet werden den Abdichtwiderstand der Fakir-Elektrode zu erhohen. Die Fusion kann durch moderate μs- Hochspannungspulse erreicht werden (um mehrere lateral oder vertikal dielektrophoretisch angeordnete Zellen elektrisch zu einem Fusionsprodukt zu verschmelzen, so genannte Elektrofusion, Dadurch entstehen gleichzeitig „Sensorkopfe" mit sehr großen, intakten Membranflachen.
Durch Verwendung von elektrischen Zellkafigen soll der Prozess der Kontaktierung automatisiert werden.
Elektrische Messungen an Hybridsensorkopfen
Die elektrische Parameter der Zelle können über verschiedene elektrische Verfahren ermittelt werden:
a) Impedanzverfahren, b) Voltageclampverfahren und c) Currentclampverfahren .
Beim Voltageclampverfahren ist es erforderlich reversibel arbeitende Elektroden wie die Ag/AgCl-Elektrode zu verwenden. Eine Chlorierung der Silberfakirelektrode soll vorher und bei Bedarf auch nach Kontaktierung erfolgen. Im letzten Fall wird dafür das intrazellular vorhandene Chlorid verwendet. Um Verunreinigungen oder Störungen bei diesem Prozess zu vermeiden, soll die Fakirelektrode in diesem Fall durch eine intrazellulare Salzbrucke vom Zytosol abgetrennt sein. Diese Salzbrucke kann z.B. aus Hydrogelen, wie z.B. Alginat, bestehen, die mit Cl- haltigen Salzen dotiert sind.
Abhangig vom Verfahren müssen verschiedene Elektrodenmaterialien verwendet werden (siehe dazu (1) und (2)). Es sollen je nach
Zweck verschiedene Verfahrensweise angewandt werden a) Verwendung einer einzeln Fakir-Elektrode zur Kontaktierung einer Zelle b) Verwendung mehrerer Fakir-Elektroden zur Kontaktierung einer Zelle d) Verwendung mehrerer Fakir-Elektroden zur Kontaktierung mehrerer Zellen. Im letzten Fall sollen die Fakirelektroden einerseits zusammen, andererseits einzeln abgegriffen werden.
Generell hat der Einsatz mehrerer Fakir-Elektroden den Vorteil, dass der Ausfall von einer oder mehreren Elektroden durch z.B. eine eventuelle Ablagerung von zytoplasmatischen Lipid- und Pro- temkomponenten oder von Membrankomponenten bei der Penetrierung aufgrund des redundanten Systems kompensiert werden kann. Der Vorteil mehrerer unabhängige abgegriffener Fakirelektroden hat zusatzlich den Vorteil, dass parallel mehrere unterschiedliche Zellen simultan abgegriffen werden können und dadurch bei Einsatz äußerst geringer Losungsvolumina viele voneinander unabhängige Ergebnisse ermittelt werden können.
Etablierung der Langzeitvitalitat des Hybridsensorkopfes
Für kommerzielle Applikationen der hier vorgestellten Erfindung ist es von entscheidender Bedeutung nicht nur ein mechanisch stabiles System zu erzeugen, sondern gleichzeitig auch die Funktion des Systems über einen langen Zeitraum aufrecht zu erhalten. Die Grundvoraussetzungen hierfür sind weiter oben bereits geschildert. Eine weitere Maßnahme zur Erhöhung der mechanischen Stabilität des Komplexes aus Fakir-Elektrode und kontaktierte Zelle ist die Einbettung dieses Komplexes (des „Hybnd- Sensorkopfes ) in eine vernetzte Hydrogelmatrix (die z.B. aus einer mit Ba2+-Ionen vernetzten Algmatmatrize besteht). Diese Immobilisierung des Komplexes gewährleistet gleichzeitig eine Langzeit-Vitalitat des Komplexes und erleichtert auch die (Kryokonservierung der Hybrid-Sensorkopfe .
Anwendungsgebiete des Hybridsensorkopfes
Die hier vorgestellte Erfindung konnte bestehende elektrophysio- logische Technologien komplementär erganzen. Sie soll in verschiedenen Variationen zur Anwendung kommen. Hintergrund hierfür liegt darin, dass zum Beispiel der Transmembran-Widerstand (ein wichtiger elektrischen Parameter des Zelle) von den Ionenkanalen in der Membran eines Systems abhangt, deren elektrische Leitfähigkeit spezifisch über ein breites Spektrum von Analyten (Ligan- den, Inhibitoren etc.) beeinflusst wird/werden kann.
Deshalb kann die Fakir-Technologie in Screemngtools (z.B. High- Throughput-Drug-Target-Verfahren) eingesetzt werden. Dazu werden so genannte Targets (z.B. Membranproteine wie Ionenkanale, siehe oben) in die Membran des Sensorkopfes eingebaut (durch z.B. hete- rologe Uberexpression von Proteinen oder Dotierung mit rekonstituierten Proteinen) . Derartige, aus Fakirelektroden und kontak- tierten Zellen entstandene Hybrid-Sensorkopfe erlauben das Screenen eines breiten Spektrums von Wirkstoffen in analytischen Laboratorien ( „High-throughput-Screenmg" , „Lab on the Chip") sowie unter in-situ-Bedingungen (als „Lab in the Probe" im huma- nen/tierischen und pflanzlichen System). Zusatzlich zu nativen Zellen sollen tierische und pflanzliche Sensorzellen verwendet werden, die über spezifische heterologe Uberexpression von Trans- portern oder Zeil-Zeil- bzw. Zell-Membranfusion maßgeschneidert hergestellt werden können. Spezifisch auslegbare Sensorkopfe können als Disposables zur universellen elektronischen Peripherie vorgehalten werden. Die Sensoreinheiten können sowohl einzeln als auch m Form von Mikromodulen, vergleichbar mit Mikrotiterplat- ten, hergestellt werden. Letztere Konfiguration garantiert durch die Möglichkeit redundanter Messungen mit vergleichbaren Sensor- kopfen unter identischen Messbedingungen eine sehr hohe Zuverlässigkeit der Analytik. Darüber hinaus können bei Verwendung unterschiedlicher maßgeschneiderter Sensorkopfe auf demselben Modul auch komplexe Nachweise multipler Komponenten in kleinen Probenvolumina, z.B. zum Zweck von Drugscreemngs , mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden.
Für m-situ-Anwendungen muss der Sensorkopf in eine Sonde lnteg- πert werden - lab-m-the-probe - die den direkten, mimmalmva- siven Zugang zu flussigkeitsgefullten Kompartimenten pflanzlicher oder tierischer/menschlicher Systeme ermöglicht. Für die Ablei- tung der Signale und für die Versorgung der Zellen mit geeigneten Medien soll die neue Sensorkopf-Technologie mit einem miniaturisierten Schlauch/Drucksensor/KatheterSystem verbunden werden. Für die schnelle und routinemäßige Vermessung von Wirkstoffkonzentra- tionen in intakten Pflanzen ist außerdem die Integration der Sensorkopf-/Katheteranordnung in einen Messautomaten nach dem Prinzip einer Gurtellochzange geplant.
Aspekte des Kontaktierens
Ein wichtige Voraussetzung, Zellen erfolgreich kontaktieren zu können, sind die Form der Spitze der Elektrodenspitze 40s und insbesondere deren Radius oder Krümmungsradius Ks am distalen
Ende 40d der Elektrodenspitze 40s, dieser sollte nicht über 1/10 des Durchmessers Dz der zu penetrierenden Zelle Z liegen.
Weiterhin ist es von Vorteil, wenn die Zellmembran M gespannt ist, sprich die Zelle Z gefüllt ist. Dies kann durch Verwendung nicht isoosmolare Losungen erreicht werden, in denen die Zellen Z mkubiert werden oder die als Messmedien 30 verwendet werden.
Für ein erfolgreiches Kontaktieren ist weiterhin hilfreich, dass - passend zum Durchmesser Dz der Zelle Z und zum Abstand der Zelle Z von der Fakirelektrode 40s die richtige dielektrophoreti- sehe Kraft erzeugt wird. Die Parameter für diesen Prozess werden für jeden Zelltyp abhangig von oben genannten Bedingungen gewählt. Sie liegen in den angegebenen Bereichen. Nicht notwendig, aber gunstig ist die Applikation eines modulierten Wechselfeldes, d.h. eines elektrischen Feldes, welches sich in vorprogrammierter Weise wahrend des Anziehexperiments verändert. Der Zeitbereich zur Erzeugung der anziehenden Kraft liegt bei etwa 10 μs bis etwa 30 s.
Die Modulation des Wechselfeldes kann über die Amplitude - Er- niedrigung der Amplitude, z.B. als Rampenprotokoll, insbesondere linear oder exponentiell - oder über die Frequenz erfolgen. Theoretischer Hintergrund
Die dielektrophoretische Kraft umgekehrt proportional zur fünften Potenz des Abstandes zwischen der Zelle Z und der Fakirelekt- rode 40s. Der Anziehungsprozess ist so beschaffen, dass zunächst durch Wahl geeigneter Frequenzen und hoher Amplituden eine relativ geringe Kraft auf die Zelle Z erzeugt wird. Nähert sich die Zelle Z der Elektrode 40s, so wird die Kraft schnell großer und die Zelle Z kann - wenn die ursprünglichen Feldparameter beibe- halten werden - drastisch beschleunigt werden. Dies kann zu einer zu schnellen Bewegung der Zelle und zur Zerstörung der Zelle Z, z.B. durch Platzen, bei der Kontakt ierung fuhren. Hingegen fuhren zu niedrige Anziehkrafte dazu, dass die Zelle Z nicht durch die Fakirelektrode 40s penetπert wird, weil der mechanische Widerstand der Membran M der Zelle dann nicht überwunden werden kann .
Herstellung von Fakirelektroden
Eine weitere Möglichkeit eine Art von Fakirelektroden kostengünstig im industriellen Maßstab herzustellen ist unter Verwendung von automatisierten Bondmg-Maschinen gegeben. Diese werden heutzutage vor allem bei der Kontaktierung von Computerplatmen/Chips eingesetzt. Ausgehend von einer aus Isolator-Material bestehendem Wafer (Kunststoff, Glas, etc.), der mit elektrisch ableitbaren Flachen versehen ist, können diese individuell mit einem Bonddraht versehen werden. Dieser Bonddraht, einseitig mit den elektrisch leitenden Stellen des „Chips" kontaktiert, kann in einem Folgeschritt automatisiert an seinem zweiten Ende durch eine entsprechend automatisierte Applikation elektrischer Felder e- lektrochemisch geatzt werden. Alternativ kann eine entsprechende Bondmg-Prozedur gewählt werden, die den Bonddraht mit geeigneten geometrischen Proportionen (Lange, Dicke, Spitze) an den Chip anbringt. Die elektrisch leitenden Stellen, die einzeln abgreif- bar sein sollen, des Chips sollen einen Durchmesser haben, der geringer als der der eingesetzten Zelle (oder Fusionszeile) ist. D.h. er sollte im Normalfall im Bereich von etwa 5 μm bis etwa 100 μm liegen. Wird als Tragermaterial Glas, z.B. Borosilicat, gewählt, so ist zu erwarten, dass die Zellen sehr gut kontaktie- ren (vergleiche Patch-Clamp-Technik) . Dies ist auch zu erwarten bei der Verwendung von geeigneten Kunststoffen. Techniken zum nachträglichen Abisolieren - wie sie bereits beschrieben wurden - können bei Bedarf ebenfalls zum Einsatz kommen.
Automatisierter Einsatz der Fakirelektrode in Kombination mit Zellkafigen
Der automatisierte Einsatz der Fakirelektrode in maschinellen Systemen (Sensorsysteme, High-Throughput-Systeme, etc.) soll dadurch erreicht werden, dass der Chip, der die Fakir-Elektroden tragt, in eine Mikrofluidikkammer eingesetzt werden kann. Diese Kammer soll durch geeignete Systeme, basierend auf dem Prinzip der elektrischen Zellkafige, gewährleisten, dass Zellen automatisch und in Hinblick auf die einzelnen Fakir-Spit zen exakt gegenüber den Fakirelektroden positioniert werden können. Dies soll gewährleisten, dass das System mit automatisch applizierten Die- lektrophoresprotokollen Zellen - wie bereits beschrieben - kon- taktiert werden können. Das Mikrofluidiksystem soll auch die Möglichkeit des Losungswechsels zulassen.
Weitere Aspekte des elektrochemischen Herstellens
Im Folgenden sind mögliche Bedingungen für das elektrochemische Atzen im Rahmen einer vorteilhaften Ausfuhrungsform des erfin- dungsgemaßen Herstellungsverfahrens angegeben.
Vorbereiten der Chips
• Glaskapillare auf ca. 3 mm Lange brechen, und zwar mit möglichst glatter Bruchkante.
• Kapillare in Chiphalterung einsetzen. • Kapillarende mit feinem Sandpapier, z.B. (Körnung 1200, abschleifen bis Bruchkante glatt und scharf ist.
• Kapillare entnehmen und gewendet einsetzen. • Kapillarende mit feinem Sandpapier, z.B. (Körnung 1200, abschleifen bis Bruchkante glatt und scharf ist.
• Kapillare in gewünschte Position bringen.
• Kapillare mit UV-Kleber befestigen. » In Trockenschrank bei 1050C oder unter UV-Lampe harten.
Herstellung des Elektrodenrohlings (z.B. unter einem Binokular)
• Drahtstuck, z.B. aus Ag, von 25 μm Durchmesser z.B. auf ca. 1,5 cm ablangen.
• Auf einer sauberen Flache glatten, z.B. mit Fingerspitze.
• Chip-Rohling in den Chiphalter einspannen.
• Drahtstuck durch die Glaskapillare fädeln, z.B. mit Pinzette und/oder auf maximal 4 mm herausragend. • Hinteres Ende des Drahtes am Metall des Chiphalters verankern, z.B. mit Leitsilber.
• Zwei Minuten trocknen lassen.
• Dann Chiphalter z.B. am Mikromanipulator anbringen.
• Stromklemme an Chiphalter anbringen.
Dann folgt die eigentliche
Elektrochemische Behandlung des Elektrodenrohlings (z.B. unter einem Binokular)
• Drahtende in der Mitte des Blickfeldes fixieren.
• Einen Tropfen Atz-Losung (z.B. Perchlorsaure : Methanol = 1:4) in Atzose einhangen.
• Spannung anlegen (z.B. 2 V Gleichspannung, Ose negativ, Draht positiv) .
• Die Losung mit Hilfe der Schubschrauben kurz über das Drahtende schieben und direkt wieder zurückziehen.
• Vorgang solange wiederholen bis die gewünschte Spitzenform erreicht ist. So lassen sich unter Beobachtung die Spitzen qua- si feilen.
• Eventuell Draht mit Schrauben des Chiphalters nachschieben Manufakturstation - Variante-1-Chips
• Chiphalter am rechten Manipulator anbringen.
• Ende der Kapillare im Blickfeld zentrieren. • Drahtspitze 1-2 mm herausschauen lassen und in der Kapillare zentrieren .
• Abzugshaube nahern.
• Spritze mit UV-Kleber in Position bringen.
• Kleber durch Kapillarkrafte in die Kapillare ziehen lassen, überlaufen vermeiden.
• Draht vorsichtig zurückziehen und dabei eventuell Position korrigieren, bis die Drahtspitze nur noch wenige μm übersteht ( 40er-Objektiv) .
• UV-Licht zum Ausharten einschalten und die ersten 2 Minuten beobachten. Eventuell korrigieren.
• Objektiv wechseln, damit Chip vollständig von UV-Licht bestrahlt wird und eine halbe Stunde ausharten lassen.
Fertigstellung - Variante-1-Chips
• Mikroskopische Aufnahmen der Spitze machen.
• Draht aus dem Chiphalter losen und Drahtende durch Leitsilber mit Metall des Chips verbinden .
• 5 Minuten warten. • Mit UV-Kleber Kontaktstelle versiegeln 1 h bei 1050C im Trockenofen harten.
• Fertigen Chip m die Kammer einsetzen oder bis zur Verwendung aufbewahren .
Manufakturstation - Variante-2-Chips
• Chiphalter am rechten Manipulator anbringen.
• Chip an der Halterung des linken Mikromampulators anbringen.
• Bohrloch ms Blickfeld bringen und linke Seite des Chips im Blickfeld zentrieren. • Mit Hilfe des rechten Manipulators und dem Chiphalters Drahtspitze durch das Bohrloch des Chips manövrieren und 1 - 2 mm herausschauen lassen.
• Im Bohrloch zentrieren.
• Abzugshaube nahern.
• Spritze mit UV-Kleber in Position bringen.
• Kleber durch Kapillarkrafte in das Bohrloch ziehen lassen, überlaufen vermeiden.
• Draht vorsichtig zurückziehen, bis die Drahtspitze nur noch wenige μm übersteht ( 40er-Obj ektiv) .
• UV-Licht zum Ausharten einschalten und die ersten 2 Minuten beobachten .
• Eventuell korrigieren.
• Objektiv wechseln, damit Chip vollständig von UV-Licht bestrahlt wird und eine halbe Stunde ausharten lassen.
• Mikroskopische Aufnahmen der Spitze herstellen.
Fertigstellung Variante 2-Chips
• Draht aus dem Chiphalter losen und Drahtende am Chip mit
Leitsilber betraufein
• Fertigen Chip in die Kammer einsetzen oder bis zur Verwendung aufbewahren .
Im Folgenden sind noch einige Bedingungen m einer Tabelle angegeben, die bei der Spitzenherstellung berücksichtigt werden können. Die Publikationen sind im Abschnitt zitierte Literatur im Detail angegeben.
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend anhand der beigefugten Figuren erläutert, welche exemplarisch Ausfuhrungsformen der Erfindung zeigen:
Fig. 1 ist eine schematische und geschnittene Seitenansicht einer ersten Ausfuhrungsform der erfm- dungsgemaßen Elektrodenanordnung mit einer E- lektrodenspitze.
Fxg. 2 ist eine schematische und geschnittene Seitenansicht einer anderen Ausfuhrungsform der er- fmdungsgemaßen Elektrodenanordnung mit einer Mehrzahl Elektrodenspitzen.
Fig. 3A, 3B sind schematische und geschnittene Seitenansicht einer weiteren Ausfuhrungs form der erfm- dungsgemaßen Elektrodenanordnung, einmal mit und einmal ohne kontaktierte biologische Zelle.
Fig. 4A - 4D sind schematische und geschnittene Seitenansichten verschiedener weiterer Ausfuhrungsformen der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung.
Fig. 5A, 5B demonstrieren in Form einer schematischen und geschnittenen Seitenansicht bzw. einer schematischen Draufsicht auf eine Ausfuhrungsform der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung bestimmte Details der Erfindung. Fig. 6 ist eine schematische Draufsicht auf eine weitere Ausfuhrungs form der erfmdungsgemaßen E- lektrodenanordnung .
Fig. 7 ist eine schematische und geschnittene Seitenansicht einer weiteren Ausfuhrungsform der er- fmdungsgemaßen Elektrodenanordnung .
Fig. 8 - 10 zeigen in Form mikroskopischer Aufnahmen be- stimmte Anwendungsfalle, wie sie für die erfin- dungsgemaße Elektrodenanordnung in Frage kommen .
Fig. IIA - 12B zeigen weitere Verwendungen der vorliegenden Erfindung.
Nachfolgend werden strukturell und/oder funktionell ähnliche oder äquivalente Strukturen oder Verfahrensschritte mit denselben Bezugs zeichen bezeichnet. Nicht in jedem Fall ihres Auftretens wird eine Detailbeschreibung der strukturellen Elemente oder Verfahrensschritte wiederholt.
Fig. 1 ist eine schematische und geschnittene Seitenansicht, welche eine erste Ausfuhrungsform der erfmdungsgemaßen Elektro- denanordnung 10 und deren Anwendung bei der Untersuchung einer Zelle Z beschreibt.
Die Ausfuhrungsform der hier gezeigten erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung 10 basiert auf einem Trager 20 oder Tragersubstrat 20 mit einer Oberflache 20a und einer Unterseite 20b. In den Trager 20 sind ein Kontaktbereich 40K zum Teil und der Anschlussbereich 40A vollständig integriert ausgebildet, und zwar derart, dass die den Kontaktbereich 4OK der Elektrodenanordnung 10 bildende Elektrodenspitze 40s mit ihrem dem Anschlussbereich 4OA zugewandten oder proximalen Ende 40p vollständig unterhalb der Oberflache 20a des Tragers 20 und mit ihrem distalen Ende 40d, welches vom Anschlussbereich 4 OA abgewandt ist, strikt oberhalb der Oberflache 40a des Tragers 40 ausgebildet ist. Der Anschlussbereich 4 OA wird von einer Basis 40b gebildet, die einen einstu- ckigen Materialbereich - hier in Form einer planaren Platte - realisiert, dessen Oberseite 40ba mit dem proximalen Ende 40p der Elektrodenspitze 40s kontaktiert ist und deren Unterseite 40bb bündig mit der Unterseite 20b des Tragers 20 abschließt und somit eine externe Kontaktierung erlaubt.
Über den Kontaktbereich 4OK mit der Elektrodenspitze 40s und deren distalem Ende 4Od erfolgt ein elektrischer Abgriff in das Innere I einer kontaktierten Zelle Z, indem das distale Ende 4Od der Elektrodenspitze 40s durch die Zellmembran M hindurch in das Innere I der Zelle Z eindringt und so über die Leitfähigkeit der Elektrodenspitze 40s einen entsprechenden elektrischen Abgriff realisiert. Somit kann über den äußeren Messkreis 60 und die Anschlussleitungen 61 und 62 eine Strommessung oder Spannungsmessung erfolgen, so dass durch das transmembrane Protein P verschobene Ladungsträger als entsprechende Verschiebungsströme I(t) als Funktion der Zeit gemessen werden können, wobei die Elektroden- spitze 40s als erste Elektrode der Elektrodenanordnung 10 und eine in der Oberflache 20a vorgesehene Referenzelektrode R als entsprechende zweite Messelektrode ausgebildet sind, wobei der Stromkreis durch das entsprechend vorzusehende wassrige Messmedium 30 geschlossen wird.
Dabei ist wichtig, dass über den elektrisch isolierenden Trager 20 and den mechanischen Kontaktstellen X zwischen Zelle Z und Trager 20 ein hoher elektrischer Abdichtwiderstand realisiert ist, um die Elektrodenanordnung 10 nicht kurz zu schließen.
Die Referenzelektrode R kann, wie eben gezeigt wurde, als Messelektrode dienen. Denkbar ist aber auch, dass diese Referenzelektrode R zur dielektorphoretischen Annäherung und Kontaktierung der Zelle Z mit dem Kontaktbereich 4OK genutzt wird, indem diese eine Gegenelektrode 51 einer Gegenelektrodenanordnung 50 bildet. Alternativ oder zusatzlich kann die Gegenelektrodenanordnung 50 auch eine Gegenelektrode 51 aufweisen, welche der Elektrodenspitze 40s des Kontaktbereichs gegenübersteht, wie dies durch eine gestrichelte Darstellung angedeutet ist.
Die Ausfuhrungsform der Fig. 1 wird mit nur einer einzigen Elektrodenspitze 40s im Kontaktbereich 40K definiert.
Es sind jedoch auch Ausfuhrungsformen denkbar, bei welchen der Kontaktbereich 4OK der Elektrodenanordnung 10 über eine Mehrzahl, insbesondere gleichartiger oder gleich wirkender, Elektrodenspitzen 40s definiert wird.
Die Anordnung der Fig. 2 zeigt eine solche Ausfuhrungsform mit mehreren gleichartigen Elektrodenspitzen 40s im Kontaktbereich 4OK.
Die Ausfuhrungsform der hier gezeigten erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung 10 basiert auf einem Trager 20 oder Tragersubstrat 20 mit einer Oberflache 20a und einer Unterseite 20b. In den Trager 20 sind wieder ein Kontaktbereich 4OK zum Teil und ein Anschlussbereich 4OA vollständig integriert ausgebildet, und zwar derart, dass die den Kontaktbereich 4OK der Elektrodenanordnung 10 bildende Elektrodenspitze 40s mit ihrem dem Anschlussbereich 4OA zugewandten oder proximalen Ende 40p vollständig unterhalb der Oberflache 20a des Tragers 20 und mit ihrem distalen Ende 4Od, welches vom Anschlussbereich 4OA abgewandt orientiert ist, strikt oberhalb der Oberflache 40a des Tragers 40 liegt. Der Anschlussbereich 4OA wird ebenfalls von einer so genannten Basis 40b gebildet, die einen emstuckigen Materialbereich realisiert, dessen Oberseite 40ba mit dem proximalen Ende 40p der Elektrodenspitze 40s kontaktiert ist und deren Unterseite 40bb bundig mit der Unterseite 20b des Tragers 20 abschließt und somit wieder eine externe Kontaktierung erlaubt.
Über den Kontaktbereich 4OK, hier mit einer Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s, und den distalen Enden 4Od der Mehrzahl Elektroden- spitzen 40s erfolgt ein elektrischer Abgriff in das Innere I einer kontaktierten Zelle Z, indem die distalen Enden 4Od der Elektrodenspitzen 40s durch die Zellmembran M hindurch in das Innere I der Zelle Z eindringen und so über die Leitfähigkeit der Elektrodenspitzen 40s als Elektrode einen entsprechenden elektrischen Abgriff realisieren. Somit kann über den äußeren Messkreis 60 und die Anschlussleitungen 61 und 62 eine Strommessung oder Spannungsmessung erfolgen, so dass durch das transmembrane Protein P verschobene Ladungsträger als entsprechende Verschiebungs- ströme I(t) als Funktion der Zeit gemessen werden können, wobei die Elektrodenspitze 40s als erste Elektrode der Elektrodenanordnung 10 und eine in der Oberflache 20a vorgesehene Referenzelektrode R als entsprechende zweite Messelektrode ausgebildet ist, wobei der Stromkreis durch das entsprechend vorzusehende wassrige Messmedium 30 geschlossen wird.
Die Referenzelektrode R kann wieder als Messelektrode dienen. Denkbar ist aber auch wieder, dass diese Referenzelektrode R zur dielektorphoretischen Annäherung und Kontaktierung der Zelle Z mit dem Kontaktbereich 4OK genutzt wird, indem diese eine Gegenelektrode 51 einer Gegenelektrodenanordnung 50 bildet. Alternativ oder zusätzlich kann die Gegenelektrodenanordnung 50 auch eine Gegenelektrode 51 aufweisen, welche den Elektrodenspitzen 40s des Kontaktbereichs gegenübersteht, wie dies durch eine gestrichelte Darstellung angedeutet ist.
Die in den Fig. 3A und 3B dargestellte Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 unterscheidet sich nur dadurch von der Ausführungsform, welche in Fig. 2 dargestellt ist, dass die Oberflache 20a des Trägers 20 nicht strikt planar verlauft, sondern im Bereich der Elektrodenspitzen 40s eine konkave Vertiefung 22 bilden, insbesondere in Form einer Mulde, so dass, wie das im Übergang vom Zustand der Fig. 3A zum Zustand der Fig. 3B deutlich wird, eine sich annähernde Zelle Z besser an die Oberflache 20a im Bereich der Ausnehmung 22 an die Oberflache anschmiegen kann, so dass bessere Abdichtwiderstande an den Stel- len X gegenüber dem vorgesehenen Messmedium 30 zur Vermeidung von Kurzschlüssen möglich sind.
Die Fig. 4A bis 4D zeigen in schematischer und geschnittener Seitenansicht verschiedene Ausfuhrungsformen der erfmdungsgema- ßen Elektrodenanordnung 10.
Diese Ausfuhrungsformen sind jeweils ohne einen Trager 20 oder Tragersubstrat 20 dargestellt und zeigen ausschließlich den Kon- taktbereich 40K in Form einer oder mehrerer Elektrodenspitzen 40s und den Anschlussbereich 4OA jeweils in Form einer emstuckig ausgebildeten Basis 40b nach Art einer planaren Platte mit einer Oberseite 40ba und einer Unterseite 40bb.
Bei der Ausfuhrungsform der Fig. 4A ist eine einzelne Elektrodenspitze 40s vorgesehen, die den Kontaktbereich 40K der Elektrodenanordnung 10 definiert und die mit ihrem proximalen Ende 40p an der Oberseite 40ba angebracht und kontaktiert ist. Die Elektrodenspitze 40s und die Basis 40b als Anschlussbereich 4OA sind emstuckig ausgebildet.
Im Gegensatz dazu ist in der Fig. 4B dargestellt, dass eine einzelne und separate Elektrodenspitze 40s, die den Kontaktbereich 4OK der Elektrodenanordnung 10 bilden soll, auch in einem nachge- schalteten Vorgang an der Oberseite 40ba der Basis 40b angebracht werden kann, so dass sich eine einteilige Struktur ergibt, wie dies in Fig. 4B dargestellt ist.
Die Fig. 4C zeigt ebenfalls eine emstuckige Ausgestaltungsform der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung 10, diesmal aber mit einer Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s, die jeweils mit ihren proximalen Enden auf der Oberseite 40ba des Tragers 40b ausgebildet sind .
Im Gegensatz dazu ist m der Fig. 4D wieder eine Aus fuhrungs form der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung 10 gezeigt, bei welcher keine Emstuckigkeit vorliegt zwischen den Elektrodenspitzen 40s und der Basis 40b. Vielmehr sind die Elektrodenspitzen 40s, welche den Kontaktbereich 4OK der Elektrodenanordnung 10 der Fig. 4D bilden sollen, auf der Oberseite 40ba in einem nachgeschalteten Prozess aufgebracht, elektrisch und mechanisch kontaktiert.
Die Ausfuhrungs form der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung 10, die in den Fig. 5A und 5B in Form einer schematischen und geschnittenen Seitenansicht bzw. in Form einer schematischen Draufsicht dargestellt ist, zeigt eine Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s, die in einer Reihe auf der Basis 40b in Form einer planaren Platte angeordnet sind, und zwar in nicht emstuckiger Art und Weise. Es sind auch hier noch einmal die distalen Enden 4Od und die proximalen Enden 40p der Elektrodenspitzen 40s dargestellt, die von der Oberseite 40ba der Basis 40b abgewandt bzw. zugewandt und mit dieser in Kontakt stehend ausgebildet sind. Die in den Fig. 5A und 5B gezeigten Elektrodenspitzen 40s weisen eine Lange Ls auf und sind paarweise zueinander aquidistant beabstandet mit gleichen Abstanden dd, ds . Auch ist ihre geometrische Ausgestaltung gleich. Das bedeutet, dass sie den gleichen quadratischen Querschnitt mit einer Kantenlange Dp und einem entsprechenden Durchmesser Dp im Bereich des distalen Endes 40p besitzen. Die Elektrodenspitzen 40s sind gleich lang und erstrecken sich streng monoton verjungend bis zu ihrer Spitze hm.
Fig. 6 zeigt eine Ausfuhrungsform der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung, bei welcher eine Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s, welche den Kontaktbereich 4OK der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung 10 bilden, in Form einer quadratischen Matrix angeordnet sind mit einem gleichen Abstand dd, ds voneinander sowie mit einem identischen Durchmesser Dp, welcher hier den Durchmesser des mit kreisförmigem Querschnitt versehenen proximalen Endes 40p der jeweiligen Elektrodenspitzen 40s beschreibt.
Die Fig. 7 zeigte eine Ausfuhrungsform der erfmdungsgemaßen Elektrodenanordnung, bei welcher eine Art Rasen einer Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s auf der Basis 40b der Elektrodenanordnung 10 vorgesehen ist. Die Fig. 8 bis 10 zeigen mikroskopische Aufnahmen entsprechender Anwendungen einer erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 mit einer einzelnen Elektrodenspitze 40s, die mit einer Testzelle Z in Kontakt steht.
Zitierte Literatur
[1] Iwami et al., "Preparation of silver tips for scanning tunneling microscopy imaging", Rev . Sei. Instr. Vol. 69, Nr. 11, S. 4010-4011, 1998.
[2] Libioulle et al., "Very Sharp platinum tips for scanning tunneling microscopy", Rev. Sei. Instr. Vol. 66, Nr. 1, S.
97-100, 1995.
[3] Melmed, Alan J., "The art and science and other aspects of making sharp tips", J. Vac. Sei. Technol . B Vol. 9, Nr. 2,
S. 601-608, 1991.
[4] Oliva et al . , "Electrochemical preparation of tungsten tips for a scanning tunneling microscope" , Rev. Sei. Instr. Vol. 67, Nr. 5, S. 1917-1920, 1996.
Bezugszeichenliste
10 erfmdungsgemaße Elektrodenanordnung
20 Trager, Tragersubstrat 20a Oberflache, Ober flachenbereich , Oberseite
20b Unterseite
30 Messmedium
40A Anschlussbereich
40b Basis, Basisbereich 40ba Oberflache, Oberflachenbereich, Oberseite
40bb Unterseite
4Od distales Ende
4OK Kontaktbereich
40p proximales Ende 40s Elektrodenspitze
50 Gegenelektrodenanordnung
51 Gegenelektrode
60 Messkreis
61 Messleitung 62 Messleitung
Dd Durchmesser der Elektrodenspitze am distalen
Ende 4Od dd Abstand der Spitzen oder distalen Enden 4Od der Elektrodenspitzen
Dp Durchmesser der Elektrodenspitze am proximalen
Ende 40p dp Abstand der proximalen Enden 4Od der Elektrodenspitzen ds Abstand der Spitzen der Elektrodenspitzen
Dz Durchmesser der Zelle oder Spezies
I Innenraum der Zelle oder Spezies
Ks Krümmungsradius der Spitzen der Elektrodenspitzen Ls Lange der Elektrodenspitze
M Zellmembran
P Transmembranprotein Z biologische Zelle, Spezies αs Öffnungswinkel der Spitzen der Elektrodenspitzen

Claims

Patentanspruche
1. Elektrodenanordnung (10) für elektrophysiologische Untersuchungen biologischer Zellen und dergleichen - welche mit einem Kontaktbereich (40K) ausgebildet ist zum elektrischen Kontaktieren der Elektrodenanordnung (10) mit mindestens einer biologischen Spezies (Z) oder Zelle (Z) oder dergleichen und welche mit einem Anschlussbereich (40A) ausgebildet ist zum externen elektrischen Anschließen der Elektrodenanordnung (10) , wobei der Kontaktbereich (40K) mit einer Elektrodenspitze (40s) oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) als E- lektroden ausgebildet ist, die sich vom Anschlussbereich (40A) der Elektrodenanordnung (10) her erstrecken, und wobei die Elektrodenspitzen (40s) jeweils mit einer geometrischen Gestalt ausgebildet sind, die im Betrieb ein ansonsten zerstörungsfreies Eindringen in eine biologische Spezies (Z) oder Zelle (Z) oder dergleichen über deren Membran (M) in deren Inneres (I) erlaubt.
2. Elektrodenanordnung nach Anspruch 1, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) sich jeweils vom Anschlussbereich (40A) her monoton oder streng monoton verjungend erstreckend ausgebildet sind oder bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) sich jeweils vom Anschlussbereich (40a) her zylindrisch oder quaderförmig verlaufend und am vom An- Schlussbereich (40a) abgelegenen und distalen Ende (40d) der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) mit einer sich monoton oder streng monoton verjungenden Spitze ausgebildet sind.
3. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) mit einem Querschnitt ausgebildet sind, der rund, kreisförmig, elliptisch, rechteckig oder quadratisch ist.
4. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) mit einem dem Anschlussbereich (40A) zugewandten oder den Anschlussbereich (40A) bildenden ersten und proximalen Ende (40p) ausgebildet sind.
5. Elektrodenanordnung nach Anspruch 4, bei welcher der Durchmesser (Dp) der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) am proximalen Ende (40p) im Bereich von etwa 50 nm bis etwa 5000 nm ausgebildet ist.
6. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 4 oder 5, bei welcher der Durchmesser (Dp) der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) am proximalen Ende (40p) unter- halb von etwa 1/10 des Durchmessers (Dz) einer zu kontaktierenden Spezies (Z) liegt.
7. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektroden- spitzen (40s) mit einem vom Anschlussbereich (40A) abgewandten zweiten und distalen Ende (4Od) ausgebildet sind.
8. Elektrodenanordnung nach Anspruch 7, bei welcher der Durchmesser (Dd) der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) am distalen Ende (4Od) im Bereich von 1/10 des Durchmessers (Dz) einer zu kontaktierenden Spezies (Z) ausgebildet sind.
9. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 7 oder 8, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) am distalen Ende (4Od) mit einem Krümmungsradius (Ks) im Bereich von etwa 5 nm bis etwa 50 nm ausgebildet sind.
10. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 7 bis 9, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) im Bereich der distalen Enden (4Od) mit einem spitzen Winkel (αs) im Bereich von etwa 10° bis etwa 50° als Öff- nungswinkel der jeweiligen Spitze ausgebildet sind.
11. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) vom Anschlussbereich (40a) her eine Länge (Ls) im Bereich von etwa 4/5 dem Durchmesser (Dz) einer zu kontaktierenden Spezies (Z) aufweisen.
12. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher der Kontaktbereich (40K) mit einer Mehrzahl Elektro- denspitzen (40s) ausgebildet ist.
13. Elektrodenanordnung nach Anspruch 12, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) geometrisch gleich und/oder gleich wirkend ausgebildet sind.
14. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher der Anschlussbereich (40A) als materiell zusammenhängende Basis (40b) mit einer Oberfläche (40ba) und einer Unterseite (40bb) ausgebildet ist.
15. Elektrodenanordnung nach Anspruch 14, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) sich von der Oberflache (40ba) der Basis (40b) aus erstreckend ausgebildet sind.
16. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 14 oder 15, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) sich von der Oberflache (40ba) der Basis (40b) aus senkrecht oder im Wesentlichen senkrecht erstreckend ausgebildet sind, zumindest lokal.
17. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 12 bis 16, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) zueinander gleich orientiert und parallel oder im Wesentlichen parallel ausgerichtet ausgebildet sind, zumindest lokal.
18. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 12 bis 17, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) in Form einer Reihe Mat- rix oder senkrechten Matrix auf der Oberseite (40ba) der Basis (40b) angeordnet ausgebildet sind.
19. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 12 bis 17, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) mit gleichen paarweisen Abständen (dd, dp) direkt benachbarter Elektrodenspitzen (40s) in den Hauptachsenrichtungen ihrer Anordnung angeordnet ausgebildet sind .
20. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 19, bei welcher die Oberflache (40ba) der Basis (40b) planar ausgebildet ist, zumindest lokal.
21. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche
14 bis 20, bei welcher die Basis (40b) und die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) miteinander einstuckig als integraler materieller Bereich ausgebildet sind.
22. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche
14 bis 20, bei welcher die Basis (40b) und die Elektrodenspitzen (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen einteilig miteinander verbunden ausgebildet sind.
23. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 22, bei welcher die Basis (40b) und die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) aus demselben, insbesondere elektrisch leitfahigen Material ausgebildet sind.
24. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) als elektrochemisch geatzte Strukturen ausgebildet sind.
25. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher ein Trager (20) mit einer Oberflache (20a) und einer Unterseite (20b) aus einem elektrisch isolierenden Material ausgebildet ist .
26. Elektrodenanordnung nach Anspruch 25, bei welcher die proximalen Enden (40p) der Elektrodenspitzen (40s) und gegebenenfalls die Basis (40b) im Trager (20) eingebettet und echt unterhalb der Oberflache (20a) des Tragers (20) und die distalen Enden (4Od) der Elektrodenspitzen (40s) echt oberhalb der Oberflache (20a) des Tragers (20) ausgebildet sind.
27. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 25 oder 26, bei welcher die Oberflache (20a) des Tragers (20) vollständig oder lokal konform und insbesondere parallel zur Oberflache (40ba) der Basis (40b) verlaufend ausgebildet ist.
28. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 25 bis 27, bei welcher die Oberflache (20a) des Tragers (20) vollständig oder lokal planar, konvex und/oder konkav ausgebildet ist.
29. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 25 bis 28, bei welcher die Oberflache (20a) des Tragers (20) planar oder im Wesentlichen planar und mit konkaven Vertiefungen (22) im Bereich der proximalen Enden (40p) der Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet ist .
30. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 25 oder 29, bei welcher die Unterseite (40bb) der Basis (40b) an der Unterseite (20b) des Tragers (20) zumindest zum Teil vom Tragermateri- al unbedeckt ausgebildet ist, um einen externen elektrischen Abgriff zu ermöglichen.
31. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher elektrisch isoliert zum Kontaktbereich (40K) und zum Anschlussbereich (40A) eine Gegenelektrodenanordnung (50) und/oder eine Referenzelektrodenanordnung (R) ausgebildet sind.
32. Elektrodenanordnung nach Anspruch 31, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) mit einer oder einer Mehrzahl Gegenelektroden (51) ausgebildet ist.
33. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 oder 32, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) oder ein Teil (51) davon und/oder die Referenzelektrodenanordnung (R) auf der Oberflache (20a) des Tragers (20) ausgebildet sind.
34. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 33, bei welcher die räumliche Anordnung und/oder die Geometrie der Gegenelektrodenanordnung (50) zur Erzeugung eines gesteuert inhomogenen elektrischen und/oder elektromagnetischen Feldes ausge- bildet sind.
35. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 34, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) oder ein Teil (51) davon der Elektrodenspitze (40s) oder der Mehrzahl Elektroden- spitzen (40s) gegenüberliegend ausgebildet sind.
36. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 35, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) oder ein Teil (51) davon in einem Abstand im Bereich von etwa 50 μm bis etwa 500 μm von der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet sind.
37. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 36, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) oder ein Teil (51) davon nach einem der vorangehenden Ansprüche ausgebildet ist, um insbesondere eine dielektrische Kontaktierung biologischer Zellen m einer Art von Sandwichsystem zu ermöglichen, bei der die zu untersuchende biologische Zelle nach elektrischer Kontaktierung und Fusion eine Überbruckung zwischen den beiden Elektroden ermöglicht.
38. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 37, bei welcher eine Gegenelektrode (51) der Gegenelektrodenanordnung (50) mit einer flachenhaften Geometrie ausgebildet ist.
39. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 38, bei welcher eine Gegenelektrode (51) der Gegenelektrodenanordnung (50) eine Große und/oder eine Flache aufweist, die groß sind im Verhältnis zur Große/Flache der Elektrodenspitzen (40s), msbe- sondere in einem Verhältnis im Bereich von etwa 5:1 oder im Bereich von etwa 100:1 oder darüber, vorzugsweise im Bereich von etwa 10000:1.
40. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektroden durch eine chemische Reaktion derart modifiziert sind, dass eine elektrophysiologische Untersuchung von biologischen Zellen ermöglicht, erleichtert o- der sensitiver ist, wobei die chemische Reaktion insbesondere hauptsächlich eine elektrochemische Oxidation der vorgenannten Metalle mit einem Halogen ist, wobei die chemische Reaktion insbesondere zeitlich vor oder nach der Kontaktierung der biologischen Zelle erfolgt, wobei im letzteren Fall das Halogen aus dem Zytosol der Zelle gewonnen und/oder geliefert wird.
41. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) und/oder die Basis (40b) aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe gebildet sind, die besteht aus Silber, Gold, Platin, Wolfram, Legierungen, Legierungen dieser Metalle, Platm-Iridium- Legierungen und Gold-Iridium-Legierungen .
42. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher eine Mehrzahl Basen (40b) mit jeweils einer oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet ist.
43. Elektrodenanordnung nach Anspruch 42, bei welcher die Basen (40b) einzeln oder gruppenweise voneinander elektrisch isoliert und/oder räumlich getrennt ausgebildet sind.
44. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher als Trager (20) ein Materialbereich mit oder aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe ausgebildet ist, die besteht aus Glasern, glasahnlichen Materialien, organischen Polymeren und Fotolacken.
45. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenanordnung mit einer Druckmesssonde kombiniert ist, wobei es sich dabei insbesondere um eine externe, außen an einem Messobjekt, oder eine invasive, sich innerhalb eines Messobjektes befindliche Druckmesssonde handelt.
46. Verfahren zum Herstellen einer Elektrodenanordnung (10) nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 45, bei welchem die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) durch ein elektrochemisches Atzverfahren ausgebildet werden.
47. Verfahren nach Anspruch 46, bei welchem dem elektrochemischen Atzen ein einzelner oder eine Mehrzahl feiner Drahte zugrunde gelegt werden, insbesondere unter Verwendung einer Bondingmaschine .
48. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 46 oder 47, bei welchem dem elektrochemischen Atzverfahren feine Drahte mit einem Durchmesser im Bereich von etwa 5 μm bis etwa 50 μm zugrun- de gelegt werden.
49. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 46 bis 48, bei welchem dem elektrochemischen Atzverfahren feine Drahte aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe zugrunde gelegt werden, die besteht aus Silber, Gold, Platin, Wolfram, Legierungen, Legierungen dieser Metalle, Platin- Iridium-Legierungen und Gold-Iridium-Legierungen .
50. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 46 bis 49, bei welchem dem elektrochemischen Atzverfahren so genannte Bonddrahte oder Drahte zugrunde gelegt werden, die in ihren Eigenschaften Bonddrahten entsprechen.
51. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 46 bis 50, - bei welchem zunächst ein oder mehrere feine Drahte durch einen entsprechenden elektrochemischen Atzprozess behandelt werden und bei welchem dann die so behandelten Drahte in eine Haltevorrichtung eingebracht werden, insbesondere durch Haltern der als proximale Enden (40p) für die Elektrodenspitzen (40s) bestimmten Enden der Drahte in der Haltevorrichtung, - wobei dann der Draht oder die Mehrzahl Drahte in ein isolierendes Material für einen Trager (20) eingefasst wird bzw. werden.
52. Verfahren nach Anspruch 51, bei welchem als isolierendes Material für den Trager (20) ein viskoses Polymer oder ein Glas verwendet werden.
53. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 51 oder 52, bei welchem das Material für den Trager (20) und insbesondere das viskose Polymer durch Oberflachenspannung oder durch externe Felder beim Einfassen des Drahtes oder der Mehrzahl Drahte in der Haltevorrichtung gehaltert wird.
54. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 51 bis 53, bei welchem nach Einfassen des Drahtes oder der Drahte durch das isolierende Material für den Trager (20) in der Haltevorrichtung der Draht oder die Drahte gesteuert mikropositioniert werden, um dabei insbesondere die freiliegende Lange für die auszubildende Elektrodenspitze (40s) oder für die auszubildenden Elektrodenspitzen (40s) einzustellen.
55. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 51 bis 54, bei welchem - insbesondere nach dem Mikropositionieren - das isolierende Material für den Trager (20) und insbesondere das viskose Polymer ausgehartet wird, insbesondere durch Strahlung, UV-Licht, durch Temperaturerhöhung und/oder durch andere physikalische und/oder chemische Prozesse.
56. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 51 bis 54, bei welchem als isolierendes Material für den Trager (20) ein Glas vorgesehen wird und bei welchem, insbesondere nach der Mikropositxonierung, das Glas durch Erstarren durch Abkühlen ausgehartet wird.
57. Verwendung einer Elektrodenanordnung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 45 zur elektrophysiologischen Untersuchung und/oder Manipulation einer Spezies (Z) aus der Gruppe, die gebildet wird von biologischen Zellen, Liposomen, Vesikeln, micel- laren Strukturen, Bakterien, Viren, Fusionszellen, Organellen, genetischen, molekularbiologischen und/oder biochemischen Deriva- ten davon, Bestandteilen dieser Spezies (Z) und Verbanden dieser Spezies (Z).
58. Verwendung einer Elektrodenanordnung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 45 zur Mikroin] ekt ion einer Substanz in eine Spezies (Z) aus der Gruppe, die gebildet wird von biologischen Zellen, Liposomen, Vesikeln, micellaren Strukturen, Bakterien, Viren, Fusionszellen, Organellen, genetischen, molekularbiologischen und/oder biochemischen Derivaten davon, Bestandteilen dieser Spezies (Z) und Verbanden dieser Spezies (Z) .
59. Verwendung nach Anspruch 58, bei welcher vor der Mikroin] ektion die Spitze der Elektrodenspitze (40s) oder die Spitzen der Elektrodenspitzen (40s) mit der zu injizierenden Substanz beaufschlagt werden.
60. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 57 bis 59, bei welcher die Elektrodenanordnung (10) in einer Mikrostruktur eingebettet vorgesehen wird.
61. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 57 bis 60, bei welcher die Elektrodenanordnung (10) in einer Lap-on-the- Chip-Struktur vorgesehen wird.
62. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 57 bis 61, bei welcher die Elektrodenanordnung (10) in oder für einen Assay vorgesehen wird, insbesondere für High-Throughput-Anwendungen .
63. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 57 bis 62, bei welcher bei ruhender Elektrodenanordnung (10) die zu untersuchende und/oder zu behandelnde Spezies (Z) oder eine Mehrzahl davon auf die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) zu gefuhrt werden.
64. Verwendung nach Anspruch 63, bei welcher das Bewegen der zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies (Z) auf die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) zu durch Kraftausubung auf die entsprechende Spezies (Z) bewirkt wird.
65. Verwendung nach Anspruch 63, bei welcher die Kraftausubung bewirkt wird durch eine dielektrophoretische Kraft.
66. Verwendung nach Anspruch 65, bei welcher die dielektrophoretische Kraft erzeugt wird durch das Erzeugen eines - insbesondere hochfrequenten - inhomogenen elektrischen Wechselfeldes zwischen der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) und der vorgesehenen Gegenelektrodenanordnung (50) mit den Gegenelektroden (51) .
67. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 62 oder 63, bei welchem die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektroden- spitzen (40s) mit einer Wechselspannung im Bereich von etwa 10 mV bis , etwa 300 V und/oder im Frequenzbereich von etwa 100 Hz bzw. etwa 100 MHz, vorzugsweise von etwa 100 Hz bzw. etwa 60 MHz, weiter bevorzugt von etwa 100 Hz bzw. etwa 40 MHz beaufschlagt werden, um die dielektrophoretische Kraft zu erzeugen.
68. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 65 bis 67, bei welcher ein elektrischer Zellkafig zur Mikropositionierung der Spezies (Z) oder Zelle (Z) wahrend der dielektrophoretischen Annäherung verwendet wird.
69. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 57 bis 68, bei welcher zur Erleichterung der Zellkontaktierung die zu kon- taktierende Spezies (Z) oder Zelle (Z) durch isoosmolare Losungen prall aufgefüllt wird.
70. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 57 bis 69, bei welcher eine elektrische Isolation nicht mit Zellen kontak- tierter, freier Elektroden derart vorgenommen wird, dass eine Losung von Liposomen definierter Große, wobei der minimale Durch- messer 100 nm und der maximale Durchmesser 5 μm betragt, über die Elektrodenflache gespult und durch Anlegen eines Wechselstroms auf die besagten freien Elektrodenspitzen kontaktiert wird.
71. Verfahren zum elektrischen Kontaktieren einer zu untersuchen- den und/oder zu behandelnden Spezies (Z), insbesondere einer biologischen Zelle oder dergleichen, mit einer Elektrodenspitze (40s) einer Elektrodenanordnung (10), bei welchem eine Patchpipette oder Patchelektrode als E- lektrodenspitze (40s) verwendet wird oder die Elektrodenspitze (40s) aufweist und bei welchem die Elektrodenanordnung (10) derart gesteuert mit einem elektrischen Feld beaufschlagt wird, dass ein dielektrophoretische Kraft auf die zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies (Z) derart ausgeübt wird, - dass die zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies (Z) an die Elektrodenspitze (40s) angenähert und mit dieser kon- taktiert wird.
72. Verfahren nach Anspruch 71, bei welchem die Elektrodenspitze (40s) oder eine Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) mit einer Wechselspannung im Bereich von etwa 10 mV bis etwa 300 V und/oder im Frequenzbereich von etwa 100 Hz bzw. etwa 100 MHz, vorzugsweise von etwa 100 Hz bzw. etwa 60 MHz, weiter bevorzugt von etwa 100 Hz bzw. etwa 40 MHz beaufschlagt werden, um die dielektrophoretische Kraft zu erzeugen.
PCT/EP2006/006459 2005-07-01 2006-07-03 Elektrodenanordnung, deren verwendung sowie verfahren zu deren herstellung WO2007003398A2 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/922,971 US20100038247A1 (en) 2005-07-01 2006-07-03 Electrode Assembly, Use Thereof, and Method for the Production Thereof
EP06776116A EP1899724A2 (de) 2005-07-01 2006-07-03 Elektrodenanordnung, deren verwendung sowie verfahren zu deren herstellung

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102005030859A DE102005030859A1 (de) 2005-07-01 2005-07-01 Elektrodenanordnung, deren Verwendung sowie Verfahren zu deren Herstellung
DE102005030859.7 2005-07-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2007003398A2 true WO2007003398A2 (de) 2007-01-11
WO2007003398A3 WO2007003398A3 (de) 2007-03-15

Family

ID=37027789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2006/006459 WO2007003398A2 (de) 2005-07-01 2006-07-03 Elektrodenanordnung, deren verwendung sowie verfahren zu deren herstellung

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20100038247A1 (de)
EP (1) EP1899724A2 (de)
DE (1) DE102005030859A1 (de)
WO (1) WO2007003398A2 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007076458A1 (en) * 2005-12-21 2007-07-05 Primegen Biotech Llc Microinjector chip
WO2008076465A1 (en) * 2006-12-21 2008-06-26 Primegen Biotech, Llc Microinjector chip
DE102008009826A1 (de) 2008-02-19 2009-08-20 Max-Planck-Gesellschaft Vorrichtung zur Bestimmung eines elektrophysiologischen Parameters von biologischem Zellmaterial, Verfahren zur Herstellung einer Messelektrode für eine derartige Vorrichtung sowie Verfahren zur Vermessung einer Zelle mithilfe einer derartigen Vorrichtung

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100330612A1 (en) * 2008-02-21 2010-12-30 Inxell Bionics Aps Biochip for electrophysiological measurements
DE102008047399A1 (de) * 2008-09-16 2010-04-15 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Elektrodeneinrichtung, Generatoreinrichtung und Verfahren zur Stromerzeugung durch Membranpotential-Ableitung
US9304132B2 (en) 2009-04-16 2016-04-05 President And Fellows Of Harvard College Molecular delivery with nanowires
WO2012058308A2 (en) * 2010-10-26 2012-05-03 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Antibody based reagent that specifically recognizes toxic oligomeric form of beta-amyloid
US9586279B2 (en) 2013-09-17 2017-03-07 Kangmin Hsia Method and system of surface polishing
WO2016112315A2 (en) 2015-01-09 2016-07-14 President And Fellows Of Harvard College Nanowire arrays for neurotechnology and other applications
EP3361242B1 (de) * 2015-10-09 2022-04-27 Sony Semiconductor Solutions Corporation Potenzialmessvorrichtung
DE102017218262B4 (de) 2017-10-12 2019-05-29 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur sensorbasierten Untersuchung biologischer Zellen, hergestellte Vorrichtung und Verwendungen hiervon
FR3099696B1 (fr) * 2019-08-08 2024-02-09 Pkvitality Systeme de surveillance corporelle comprenant une microaiguille
CN113970677B (zh) * 2021-10-09 2023-10-27 上海林海生态技术股份有限公司 生物电化学系统用电极板可靠性的检测方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4969468A (en) * 1986-06-17 1990-11-13 Alfred E. Mann Foundation For Scientific Research Electrode array for use in connection with a living body and method of manufacture
US5388577A (en) * 1990-06-08 1995-02-14 Boston University Electrode array microchip
WO2000016833A1 (en) * 1998-09-18 2000-03-30 The University Of Utah Research Foundation Surface micromachined microneedles
WO2001052731A1 (en) * 2000-01-21 2001-07-26 Instrumentarium Corporation Medical electrode
US20020028991A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-07 Medtronic, Inc. Skin-mounted electrodes with nano spikes
EP1344551A2 (de) * 1995-08-10 2003-09-17 Nmi Naturwissenschaftliches Und Medizinisches Institut An Der Universität Tübingen Mikroelektroden-Anordnung
EP1488740A1 (de) * 2003-06-17 2004-12-22 Instrumentarium Corporation Einheitlicher Multielektrodenbiopotentialsensor und Herstellungsverfahren desselben.
WO2005117554A2 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 California Institute Of Technology Microfabricated neural probes and methods of making same

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040063100A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Wang Chung Lin Nanoneedle chips and the production thereof
US8232074B2 (en) * 2002-10-16 2012-07-31 Cellectricon Ab Nanoelectrodes and nanotips for recording transmembrane currents in a plurality of cells

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4969468A (en) * 1986-06-17 1990-11-13 Alfred E. Mann Foundation For Scientific Research Electrode array for use in connection with a living body and method of manufacture
US5388577A (en) * 1990-06-08 1995-02-14 Boston University Electrode array microchip
EP1344551A2 (de) * 1995-08-10 2003-09-17 Nmi Naturwissenschaftliches Und Medizinisches Institut An Der Universität Tübingen Mikroelektroden-Anordnung
WO2000016833A1 (en) * 1998-09-18 2000-03-30 The University Of Utah Research Foundation Surface micromachined microneedles
WO2001052731A1 (en) * 2000-01-21 2001-07-26 Instrumentarium Corporation Medical electrode
US20020028991A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-07 Medtronic, Inc. Skin-mounted electrodes with nano spikes
EP1488740A1 (de) * 2003-06-17 2004-12-22 Instrumentarium Corporation Einheitlicher Multielektrodenbiopotentialsensor und Herstellungsverfahren desselben.
WO2005117554A2 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 California Institute Of Technology Microfabricated neural probes and methods of making same

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C. ZOSKI: "Ultramicroelectrodes: Design, Fabrication and Characterization" ELECTROANALYSIS, Bd. 14, Nr. 15-16, 2002, Seiten 1041-1051, XP002404701 Weinheim *
GRISS P ET AL: "Spiked biopotential electrodes" IEEE TRANSACTIONS ON BIOMEDICAL ENGINEERING, 23. Januar 2000 (2000-01-23), Seiten 323-328, XP010377147 *
METZ S ET AL: "Microelectrodes with three-dimensional structures for improved neural interfacing" PROCEEDINGS OF THE 23RD. ANNUAL INTERNATIONAL CONFERENCE OF THE IEEE ENGINEERING IN MEDICINE AND BIOLOGY SOCIETY. 2001 CONFERENCE PROCEEDINGS. (EMBS). INSTANBUL, TURKEY, OCT. 25 - 28, 2001, ANNUAL INTERNATIONAL CONFERENCE OF THE IEEE ENGINEERING IN M, Bd. VOL. 1 OF 4. CONF. 23, 25. Oktober 2001 (2001-10-25), Seiten 765-768, XP010593487 ISBN: 0-7803-7211-5 *
SCHWANK M ET AL: "Production of a microelectrode for intracellular potential measurements based on a Pt/Ir needle insulated with amorphous hydrogenated carbon" SENSORS AND ACTUATORS B, ELSEVIER SEQUOIA S.A., LAUSANNE, CH, Bd. 56, Nr. 1-2, 1. Juli 1999 (1999-07-01), Seiten 6-14, XP004179610 ISSN: 0925-4005 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007076458A1 (en) * 2005-12-21 2007-07-05 Primegen Biotech Llc Microinjector chip
WO2008076465A1 (en) * 2006-12-21 2008-06-26 Primegen Biotech, Llc Microinjector chip
DE102008009826A1 (de) 2008-02-19 2009-08-20 Max-Planck-Gesellschaft Vorrichtung zur Bestimmung eines elektrophysiologischen Parameters von biologischem Zellmaterial, Verfahren zur Herstellung einer Messelektrode für eine derartige Vorrichtung sowie Verfahren zur Vermessung einer Zelle mithilfe einer derartigen Vorrichtung

Also Published As

Publication number Publication date
EP1899724A2 (de) 2008-03-19
DE102005030859A1 (de) 2007-01-04
WO2007003398A3 (de) 2007-03-15
US20100038247A1 (en) 2010-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2007003398A2 (de) Elektrodenanordnung, deren verwendung sowie verfahren zu deren herstellung
EP1218736B1 (de) Vorrichtung zum messen an in einer flüssigen umgebung befindlichen zellen
EP1311655B1 (de) Vorrichtung und verfahren zum elektrischen kontaktieren von in einer flüssigkeit in suspension befindlichen biologischen zellen
DE60025929T2 (de) Anordnung und verfahren zum feststellen und/oder überwachen elektrophysiologischer eigenschaften von ionenkanälen
Wang et al. Single-cell electroporation
DE10202094B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Elektroporation biologischer Zellen
DE69902794T2 (de) Einbringen von Materialien in Zellen mittels porösem oder polykrystallinem Silizium
EP0938674A1 (de) Mikroelementenanordnung, verfahren zum kontaktieren von in einer flüssigen umgebung befindlichen zellen und verfahren zum herstellen einer mikroelementenanordnung
EP1349916A2 (de) Vorrichtung und verfahren zur untersuchung von ionenkanälen in membranen
EP1141264A1 (de) Mikrosysteme zur zellpermeation und zellfusion
DE102010022929A1 (de) Verfahren zum Herstellen einer Bilipidschicht sowie Mikrostruktur und Messanordnung
DE60311973T2 (de) Substrat und verfahren zum messen elektrophysiologischer eigenschaften von zellmembranen
WO2007003399A2 (de) Elektrodenanordnung, deren verwendung sowie verfahren zu deren herstellung
EP1807503B1 (de) Verfahren und vorrichtungen zur bearbeitung einzelner biologischer zellen
DE102007019842A1 (de) Verfahren und Anordnung zum elektrischen Kontaktieren eines membranumhüllten Objekts mit einer Elektrode
EP1775586B1 (de) Verfahren zur elektrophysiologischen Untersuchung einer einen Ionenkanal umfassenden Membran
EP2136921B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur tropfenmanipulation
DE102011120394B4 (de) Verfahren und Mikrostrukturvorrichtung zur elektrischen Kontaktierung biologischer Zellen
DE102010054581A1 (de) Probenpräparation für die Ionisierung mit matrixunterstützter Laserdesorption
DE102020126759B3 (de) Piezoelektrisches Membran-Mikroelektroden Array
DE10352416A1 (de) Verfahren und Vorrichtungen zur Untersuchung eines deformierbaren Objekts
EP1717574B1 (de) Detektion der Abdichtung einer biologischen Substanz auf einem Träger mittels Rauschanalyse
EP2302375B1 (de) Verfahren und Vorrichtung zum Erfassen der Stromspannungskurve einer Zelle
EP1418427B1 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Messung elektrischer Vorgänge an biologischen Membranen
DE102008012760B4 (de) Vorrichtung zur elektrischen Kontaktierung biologischer Zellen

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006776116

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2006776116

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11922971

Country of ref document: US