DE102017218262B4

DE102017218262B4 - Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur sensorbasierten Untersuchung biologischer Zellen, hergestellte Vorrichtung und Verwendungen hiervon

Info

Publication number: DE102017218262B4
Application number: DE102017218262.8A
Authority: DE
Inventors: Joachim Wegener; Stefanie Michaelis
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Universitaet Regensburg
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Universitaet Regensburg
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2019-05-29
Anticipated expiration: 2037-10-13
Also published as: DE102017218262A1; WO2019072588A1; US20200238281A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur sensorbasierten Untersuchung biologischer Zellen, umfassend die Schrittea) Ausstatten mindestens eines sterilen Gefäßes, das eine Öffnung und einen zumindest bereichsweise planaren Boden aufweist, mit mindestens einem Sensor zur Untersuchung biologischer Zellen; undb) Aufbringen eines flüssigen Mediums zur Kryokonservierung, das biologische Zellen enthält, auf eine Oberfläche des mindestens einen Sensors in dem mindestens einen Gefäß; dadurch gekennzeichnet, dass das flüssige Medium zur Kryokonservierung, das biologische Zellen enthält, eingefroren wird.

Description

Es wird ein Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur sensorbasierten Untersuchung biologischer Zellen vorgestellt. Das Verfahren umfasst ein Ausstatten mindestens eines sterilen Gefäßes, das eine Öffnung und einen zumindest bereichsweise planaren Boden aufweist, mit mindestens einem Sensor zur Untersuchung biologischer Zellen. Nach der Ausstattung des sterilen Gefäßes mit dem Sensor wird ein flüssiges Medium zur Kryokonservierung, das biologische Zellen enthält, auf eine Oberfläche des mindestens einen Sensors in dem mindestens einen Gefäß aufgebracht. Anschließend wird das flüssige Medium zur Kryokonservierung, das biologische Zellen enthält, eingefroren. Eine derart hergestellte Vorrichtung erlaubt eine ökonomischere und weniger fehleranfällige sensorbasierte Untersuchung biologischer Zellen und deren Transport und Lagerung in der genannten Vorrichtung bis zum Zeitpunkt der Untersuchung. Verwendungen der Vorrichtung werden vorgeschlagen.
Die genaue Erforschung von Zellphysiologie und Zellreaktionen als Antwort auf äußere chemische, biologische oder physikalische Stimuli spielt eine entscheidende Rolle für viele biochemische und biomedizinische Fragestellungen. Zur Beurteilung der Zytotoxizität neuer Substanzen und Materialien, bei der Wirkstoffsuche oder bei der Validierung therapeutischer Targets bedarf es genauer Kenntnis der zellulären Reaktion. Um hier auf Tiermodelle in der frühen Entwicklungsphase von Wirkstoffen verzichten zu können, werden häufig Zellkulturmodelle verwendet. Diese in-vitro-Modelle - für faktisch alle Gewebe des Körpers vorhanden - sollen die Antwort des jeweiligen Zielgewebes auf die applizierte Substanz unter definierten Bedingungen widerspiegeln und somit erste Abschätzungen über deren Wirkung in vivo liefern. Als Zellkulturmodelle werden häufig aus Tumorgewebe etablierte Zelllinien eingesetzt, die sich über lange Zeit in vitro kultivieren lassen, sich kontinuierlich weiter vermehren und durch Kryokonservierung langfristig bevorraten und lagern lassen.
Heutzutage steht eine Vielzahl von an der Problemstellung orientierten zellbasierten Assays für beispielsweise Zytotoxizitäts- oder Wirkstoffprüfungen zur Verfügung, von denen die meisten sogenannte Endpunkt-Assays darstellen. In diesen Endpunkt-Assays werden die Zellen zu einem definierten Zeitpunkt nach Applikation eines äußeren Stimulus durch Zugabe von Nachweisreagenzien im Hinblick auf einen Biomarker (z.B. Zellstruktur, Metabolit und/oder Signalmolekül) untersucht, wodurch sie auch gleichzeitig irreversibel zerstört, d.h. abgetötet, werden.
Der Nachteil dieses invasiven Verfahrens ist, dass nur ein sehr eingeschränktes Abbild des zeitlichen Verlaufs einer Zellreaktion erzeugt wird und informative Details unter Umständen verborgen bleiben. Ein vielversprechender Ansatz zur zerstörungs- und markierungsfreien Analyse (engl. „label-free analysis“) zellulärer Antworten bzw. Reaktionen in Echtzeit stellt die Verwendung von physikalischen, nicht-invasiv arbeitenden Signalwandlern (Sensoren) dar, speziell der Einsatz von Substrat-integrierten Signalaufnehmern (z.B. Elektroden und/oder Optroden). Bei diesem messtechnischen Konzept werden die Zellen direkt auf der Oberfläche eines physikalischen Signalwandlers kultiviert, der die Zellantwort in ein messbares, meist elektronisches, Signal umwandelt und dadurch quantifizierbar macht. Die Sensoroberfläche dient somit gleichzeitig als Wachstumssubstrat für die Zellen. Hieraus resultiert eine unmittelbare räumliche Nähe von Sensoroberfläche und Zellen, was eine hohe Detektionssensitivität (z.B. bei impedimetrischen Messungen) bewirkt.
Anwendungsgebiete finden sich beim Screening von Arzneistoffen, der Diagnostik klinischer Proben oder der Evaluierung von Biomaterialien. Besonders im Bereich des Hochdurchsatz-Screenings (engl. „high-throughput-screening“ oder kurz „HTS“) haben Substrat-integrierte Signalwandler durch eine quantitative und zeitaufgelöste Datenerfassung die Testung von Wirkstoffen deutlich komfortabler, objektiver und schneller, kurzum effizienter, gemacht.
Der Einsatz von markierungsfrei-arbeitenden, Substrat-integrierten Signalwandlern zur Untersuchung zellulärer Fragestellungen hat in den vergangenen Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen, vor allem aufgrund der Tatsache, dass hierdurch einerseits eine zerstörungsfreie und kontinuierliche Untersuchung einer lebenden, adhärenten Zellpopulation möglich ist und andererseits quantitative Messparameter erhalten werden können.
Das in diesem Bereich am weitesten entwickelte Verfahren ist die nichtinvasive, impedimetrische Untersuchung lebender adhärenter Zellen auf leitenden planaren Filmelektroden unter Verwendung von Wechselstrom, auch als ECIS (engl. „electric cell-substrate impedance sensing“, kurz: „ECIS“) bekannt. Daneben werden aber auch optische oder akustische Signalwandler eingesetzt. Hierunter fallen beispielsweise die Oberflächenplasmonenresonanz (engl. „surface plasmon resonance“, kurz: „SPR“), der resonante Wellenleiter (engl. „resonant waveguide grating“, kurz: „RWG“) oder die Quarzkristall-Mikrowaage („quartz crystal microbalance“, kurz: „QCM“).
Für eine Echtzeitanalyse einer Zellreaktion mit den oben genannten Signalwandlern wird ein unmittelbarer Kontakt zwischen einer Schicht der Zellen und einer Oberfläche dieser Signalwandler benötigt. Um also lebende Zellen mit Hilfe solcher Substrat-integrierter Signalwandler (z.B. impedimetrisch) untersuchen zu können, müssen die Zellen im Vorfeld der Messung als Suspension in entsprechend definierter Zelldichte auf die Sensoroberfläche aufgebracht werden. Dieser Vorbereitungsschritt ist arbeitsintensiv, zeitintensiv und kostenintensiv. Nicht selten ist eine Vervielfältigung der zur langfristigen Bevorratung (z.B. durch eine Zellbank) eingefrorenen, dann aufgetauten Zellen nötig, um die für die Untersuchung nötigen Zellmengen zu erhalten. Hierfür müssen die in Kulturmedium befindlichen Zellen in Zellkulturflaschen oder Petrischalen unter geeigneten Bedingungen kultiviert und anschließend in geeigneter Suspension wiedergewonnen werden. Dieser Vorgang kann mehrere Tage in Anspruch nehmen.
Ferner ist dieser Vorgang nicht nur arbeitsintensiv, zeitintensiv und kostenintensiv, sondern auch fehleranfällig, da in dem mehrtägigen Zeitraum leicht eine Kontamination in der Zellpopulation auftreten kann, die eine termingerechte Bereitstellung eines Untersuchungsergebnisses unmöglich machen kann.
Ausgehend hiervon war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung bereitzustellen, welche eine weniger arbeitsintensive, weniger zeitintensive, weniger kostenintensive und weniger kontaminationsanfällige (schlicht: ökonomischere) und zudem weniger fehleranfällige und reproduzierbarere sensorbasierte Zelluntersuchung erlaubt. Ferner sollte ein Verfahren zu dessen Herstellung bereitgestellt werden und Verwendungen der Vorrichtung vorgeschlagen werden.
Die Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 1, die Vorrichtung mit den Merkmalen von Anspruch 8 und die Verwendung mit den Merkmalen von Anspruch 15.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur sensorbasierten Untersuchung biologischer Zellen bereitgestellt, umfassend die Schritte

a) Ausstatten mindestens eines sterilen Gefäßes, das eine Öffnung und einen zumindest bereichsweise planaren Boden aufweist, mit mindestens einem Sensor zur Untersuchung biologischer Zellen; und
b) Aufbringen eines flüssigen Mediums zur Kryokonservierung, das biologische Zellen enthält, auf eine Oberfläche des mindestens einen Sensors in dem mindestens einen Gefäß;

Mit dem hier beschriebenen Herstellungsverfahren werden die biologischen Zellen in einem Gefäß (z.B. ein sog. „well“, einer Multiwellplatte) mit mindestens einem Sensor (z.B. eine Elektrode und/oder eine Optrode) eingefroren. Ein Vorteil des Einfrierschrittes des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass die so hergestellte Vorrichtung noch nicht unmittelbar zur Untersuchung der biologischen Zellen verwendet werden muss und jederzeit bei einer geplanten Untersuchung zur Verfügung steht. Natürlich kann das flüssige Medium zur Kyrokonservierung (bevorzugt das gesamte Gefäß) in einem weiteren Verfahrensschritt wieder aufgetaut werden. Durch diese Maßnahme werden die in dem Gefäß enthaltenen Zellen revitalisiert (z.B. indem diese bis zu einer Temperatur von 37 °C erwärmt werden). Es kann jedoch durch den in dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Kontakt der Zellsuspension mit der Oberfläche des Sensors auch bereits unmittelbar während des Auftauvorgangs mit einer Untersuchung begonnen werden (z.B. einer zeitaufgelöste Untersuchung der Bildung einer Zellschicht).
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass insbesondere das Aufbringen einer Zellsuspension auf eine Oberfläche des mindestens einen Sensors in standardisiert, mit hoher Präzision und beispielsweise auch in einem Sterilraum durchführbar ist. Für spätere Untersuchungen mit der hergestellten Vorrichtung bedeutet dies, dass die Untersuchungen mit einer höheren Genauigkeit, besseren Reproduzierbarkeit und geringeren Kontaminationsanfälligkeit möglich sind.
In einer vorteilhaften Ausgestaltungsform erfolgt das Einfrieren bis zu einer Temperatur in einem Bereich von - 200°C bis - 1 °C, bevorzugt - 199 °C bis - 10 °C, besonders bevorzugt -198 °C bis -20 °C, ganz besonders bevorzugt - 197 °C bis -40 °C, insbesondere -196 °C bis -60 °C, am bevorzugtesten -196°C bis - 80°C.
Die Verfahrensschritte a) und/oder b) können maschinell, bevorzugt mit einem zur Durchführung des Verfahrensschritts konfigurierten Roboter, optional in einem Sterilraum, durchgeführt werden. Damit wird eine hohe Standardisierung, eine hohe Reproduzierbarkeit und eine geringe Kontaminationsanfälligkeit zu erreicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass der mindestens eine Sensor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus elektrischen Sensoren, optischen Sensoren, akustischen Sensoren und Kombinationen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Elektroden, Optroden, resonante Wellenleiter, Schwingquarze und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Elektroden zur impedimetrischen Messung, Elektroden zur potentiometrischen Messung, Optroden zur Oberflächenplasmonresonanz-Messung, resonante Wellenleiter zur resonanten Gitter-Wellenleiter-Messung, Schwingquarze zur Quarzkristall-Mikrowaagen-Messung und Kombinationen hiervon.
Ferner kann der mindestens eine in dem Verfahren eingesetzte Sensor ein Material enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Metalle, Halbleiter, elektrisch leitfähige Polymere und Kombinationen hiervon, wobei das Material bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Edelmetalle, Mischoxid-Halbleiter, Polymere mit konjugierten Doppelbindungen und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gold, Indium-Zinn-Oxid, Polypyrrol, Polythiophen und Kombinationen und Derivate hiervon.
Der in dem Verfahren eingesetzte Sensor kann mindestens zwei Schichten enthalten oder daraus bestehen, die bevorzugt zueinander coplanar in dem Gefäß angeordnet werden.
Darüberhinaus kann der in dem Verfahren eingesetzte Sensor photolithographisch hergestellt sein. Besonders für mikroskopische Untersuchungen ist es vorteilhaft, wenn der in dem Verfahren verwendete mindestens eine Sensor für Licht einer Wellenlänge im Bereich von 300 nm bis 700 nm transparent ist.
Der mindestens eine im Verfahren verwendete Sensor kann auf dem Boden des mindestens einen Gefäßes angeordnet werden, bevorzugt auf einem planaren Bereich des Bodens. Besonders bevorzugt wird der mindestens eine Sensor zumindest teilweise in den Boden des mindestens einen Gefäßes integriert. Ferner kann der mindestens eine Sensor durch den Boden des mindestens einen Gefäßes hindurch angeordnet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der mindestens eine Sensor durch den Boden des mindestens einen Gefäßes hindurch angeordnet und auf einer der Öffnung des Gefäßes gegenüberliegenden Seite mit einem Messgerät zur Erfassung eines Signals des Sensors kontaktiert. Hierdurch wird auf dieser Seite des Gefäßes eine elektrische, optische und/oder akustische Schnittstelle geschaffen, über welche auf einfache Art und Weise Informationen von dem mindestens einen Sensor an ein Messgerät kommuniziert werden können.
Das mindestens eine im Verfahren verwendete Gefäß kann ein Material enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Metallen, Kunststoffen, Gläsern und Kombinationen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kunststoffen, die bei einer Abkühlung auf eine Temperatur im Bereich von -200 °C bis - 10 °C keine Rissbildung zeigen, besonders bevorzugt Kunststoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polycarbonat, Polyethylenterephthalat, Polystyrol und Mischungen und Kombinationen hiervon. Ferner kann das Material für Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 300 nm bis 700 nm transparent sein. Darüberhinaus kann das Material über eine Behandlung mit Plasma sterilisiert werden oder sein, besonders bevorzugt über eine Behandlung mit Luft-Plasma und/oder Argon-Plasma, insbesondere für einen Zeitraum von 20 bis 60 Sek. Ferner kann das Material zumindest bereichsweise, bevorzugt am Boden und/oder an mindestens einer Seitenwand des Gefäßes, über ein Argon-Plasma hydrophilisiert sein. Die Hydrophilisierung hat den Vorteil, dass auch wenig zellkompatible Materialien zumindest an Teilen ihrer Oberfläche in zellkompatible Materialien umgewandelt werden können.
In dem Verfahren kann das Gefäß am Boden mit einer Erhebung, optional mit einer ringförmigen Erhebung, versehen werden, die flüssigkeitsdicht mit dem Boden verbunden wird oder die monolithisch mit dem Boden des Gefäßes ausgestaltet wird. Die Erhebung weist eine Höhe auf, die kleiner ist als die Höhe des Gefäßes, bevorzugt eine Höhe, die weniger als 80%, weniger als 60%, weniger als 40%, weniger als 20% oder weniger als 10%, der Höhe des Gefäßes beträgt. Ferner begrenzt die Erhebung eine Fläche am Boden des Gefäßes, die kleiner ist als die gesamte Fläche des Bodens, bevorzugt eine Fläche, die weniger als 80%, weniger als 60%, weniger als 40%, weniger als 20% oder weniger als 10%, der Fläche des Bodens beträgt.
Das in dem Verfahren verwendete Gefäß kann ein Gefäß (engl. „well“) einer Multiwellplatte sein und die Multiwellplatte mindestens zwei Gefäße, bevorzugt mit den Merkmalen des mindestens einen Gefäßes, enthalten, bevorzugt mindestens 6, mindestens 12, mindestens 24, mindestens 48 oder mindestens 96 Gefäße (optional mit den Merkmalen des mindestens einen Gefäßes), wobei die Zellsuspension besonders bevorzugt in mindestens zwei der Gefäße, insbesondere in alle Gefäße der Vorrichtung, pipettiert wird
Das in dem Verfahren verwendete Medium zur Kryokonservierung kann eine wässrige Pufferlösung enthalten, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zellkulturmedium, Blutserum, wässrige Lösung mindestens eines Puffers, der im pH-Bereich von 6 bis 8 Pufferwirkung zeigt, und Mischungen hiervon, wobei das Zellkulturmedium und/oder die wässrige Lösung des mindestens einen Puffers optional Blutserum enthält, und wobei die wässrige Pufferlösung bevorzugt einen pH in einem Bereich von 7.0 bis 7.4 aufweist. Ferner kann das Medium zur Kryokonservierung eine kyroprotektive Substanz enthalten, die bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DMSO, Glycerin, Trehalose und Mischungen hiervon. Die in dem Medium zur Kryokonservierung enthaltenen (suspendierten) biologischen Zellen können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus tierischen Zellen, pflanzlichen Zellen, Mikroorganismen und Mischungen hiervon, bevorzugt ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus biologischen Zellen aus einem Gewebe eines tierischen Organismus, besonders bevorzugt ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Keratinocyten, Nierenzellen, Astrocyten, Gliazellen, Cardiomyocyten, Epithelzellen, Endothelzellen, Stammzellen, Neuronen und Kombinationen hiervon, ganz besonders bevorzugt ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Ratten-Nierenzellen, HaCaT-Zellen, U373-Zellen und Kombinationen hiervon.
Das Einfrieren des Gefäßes kann in einem Gefrierschrank erfolgen, wobei das Einfrieren bevorzugt mit einer Abkühlungsrate im Bereich von 0,1 bis 10 K pro Minute, besonders bevorzugt 0,2 bis 5 K/Min., ganz besonders bevorzugt 0,5 bis 2 K/Min., insbesondere 1 K/Min, durchgeführt wird.
Darüberhinaus wird erfindungsgemäß eine Vorrichtung zur sensorbasierten Untersuchung biologischer Zellen bereitgestellt. Die Vorrichtung enthält mindestens ein Gefäß, wobei das mindestens eine Gefäß

a) eine Öffnung;
b) einen zumindest bereichsweise planaren Boden;
c) mindestens einen Sensor zur Untersuchung biologischer Zellen; und
d) ein Medium zur Kryokonservierung, wobei das Medium zur Kryokonservierung biologische Zellen enthält und eine Oberfläche des mindestens einen Sensors kontaktiert;

Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt eine weniger arbeitsintensive, weniger zeitintensive, weniger kostenintensive, weniger kontaminationsanfällige (d.h. eine ökonomischere) und weniger durch systembedingte Ursachen verfälschte (d.h. eine reproduzierbarere) sensorbasierte Zelluntersuchung. Die Zelluntersuchung mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist mit geringeren Kosten verbunden, da keine teure Infrastruktur (z.B. teure Geräte und teure Materialien für die Zellanzucht und die Zellernte, geschulte Arbeiter) für Vorarbeiten bis zur Durchführung der Untersuchung mehr nötig ist.
Es können ferner durch die erfindungsgemäße Vorrichtung mit minimalem Aufwand verschiedene Zelltypen gleichzeitig untersucht werden, ohne dass die verschiedenen Zelltypen unmittelbar vor der Untersuchung kultiviert werden müssen.
Darüberhinaus reduziert die erfindungsgemäße Vorrichtung das Risiko, dass die Zellen vor der Untersuchung kontaminieren, da sich die Zellen bereits auf der Oberfläche des Sensors befinden und nicht mehr kurz vor der Untersuchung auf die Sensoroberfläche aufgebracht (z.B. pipettiert) werden müssen.
Da die im Stand der Technik übliche, in der Genauigkeit von Person zu Person variierende Pipettierung der Zellsuspension auf die Oberfläche des mindestens einen Sensors entfällt, weist eine Untersuchung von biologischen Zellen mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung weniger systembedingte Messfehler auf. Ferner ermöglicht die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Untersuchung von identischen Zellen einer Charge (ein „batch“), sodass keine Batch-to-batch Variationen auftreten und Zellkultur-bedingte (Veränderungen im Phänotyp und/oder eine De-/Trans-/Differenzierung der Zellen) und Anwender-bedingte Schwankungen bei der Bereitstellung der biologischen Zellen wegfallen, wodurch die Streubreite der erhaltenen Messergebnisse deutlich reduziert wird.
Letztlich erlaubt die erfindungsgemäße Vorrichtung eine einfachere Planbarkeit und Logistik der Zelluntersuchungen, da ein bedarfsangepasstes Auftauen in jeweils benötigten Quantitäten möglich ist.
In einer vorteilhaften Ausgestaltungsform erfolgt das Einfrieren bis zu einer Temperatur in einem Bereich von - 200°C bis - 1 °C, bevorzugt - 199 °C bis - 10 °C, besonders bevorzugt -198 °C bis -20 °C, ganz besonders bevorzugt - 197 °C bis -40 °C, insbesondere -196 °C bis -60 °C, am bevorzugtesten -196°C bis - 80°C.
Der mindestens eine Sensor der Vorrichtung kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus elektrischen Sensoren, optischen Sensoren, akustischen Sensoren und Kombinationen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Elektroden, Optroden, resonante Wellenleiter, Schwingquarze und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Elektroden zur impedimetrischen Messung, Elektroden zur potentiometrischen Messung, Optroden zur Oberflächenplasmonresonanz-Messung, resonante Wellenleiter zur resonanten Gitter-Wellenleiter-Messung, Schwingquarze zur Quarzkristall-Mikrowaagen-Messung und Kombinationen hiervon.
Ferner kann der mindestens eine Sensor der Vorrichtung ein Material enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Metalle, Halbleiter, elektrisch leitfähige Polymere und Kombinationen hiervon, wobei das Material bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Edelmetalle, Mischoxid-Halbleiter, Polymere mit konjugierten Doppelbindungen und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gold, Indium-Zinn-Oxid, Polypyrrol, Polythiophen und Kombinationen und Derivaten hiervon.
Zudem kann der mindestens eine Sensor der Vorrichtung mindestens zwei Schichten enthalten oder daraus bestehen, die bevorzugt zueinander coplanar in dem mindestens einen Gefäß angeordnet sind.
Darüberhinaus kann der Sensor photolithographisch hergestellt sein. Besonders für mikroskopische Untersuchungen ist es vorteilhaft, wenn der mindestens eine Sensor für Licht einer Wellenlänge im Bereich von 300 nm bis 700 nm transparent ist.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform der Vorrichtung ist der mindestens eine Sensor der Vorrichtung auf dem Boden des mindestens einen Gefäßes angeordnet, bevorzugt auf einem planaren Bereich des Bodens. Der mindestens eine Sensor kann zumindest teilweise in den Boden des mindestens einen Gefäßes integriert sein. Ferner kann der mindestens eine Sensor durch den Boden des mindestens einen Gefäßes hindurch angeordnet sein. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsform ist der mindestens eine Sensor durch den Boden des mindestens einen Gefäßes hindurch angeordnet und auf einer der Öffnung des Gefäßes gegenüberliegenden Seite mit einem Messgerät zur Erfassung eines Signals des Sensors kontaktiert.
Das mindestens eine Gefäß der Vorrichtung kann ein Material enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Metallen, Kunststoffen, Gläsern und Kombinationen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kunststoffen, die bei einer Abkühlung auf eine Temperatur im Bereich von -200 °C bis - 10 °C keine Rissbildung zeigen, besonders bevorzugt ein Kunststoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polycarbonat, Polyethylenterephthalat, Polystyrol und Mischungen und Kombinationen hiervon. Ferner kann das Material für Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 300 nm bis 700 nm transparent sein. Darüberhinaus kann das Material sterilisiert sein, bevorzugt über eine Behandlung mit Plasma sterilisiert sein, besonders bevorzugt über eine Behandlung mit Luft-Plasma und/oder Argon-Plasma, insbesondere für einen Zeitraum von 20 bis 60 Sek. Ferner kann das Material zumindest bereichsweise, bevorzugt am Boden und/oder an mindestens einer Seitenwand des Gefäßes, über ein Argon-Plasma hydrophilisiert sein. Die Hydrophilisierung hat den Vorteil, dass auch wenig zellkompatible Materialien zumindest an Teilen ihrer Oberfläche in zellkompatible Materialien umgewandelt werden können.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform weist das Gefäß am Boden der Vorrichtung eine Erhebung, optional eine ringförmige Erhebung, auf, die flüssigkeitsdicht mit dem Boden verbunden ist oder die monolithisch mit dem Boden des Gefäßes ist. Die Erhebung weist eine Höhe auf, die kleiner ist als die Höhe des Gefäßes, bevorzugt eine Höhe, die weniger als 80%, weniger als 60%, weniger als 40%, weniger als 20% oder weniger als 10%, der Höhe des Gefäßes beträgt. Ferner begrenzt die Erhebung eine Fläche am Boden des Gefäßes, die kleiner ist als die gesamte Fläche des Bodens, bevorzugt eine Fläche, die weniger als 80%, weniger als 60%, weniger als 40%, weniger als 20% oder weniger als 10%, der Fläche des Bodens beträgt.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist das Gefäß ein Gefäß einer Multiwellplatte und die Multiwellplatte enthält mindestens zwei Gefäße, bevorzugt mit den Merkmalen des mindestens einen Gefäßes. Bevorzugt weist die Multiwellplatte mindestens 6, mindestens 12, mindestens 24, mindestens 48 oder mindestens 96 Gefäße (optional mit den Merkmalen des mindestens einen Gefäßes) auf, wobei die (gefrorene) Zellsuspension besonders bevorzugt in mindestens zwei der Gefäße, insbesondere in allen Gefäße der Vorrichtung, vorliegt.
Das Medium zur Kryokonservierung kann eine wässrige Pufferlösung enthalten (in gefrorenem Zustand), bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zellkulturmedium, Blutserum, wässrige Lösung mindestens eines Puffers, der im pH-Bereich von 6 bis 8 Pufferwirkung zeigt, und Mischungen hiervon, wobei das Zellkulturmedium und/oder die wässrige Lösung des mindestens einen Puffers optional Blutserum enthält, und wobei die wässrige Pufferlösung bevorzugt einen pH in einem Bereich von 7.0 bis 7.4 aufweist. Ferner kann das Medium zur Kryokonservierung eine kyroprotektive Substanz enthalten (in gefrorenem Zustand), die bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DMSO, Glycerin, Trehalose und Mischungen hiervon. Darüberhinaus kann das Medium zur Kryokonservierung biologische Zellen enthalten (in gefrorenem Zustand), die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus tierischen Zellen, pflanzlichen Zellen, Mikroorganismen und Mischungen hiervon, bevorzugt ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus biologischen Zellen aus einem Gewebe eines tierischen Organismus, besonders bevorzugt ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Keratinocyten, Nierenzellen, Astrocyten, Gliazellen, Cardiomyocyten, Epithelzellen, Endothelzellen, Stammzellen, Neuronen und Kombinationen hiervon, ganz besonders bevorzugt ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Ratten-Nierenzellen, HaCaT-Zellen, U373-Zellen und Kombinationen hiervon.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist bevorzugt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar bzw. hergestellt.
Ferner wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Identifikation und/oder Analyse mindestens eines Wirkstoffs vorgeschlagen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch zur Identifikation und/oder Analyse mindestens einer toxischen Substanz verwendet werden. Darüberhinaus kann die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Untersuchung einer Biokompatibilität verwendet werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann ferner zur Untersuchung mindestens eines Differenzierungsvorgangs der Zellen und/oder zur Untersuchung einer metabolischen Aktivität der Zellen verwendet werden. Ferner kann die Vorrichtung zur Identifizierung der Zellen und/oder zur Bestimmung von deren Qualität verwendet werden. Die Vorrichtung und/oder das mindestens eine Gefäß der Vorrichtung werden insbesondere vor der Messung auf eine Temperatur im Bereich von 1 ° bis 40 °C, bevorzugt 36 °C bis 38 °C, erwärmt.
Anhand der nachfolgenden Figuren und Beispiele soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen auf die hier dargestellten spezifischen Ausführungsformen einschränken zu wollen.

1 illustriert ein Verfahren zum Einfrieren bzw. Kryokonservieren von suspendierten Zellen 1 in mehreren Gefäßen („Wells“) einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. Die einzufrierenden Zellen 1 befinden sich zunächst in einer Vorkultur. Eine Suspension dieser Zellen 1 in Einfriermedium wird in jedes Well 2 mit Sensor 3 (hier: eine Elektrode für eine impedimetrische Messung) pipettiert. Die erfindungsgemäße Vorrichtung wird eingefroren, bevorzugt durch ein Abkühlen der Zellsuspension mit einer Abkühlrate von 1 °C/min auf eine Lagertemperatur von -80 °C. Die eingefrorenen Zellen 1' werden in einem Gefrierschrank 5 bei -80 °C gelagert. Nach einer bestimmten Zeit werden die Zellen bei 37 °C zu einer flüssigen Zellsuspension 1 aufgetaut. Dies kann unmittelbar durch eine Zugabe von auf 37 °C vorgewärmtem Medium passieren. Nach Absetzen der Zellen durch die Schwerkraft kommt es zur Adhäsion 6 der Zellen 1 an der Oberfläche des Sensor 3 und des Bodens 4 des Gefäßes 2. Nun können auf die gebildete Zellschicht 7 Stimulantien gegeben werden und eine Zellreaktion über den Sensor 3 analysiert werden.
2 zeigt den zeitlicher Verlauf der Kapazität C (f = 40 kHz) während der Adhäsion von suspendierten HaCaT Zellen auf der Sensoroberfläche (hier: eine Elektrode für eine impedimetrische Messung) einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. 2A zeigt das Ergebnis für Zellen nach der Kryokonservierung über 5 Wochen bei -80 °C und dem Revitalisieren mit Kulturmedium zum Zeitpunkt t = 0 min. 2B zeigt das Ergebnis für Zellen aus einer Zellsuspension, die von einer nicht-kryokonservierten Dauerkultur stammt. In beiden Fällen beträgt die Zelldichte auf der Sensoroberfläche 450000 Zellen/cm² (T = 37 °C). Die Abnahme der Kapazität spiegelt die zunehmende Elektrodenbedeckung wider.
3 zeigt den zeitlichen Verlauf der normierten Impedanz norm. IZI bei 32 kHz für konfluente HaCaT Zellen, die zum Zeitpunkt t = 0 h mit steigenden Konzentrationen an CdCl₂ inkubiert wurden (Zytotoxizitätsassay). 3A zeigt eine revitalisierte Zellschicht nach Kryokonservierung über 7 Tage bei -80 °C und 3B zeigt eine frische Zellsuspension gleicher Dichte (450000 Zellen/cm² aus einer Dauerkultur. CdCl₂ wurde 24 h nach Revitalisieren, respektive Zellaussaat, appliziert (T = 37 °C).
4 zeigt zunächst in 4A nur eine herkömmliche Multiwell-Platte. In den 4B und 4C sind zwei Varianten einer erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt, bei der ein erster Teil 3a eines Sensors zentral am Boden 4 des Gefäßes 2 (einem „well“ einer Multiwellplatte) positioniert ist (hier: eine punktförmige Arbeitselektrode aus Gold) und ein zweiter Teil 3b eines Sensors am Rand des Bodens 4 des Gefäßes 2 angeordnet ist (hier: eine ringförmige Gegenelektrode aus Gold). In beiden Varianten hat die Wandung des Gefäßes 2 hat eine bestimmte Höhe H_w und begrenzt das Volumen des Gefäßes 2. In der in 4C dargestellten Variante enthält das Gefäß 2 zusätzlich eine Erhebung 8 am Boden des Gefäßes 2 (hier: ein Ring, z.B. aus Kunststoff), der zwischen der Gegenelektrode 3b und der Arbeitselektrode 3a am Boden 4 des Gefäßes 2 angeordnet ist und mit dem Boden 5 des Gefäßes 2 flüssigkeitsdicht verbunden ist. Die Erhebung 8 weist eine geringere Höhe H_E als die Höhe H_w der Wandung des Gefäßes 2 auf. Die in 4C dargestellte Variante erlaubt eine Kompartimentierung der in dem Kryokonservierungsmedium befindlichen Zellen innerhalb des Gefäßes 2 („Kryokompartimentierung“) und ermöglicht somit auch bei sehr geringen Volumina der einzufrierenden Zellsuspension eine zuverlässige Benetzung der Oberfläche des ersten Teils 3a des Sensors. Der geringere Bedarf an Suspensionsvolumen stellt vor allem bei der Untersuchung von kostenintensiven Zellen einen großen ökonomischen Vorteil dar. Ferner ist die Gegenelektrode 3b vor Schäden geschützt, die durch die Zellsuspension bzw. die Zellen entstehen können.
5 illustriert die Verwendung der in 4C dargestellten Variante der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Die in 5A dargestellte eingefrorene Vorrichtung weist lediglich in dem von der Erhebung 8 begrenzten Teilvolumen des Gefäßes 2 die gefrorene Suspension biologischer Zellen 1' auf. Über ein rasches Auffüllen des Gefäßes 2 mit erwärmten (z.B. auf 37 °C temperierten) Kulturmedium 9 wird erreicht, dass die gefrorene Zellsuspension 1' nicht nur schnell auftaut, sondern auch lokal in dem durch die Erhebung 8 begrenzten Volumen verbleibt. Dieser Zustand während dem Auftauen ist in 5B dargestellt. Das Verbleiben der Zellsuspension in dem durch die Erhebung 8 begrenzten Volumen bewirkt, dass sich nur auf dem durch die Erhebung 8 begrenzten Teil des Bodens 4 des Gefäßes 2 eine Zellschicht ausbildet und die Gegenelektrode 3b von einer Zellschicht befreit bleibt. Dies kann je nach eingesetztem Sensor 3a, 3b eine positive Wirkung auf die Qualität des Messsignals ausüben.

Beispiel 1 - Herstellung und Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung
In einer Zellkulturflasche oder auf einer Petrischale adhärent wachsende Zellen werden zunächst nach einem enzymatischem Ablösen (z.B. mit einer Trypsinlösung) von ihrer Zellkulturflasche bzw. ihrer Petrischale in präzise eingestellter Zelldichte in einem kleinen Volumen eines speziellen Einfriermediums (enthält eine kryoprotektive Substanz wie DMSO oder Glycerin) aufgenommen.
Anschließend wird diese Zellsuspension in die Gefäße der erfindungsgemäßen Vorrichtung, hier die „wells“ einer Mulitwell-Platte, gefüllt. Als Sensor am Boden der „wells“ befinden sich Goldfilmelektroden.
Die befüllte Multiwell-Platte wird bei -80 °C im Tiefkühlschrank eingefroren und gelagert.
Bei Bedarf können die Zellen aufgetaut und zum Experiment genutzt werden. Dazu wird die Multiwell-Platte dem Tiefkühlschrank entnommen. Zum Revitalisieren der Zellen wird der aufgetauten Zellsuspension Kulturmedium hinzupipettiert, so dass das Einfriermedium um ein Vielfaches verdünnt wird.
Da die Messungen mit lebenden Zellen durchgeführt werden, müssen alle folgenden Experimente in einem Inkubator bei konstanter Temperatur von 37 °C stattfinden.
Nach Anschluss des Sensor-Arrays an eine entsprechende Messelektronik kann die Adhäsion der noch suspendierten Zellen an die Oberfläche des Signalwandlers (hier eine Elektrode) zeitaufgelöst verfolgt werden, so dass schon während dieser ersten Phase nach dem Auftauen ein Überwachen der Zellvitalität und der Ausbildung einer intakten Zellschicht auf der Sensor-/Elektrodenoberfläche erfolgt (Qualitätskontrolle/Vitalitätsnachweis der aufgetauten Zellen).
Nach Adhäsion an die Oberfläche des Signalwandlers sind die Zellen weiteren zellphysiologischen Untersuchungen zugänglich, wie beispielsweise Zytotoxizitäts-Screenings, Wirkstoff-Screening und/oder Differenzierungsstudien.
Alternativ kann auch erst nach Zelladhäsion und -spreiten mit der Datenaufzeichnung begonnen werden.
Beispiel 2 - Überlebensquote von in der erfindungsgemäßen Vorrichtung gelagerten und aufgetauten Zellen
Das Auftauen der erfindungsgemäßen Vorrichtung erfolgt mit dem für eine Kryokonservierung üblichen Verlust an lebenden Zellen. Die Überlebensquote wurde durch den klassischen Vitalitätsassay „PrestoBlue“ ermittelt. Basierend auf dem Viabilitätsassay „PrestoBlue“ konnte für verschiedene Zelllinien die nachfolgenden Überlebensquoten 48 h nach Auftauen demonstriert werden:

Zellen Überlebensquote

Normal Rat Kidney Zellen (86 ± 3)%

HaCaT Zellen (89 ± 9) %

U373 Zellen (92 ± 4) %
Dies bestätigt den nicht-invasiven Charakter der Kryokonservierung lebender Zellen auf der Sensoroberfläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung und validiert somit die grundsätzliche Funktionalität der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Beispiel 3 - Vergleich der Vitalität von in der erfindungsgemäßen Vorrichtung gelagerten und aufgetauten Zellen zu frisch kultivierten Zellen
Es wurde gefunden, dass die auf der Sensoroberfläche über Kyrokonservierung gelagerten Zellen nach dem Auftauen voll vital sind und ihre normalen physiologischen Prozesse wieder aufnehmen, so dass sie sich physiologisch nicht von frisch ausgesäten Zellen aus einer kontinuierlich wachsenden Kultur unterscheiden.
Zur Überprüfung des Vitalitätszustandes der eingefrorenen und danach wieder aufgetauten Zellen wurde die Kinetik der Adhäsion von humanen Hautzellen (Keratinozyten, HaCaT Zellen) auf die Elektrodenoberfläche (aus Gold) nach einer Kryokonservierung von über fünf Wochen bei -80 °C unmittelbar nach dem Auftauen (Revitalisieren) zeitaufgelöst über einen impedimetrischen Readout verfolgt (siehe 2A). Der Zeitverlauf der Kapazität C des Gesamtsystems bei einer Messfrequenz von 40 kHz steht in linearer Abhängigkeit zur Belegung der Elektrode mit adhärenten Zellen und spiegelt somit den fortschreitenden Prozess der Zelladhäsion wider.
Dem vergleichend gegenübergestellt ist der zeitliche Verlauf der Kapazität für frisch ausgesäte Zellen gleicher Dichte aus einer kontinuierlich wachsenden Zellkultur gleicher Passagennummer (Charge) (siehe 2B), die nicht kryokonserviert war.
Das Kulturmedium ist in der chemischen Zusammensetzung dem Einfriermedium nach Revitalisieren der Zellen nachempfunden. Zum Einfrieren der Zellen wurden variable DMSO-Gehalte gewählt, um das Einfriermedium für die jeweilige Zelllinie gezielt optimieren zu können.
Die Ähnlichkeit der Kapazitätsverläufe nach Auftauen von kryokonservierten Zellen, respektive nach Aussaat frischer Zellen gleicher Dichte, belegt, dass kryokonservierte Zellen ähnlich schnell auf die Elektrodenoberfläche adhärieren und einen dichten Zellrasen ausbilden.
Weiterhin zeigt 2A für HaCaT Zellen deutlich auf, dass diese Zellen auch ohne Kryoprotektivum eingefroren werden können, ein Anteil von 10 % Volumenanteil DMSO im Einfriermedium aber auch keinen negativen Einfluss auf die Zellvitalität nach Auftauen besitzt.
Die Bereitstellung eingefrorener Zellen in Wells mit integrierten Signalwandlern erlaubt damit die quantitative online Dokumentation zellphysiologischer Prozesse zu einem beliebigen Zeitpunkt nach dem Auftauen der Zellen und der Adhäsion der Zellen auf der Elektrodenoberfläche.
Die nachfolgend dargestellten Daten dokumentieren, dass die Zellen nicht nur vital sondern unverändert sensitiv gegenüber chemischen Reizen sind.
3 zeigt eine vergleichende Gegenüberstellung einer impedimetrischen Toxizitätsstudie mit HaCaT Zellen, die einerseits vor dem Experiment für 7 Tage in Suspension auf dem Sensorarray bei -80 °C eingefroren und anschließend aufgetaut wurden (siehe 3A) und andererseits aus einer kontinuierlichen Kultur frisch auf das Sensorarray ausgesät wurden (siehe 3B).
Die Zelldichte war in beiden Fällen identisch. Als chemisches Modeltoxin dienten steigenden Konzentrationen des Schwermetallsalzes CdCl₂. Der Assay wurde 24 h nach dem Auftauen, respektive der Aussaat, der Zellen durchgeführt.
Die Zellantwort auf die Gabe von CdC_l2 ist anhand des zeitlichen Profils der normierten Impedanz bei einer Messfrequenz von 32 kHz dokumentiert. Die zunächst hohe Impedanz der zellbedeckten Elektroden nimmt in Folge der einsetzenden Vergiftung der Zellen dosisabhängig ab. Die zeitlichen und für jede Konzentration an CdC_l2 sehr charakteristischen Verläufe der Impedanz nach CdCl₂-Zugabe auf die konfluenten Zellschichten sind für die kryokonservierten Zellen ununterscheidbar ähnlich zu denen der frisch ausgesäten Zellen.
Die ähnlichen Toxizitätsprofile beider Populationen belegen eine ähnliche Chemosensitivität frisch ausgesäter Zellen und auf der Sensoroberfläche eingefrorener Zellen.
Eine weitere, hier nicht weiter ausgeführte Ausführungsform ist die Kryokonservierung von schlagenden Herzmuskelzellen (Cardiomyocyten) in Multiwell-Platten mit integrierten Impedanzelektroden. Die Zellen können nach Adhäsion auf die Elektrodenoberfläche durch zeitaufgelöste Impedanzmessungen in ihrem Kontraktionsmuster verfolgt und analysiert werden.
Bezugszeichenliste

1:: suspendierte biologische Zellen;
1':: eingefrorene biologische Zellen;
2:: Gefäß (z.B. ein „well“ einer Multiwellplatte;
3:: Sensor;
3a:: erster Teil des Sensors;
3b:: zweiter Teil des Sensors;
4:: Boden des Gefäßes;
5:: Gefrierschrank;
6:: Adhäsion der suspendierten Zellen;
7:: Zellschicht;
8:: Erhebung am Boden des Gefäßes (z.B. ein Ring);
9:: Kulturmedium (z.B. auf 37°C erwärmt);
H_W:: Höhe der Wandung des Gefäßes;
H_E:: Höhe der Erhebung am Boden des Gefäßes.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur sensorbasierten Untersuchung biologischer Zellen, umfassend die Schritte a) Ausstatten mindestens eines sterilen Gefäßes, das eine Öffnung und einen zumindest bereichsweise planaren Boden aufweist, mit mindestens einem Sensor zur Untersuchung biologischer Zellen; und b) Aufbringen eines flüssigen Mediums zur Kryokonservierung, das biologische Zellen enthält, auf eine Oberfläche des mindestens einen Sensors in dem mindestens einen Gefäß; dadurch gekennzeichnet, dass das flüssige Medium zur Kryokonservierung, das biologische Zellen enthält, eingefroren wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Sensor i) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus elektrischen Sensoren, optischen Sensoren, akustischen Sensoren und Kombinationen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Elektroden, Optroden, resonanten Wellenleiter, Schwingquarzen und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Elektroden zur impedimetrischen Messung, Elektroden zur potentiometrischen Messung, Optroden zur Oberflächenplasmonresonanz-Messung, resonante Wellenleiter zur resonanten Gitter-Wellenleiter-Messung, Schwingquarze zur Quarzkristall-Mikrowaagen-Messung und Kombinationen hiervon; und/oder ii) ein Material enthält oder daraus besteht, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Metalle, Halbleiter, elektrisch leitfähige Polymere und Kombinationen hiervon, wobei das Material bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Edelmetalle, Mischoxid-Halbleiter, Polymere mit konjugierten Doppelbindungen und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gold, Indium-Zinn-Oxid, Polypyrrol, Polythiophen und Kombinationen und Derivaten hiervon.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Sensor auf dem Boden des mindestens einen Gefäßes angeordnet wird, bevorzugt auf einem planaren Bereich des Bodens, wobei der mindestens eine Sensor besonders bevorzugt i) zumindest teilweise in den Boden des mindestens einen Gefäßes integriert wird; und/oder ii) durch den Boden des mindestens einen Gefäßes hindurch angeordnet wird; und/oder iii) durch den Boden des mindestens einen Gefäßes hindurch angeordnet wird und auf einer der Öffnung des Gefäßes gegenüberliegenden Seite mit einem Messgerät zur Erfassung eines Signals des Sensors kontaktiert wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Gefäß ein Material enthält oder daraus besteht, das i) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Metallen, Kunststoffen und Kombinationen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kunststoffen, die bei einer Abkühlung auf eine Temperatur im Bereich von -200 °C bis - 10 °C keine Rissbildung zeigen, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polycarbonat, Polyethylenterephthalat, Polystyrol und Mischungen und Kombinationen hiervon; und/oder ii) für Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 300 nm bis 700 nm transparent ist; und/oder iii) sterilisiert wird oder ist, über eine Behandlung mit Plasma sterilisiert wird oder ist, besonders bevorzugt über eine Behandlung mit Luft-Plasma und/oder Argon-Plasma, insbesondere für einen Zeitraum von 20 bis 60 Sek; und/oder iv) zumindest bereichsweise, bevorzugt am Boden und/oder an mindestens einer Seitenwand des Gefäßes, über ein Argon-Plasma hydrophilisiert ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefäß am Boden mit einer Erhebung, optional mit einer ringförmigen Erhebung, versehen wird, die flüssigkeitsdicht mit dem Boden verbunden wird oder die monolithisch mit dem Boden des Gefäßes ausgestaltet wird, wobei die Erhebung i) eine Höhe aufweist, die kleiner ist als eine Höhe des Gefäßes, bevorzugt eine Höhe, die weniger als 80%, weniger als 60%, weniger als 40%, weniger als 20% oder weniger als 10%, der Höhe des Gefäßes beträgt; und/oder ii) eine Fläche am Boden des Gefäßes begrenzt, die kleiner ist als die gesamte Fläche des Bodens, bevorzugt eine Fläche, die weniger als 80%, weniger als 60%, weniger als 40%, weniger als 20% oder weniger als 10%, der Fläche des Bodens beträgt.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefäß ein Gefäß einer Multiwellplatte ist und die Multiwellplatte mindestens zwei Gefäße, bevorzugt mit jeweils den Merkmalen des mindestens einen Gefäßes, enthält, bevorzugt mindestens 6, mindestens 12, mindestens 24, mindestens 48 oder mindestens 96 Gefäße, bevorzugt mit den Merkmalen des mindestens einen Gefäßes, wobei die Suspension besonders bevorzugt in mindestens zwei der Gefäße, insbesondere in alle Gefäße der Vorrichtung, pipettiert wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium zur Kryokonservierung i) eine wässrige Pufferlösung enthält, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zellkulturmedium, Blutserum, wässrige Lösung mindestens eines Puffers, der im pH-Bereich von 6 bis 8 Pufferwirkung zeigt, und Mischungen hiervon, wobei das Zellkulturmedium und/oder die wässrige Lösung des mindestens einen Puffers optional Blutserum enthält, und wobei die wässrige Pufferlösung bevorzugt einen pH in einem Bereich von 7.0 bis 7.4 aufweist; und/oder ii) eine kyroprotektive Substanz enthält, die bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DMSO, Glycerin, Trehalose und Mischungen hiervon; und/oder iii) biologische Zellen enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus tierischen Zellen, pflanzlichen Zellen, Mikroorganismen und Mischungen hiervon, bevorzugt biologische Zellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus biologische Zellen aus einem Gewebe eines tierischen Organismus, besonders bevorzugt biologische Zellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Keratinocyten, Nierenzellen, Astrocyten, Gliazellen, Cardiomyocyten, Epithelzellen, Endothelzellen, Stammzellen, Neuronen und Kombinationen hiervon, ganz besonders bevorzugt biologische Zellen, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Ratten-Nierenzellen, HaCaT-Zellen, U373-Zellen und Kombinationen hiervon.
Vorrichtung zur sensorbasierten Untersuchung biologischer Zellen, enthaltend mindestens ein Gefäß, wobei das mindestens eine Gefäß a) eine Öffnung; b) einen zumindest bereichsweise planaren Boden; c) mindestens einen Sensor zur Untersuchung biologischer Zellen; und d) ein Medium zur Kryokonservierung, wobei das Medium zur Kryokonservierung biologische Zellen enthält und eine Oberfläche des mindestens einen Sensors kontaktiert; aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium zur Kryokonservierung, das die biologischen Zellen enthält, in einem gefrorenen Zustand vorliegt.
Vorrichtung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Sensor i) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus elektrischen Sensoren, optischen Sensoren, akustischen Sensoren und Kombinationen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Elektroden, Optroden, resonanten Wellenleitern, Schwingquarzen und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Elektroden zur impedimetrischen Messung, Elektroden zur potentiometrischen Messung, Optroden zur Oberflächenplasmonresonanz-Messung, resonante Wellenleiter zur resonanten Gitter-Wellenleiter-Messung, Schwingquarze zur Quarzkristall-Mikrowaagen-Messung und Kombinationen hiervon; und/oder ii) ein Material enthält oder daraus besteht, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Metalle, Halbleiter, elektrisch leitfähige Polymere und Kombinationen hiervon, wobei das Material bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Edelmetalle, Mischoxid-Halbleiter, Polymere mit konjugierten Doppelbindungen und Kombinationen hiervon, besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gold, Indium-Zinn-Oxid, Polypyrrol, Polythiophen und Kombinationen und Derivaten hiervon.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Sensor auf dem Boden des mindestens einen Gefäßes angeordnet ist, bevorzugt auf einem planaren Bereich des Bodens, wobei der mindestens eine Sensor besonders bevorzugt i) zumindest teilweise in den Boden des mindestens einen Gefäßes integriert ist; und/oder ii) durch den Boden des mindestens einen Gefäßes hindurch angeordnet ist; und/oder iii) durch den Boden des mindestens einen Gefäßes hindurch angeordnet ist und auf einer der Öffnung des Gefäßes gegenüberliegenden Seite mit einem Messgerät zur Erfassung eines Signals des Sensors kontaktiert ist.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Gefäß ein Material enthält oder daraus besteht, das i) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Metallen, Kunststoffen und Kombinationen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kunststoffen, die bei einer Abkühlung auf eine Temperatur im Bereich von -200 °C bis - 10 °C keine Rissbildung zeigen, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polycarbonat, Polyethylenterephthalat, Polystyrol und Mischungen und Kombinationen hiervon; und/oder ii) für Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 300 nm bis 700 nm transparent ist; und/oder iii) sterilisiert ist, bevorzugt über eine Behandlung mit Plasma sterilisiert ist, besonders bevorzugt über eine Behandlung mit Luft-Plasma und/oder Argon-Plasma, insbesondere für einen Zeitraum von 20 bis 60 Sek.; und/oder iv) zumindest bereichsweise, bevorzugt am Boden und/oder an mindestens einer Seitenwand des Gefäßes, über ein Argon-Plasma hydrophilisiert ist.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefäß am Boden eine Erhebung, optional eine ringförmige Erhebung, aufweist, die flüssigkeitsdicht mit dem Boden verbunden ist oder die monolithisch mit dem Boden des Gefäßes ist, wobei die Erhebung i) eine Höhe aufweist, die kleiner ist als eine Höhe des Gefäßes, bevorzugt eine Höhe, die weniger als 80%, weniger als 60%, weniger als 40%, weniger als 20% oder weniger als 10%, der Höhe des Gefäßes beträgt; und/oder ii) eine Fläche am Boden des Gefäßes begrenzt, die kleiner ist als die gesamte Fläche des Bodens, bevorzugt eine Fläche, die weniger als 80%, weniger als 60%, weniger als 40%, weniger als 20% oder weniger als 10%, der Fläche des Bodens beträgt.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Gefäß ein Gefäß einer Multiwellplatte ist und die Multiwellplatte mindestens zwei Gefäße, bevorzugt mit jeweils den Merkmalen des mindestens einen Gefäßes, enthält, bevorzugt mindestens 6, mindestens 12, mindestens 24, mindestens 48 oder mindestens 96 Gefäße, bevorzugt mit den Merkmalen des mindestens einen Gefäßes, auf, wobei die Suspension besonders bevorzugt in mindestens zwei der Gefäße, insbesondere in allen Gefäße der Vorrichtung, vorliegt.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium zur Kryokonservierung i) eine wässrige Pufferlösung enthält, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zellkulturmedium, Blutserum, wässrige Lösung mindestens eines Puffers, der im pH-Bereich von 6 bis 8 Pufferwirkung zeigt, und Mischungen hiervon, wobei das Zellkulturmedium und/oder die wässrige Lösung des mindestens einen Puffers optional Blutserum enthält, und wobei die wässrige Pufferlösung bevorzugt einen pH in einem Bereich von 7.0 bis 7.4 aufweist; und/oder ii) eine kyroprotektive Substanz enthält, die bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DMSO, Glycerin, Trehalose und Mischungen hiervon; und/oder iii) biologische Zellen enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus tierischen Zellen, pflanzlichen Zellen, Mikroorganismen und Mischungen hiervon, bevorzugt ausgewählt sind aus biologischen Zellen aus einem Gewebe eines tierischen Organismus, besonders bevorzugt ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Keratinocyten, Nierenzellen, Astrocyten, Gliazellen, Cardiomyocyten, Epithelzellen, Endothelzellen, Stammzellen, Neuronen und Kombinationen hiervon, ganz besonders bevorzugt ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Ratten-Nierenzellen, HaCaT-Zellen, U373-Zellen und Kombinationen hiervon.
Verwendung der Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 14 zur i) Identifikation und/oder Analyse mindestens eines Wirkstoffs; und/oder ii) Identifikation und/oder Analyse mindestens einer toxischen Substanz; und/oder iii) Untersuchung einer Biokompatibilität; und/oder iv) Untersuchung mindestens eines Differenzierungsvorgangs der Zellen; und/oder v) Untersuchung einer metabolischen Aktivität der Zellen; und/oder vi) Identifizierung der Zellen und/oder Bestimmung von deren Qualität; wobei die Vorrichtung und/oder das mindestens eine Gefäß der Vorrichtung insbesondere vor der Messung auf eine Temperatur im Bereich von 1 ° bis 40 °C, bevorzugt 36 °C bis 38 °C, erwärmt wird.