DE60302083T2

DE60302083T2 - Ausleger-Gerät und Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen

Info

Publication number: DE60302083T2
Application number: DE60302083T
Authority: DE
Inventors: Urs Christian Hubler; Felice Mauro Battiston; Bianca Antje Hermann
Original assignee: Universitaet Basel; Concentris GmbH
Current assignee: Universitaet Basel; Concentris GmbH
Priority date: 2002-03-04
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2023-03-01
Also published as: DE60302083D1; DE10209245B4; ATE308623T1; EP1342789A3; EP1342789B1; DE10209245A1; EP1342789A2; US20030166039A1; US7129081B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet des raschen Nachweises von Mikroorganismen, d.h. von Bakterien, Pilzen, Zellen und anderen Organismen mittels Verfahren und Vorrichtungen aus der Nanotechnologie. Erfindungsgemäss werden solche Organismen, die mittels bekannter Techniken mehr oder minder schwer und zeitaufwendig nachweisbar sind, mittels mikromechanischer Sensoren nachgewiesen. Derartige Sensoren werden bereits in einer Vielzahl von Anwendungen physikalischer und chemischer Natur eingesetzt, beispielsweise auf dem Gebiet der Oberflächenuntersuchung, als chemische Sensoren oder auf dem Gebiet der Gasanalyse als "künstliche Nase".
Stand der Technik
Für die oben erwähnten Anwendungen dienen heute meist mikrofabrizierte Federbalken, sog. Cantilever, die üblicherweise einseitig an einer festen Trägerstruktur befestigt sind und am anderen Ende frei schwingen können. Die minimale Auslenkung (Verbiegung) derartiger Cantilever oder geringe Änderungen ihres Schwingungsverhaltens dienen als Indikator für die zu messende Grösse.
Prinzipiell dient also eine mechanische Änderung des Zustands und/oder Verhaltens des Cantilevers zur Detektion. Die hohe Sensitivität mikromechanischer Cantilever ist ein besonderer Vorteil, der nur schwierig mit anderen Methoden erreichbar ist. Es ist beispielsweise bekannt, einen solchen Cantilever als bimetallische Struktur auszubilden, um sehr geringe Wärmemengen nachzuweisen, die z.B. durch chemische Prozesse an der Oberfläche des Cantilevers erzeugt werden und eine minimale asymmetrische Verbiegung des Cantilevers verursachen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, geringe Veränderungen der Eigenfrequenz eines Cantilevers, bedingt z.B. durch eine Änderung der Masse, zu messen.
Bisher werden solche Sensoren in erster Linie mit einer geeigneten chemischen Beschichtung funktionalisiert, z.B. mit Polymeren, die in der Lage sind, mehr oder weniger selektiv bestimmte Moleküle zu binden oder zu adsorbieren. Die durch diese Bindung oder den Adsorptionsprozess verursachten Effekte, also beispielsweise Oberflächen-Stress, Reaktionswärme oder eine Massenänderung, führen zu einem einfach messbaren Signal. Im Prinzip macht man sich also Bindungsvorgänge an einer chemisch funktionalisierten Oberfläche für die Detektion zunutze.
Die Anwendung solcher Techniken im biologischen Bereich wurde bereits vorgeschlagen, wie an Hand der folgenden Literaturstellen illustriert werden soll:
Die wahrscheinlich früheste Erwähnung betreffend die Verwendung von mikromechanischen Cantilevern als Biosensoren findet sich in S. Prescesky et al. in "Silicon micromachining technology for sub-nanogram discrete mass resonant biosensors", Can. J. Phys. Vol. 70 (1992), pp. 1178–1183. Die Idee, Zellen auf einem Cantilever wachsen zu lassen, findet sich in dieser Veröffentlichung. Allerdings konzentriert sich das beschriebene Konzept einzig auf den Nachweis einer Massenzunahme über die Bestimmung der Resonanzfrequenz. Weder ist die Verbiegung des Cantilevers durch Oberflächen-Stress (statischer Modus), noch die Verwendung eines Nährmediums zur Funktionalisierung des Cantilevers beschrieben.
Die internationale Patentanmeldung WO 95/02180 (1993) "Calorimetric Sensor" von Ch. Gerber et al. (IBM) stellt wohl das früheste Schutzrecht für Sensoren auf der Basis mikromechanischer Cantilever dar.
In der internationalen Patentanmeldung WO 98/50773 (1997) beschreiben D. Charych et al. den Nachweis von Biomolekülen nach dem „Schlüssel-Schloss- Prinzip". Dabei sind spezielle Rezeptoren auf dem Cantilever immobilisiert, um spezifische Moleküle selektiv zu binden und so nachzuweisen.
Eine ähnliche Beschreibung des Nachweises von Molekülen über Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen findet sich in der internationalen Patentanmeldung WO 00/58729 (1999) "Micromechanical Antibody Sensors" von T. Thundat et al.
Die Detektion einzelner Bakterien über eine Antigen-Antikörper-Wechselwirkung beschreiben beispielsweise B. Ilic et al. in "Single cell detection with micromechanical oscillators", J. of Vacuum Science & Technology B, Vol. 19 (2001), pp. 2825–2828.
Mit anderen Worten basieren Anwendungen im biologischen Bereich heute in der Regel auf hochspezifischen Bindungen, z.B. auf Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen oder auf der Hybridisierung komplementärer DNA-Stränge. Diese Detektionsmethode erweist sich jedoch in mehrfacher Hinsicht als Nachteil.
Alle oben erwähnten Anordnungen und Verfahren erfordern nämlich einerseits eine hinreichend genaue Kenntnis des zu detektierenden Organismus sowie eine relativ komplexe Präparation der Cantilever-Oberfläche. Auch können derartige Messungen nur in Flüssigkeiten erfolgen, und es können direkt keine Aussagen über die biologische Aktivität, z.B. die Vermehrungsrate oder die Wirksamkeit von Medikamenten, z.B. Antibiotika, gewonnen werden.
Auf der anderen Seite erfordern klassische Methoden der Mikrobiologie oft lange Wartezeiten und eine aufwändige mikroskopische Auswertung. Modernere Methoden, wie Immuno-Assays oder die Untersuchung von DNA mittels PCR, sind im Allgemeinen komplex, zeitaufwändig und auf spezifische Stämme z.B. von Bakterien eingeschränkt. In bestimmten Fällen können sich diese Nachteile ein gravierendes Problem erweisen, z.B. in der Notfallmedizin oder Intensivpflege.
Eine weitere vergleichbare Methode beschreiben Ebersole et al. im US-Patent 5 135 852. Dort wird die Aktivität von Mikroorganismen nicht mit einem mikromechanischen Cantilever sondern mit einem piezoelektrischen Oszillator und einem Polymer nachgewiesen, welches mit bakteriellen Metaboliten chemische Komplexe bildet. Die so entstehenden Komplexe reichern sich auf dem piezoelektrischen Oszillator an und ändern seine Resonanzfrequenz. Für eine messbare Verschiebung der Frequenz zu benötigt man mindestens 10³ bis 10⁵ Mikroorganismen. Zwar ist diese Methode dazu geeignet, den Einfluss sich ändernder Bedingungen auf das Bakterienwachstum zu untersuchen, jedoch müssen sich die Bakterien weiterhin über eine längere Zeitspanne hinweg substanziell vermehren, bis ein Signal nachgewiesen werden kann. Dies führt zu einem relativ langwierigen Vorgang, und die Methode ist daher für Notfallmedizin oder Intensivpflege nicht geeignet.
Zusammenfassung der Erfindung
Das neue Verfahren gemäss dieser Erfindung macht sich einerseits die hohe Empfindlichkeit mikromechanischer Sensoren und damit die schnelle Detektionsmöglichkeit zunutze, benutzt aber andererseits im Gegensatz zum Stand der Technik nicht die Bindungsvorgänge an einer chemisch funktionalisierten Oberfläche, sondern weist einen an der Oberfläche ablaufenden biologischen Prozess nach.
Dazu wird ein auf Nährmedium benutzt, das vorzugsweise auf den zu untersuchenden Mikroorganismus abgestimmt ist und auf die Cantilever-Oberfläche aufgebracht wird. Es dient also nicht die eine chemische Reaktion nutzende "chemische" Beschichtung des Federbalkens zur Detektion, sondern sozusa gen eine "biologische" Beschichtung. Treffen lebende Organismen auf die Oberfläche des erfindungsgemäss beschichteten Cantilevers, so wird ihnen eine vorteilhafte Umgebung und damit die Möglichkeit zur Reproduktion geboten. Durch diesen natürlichen Vermehrungsprozess und den damit einhergehenden Stoffwechsel ergeben sich zwei wesentliche Änderungen an der Oberfläche des Federbalkens:

• Als Ergebnis des Stoffwechsels und/order der Vermehrung der lebenden Organismen wird die aufgebrachte Nährschicht chemisch sowie in ihrer räumlichen Struktur verändert. Dadurch ändern sich die Eigenschaften des Cantilevers und es kommt beispielsweise zu einer asymmetrischen Änderung der Oberflächensteifigkeit, einer Änderung der Federkonstante, einer Änderung des Qualitätsfaktors der mechanischen Schwingung (d.h. der Resonanzfrequenz dividiert durch die Breite der Resonanzkurve auf halber Höhe der Maximalamplitude), einer Änderung der Cantilever-Masse und/oder einer Veränderung in der Massenverteilung auf der Cantilever-Oberfläche. Alle diese Messgrössen, wie z.B. die Verbiegung des Cantilevers oder die Änderung des Schwingungsverhaltens, können mit bekannten Verfahren nachgewiesen werden, wie sie beispielsweise E. Meyer und H. Heinzelmann in „R. Wiesendanger and H.-J. Güntherodt (Editors), Scanning Tunneling Microscopy II, Springer Series in Surface Sciences, Vol. 28 (1992)" beschreiben.
• Der Stoffwechselprozess und der Austausch mit der Umgebung, z.B. die Aufnahme von O₂ oder von zusätzlichen Nährstoffen, die von aussen zugeführt werden, oder die Abgabe von CO₂ ändern die Masse und/oder die Massenverteilung auf der Cantilever-Oberfläche. Diese Änderungen führen in der Folge zu einer Verschiebung der Resonanzfrequenz des Cantilevers, welche wiederum mit bekannten Techniken bestimmt werden kann.
• Der Vermehrungsprozess der Mikroorganismen auf der Cantilever-Oberfläche verändert die mechanischen Eigenschaften des Systems Cantilever/Mikroorganismen stark. Dies führt zu einer Verbiegung des Cantilevers, z.B. bedingt durch Oberflächen-Stress, oder zu einer zu einer Verschiebung der Resonanzfrequenz des Cantilevers, z.B. bedingt durch eine Änderung der Masse, der Massenverteilung oder der Federkonstante des Cantilevers. Diese drei Effekte können auch gleichzeitig auftreten. Alle Effekte können mit bekannten Techniken einfach getrennt oder parallel gemessen werden.
• Zusätzlich kann die Wärme, welche von den Mikroorganismen während des Stoffwechsels oder während der Reproduktion erzeugt wird, eine Verbiegung des Cantilevers verursachen. Wird ein Cantilever mit einer bimorphen Struktur benutzt, kann diese Verbiegung mittels bekannter Techniken gemessen werden.

Allgemein ausgedrückt, betrifft die Erfindung eine mikromechanische Anordnung und ein entsprechendes Verfahren zur Detektion biologischer Aktivität von Mikroorganismen, insbesondere deren Stoffwechsels und/oder deren Reproduktionsaktivität, mit mindestens einem Cantilever und einer Anordnung zur Bestimmung geänderter mechanischer Cantilever-Eigenschaften. Charakteristisch für die Erfindung ist, dass auf der Oberfläche des Cantilevers ein Nährmedium angeordnet ist oder der Cantilever zumindest teilweise aus einem Nährmedium besteht. Der Cantilever kann als leicht auswechselbares Bauteil einer Anordnung ausgebildet sein, der nach Gebrauch ausgewechselt und ggf. vernichtet werden kann. Dies könnte insbesondere bei gefährlichen Mikroorganismen, z.B. Bakterien oder Pilzen hochansteckender Krankheiten, eine zweckmässige Sicherheitsmassnahme darstellen.
Neben der geometrischen Ausprägung des Cantilevers als einseitig einge spannte Blattfeder kommen zahlreiche andere Geometrien für den mikromechanischen Sensor in Frage. Diese reichen etwa von einer beidseitig eingespannten, Blattfeder-ähnlichen Struktur bis hin zu komplexeren Geometrien wie beispielsweise derjenigen einer mikrofabrizierten Torsionsfeder oder einer membran-artigen Struktur.
Eine bevorzugte Ausgestaltung besteht darin, dass eine Vorrichtung vorgesehen ist, mittels der der Mikroorganismus auf das Nährmedium vorzugsweise gezielt und in einer wohldefinierten Dosis aufgebracht werden kann.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, dass die nach oder infolge des aufgebrachten Mikroorganismus geänderten Cantilever-Eigenschaften bestimmt werden, indem die Auslenkung/Verbiegung und/oder das Schwingungsverhalten des Cantilevers ermittelt werden, und dass dafür eine zweckbestimmte Vorrichtung vorgesehen ist. Dabei kann beispielsweise die Massenänderung des Cantilevers durch Ermitteln seiner Resonanzfrequenz-Verschiebung in an sich bekannter Weise bestimmt werden. Zudem kann zur Bestimmung von strukturellen Veränderungen der Cantilever-Oberfläche die mechanische Dämpfung der Cantilever-Schwingung gemessen werden.
Änderungen der Cantilever-Eigenschaften können optisch detektiert werden, z.B. mittels Ablenkung eines Laserstrahls, oder mittels eines vom Cantilever erzeugten elektrischen Signals, z.B. bei Verwendung eines piezoresistiven Cantilevers.
Zweckmässigerweise wird das Nährmedium auf den zu untersuchenden Mikroorganismus abgestimmt, um Messungen an spezifische Organismen durchführen zu können.
Eine weitere zweckmässige Ausgestaltung besteht darin, den Zeitfaktor, der ja alle biologischen Vorgänge begleitet, in Betracht zu ziehen. Dies geschieht, indem die geänderten Cantilever-Eigenschaften zu festgelegten Zeitpunkten, die auf den zu untersuchenden Mikroorganismus abgestimmt sein können, ermittelt werden, d.h. die Messeinrichtung erst zu einem oder mehreren aufeinander folgenden Zeitpunkten nach Aufbringen des Mikroorganismus aktiviert wird. Eine andere zweckmässige Möglichkeit besteht darin, gezielt und fortlaufend den zeitlichen Verlauf der Änderung der Cantilever-Eigenschaften aufzuzeichnen und so den zeitlichen Ablauf des biologischen Prozesses genau zu verfolgen.
Eine besondere Ausgestaltung besteht in der Anordnung mehrerer Cantilever in einem Gerät, wobei die Cantilever mit unterschiedlichen Nährmedien beschichtet sein oder teilweise daraus bestehen können und der zu untersuchende Mikroorganismus auf mehrere Cantilever aufgebracht wird. Zweckmässig wird diese Mehrfach-Anordnung derart weiter ausgebildet, dass man die Vorrichtung zum Ermitteln der geänderten Cantilever-Eigenschaften ebenfalls mehrfach anordnet. Alternativ ist wenigstens eine Detektionsvorrichtung vorhanden und so ausbildet, dass sie für jeden Cantilever separat aktivierbar ist. Mittels dieser Anordnung können insbesondere zu vorherbestimmten Zeiten, insbesondere zu einem oder mehreren auf den zu untersuchenden Mikroorganismus abgestimmten Zeitpunkten, die geänderten Cantilever-Eigenschaften bestimmt werden und damit die Mikroorganismen beobachtet oder nachgewiesen werden.
In einer weiteren Ausgestaltung können die Nährmedien auf den verschiedenen Cantilevern vor oder nach dem Aufbringen der Mikroorganismen mit unterschiedlichen Wirkstoffen in Kontakt gebracht werden, beispielsweise kann das Nährmedium mit einem bestimmten Antibiotikum oder einer Wirksubstanz versetzt werden. Aus der detektierten Veränderung der Cantilever-Eigenschaften kann auf diese Weise der Effekt bestimmter Wirkstoffe auf bestimmte Mikroor ganismen rasch und zuverlässig bestimmt werden. Dies wäre beispielsweise für einen schnellen Wirksamkeitstest von Medikamenten einsetzbar, z.B. bei Antibiotika-resistenten Keimen.
In einer weiteren Ausgestaltung enthält das Nährmedium, welches auf der Cantilever-Oberfläche aufgebracht wird oder aus welchem der Cantilever mindestens teilweise besteht, nicht alle vom Mikroorganismus benötigten Nährstoffe. Die fehlenden Nährstoffe können in diesem Fall von aussen zugefügt werden, z.B. indem sie sich in einem flüssigen oder gasförmigen Medium befinden, welches den Cantilever umgibt. Dies führt zu einer Massenzunahme während des Reproduktionsprozesses der Mikroorganismen und/oder würde beispielsweise die Untersuchung von Wachstumsraten in Abhängigkeit der Konzentration bestimmter Nährstoffe erlauben. Bei Messungen in Flüssigkeiten können zusätzliche Vorkehrungen getroffen werden, um die Mikroorganismen und/oder das Nährmedium an der Cantilever-Oberfläche zu fixieren.
Eine zusätzliche Ausgestaltung kann eine Vorrichtung enthalten, welche eine präzise Kontrolle der Umgebung des Cantilever/Mikroorganismus-Systems erlaubt. Dies beinhaltet etwa die Messung und/oder Regelung von Temperatur, von relativer Luftfeuchtigkeit oder von eintretendem Licht oder Strahlung.
Weitere Ausgestaltungen der Vorrichtung und des Verfahrens gemäss der Erfindung können der folgenden Beschreibung verschiedener Anordnungen sowie den beigefügten Patentansprüchen entnommen werden.
Beschreibung der Zeichnungen
Nachfolgend soll ein bestimmtes Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert werden.
1a und 1b zeigen einen Cantilever gemäss der Erfindung;
2a und 2b stellt eine Anordnung mehrerer Cantilever dar;
3 enthält ein Blockschaltbild mit den verschiedenen Teilen einer erfindungsgemässen Anordnung;
4 zeigt eine Anordnung mit mehreren Cantilevern;
5 enthält schematische Messkurven des aus der Vermehrung von Bakterien auf dem Cantilever resultierenden Signalverlaufs.
Die 1a und 1b zeigen beispielhaft einen Cantilever zu zwei verschiedenen Zeitpunkten. Während 1a den Cantilever unmittelbar nach dem Aufbringen der Mikroorganismen, also zum Zeitpunkt t = 0, zeigt, ist in 1b der Cantilever zu sehen, nachdem eine "biologische Reaktion" stattgefunden hat, d.h. nachdem die Mikroorganismen sich vermehrt haben.
In 2a und b ist eine mögliche Anordnung mehrerer Cantilever dargestellt, die ein auswechselbares Array bilden. 2a zeigt einen Array von mit unterschiedlichen Nährmedien beschichteten Cantilevern zum Zeitpunkt t = 0, d.h. unmittelbar vor der Injektion oder dem Aufbringen (Inkubation) der Mikroorganismen. Nach einer gewissen Zeit weisen die verschieden beschichteten Cantilever unterschiedliche Auslenkungen auf, abhängig z.B. von der Beschaffenheit der Nährmedien, von ihrer Behandlung mit Wirkstoffen und/oder vom aufgebrachten Mikroorganismus. Dies ist in 2b dargestellt. So kann z.B. eine Aussage über die Art des Mikroorganismus gemacht oder die Wirksamkeit von Wirkstoffen gegen (oder für) den Mikroorganismus überprüft werden. Die gebogene Haltefeder stellt eine Möglichkeit dar, einen auswechselbaren Cantilever-Array zu fixieren.
In einem typischen Experiment würde steriler Nähr-Agar in einer Weise hergestellt, wie sie einem üblichen Lehrbuch der Mikrobiologie entnommen werden kann, oder kommerziell erhältlicher Agar (z.B. von FLUKA) käme zum Einsatz. Während sich der Agar noch in der flüssigen Phase befindet, üblicherweise oberhalb von 82°C (Grad Celsius), wird er auf den Cantilever aufgebracht. Dies geschieht etwa durch Eintauchen des Cantilevers in den flüssigen Agar oder mittels eines Spin-coating-Verfahrens. Eine typische Agarschicht auf der Cantilever-Oberfläche hat eine Dicke von wenigen Mikrometern. Insbesondere Spincoating erlaubt eine wohldefinierte Beschichtung des Cantilevers mit einem Nährmedium, d.h. die Dicke der Nährschicht kann gesteuert werden und der Nähragar kann nur auf einer Seite des Cantilevers oder sogar nur auf einem Teil der Oberfläche aufgebracht werden. Spezielle Beachtung ist der Kontaminationsfreiheit von Cantilever und Nähragar beizumessen, d.h. der Prozess muss unter sterilen Bedingungen ablaufen. Die Sterilität kann beispielsweise durch eine Beobachtung der beschichteten Cantilever über eine bestimmte Zeitspanne überprüft werden, d.h. indem die Cantilever während ungefähr zwei Tagen bei Umgebungsbedingungen oder in einem Inkubator gelagert werden. Ein typischer Mikroorganismus, der auf den Cantilever aufgebracht und beobachtet werden kann, ist das Bakterium Escherichia coli (E.coli). Dieses Bakterium ist relativ einfach in der Handhabung, wird oft für medizinische und mikrobiologische Forschung verwendet und ist als natürlich in der menschlichen Darmflora vorkommender Bakterienstamm nicht pathogen. Die Aufzeichnung der Verbiegung oder des Schwingungsverhaltens des Cantilevers erlaubt es, die Reproduktionsaktivität der E.coli Bakterien unter verschiedenen Bedingungen zu studieren, z.B. indem Temperatur, relative Luftfeuchtigkeit oder die Zusammensetzung des Nähragars kontrolliert variiert werden.
Ähnliche Experimente können mit Nährmedien für Pilze durchgeführt werden. Dies erlaubt beispielsweise das Studium des Wachstums von Hefe.
3 zeigt ein Blockschaltbild mit den verschiedenen Teilen einer erfindungsgemässen Anordnung. Der Array von Cantilevern – in der Figur zusätzlich mit einer symbolischen Andeutung eines Mechanismus zum Aufbringen der Mikroorganismen dargestellt – liefert elektrische Signale, welche die momentane Auslenkung der Cantilever messen. Diese Signale werden direkt einem Frequenzdetektor zugeführt, welcher aufbereitete Daten, vorzugsweise die aktuellen Schwingungsfrequenzen der Cantilever, einem PC zur Visualisierung und weiteren Verarbeitung zuführt. Falls notwendig, können in einem Regelkreis Signale erzeugt und für die Schwingungsanregung des Cantilevers genutzt werden.
Der Gleichspannungsanteil (DC) des Signals, z.B. das Tiefpass-gefilterte Ausgangssignal, kann zur Detektion der statischen Auslenkung des Cantilevers benutzt werden. Das DC-Signal wird ebenfalls einem PC zur Visualisierung und weiteren Verarbeitung zugeführt.
In 4 ist eine mögliche Ausgestaltung der Erfindung mit mehreren Cantilevern dargestellt. Eine Anordnung von acht Cantilevern, die nacheinander mit jeweils mit einer von acht Lichtquellen bestrahlt werden, erlaubt eine quasiparallele Auslesung von Cantilever-Auslenkung und -Resonanzfrequenz. Die Ablenkung des Lichtstrahls wird über einen positionssensitiven Photodetektor (PSD) bestimmt, dessen Ausgangssignal elektronisch verstärkt und den elektronischen Schaltungen zur Bestimmung der Frequenz und der statischen Auslenkung, d.h. der Nullpunktsposition der Schwingung, zugeführt wird. Mittels eines Computers können die so gewonnenen Daten visualisiert, ausgewertet und weiter verarbeitet werden. Neben der dargestellten optischen Auslesemethode, der sog. „Beam-deflection"-Methode sind andere optische oder elektronische Ausleseverfahren denkbar: beispielsweise stellen interferometrische oder piezoelektrische Signaldetektion bekannte Alternativen dar.
In einem Experiment mit einem Cantilever-Array würden die Cantilever typischerweise mit unterschiedlichem Nähragar beschichtet. Während ein Cantile ver mit einem „gewöhnlichen" Nähragar beschichtet ist, wie in Zusammenhang mit den 2a und 2b beschrieben, sind die anderen Cantilever mit Agarsorten beschichtet, die verschiedene Antibiotika gegen Bakterien enthalten, z.B. Ampicillin, Kanamycin oder Zeocin, die alle kommerziell erhältlich sind. Wenn der ganze Cantilever-Array, also jeder Cantilever, mit einem E.coli-Stamm in Berührung kommt, der keine Resistenz gegen Antibiotika aufweist, wachsen die Bakterien nur auf dem „gewöhnlichen" Agar. Dies zeigt sich an einer signifikanten Verbiegung dieses Cantilevers, während alle übrigen Cantilever keine Änderung ihrer Auslenkung zeigen. Wird jedoch ein E.coli-Stamm, der eine Resistenz gegen das Antibiotikum Ampicillin aufweist, auf den Cantilever-Array aufgebracht, so vermehren sich die Bakterien sowohl auf dem „gewöhnlichen" Agar als auch auf dem Agar, welcher Ampicillin enthält. Die Signatur der Cantilever, welche eine substanzielle Verbiegung aufweisen, ist damit charakteristisch für den Ampicillin-resistenten E.coli-Stamm.
Für eine mit dem Fachgebiet vertraute Person stellt es keine Schwierigkeit dar, mittels bekannter gentechnischer Methoden einen resistenten E.coli-Stamm zu züchten.
Anstelle der Verbiegung der Cantilever kann deren Schwingungsverhalten beobachtet werden. Das Bakterienwachstum ändert die Massenverteilung und/oder die Oberflächenstruktur des Cantilevers. Die Ursache hierfür ist der zweidimensionale, inhomogene Vermehrungsprozess der Bakterien; die resultierende Verschiebung der Resonanzfrequenz und/oder Veränderung des Qualitätsfaktors können für die Erkennung des Bakterienwachstums genutzt werden.
In einer klinischen Umgebung könnte dieses Verfahren in Zusammenhang mit pathogenen Bakterienstämmen eingesetzt werden, um schnell eine mögliche Antibiotika-Resistenz festzustellen und so eine unwirksame Behandlung mit falschen Antibiotika zu vermeiden.
In einem ähnlichen Experiment werden verschiedene Cantilever mit unterschiedlich zusammengesetztem Nähr-Agar beschichtet, die in einer Vielzahl kommerziell erhältlich sind (z.B. bei Merck oder Fluka). Während beispielsweise ein bestimmter E.coli-Stamm auf einem cantilever, welcher mit Plate Count Agar (d.h. auf einem Nährmedium, welches Trypton, Hefeextrakt, Dextrose und Agar enthält) beschichtet ist, gut wächst, wachsen Salmonellen z.B. auf Rambach-Agar (d.h. auf einem Nährmedium, welches Pepton, Natriumchlorid, Natrium-Deoxycholat, Propylen-Glycol und Agar-Agar enthält) besser. Der charakteristische „Fingerabdruck" unterschiedlicher Cantilever-Auslenkungen und/oder unterschiedlicher Verschiebungen der Resonanz-Frequenz kann nun benutzt werden, um den Typus des untersuchten Mikroorganismus zu bestimmen und zumindest eine teilweise Selektivität zu erreichen. Dieser Erkennungsprozess lässt sich mit Hilfe eines künstlichen neuronalen Netzwerks automatisieren, welches darauf trainiert wird, einem bestimmten „Fingerabdruck" den entsprechenden Bakterienstamm zuzuordnen.
5 schliesslich zeigt eine schematische Messkurve, welche den aus der Vermehrung von Bakterien auf dem Cantilever resultierenden Signalverlauf wiedergibt, nämlich die Resonanzfrequenzverschiebung Δf, die Veränderung des Qualitätsfaktor ΔQ (Änderung der Dämpfung) und/oder die statische Deflektion Δs. Der Qualitätsfaktor ist dabei definiert als das Verhältnis zwischen der Resonanzfrequenz und der Breite der Resonanzkurve auf Höhe der halben Maximalamplitude. Nach einer allfälligen Lag-Phase (I), in welcher sich der Mikroorganismus an die neue Umgebung gewöhnt und in welcher nur eine langsame Vermehrung und damit ein geringer Einfluss auf die gemessenen Signale vorliegt, folgt die Log-Phase (II). Für diese Phase ist die exponentielle Vermehrung des Mikroorganismus charakteristisch. Die Massenabnahme, etwa durch die Abgabe von CO₂ während der Produktion von ATP (Adenosin-Tri- Phosphat) führt zu einer Erhöhung der Resonanzfrequenz f des Cantilevers, während gleichzeitig seine statische Auslenkung (Gleichgewichtspunkt) zunimmt. Werden jedoch von aussen Nährstoffe zugeführt, nimmt die Gesamtmasse des Cantilevers zu, was – wie in 5 dargestellt – zu einer Abnahme der Resonanzfrequenz führt. Zusätzlich wird durch das lokale Wachstum der Mikroorganismen die Oberflächenstruktur inhomogen, was zu einer Abnahme des Qualitätsfaktors Q führt. Wird in der stationären Phase (III) Sättigung erreicht, treten auch keine Änderungen der gemessenen Signale mehr auf.
Die Implementierung der beschriebenen Mess-Funktionen bereitet der mit dem Fachgebiet vertrauten Person keine Schwierigkeiten. Zudem können alle Methoden, Schritte und Einrichtungen, die hier beschrieben und beansprucht werden, ohne unverhältnismässigen Aufwand durchgeführt bzw. aufgebaut werden. Zudem können die hier beschriebenen Bestandteile und deren Zusammensetzung durch chemisch oder biologisch ähnlich geartete Bestandteile und Zusammensetzungen ersetzt werden, wobei dieselben oder ähnliche Ergebnisse erzielt werden.
Auch ist für viele Teilfunktionen kommerzielle Software verfügbar. Wo dies nicht der Fall ist, kann solche Software durch eine mit dem Fachgebiet vertraute Person ohne Schwierigkeiten erstellt werden.

Claims

Mikromechanische Anordnung zur Detektion biologischer Aktivität von Mikroorganismen, insbesondere des Stoffwechsels und/oder der Reproduktionsaktivität, mit mindestens einem mikromechanischen Cantilever und einer Erkennungsvorrichtung zur Bestimmung geänderter Cantilever-Eigenschaften, dadurch gekennzeichnet, dass • der Cantilever aus einem Nährmedium besteht oder mindestens ein Teil seiner Oberfläche mit einem Nährmedium bedeckt ist, • eine Vorrichtung vorgesehen ist, um den Mikroorganismus in Kontakt mit dem Nährmedium zu bringen und • die Erkennungsvorrichtung eine geänderte Eigenschaft des Cantilevers ermittelt, die in Beziehung zur biologischen Aktivität des Mikroorganismus steht.
Mikromechanische Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsvorrichtung die Auslenkung und/oder das Schwingungsverhaltens des Cantilevers nach oder als Folge des aufgebrachten Mikroorganismus bestimmt.
Mikromechanische Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsvorrichtung das Schwingungsverhaltens des Cantilevers bestimmt, indem mindestens eine der folgenden Grössen gemessen wird: (a) die Verschiebung der Resonanzfrequenz; (b) die mechanische Dämpfung der Resonanzamplitude; (c) die Phasenverschiebung zwischen der Anregung und der Oszillation des Cantilevers.
Mikromechanische Anordnung nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsvorrichtung eine Lichtquelle und einen Detektor zur Bestimmung der Position eines von der Cantilever-Oberfläche reflektierten Lichtstrahls und/oder eine interferometrische Detektionsvorrichtung enthält.
Mikromechanische Anordnung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsvorrichtung eine Vorrichtung zur Ermittlung einer elektrischen Eigenschaft enthält, insbesondere einer Änderung des elektrischen Widerstandes oder der Dielektrizitätskonstante des Cantilevers oder des Nährmediums.
Mikromechanische Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zum Aufbringen eines Mikroorganismus eine Dosiereinrichtung umfasst, mit der Mikroorganismus gezielt und/oder in einer vorbestimmte Menge auf das Nährmedium aufgebracht werden kann.
Mikromechanische Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium auf den zu untersuchenden Mikroorganismus abgestimmt ist und/oder Wirkstoffe, insbesondere Medikamente, für oder gegen den zu untersuchenden Mikroorganismus enthält.
Mikromechanische Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium auf oder im Cantilever einen notwendigen Nährstoff nicht enthält und dieser fehlende notwendige Nährstoff von aussen zur Verfü gung gestellt wird.
Mikromechanische Anordnung nach Anspruch 1, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass eine Zeitmesseinrichtung vorgesehen ist, welche die Messeinrichtung an einem oder mehreren vorbestimmten, insbesondere auf den zu untersuchenden Mikroorganismus abgestimmten Zeitpunkten, aktiviert.
Mikromechanische Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitmesseinrichtung so angepasst ist, dass sie kontinuierlich aktiv ist und eine kontinuierliche Bestimmung einer Cantilever-Eigenschaft erlaubt.
Mikromechanische Anordnung Anspruch 1 mit mehreren Cantilevern, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Cantilever mit einem Nährmedium und/oder einer Wirksubstanz beschichtet ist oder mindestens teilweise aus einem Nährmedium und/oder einem Wirkstoff besteht, wobei dieses Nährmedium und/oder dieser Wirkstoff sich vom Nährmedium und/oder vom Wirkstoff auf mindestens einem der übrigen Cantilever unterscheidet, und/oder die Vorrichtung zum Aufbringen der Mikroorganismen so angepasst ist, dass die untersuchten Mikroorganismen auf mehr als einem Cantilever aufgebracht werden können.
Mikromechanische Anordnung Anspruch 11, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsvorrichtung mehrfach angeordnet ist, vorzugsweise so, dass sie für jeden Cantilever separat aktivierbar ist.
Verfahren zur Detektion biologischer Aktivität von Mikroorganismen, insbe sondere des Stoffwechsels und/oder der Reproduktion von Mikroorganismen, mittels einer mikromechanischen Anordnung mit mindestens einem Cantilever und Vorrichtung zur Bestimmung einer geänderten Cantilever-Eigenschaft, dadurch gekennzeichnet, dass (a) der Mikroorganismus auf ein Nährmedium aufgebracht wird, welches sich auf oder in dem Cantilever befindet oder aus dem der Cantilever zumindest teilweise besteht; (b) der Mikroorganismus mit dem Nährmedium wechselwirkt; (c) mindestens eine geänderte Eigenschaft des Cantilevers bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus gezielt und dosiert auf das Nährmedium aufgebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung einer Cantilever-Eigenschaft infolge des aufgebrachten Mikroorganismus aus der Auslenkung und/oder der Änderung des Schwingungsverhaltens des Cantilevers bestimmt wird, in letzterem Falle durch die Messung mindestens einer der folgenden Grössen: (a) Verschiebung der Resonanzfrequenz; (b) mechanische Dämpfung der Schwingungsamplitude; (c) Phasenverschiebung zwischen der Anregung und der Oszillation des Cantilevers.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung einer Eigenschaft des Cantilevers mittels der Bewegung eines von der Cantilever-Oberfläche reflektierten Lichtstrahls und/oder mittels der Interferenz zwischen einem Referenz-Lichtstrahl und einem von der Cantilever-Oberfläche reflektierten Lichtstrahl bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Änderung einer Eigenschaft des Cantilevers aus der Änderung der elektrischen Eigenschaften des Cantilevers bestimmt wird, insbesondere aus der Änderung des Widerstands oder der Dielektrizitätskonstanten des Cantilevers oder des Nährmediums auf dem Cantilever.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium auf oder in dem Cantilever auf den zu untersuchenden Mikroorganismus abgestimmt ist, insbesondere dadurch, dass ein für den Mikroorganismus notwendiger Nährstoff fehlt und dieser notwendige Nährstoff von aussen zugeführt wird.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass eine geänderte Eigenschaft des Cantilevers zu einem oder mehreren vorbestimmten Zeitpunkten, insbesondere zu auf den zu untersuchenden Mikroorganismus abgestimmten Zeitpunkten, und/oder kontinuierlich bestimmt wird.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 19 basierend auf einer mikromechanischen Anordnung mit mehreren Cantilevern, dadurch gekennzeichnet, dass die Cantilever mit unterschiedlichen Nährmedien beschichtet sind oder mindestens teilweise daraus bestehen und die Mikroorganismen auf mehr als einen Cantilever aufgebracht werden und bevorzugt die Eigenschaft eines Cantilevers für jeden Cantilever einzeln und/oder zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Aufbringen des Mikroorganismus bestimmt wird.
Eine Sensoranordnung für eine mikromechanische Vorrichtung zur Detektion biologischer Aktivität von Mikroorganismen, insbesondere von deren Stoffwechsel und/oder Reproduktionsaktivität, mit mindestens einem mikromechanischen Cantilever und einer Erkennungsvorrichtung zur Bestimmung einer geänderten Eigenschaft des Cantilevers, dadurch gekennzeichnet, dass • der Cantilevers aus einem Nährmedium besteht oder mindestens ein Teil seiner Oberfläche mit einem Nährmedium bedeckt ist, wobei das Medium mit dem Mikroorganismus in Kontakt kommen kann, und • die Erkennungsvorrichtung so gestaltet ist, dass eine geänderte Eigenschaft des Cantilevers ermittelt wird, die nach oder infolge einer Wechselwirkung und/oder des Kontakts des Mikroorganismus mit dem Nährmedium auftritt.
Sensoranordnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsvorrichtung die Auslenkung und/oder das Schwingungsverhaltens des Cantilevers nach oder in Folge einer Wechselwirkung und/oder des Kontakts des Mikroorganismus mit dem Nährmedium bestimmt.
Sensoranordnung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsvorrichtung das Schwingungsverhaltens des Cantilevers bestimmt, indem sie mindestens eine der folgenden Grössen misst: (a) die Verschiebung der Resonanzfrequenz; (b) die mechanische Dämpfung der Resonanzamplitude; (c) die Phasenverschiebung zwischen Anregung und Oszillation des Cantilevers.
Sensoranordnung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsvorrichtung eine Lichtquelle und einen Detektor zur Bestimmung der Position eines von der Cantilever-Oberfläche reflektierten Lichtstrahls und/oder eine interferometrische Detektionsvorrichtung enthält.
Sensoranordnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium auf den untersuchten Mikroorganismus abgestimmt ist und/oder Wirksubstanzen, insbesondere Medikamente, für oder gegen den Mikroorganismus enthält.
Sensoranordnung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass dem Nährmedium ein notwendiger Nährstoff fehlt und dieser fehlende notwendige Nährstoff von aussen zugeführt wird.
Ein mikromechanischer Cantilever für eine Vorrichtung zur Detektion biologischer Aktivität von Mikroorganismen, insbesondere von deren Stoffwechsel und/oder Reproduktionsaktivität, mit mindestens einem mikromechanischen Cantilever und einer Erkennungsvorrichtung zur Bestimmung einer geänderten Eigenschaft des Cantilevers, dadurch gekennzeichnet, dass • der Cantilever aus einem Nährmedium besteht oder mindestens ein Teil seiner Oberfläche mit einem Nährmedium bedeckt ist, • die biologische Aktivität zu einer messbaren Änderung einer Eigenschaften des Cantilevers führt, die in Zusammenhang mit der biologischen Aktivität steht.
Mikromechanischer Cantilever nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium an den zu untersuchenden Mikroorganismus angepasst ist und/oder Wirksubstanzen, insbesondere Medikamente, enthält, welche sich auf den Mikroorganismus auswirken.
Mikromechanischer Cantilever nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass dem Nährmedium ein notwendiger Nährstoff fehlt und dieser fehlende, notwendige Nährstoff von aussen zugeführt wird.
Mikromechanischer Cantilever nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die messbare Veränderung das Schwingungsverhalten des Cantilevers ist, insbesondere eine der folgenden Eigenschaften: (a) die Verschiebung der Resonanzfrequenz; (b) die mechanische Dämpfung der Schwingungsamplitude; und/oder (c) die Phasenverschiebung zwischen der Anregung und der Oszillation des Cantilevers.