DE102016224865B3

DE102016224865B3 - Bipolare Elektrode zur impedimetrischen Untersuchung und Manipulation lebender Zellen in vitro

Info

Publication number: DE102016224865B3
Application number: DE102016224865.0A
Authority: DE
Inventors: Christian Götz; Joachim Wegener
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Universitaet Regensburg
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Universitaet Regensburg
Priority date: 2016-12-13
Filing date: 2016-12-13
Publication date: 2018-05-03
Anticipated expiration: 2036-12-14
Also published as: DE102016224865B8; US20180164238A1; US10895546B2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Messvorrichtung mit einer bipolaren Elektrodenanordnung zur impedimetrischen Analyse adhärenter Zellen nach dem ECIS-Prinzip (engl. electric cell-substrate impedance sensing, ECIS). Die Messvorrichtung umfasst eine Elektrodenanordnung (100), die zur Benetzung mit einer Elektrolytlösung und zum adhärenten Wachsen von Zellen angepasst ist, angepasst ist, um impedimetrische Zellanalysen durchzuführen, die dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrodenanordnung (100) eine Bipolarelektrode auf einem Substrat umfasst, wobei die Bipolarelektrode (10) als leitfähiger Pfad auf dem transparenten Substrat ausgebildet ist und einen Eigenwiderstand zwischen zwei Anschlusspunkten (10A, 10B) des leitfähigen Pfads aufweist, der ein Vielfaches der Wechselstromimpedanz der Elektrolytlösung bei 1 MHz, gemessen an den zwei Anschlusspunkten (10A, 10B), ist.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Messvorrichtungen und deren Komponenten zur Verwendung für die Impedanzmessung an adhärenten Zellen, die auf elektrisch leitenden Substraten (Elektroden) kultiviert werden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Elektrodenanordnung, eine Messvorrichtung, die diese Elektrodenanordnung verwendet und verschiedene Verwendungen dieser Elektrodenanordnung.
Stand der Technik
Eine elektrische Impedanzmessung von Zellen, die auf elektrisch leitfähigen Substraten (Elektroden) adhärent wachsen und auf die im Folgenden als ECIS (engl. electric cell-substrate impedance sensing, ECIS) Bezug genommen wird, ist bekannt als ein markierungsfreies (label free), impedanz-basiertes Echtzeitverfahren zur Untersuchung der Aktivität lebender Zellen in vitro, d.h. außerhalb eines lebenden Organismus in einer kontrollierten Laborumgebung gewachsene Zellkulturen. Das Verfahren basiert darauf, Zellen auf einer planaren Goldfilmelektrode z.B. in einer Petrischale zu kultivieren. Die Impedanz zwischen der zellbedeckten Goldfilmelektrode und einer Gegenelektrode wird bei einer oder bei mehreren Frequenzen als Funktion der Zeit gemessen. Durch die zeit- und frequenzaufgelöste Impedanzmessung können Wachstum des Zellrasens, Zellformänderungen, Änderungen der Durchlässigkeit der Zellmembran etc. erfasst werden. Dies kann beispielsweise beim Wirkstoff- und Zytotoxizitätsscreening verwendet werden. Weiterhin können die Zellen mit den Elektroden auch manipuliert werden. Durch Beaufschlagen von Spannungspulsen können die Zellen perforiert werden, um die Permeabilität der Zellmembran für bestimmte Stoffe/Medikamente zu erhöhen, so dass die Zellreaktion unter Einfluss dieser Stoffe impedimetrisch und/oder optisch beobachtet werden kann. Zur optischen Messung wird auf Grund der undurchsichtigen Goldfilmelektrode üblicherweise ein Fluoreszenzmikroskop mit aufrechtem Stativ und wasserdichtem Immersionsobjektiv verwendet. Bei geeigneten Spannungspulsen können die Zellen auf der Elektrode auch abgetötet werden, um die Regeneration/Heilung der Schäden nachfolgend zu untersuchen.
ECIS ist mit einigen technischen Limitierungen behaftet, die im Stand der Technik unzureichend gelöst wurden. Im Folgenden werden diese Probleme und deren derzeitige Lösungen skizziert.
Impedanzanalyse
Zur impedimetrischen Untersuchung lebender, adhärenter Zellen (engl. electric cell-substrate impedance sensing, ECIS) werden in der Regel zwei coplanare Goldfilmelektroden verwendet, zwischen denen eine konstante Wechselspannung angelegt wird. Ein Beispiel zu dem Verfahren und der Vorrichtung findet man beispielsweise bei Wegener, J. „Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) as a Noninvasive Means to Monitor the Kinetics of Cell Spreading to Artificial Surfaces", erschienen in Exp. Cell Res. 259, 158-166 (2000). Eine niedrige Amplitude der eingesetzten Spannungen und Ströme garantiert, dass die Messung selbst keinen Einfluss auf die Zellen hat. Der Strom fließt von einer Elektrode durch die Zellschicht über den Elektrolyten zur Gegenelektrode. In der Regel werden eine kleine Arbeitselektrode und eine wesentlich größere Gegenelektrode oder aber zwei gleich große Arbeitselektroden verwendet, damit das Messsignal bestmöglich durch die Zellschicht bestimmt ist.
1A zeigt als Beispiel einer ECIS-Messung nach Stand der Technik das Impedanzspektrum von MDCK-II-Zellen (Madin-Darby canine kidney epithelial cells) mit Elektrode und Gegenelektrode aus Goldfilmen. Der niederfrequente Bereich wird nur durch die Grenzflächenkapazität der Elektroden bestimmt und enthält wenig analytisch relevante Informationen.
1B zeigt ein vereinfachtes Ersatzschaltbild einer Zellschicht auf einer solchen Elektrodenanordnung. R(cell) bezeichnet den Widerstand der Zellschicht, C(cell) bezeichnet die Kapazität der Zellschicht, C(el) bezeichnet die Grenzflächenkapazität der Elektrode und R(bulk) bezeichnet den Elektrolytwiderstand.
Durch die Grenzflächenkapazität der Elektrode ergibt sich ein typisches Frequenzspektrum mit ansteigender Impedanz zu niedrigeren Frequenzen (s. 1A). Dort unterscheiden sich die Spektren der zellfreien und zellbedeckten Elektroden kaum und die Impedanz ist überwiegend durch die Kapazität an dieser Grenzfläche bestimmt. Wie nachfolgend beschrieben wird, werden derzeit unter Anderem aus messtechnischen Gründen keine analytisch relevanten Informationen gewonnen. Bei Frequenzen unter 10 Hz können abhängig von der Elektrodengröße Impedanzwerte von über 10⁷ Ω erreicht werden. Bei diesen Impedanzwerten sind durch die Verwendung nur kleiner Spannunsamplituden die Stromstärken entsprechend niedrig. Diese niedrigen Stromstärken können nur mit sehr präzisen und teuren Messgeräten verlässlich aufgelöst werden, so dass Frequenzspektren mit kommerziellen Geräten bei kleinen Frequenzen oft starkes Rauschen zeigen.
Bislang wurden niedrige Frequenzen unter 100 Hz kaum zur Untersuchung der Zellschicht herangezogen und finden stattdessen ihren hauptsächlichen Nutzen in der Beschreibung der elektrochemischen Parameter der zellfreien Elektrode, die zur Gesamtbeschreibung des Systems erforderlich ist. Da dieser niedrigen Frequenzbereich wegen der hohen Lastimpedanzen sehr störanfällig und verrauscht ist, wird dieser Teil der Analyse oft vernachlässigt oder mit Näherungsverfahren umgangen. Zum Beispiel werden die Impedanzspektren in diesem Frequenzbereich entweder gar nicht gemessen oder aber die Messung der Spektren beginnt erst bei 10 oder 25 Hz, so dass ein Rauschen bei kleineren Frequenzen umgangen wird. Kommerziell sind die nachfolgend gelisteten Firmen die wesentlichen Anbieter von Messsystemen zur impedimetrischen Analyse adhärenter Zellen: Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY: www.biophysics.com), Acea Bioscience Inc. (San Diego, CA: www.aceabio.com), nanoAnalytics GmbH (Münster, www.nanoanalytics.de) und nanion (München, www.nanion.de).
Als Elektrodenmaterial wird bislang nahezu ausschließlich Gold verwendet, das sich wegen (i) seiner chemischen Inertheit, (ii) der herausragenden Biokompatibilität, (iii) der gut entwickelten nasschemischen Lithographie und nicht zuletzt wegen (iv) der guten elektrochemischen Beschreibbarkeit am besten eignet. Die Schichtdicken der Goldelektroden sind mit > 100 nm bei impedimetrischen Messungen groß genug, um ihren Eigenwiderstand vernachlässigen zu können. Die große Dicke der Goldfilmelektroden trägt zu einem signifikanten Teil sowohl zu den Produktionskosten der Goldelektroden bei als auch zu ihrer erschwerten Nutzung bei der gleichzeitigen mikroskopischen Untersuchung der Zellen auf den Elektroden.
Zusammengefasst heißt das, dass die Elektrodenanordnung nach dem Stand der Technik in kommerziellen Messsystemen teuer und im Hinblick auf simultane optische Zellbeobachtung limitierend ist. Weiterhin sind die derzeitig eingesetzten Elektrodenanordnungen einer impedanzspektroskopischen Charakterisierung bei niedrigen Frequenzen nur schwer zugänglich.
Temperaturmessung
ECIS-Messungen dienen der Untersuchung lebender Säugetierzellen und müssen deshalb in einem Inkubator bei konstanten 37 °C durchgeführt werden. Beim Wechseln des Kulturmediums (Nährlösung) oder bei der Zugabe einer Substanz, deren Einfluss auf die Zellen untersucht werden soll, muss der Inkubator jedoch in der Regel geöffnet werden, so dass ein Wärmeaustausch mit der Umgebung stattfindet. Auch hat die zugegebene Lösung oft selbst nach Vorwärmen nicht exakt 37 °C, da sie beispielsweise durch die kühlere Pipettenspitze wieder etwas abgekühlt sein kann. Derartige Temperaturschwankungen schlagen sich im Messergebnis nieder, können Einfluss auf die Zellantwort haben und müssen daher bei der Auswertung berücksichtigt werden.
Temperaturmessungen in der unmittelbaren Mikro-Umgebung der untersuchten Zellen sind im Zusammenhang mit der Impedanz-basierten Zellanalyse bislang nicht bekannt. In der Regel wird die Temperatur am Inkubator eingestellt und dann bis zur Einstellung des Gleichgewichts gewartet. Lediglich der Elektrolytwiderstand (Impedanz bei sehr hohen Frequenzen) kann näherungsweise zum Temperatur - Monitoring herangezogen werden. Durch Vorwärmen der zu untersuchenden Lösungen und möglichst kurze Zeitspannen, in denen der Inkubator bei der Zugabe geöffnet ist, soll der Temperatureinfluss auf den Ausgang der Messung möglichst gering gehalten werden. Bekannt sind aber resistive Temperatursensoren, die in mikrofluidischen Chips integriert sind und zur Temperaturmessung separat angesteuert werden müssen. Solche Widerstandsthermometer, wie z.B. der Platin-Messwiderstand Pt1000 werden wegen ihrer linearen Temperaturabhängigkeit auch industriell verwendet.
Zusammengefasst heißt das, dass bei der konventionellen, Impedanz-basierten Analyse adhärenter Zellen Temperatureffekte derzeit kaum angemessen berücksichtigt werden können. Lösungsansätze mit On-Chip Temperatursensoren erfordern jedoch zusätzlichen Herstellungsaufwand für zusätzliche Strukturen auf den mit der Elektrodenanordnung funktionalisierten Wachstumsoberfläche, die oft als einmalig zu verwendende Wegwerfartikel konzipiert sind. Dieser Lösungsansatz einer separaten Einbindung von Temperatursensoren würde deshalb zu höheren Herstellungskosten führen.
Elektroporation und elektrische Verwundung
Ein weiterer Anwendungsbereich, der sich aus der Kultur adhärenter Zellen auf Goldfilmelektroden ergibt, ist die Elektroporation von Zellmembranen. Die Membranen lebender Zellen bilden eine selektive, semi-permeable Membran und verhindern das Ein- und Ausdiffundieren von zu großen und hydrophilen Molekülen und Ionen. In vielen Bereichen der Zellbiologie und biomedizinischen Forschung sind aber häufig Anwendungen gefragt, in denen gerade solche nicht membrangängigen Moleküle wie Peptide, Antikörper, Nukleinsäuren, Pharmazeutika oder Fluoreszenzfarbstoffe zur molekularen Erkennung in die Zelle eingebracht werden sollen. Bei der Elektroporation werden kurze Spannungspulse mit genügend hoher Amplitude und Pulsdauer gesetzt, um die Zellen reversibel für ein bestimmtes Molekül zu permeabilisieren. Dabei müssen die entsprechenden Randbedingungen wie die Konzentration der einzutragenden Moleküle, die Pulsdauer, die Anzahl der Pulse und die Pulsamplitude dem jeweiligen Zelltyp und Molekül angepasst werden. Aufgrund der Vielzahl an Parametern kann die Optimierung sehr viel Zeit in Anspruch nehmen.
Werden statt kurzen Spannungspulsen im Millisekundenbereich die gleichen Amplituden über einen längeren Zeitraum (10 - 180 s) angelegt, werden die Zellen auf der Elektrode irreversibel permeabilisiert und damit abgetötet. Daraufhin kann zeitabhängig die Regeneration der Zellschicht durch die Änderung des impedimetrischen Signals verfolgt werden. Diese sogenannten Wundheilungsassays sind von den gleichen Parametern abhängig wie die Elektroporation und bedürfen auch aufwändigen Optimierungsschritten.
Die Optimierung von Elektroporation oder Verwundung mit verschiedenen diskreten Parametern-Kombinationen erfolgt in der Regel sukzessive, jeweils in einem einzelnen sogenannten „Wells“ von beispielsweise Mikrotiterplatten. Die Zellantwort kann durch eine darauffolgende Impedanzmessung ausgelesen werden, während der Grad der Beladung mit einem Fluoreszenzfarbstoff fluoreszenzmikroskopisch bestimmt wird. Aufgrund der Vielzahl an Parametern kann eine Elektroporationsmethode, bei der in einem einzigen Experiment in einer Messkammer mit verschiedenen Amplituden gepulst werden kann, einen enormen zeitlichen Vorteil einbringen. Versuche, die Optimierung der Elektroporation über Spannungsgradienten zu beschleunigen finden sich bereits in der Literatur, beispielsweise bei Granot, Y. & Rubinskv, B. in „Methods of optimization of electrical impedance tomography for imaging tissue electroporation", publiziert in Physiol. Meas. 28, 1135-1147 (2007). Dieses Dokument offenbart Imaging und mathematisches Modellieren des elektrischen Feldes um zwei Elektroden während der Elektroporation. Diese Methode kann die laterale elektrische Leitfähigkeit der Zellen in einem Gewebeverband zweidimensional auflösen, ist aber sehr aufwändig und benötigt eine Vielzahl von Elektroden für das Imaging. Mikroskopische Untersuchungen sind hier nicht möglich.
Kim, J. A. et al. beschreibt in dem Artikel „A multi-channel electroporation microchip for gene transfection in mammalian cells", erschienen bei Biosens. Bioelectron. 22, 3273-3277 (2007) die Verwendung paralleler mikrofluidischer Kanäle unterschiedlicher Länge, so dass bei Anlegen einer Spannung zwischen Ein- und Ausgang unterschiedliche elektrische Feldstärken generiert werden. Hierbei befinden sich die Zellen aber suspendiert in der Lösung und nicht auf dem Substrat.
Wu, M. et al. beschreiben in dem Artikel „Method for Electric Parametric Characterization and Optimization of Electroporation on a Chip", erschienen bei Anal. Chem. 85, 4483-4491 (2013) spezielle Elektrodenstrukturen, die einen Spannungsgradienten zwischen zwei Elektroden erzeugen.
Die beiden letztgenannten Techniken sind auf die Durchführung der Elektroporation beschränkt, bieten aber keine integrierte Option zur Analytik und können insbesondere nicht mit impedimetrischen Messungen kombiniert werden. Alle genannten Methoden haben den Nachteil, dass sehr hohe Gleichspannungen von mehreren hundert Volt für die Elektroporation verwendet werden, wobei üblicherweise in physiologischen Puffern elektrochemisch reaktive und cytotoxische molekulare Spezies an der Elektrodenoberfläche generiert werden.
Fluoreszenzmikroskopie
Oft ist bei zellbiologischen Anwendungen eine parallel durchzuführende fluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Zellen auf einer Elektrode gefragt, etwa wenn fluoreszente Marker bei der Elektroporation in die Zelle eingebracht wurden. Die gängigen Dicken der Goldfilmelektroden von 50 bis 100 nm sind aber zu dick für die in der Zellbiologie zumeist verwendeten, sehr vorteilhaften inversen Mikroskope und weisen eine zu geringe Transmission bei den relevanten Wellenlängen auf. Das relativ wenig intensive Fluoreszenzlicht kann die Goldfilme nicht durchdringen, so dass üblicherweise mit aufrechten Mikroskopen gearbeitet werden muss. Aufrechte Mikroskope lassen jedoch nur mit Aufwand einen kleinen Arbeitsabstand zum Objekt zu und bedürfen dafür besonderer Tauchobjektive. Grundsätzlich ist der Einsatz der Durchlichtmikroskopie wegen der geringen Transparenz der gängigen Goldfilmelektroden ebenfalls nur sehr eingeschränkt möglich.
Da die Detektion von Fluoreszenzlicht aufgrund der wenig transparenten Goldschicht nicht von unten erfolgen kann, müssen aufrechte Mikroskope verwendet werden. Um mit dem Objektiv nahe genug an die Zellschicht heranzukommen, ist es daher nötig, zuerst die Kammer des Elektrodenarrays zu entfernen. Dies ist sehr aufwändig und birgt die Gefahr der Zerstörung der Zellschicht oder einer sonstigen Beeinträchtigung der Messung. Alternativ wurde in der Literatur schon die Verwendung des elektrisch leitfahigen und in dünnen Schichten lichtdurchlässige Materials Indiumzinnoxid (Indium Tin Oxide = ITO) als Elektrodenmaterial beschrieben. ITO wird allerdings aufgrund seiner Seltenheit zunehmend teurer und korrodiert leichter als Gold, was vor allem bei den für die Elektroporation nötigen höheren Spannungsamplituden relevant wird.
Mit der vorliegenden Erfindung werden eine oder mehrere der oben ausgeführten Limitierungen behoben. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung bereitzustellen, mit der auf einfache Weise elektrische (impedimetrische) Untersuchungen an adhärenten Zellen bei gleichzeitiger Erfassung der Temperatur im Messmedium möglich sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, eine Vorrichtung bereitzustellen, mit der gleichzeitig elektrische (impedimetrische) und optische (mikroskopische) Untersuchungen möglich sind und die den Einsatz inverser Mikroskope, die sich von der Rückseite des Zellkulturträgers, d.h. auf der trockenen Seite,dem Objekt annähern, erlauben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die oben genannte Aufgabe wird durch eine bipolare Elektrodenanordnung gemäß Anspruch 1 gelöst.
Insbesondere wird die Aufgabe durch einebipolare Elektrodenanordnung gelöst, die zur Benetzung mit einer Elektrolytlösung und zum adhärenten Wachsen von Zellen angepasst ist, um impedimetrische Zellanalysen durchzuführen, die dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrodenanordnung eine Bipolarelektrode (10) auf einem Substrat umfasst, wobei die Bipolarelektrode (10) als leitfähiger Pfad (10) auf dem transparenten Substrat ausgebildet ist, der einen Eigenwiderstand zwischen zwei Anschlusspunkten (10A, 10B) des leitfähigen Pfads aufweist, der ein Vielfaches der Wechselstromimpedanz der Elektrolytlösung bei 1 MHz, gemessen an den zwei Anschlusspunkten (10A, 10B), ist.
Bei einer Bipolarelektrode befinden sich aufgrund des relativ hohen Eigenwiderstands der Bipolarelektrode Anode und Kathode gleichzeitig in einem kontinuierlichen leitfähigen Film. Der für die Funktionalität notwendige, hohe Eigenwiderstand des kontinuierlichen leitfähigen Films wird durch die Verwendung sehr dünner und damit transparenter Schichten als Elektroden möglich. Die Temperaturabhängigkeit des Eigenwiderstandes dieser bipolaren Elektroden ermöglichen die Bestimmung der Temperatur direkt unter der Zellschicht gleichzeitig während der impedimetrische Untersuchungen an den Zellen. Diese Methode birgt daher die Möglichkeit, Temperatureffekte herauszurechnen. Weiterhin kann durch Einstellen des Widerstands und der Form der Bipolarelektrode die Elektrodenanordnung an unterschiedliche Messumstände, beispielsweise Zelltyp, Elektrolyttyp, interessierender Frequenzbereich bei der Impedanzspektroskopie, etc. und an das Untersuchungsziel, wie beispielsweise Zellwachstum, Wundheilung, Ermitteln der optimalen Elektroporationsspannung etc. angepasst werden.
In einer Ausführungsform sind das Substrat und der leitfähige Pfad zumindest in einem Messbereich, der für adhärente Zellen vorgesehen ist, transparent.
Wird eine derartige Elektrodenanordung (Bipolarelektrode) auf einem optisch transparenten Substrat (z.B. Objektträger, Deckgläschen) generiert, sind die Zellkulturen, die auf dem kontinuierlichen leitfähigen Film (Bipolarelektrode) wachsen, von der trockenen Rückseite des Substrates (Objektträger, Deckgläschen) einer Durchlichtmikrospie sowie einer inversen Fluoreszenzmikroskopie zugänglich.
In einer Ausführungsform ist die Bipolarelektrode eine Filmelektrode aus Gold, Indium-Zinn-Oxid (ITO, Indium tin oxide), leitfähigen Polymeren wie beispielsweise Polyanilin, Polypyrrol, Polythiophen, PEDOT oder deren dotierte und/oder chemisch modifizierten Varianten.
Als transparentes Substrat sind Materialien wie Glas, Polykarbonat, Polyethylen, Terephthalat (PET), Polyethylennaphthalat (PEN) oder eine poröse Membran, beispielsweise aus einem biokompatiblen Kunststoff, geeignet.
Die genannten Materialien für das transparente Substrat und die Bipolarelektrode sind bei den erforderlichen Dicken sowohl transparent als auch biokompatibel zu lebenden Zellen, an denen die Untersuchungen durchgeführt werden sollen.
Alternative kann die poröse Membran nicht-transparent sein, wenn eine mikroskopische Durchlichtuntersuchung nicht erforderlich ist, beispielsweise wenn nur impedimetrisch untersucht werden soll, wie sich die adhärenten Zellen verhalten, wenn sie vorwiegend von der Rückseite des Substrats durch die Poren oder auch beidseitig mit Nährstoffen und/oder Wirkstoffen versorgt werden.
In einer besonderen Ausführungsform ist die Bipolarelektrode ein Goldfilm mit einer Schichtdichte im Bereich von 10 nm bis 30 nm, vorzugsweise im Bereich von 20 nm ± 2 nm. Gold ist bei einer Schichtdicke im Bereich von 20 nm optisch transparent, chemisch inert und nahezu ideal polarisierbar, d.h. an der Goldoberfläche findet kein Ladungsübertritt statt. Weiterhin ist Gold leicht zu strukturieren mit bekannten lithographischen Verfahren und mit Self-Assembly Techniken zu funktionalisieren.
In einer Ausführungsform weist die Bipolarelektrode einen Eigenwiderstand von mindestens 300 Ohm, bevorzugt mindestens 600 Ohm, noch bevorzugter mindestens 1200 Ohm auf. Der hohe Eigenwiderstand führt zu einem graduellen Spannungsabfall zwischen unterschiedlichen Punkten der Elektrode, so dass eine bipolare Elektrode, bei der gleichzeitig Anode und Kathode auf dem kontinuierlichen Film vorhanden sind, entsteht. Weiterhin können Versuchsanordnungen konzipiert werden, bei denen durch den Spannungsgradienten entlang des Filmes gleichzeitig Versuche mit verschiedenen Spannungen durchgeführt werden. Dadurch können Versuche zeiteffizienter durchgeführt werden.
Diese Werte gelten jedoch nur für bestimmte Ausführungsformen mit stark transparenten Elektroden. Es sind auch andere Ausführungsformen denkbar, bei denen auch kleinere Eigenwiderstände ausreichend sind, bei denen dann sich zunehmend die Transparenz verringert, aber eine Messung nach wie vor möglich ist.
In einer weiteren Ausführungsform weist die Bipolarelektrode mindestens einen langgestreckten schmalen Bereich mit einer Länge, die mindestens dem 10-fachen der Breite entspricht, auf. Durch die Verringerung des Querschnitts lässt sich ein erforderlicher Widerstandswert erreichen. Der langgestreckte schmale Bereich kann in besonderen Ausführungsformen je nach Anwendung in U-Form, L-Form oder mäanderförmig ausgebildet sein. Durch die Ausbildung in U-Form, L-Form oder Mäander-Form lassen sich auch sehr langgestreckte schmale Bereiche auf einem Chip platzsparend anordnen.
In einer weiteren Ausführungsform weist die Bipolarelektrode mindestens einen flächigen Bereich auf, der eine Länge aufweist, die weniger als das 10-fache der Breite entspricht. Mit den großflächigen Bereichen lassen sich auch größere Bereiche mit näherungsweise konstantem Potential realisieren, mit denen das Impedanzsignal über eine größere Fläche integriert wird, beispielsweise zum Monitoring des Wachstums eines Biofilms. In Kombination mit einem langgestreckten schmalen Bereich der Bipolarelektrode kann der flächige Bereich auch als Gegenelektrode mit konstantem Potential dienen gegenüber mehreren Messbereichen auf dem langgestreckten schmalen Bereich, bei denen die Zellen je nach Lage auf dem schmalen langgestreckten Bereich unterschiedlichen Spannungen ausgesetzt sind.
In einer weiteren Ausführungsform weist die Elektrodenanordnung weiterhin eine Isolierschicht auf, der die Bipolarelektrode abdeckt, und der mindestens zwei Aussparungen an definierten Positionen über der Bipolarelektrode aufweist, um eine elektrische Verbindung zwischen den ausgesparten Elektrodenbereichen über den Elektrolyten zu ermöglichen. Mit den Aussparungen werden definierte Messbereiche geschaffen, denen eine definierte Fläche und eine definierte Spannung zugeordnet werden können, so dass definiertere Randbedingungen bei der Impedanzmessung geschaffen werden können.
In einer Ausführungsform umfasst die Elektrodenanordnung weiterhin eine Begrenzung über der Bipolarelektrode, mit der eine Messkammer definiert wird. Die Begrenzung sorgt dafür, dass die Elektrolytlösung nur die vorgesehenen Bereiche auf der Elektrodenanordnung benetzen kann und verhindert, dass die Elektrolytlösung beispielsweise die Anschlusspads erreicht und so verfälschte Impedanzmessungen zustande kommen.
In einer Ausführungsform besteht die Begrenzung aus einem für Zellkulturen kompatiblen Material, vorzugsweise Glas oder Polystyrol.
In einer weiteren Ausführungsform wurde die Filmelektrode mit einem nass-chemischen Ätzverfahren fotolithografisch strukturiert. Auf diese Weise können kostengünstig präzise und feine Elektrodenstrukturen realisiert werden.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Messvorrichtung, die eine Haltevorrichtung umfasst, die angepasst ist, einen Chip mit einer bipolaren Elektrodenanordnung zu halten. Die Messvorrichtung umfasst weiterhin einen Impedanzanalysator, der mit der bipolaren Elektrodenanordnung elektrisch verbindbar ist, und ein Mikroskop, vorzugsweise ein Fluoreszenzmikroskop, das so angeordnet ist, dass eine Zellkultur auf der bipolaren Elektrodenanordnung mit dem Mikroskop von der trockenen Rückseite des Trägersubstrates (Objektträger, Deckglas) untersucht werden kann. Mit einer solchen Messvorrichtung lassen sich gleichzeitig impedimetrische und mikroskopische Untersuchungen an Zellkulturen durchführen, wobei das Mikroskopobjektiv an der trockenen Rückseite des Chips angeordnet werden kann, d.h. es werden keine speziellen Immersions-Objektive benötigt. Ein geringer Arbeitsabstand zum Objektiv lässt sich damit ohne großen Aufwand erreichen. Außerdem erlaubt die Verwendung einer bipolaren Elektrodenanordnung bei Messungen im Durchlicht eine bessere Ausleuchtung und damit eine kontrastreichere Abbildung der Zellkulturen. Damit lassen sich die in der Zellbiologie verbreiteten und vorteilhaften inversen Mikroskope verwenden. Weiterhin ist es möglich mit einer solchen Messvorrichtung, Zellen gleichzeitig bei mehreren Spannungen zu untersuchen, wodurch der Aufwand für mehrere Präparationen zu Untersuchungen bei verschiedenen Spannungen eingespart wird.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Messvorrichtung mit integrierter bipolarer Elektrodenanordnung zur simultanen impedimetrischen und mikroskopischen Untersuchung von lebenden Zellen.
In noch einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der bipolaren Elektrodenanordnung zur Elektroporation und/oder elektrischen Verwundung adhärenter Zellen z.B. mit dem Ziel der Untersuchungder Zellwundheilung. Mit der Bipolarelektrode lassen sich Zellmembranen reversibel perforieren, so dass gezielt Stoffe in die Zelle eingebracht werden können. Die Wirkung der Stoffe kann dann in einer anschließenden impedimetrischen und mikroskopischen Untersuchung auf der Elektrodenanordnung untersucht werden. Ebenso können auch gezielt Zellen abgetötet werden, sodass dann in der anschließenden impedimetrischen und mikroskopischen Untersuchung die Regeneration der Zellen verfolgt werden kann. Weiterhin kann die optimale Spannung für die Elektroporation in einem Messdurchgang ermittelt werden, da durch den Spannungsgradienten entlang der Bipolarelektrode gleichzeitig Messungen bei verschiedenen Spannungen stattfinden können.
Figurenliste
Im Folgenden werden Ausführungsbeispiele, Weiterentwicklungen, Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung anhand der beigefügten Figuren näher erläutert. Dabei sind alle beschriebenen und/oder bildlich dargestellten Merkmale für sich oder in beliebiger Kombination grundsätzlich Gegenstand der Erfindung, unabhängig von ihrer Zusammenfassung in den Ansprüchen oder deren Rückbeziehung. Auch wird der Inhalt der Ansprüche zu einem Bestandteil der Beschreibung gemacht.
In den Figuren zeigt

1a ein Impedanzspektrum einer konfluenten Zellschicht auf einer Goldfilm-Elektrode gemäß dem Stand der Technik im Vergleich zur gleichen, aber zellfreien Elektrode;
1b ein vereinfachtes Ersatzschaltbild einer Zellschicht auf einer Goldfilm-Elektrode gemäß dem Stand der Technik;
2a die Struktur einer planaren Bipolarelektrode gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
2b die Struktur einer optionalen isolierenden Fotolackschicht, die über der Bipolarelektrode aufgebracht wird, gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
2c die Gesamtstruktur der ersten Ausführungsform gemäß den 2a und 2b;
3a ein Impedanzspektrum einer bipolaren Elektrode gemäß der vorliegenden Erfindung im Vergleich zur gleichen, aber zellfreien Elektrode;
3b ein vereinfachtes Ersatzschaltbild einer Zellschicht auf einer bipolaren Elektrode gemäß der vorliegenden Erfindung;
4a die Struktur einer planaren bipolaren Elektrode gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
4b die Struktur einer optionalen isolierenden Fotolackschicht, die über der Bipolarelektrode aufgebracht wird, gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
4c die Gesamtstruktur der zweiten Ausführungsform gemäß den 4a und 4b;
5a die Struktur einer planaren bipolaren Elektrode gemäß einer dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
5b die Struktur einer optionalen isolierenden Fotolackschicht, die über der Bipolarelektrode aufgebracht wird, gemäß der dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung; und
5c die Gesamtstruktur der dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gemäß den 5a und 5b.

Ausführliche Beschreibung von Ausführungsformen
Diese Erfindung stellt eine neuartige bipolare Filmelektrode mit kontinuierlichem Potentialgradienten bereit, mit der die label-freie und zeitaufgelöste Impedanzanalyse adhärenter Zellen möglich ist. Abhängig von der Wahl des Elektrodenmaterials können direkt aus dem Impedanzspektrum die dielektrischen Eigenschaften der Zellen und die Temperatur in unmittelbarer Nähe der Zellen erfasst werden. Die Messung kann mit einer graduellen Elektroporation der Zellen bei gleichzeitiger mikroskopischer Beobachtung kombiniert werden. Im Folgenden werden das allgemeine Prinzip der Erfindung und einige Anwendungsmöglichkeiten beschrieben.
Das Prinzip der Erfindung
Die Erfindung besteht im Wesentlichen aus einem transparenten Substrat wie Glas, Polycarbonat, PET (Polyethylenterephthalat) oder PEN (Polyethylennaphthalat), welches mit einem leitfähigen Elektrodenmaterial mit genügend hohem Eigenwiderstand beschichtet ist, so dass zwischen den beiden Kontaktpunkten zu einer externen Spannungsquelle ein signifikanter Widerstand von mindestens einigen hundert Ohm entsteht. Das Elekrodenmaterial muss eine sehr geringe Schichtdicke und/oder große Leitungslänge und/oder einen hohen spezifischen Widerstand aufweisen, um die hohen Widerstände zu gewährleisten. Die Film-Elektrode kann bestehen aus Gold, Indium-Zinn-Oxid (ITO) oder leitfähigen Polymeren wie z.B. Polyanilin, Polypyrrol, Polythiophen, PEDOT und deren dotierte und chemisch modifizierte Varianten. Der hohe Eigenwiderstand führt zu einem graduellen Spannungsabfall zwischen den Kontaktpunkten der Elektrode zu einer externen Spannungsquelle, so dass eine bipolare Elektrode (Anode und Kathode zeitgleich in einem kontinuierlichen Metallfilm) entsteht. Zwischen den Polen der bipolaren Elektrode kann nun ein Stromfluss nicht nur durch den Elektrodenfilm sondern auch über die auf der Elektrode wachsenden Zellen und den darüber befindlichen Elektrolyten erfolgen. Das Impedanzspektrum dieser Anordnung enthält dann neben den resistiven Eigenschaften des Elektrodenmaterials auch Informationen über die dielektrischen Eigenschaften der Zellen.
Ausführungsform 1: prinzipielle Struktur
2 zeigt allgemein eine Struktur einer bipolaren Elektrodenanordnung 100 mit einigen Komponenten. 2A zeigt eine planare Bipolarelektrode 10, beispielsweise in Form einer Goldfilmelektrode nach photolithographischer Strukturierung auf einem transparenten Substrat (nicht gezeigt). Die größeren Flächen mit den Anschlusspunkten 10A und 10B dienen zum Anschluss an die Messelektronik. 2B zeigt die Struktur einer optionalen isolierenden Photolackschicht 20, die auf die Elektrode 10 aufgebracht werden kann. Aussparungen 20A, 20B, 20C und 20D definieren die effektive Elektrodengröße und deren elektrisches Potenzial. 2C zeigt eine Übereinanderlagerung von Elektrode 10 und Isolatorschicht 20, sowie die Begrenzung 30 der Messkammer (gestrichelt).
Ist der Widerstand der Filmelektrode zu gering, bewirkt die Elektrode lediglich einen Kurzschluss und eine Messung der Zellen ist nicht mehr möglich. Gold ist bei einer Schichtdicke von 20 nm optisch transparent, chemisch inert und nahezu ideal polarisierbar. Dünne Schichten können mit einer Iod/Kaliumiodid-Lösung durch nass-chemisches Ätzen photolithographisch strukturiert werden.
zeigt exemplarisch den Aufbau einer Messkammer mit bipolarer Goldfilmelektrode nach Fertigung in mehreren Schritten. Die Flächen außerhalb der Messkammer dienen zum Anschluss an die Messelektronik und sind relativ großflächig gehalten, um den Zuleitungswiderstand zu minimieren. Dagegen ist die Struktur im Inneren, auf der die Zellen ausgesät werden, auf einen geeigneten intrinsischen Widerstand ausgelegt und daher schmal und lang. Da der Bulkwiderstand des Elektrolyten ebenfalls Einfluss auf die Sensitivitit der Messung hat, muss dieser gering gehalten werden, weshalb die beiden parallelen Stränge der U-förmig angeordneten Elektrode 10 sehr nahe beieinanderliegen. Je nach Anwendung ist die Elektrode 10 mit einer Isolatorschicht 20 aus einem Photolack beschichtet, der zwei oder mehrere photolithographisch definierte Aussparungen 20A, 20B, 20C und 20D für die Elektroden 10 enthält. Die Messkammer besitzt zwar dann nur eine Elektrode 10, effektiv ergeben sich aber bei einer von außen anliegenden Spannung U an den unterschiedlichen Positionen der Aussparungen 20A, 20B, 20C und 20D der Elektrode 10 verschiedene, definierte Potentiale und damit Potentialdifferenzen U zwischen zwei verschiedenen Positionen, beispielsweise zwischen den Aussparungen 20A und 20B auf der Elektrode 10. Diese Spannung zwischen den Elektrodenpositionen induziert einen parallelen Stromfluss über die adhärenten Zellen, der von den dielektrischen Eigenschaften der Zellen bestimmt ist und diese messbar macht. U hängt vom Widerstand des Elektrodenmaterials R(el) zwischen den Positionen der Aus- und Eintrittsstellen des elektrischen Stromes ab und gibt die darüber abfallende Spannung an. Durch die Verwendung einer Isolatorschicht kann U diskret definiert werden, während andernfalls ein kontinuierlicher Potentialgradient vorliegt.
Die Begrenzung der Messkammer besteht aus einem für die Zellkultur geeigneten Material wie Glas oder Polystyrol. Vor Aussaat der Zellen in die vorbereitete Messvorrichtung wird selbige mit Zellmedium inkubiert. Das Adhärieren und Spreiten der Zellen auf der Elektrode kann impedimetrisch verfolgt werden.
Ausführungsform 2: Impedanzspektroskopie
Die Impedanzanalyse erfolgt mit Hilfe eines Impedanzanalysators durch Anlegen einer Wechselspannung oder eines Wechselstromes mit geringer, nicht-invasiver Amplitude. Die Impedanzspektren der bipolaren Elektrodenanordnung unterscheiden sich bei hohen Frequenzen kaum von denen, wie sie bei Verwendung herkömmlicher Elektrodenpaare nach dem Stand der Technik zu beobachten sind, werden aber bei niedrigen Frequenzen nicht durch die Grenzflächenkapazität der Elektrode sondern durch den Eigenwiderstand der Elektrode R(el) dominiert (s. 3).
3A zeigt ein Impedanzspektrum einer konfluenten Schicht von MDCK-II-Zellen, gemessen mit einer bipolaren Elektrode gemäß der vorliegenden Erfindung im Vergleich zum Impedanzspektrum der gleichen, aber zellfreien Elektrode. Der niederfrequente Bereich wird durch den Eigenwiderstand der Elektrode bestimmt und kann beispielsweise zur Bestimmung der Temperatur unter der Zellschicht verwendet werden.
3B zeigt ein vereinfachtes Ersatzschaltbild einer Zellschicht auf einer bipolaren Elektrode gemäß der vorliegenden Erfindung. R(cell) bezeichnet den Widerstand der Zellschicht, C(cell) bezeichnet die Kapazität der Zellschicht, C(el) bezeichnet die Grenzflächenkapazität der Elektrode, R(bulk) bezeichnet den Elektrolytwiderstand und R(el) bezeichnet den Eigenwiderstand der Elektrode.
Die maximal erreichbare Impedanz wird somit durch die Wahl des Eigenwiderstands der Elektrode begrenzt. Damit kann ein auf die Leistung des Messgeräts angepasster, frequenzunabhängiger Mindeststrom eingestellt werden.
Für eine quantitativ exakte Impedanzanalyse ist als Elektrode eine Variante mit Isolatorschicht zu verwenden, die durch ihre definierten Aussparungen die zur Bestimmung flächenspezifischer Parameter notwendige Elektrodenfläche festlegt (s. 4).
4A zeigt die Struktur der Bipolarelektrode 10 gemäß der zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in Form einer planaren Goldelektrode. Die Bipolarelektrode 10 gemäß der zweiten Ausführungsform unterteilt sich in einen schmalen, langgestreckten Bereich 11, der meanderförmig gefaltet ist, und großflächigere Bereiche 12, die durch den meanderförmigen Bereich elektrisch miteinander verbunden sind.
4B zeigt die Struktur einer isolierenden Photolackschicht 20, die auf die Elektrode 10 aufgebracht werden kann und deren Aussparungen 20E und 20F die Größe der Arbeits- und Gegenelektrode definieren.
4C zeigt die Übereinanderlagerung von Elektrode 10 und Isolatorschicht 20, sowie die Begrenzung 30 der Messkammer (gestrichelt).
Durch die Meanderstruktur wird garantiert, dass der Eigenwiderstand der Elektrode groß genug ist.
Ausführungsform 3: Elektroporation und elektrische Verwundung
Der kontinuierliche Potentialgradient der Elektrode kann bei der Elektroporation für eine zeitsparende Optimierung der Elektroporationsparameter genutzt werden. Statt mehrerer Messungen mit verschiedenen Spannungsamplituden genügt eine einzige, bei der die optimale Amplitude anhand der Position auf der Elektrode mit dem besten Elektroporationsresultat abgelesen werden kann. Die Elektrode wird ohne weitere Isolatorschicht verwendet um den Potentialgradienten stufenlos auszunutzen. Alternativ kann eine Isolatorschicht mit Elektrodenlayout in Form eines Photolacks aufgebracht werden, um über photolithographisch erzeugte Aussparungen positionsabhängig bestimmte Spannungen abgreifen zu können (s. 5).
5A zeigt die Struktur der Bipolarelektrode 10 gemäß der dritten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in Form einer planaren Goldelektrode. Die Bipolarelektrode 10 gemäß der dritten Ausführungsform unterteilt sich in einen schmalen, langgestreckten Bereich 11, der L-förmig angeordnet ist, und einen großflächigeren Bereich 12.
5B zeigt die Struktur einer (optionalen) isolierenden Photolackschicht 20, die auf die Elektrode 10 aufgebracht werden kann mit einer großflächigen Aussparung 20F, die die Größe der Gegenelektrode definiert, sowie drei kleinflächige Aussparungen 20G, 20H und 20K, deren Durchmesser ungefähr der Breite des schmalen, langgestreckten Bereichs 11 entspricht, um Größe und elektrisches Potenzial von drei Elektroprations-Positionen zu definieren.
5C zeigt die Übereinanderlagerung von Elektrode 10 und Isolatorschicht 20, sowie die Begrenzung 30 der Messkammer (gestrichelt).
Misst man das Impedanzspektrum einer Zellschicht nach der Elektroporation mit der gleichen Elektrodenanordnung, so erhält man ein über alle Positionen mit individuellem Potentialgradienten gemitteltes Signal. Gleichzeitig kann der Effekt der Elektroporation mit einem Mikroskop überprüft werden.
Ausführungsform 4: Temperaturmessung
Die Impedanz hängt im konstanten Bereich bei niedrigen Frequenzen ausschließlich vom Eigenwiderstand der Goldelektrode, dieser wiederum von der Temperatur ab. Impedanzänderungen in diesem Frequenzbereich sind also bei Konstanz aller anderen experimentellen Parameter auf eine Temperaturänderung zurück zu führen, so dass hier nach geeigneter Kalibration Temperaturänderungen direkt aus der zeitlichen Änderung des Impedanzspektrums abgelesen werden können. Impedimetrische Untersuchungen an Zellen mit dieser Methode verfügen daher über die Möglichkeit, die Temperatur direkt unter der Zellschicht zu bestimmen und birgt die Möglichkeit Temperatureffekte herauszurechnen.
Ausführungsform 5: Fluoreszenzmikroskopie
Gold ist bei einer Schichtdicke von 20 nm weitgehend durchlässig für sichtbares Licht. Aufgrund dessen ist eine Bipolarelektrode der vorliegenden Erfindung sehr gut für die Fluoreszenzmikroskopie mit inversen Mikroskopen geeignet. Die dünnen Elektrodenfilme erlauben die Transmission auch des intensitätsschwachen Fluoreszenzlichtes. Der mit der Transparenz unausweichlich verknüpfte hohe interne Widerstand der Elektroden ist hier - im Gegensatz zu den etablierten Techniken auf Basis von zwei Elektroden - erwünscht. Bei den derzeit kommerziell verfügbaren Elektrodenstrukturen ist die Verwendung eines aufrechten Mikroskops, bei dem das Objektiv von der mit Medium überschichteten Oberseite an die Zellen angenähert werden muss, aufwändig und wenig praktikabel. Zudem werden spezielle Tauchobjektive benötigt. Bei Verwendung von bipolaren Elektroden mit sehr dünnen Elektrodendicken kann die Elektroporation oder elektrische Verwendung parallel mikroskopisch mit einem inversen Mikroskop verfolgt werden, ohne die Sterilität der Probe aufzubrechen, da hierfür keine Entfernung der Messkammer nötig ist.
Die Verwendung bipolarer Dünnschichtelektroden bringt wesentliche Vorteile bei der Elektrodenfertigung, da deutlich weniger Elektrodenmaterial (10 % - 20 % der herkömmlich aufzubringenden Menge) benötigt wird und jeder Ätzschritt mit weniger Reagenzien und kürzeren Ätzzeiten auskommt. Insgesamt ist eine signifikante Reduktion der Produktionskosten - maßgeblich getragen durch den geringeren Goldverbrauch - zu erwarten.
Die dünneren Filmelektroden ermöglichen zudem eine parallele Untersuchung der Zellen mit mikroskopischen Techniken, ohne die Sterilität der Probe aufzuheben. Eine derartige Kombination der optischen und elektrischen Untersuchungsverfahren liefert einerseits ortsaufgelöste Informationen über einzelne Zellen und andererseits integrale Aussagen über das physikalische Verhalten eines Zellverbandes. Jede elektrische Messung bzw. Manipulation kann problemlos und mit inverser Mikroskop-Optik parallel optisch verfolgt werden.
Bei exakter Fertigung der Elektrodenstruktur und damit genauer Vorgabe des Elektrodeninnenwiderstandes wird der in einem Impedanzspektrum zu tolerierende Messbereich stark und wohl definiert eingeengt und erlaubt somit eine Vermeidung der sehr hochohmigen Messpunkte bei kleinen Frequenzen. Auf diese Weise wird eine sehr genaue Anpassung der Messelektronik auf die relevanten Lastimpedanzen möglich ohne Beschränkung des Frequenzbereiches.
Der Einsatz bipolarer Elektroden liefert einen deutlichen zeitlichen Gewinn bei der Optimierung der experimentellen Parameter bei Elektroporations- oder Verwundungsexperimenten. Durch die Ausnutzung fließender Potentialgradienten wird die Amplitudenabhängigkeit der eingesetzten Spannungspulse in einem Experiment erfasst.
Der konstante Bereich des Impedanzspektrums liefert bei niedrigen Frequenzen eine Messgröße, die mit der Temperatur in unmittelbarer Nähe zu den Zellen korreliert ist.

Claims

Elektrodenanordung (100, 200, 300), die zur Benetzung mit einer Elektrolytlösung und zum adhärenten Wachsen von Zellen angepasst ist, um impedimetrische Zellanalysen durchzuführen, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrodenanordnung (100, 200, 300) eine Bipolarelektrode (10) auf einem Substrat umfasst, wobei die Bipolarelektrode (10) als leitfähiger Pfad (10) auf dem Substrat ausgebildet ist, der einen Eigenwiderstand zwischen zwei Anschlusspunkten (10A, 10B) des leitfähigen Pfads aufweist, der ein Vielfaches der Wechselstromimpedanz der Elektrolytlösung bei 1 MHz, gemessen an den zwei Anschlusspunkten (10A, 10B), ist.
Elektrodenanordnung (100, 200, 300) nach Anspruch 1, wobei das Substrat und der leitfähige Pfad (10) zumindest in einem Messbereich, der für adhärente Zellen vorgesehen ist, transparent sind.
Elektrodenanordnung (100, 200, 300) nach Anspruch 1 oder 2, wobei das transparente Substrat Glas, Polycarbonat, Polyethylenterephthalat (PET), eine poröse Membran oder Polyethylennaphthalat (PEN) ist, und/oder die Bipolarelektrode (10) eine Film-Elektrode aus Gold, Indium-Zinn-Oxid (ITO), leitfähigen Polymeren, Polyanilin, Polypyrrol, Polythiophen, PEDOT oder deren dotierten und/oder chemisch modifizierten Varianten ist.
Elektrodenanordnung (100, 200, 300) nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Bipolarelektrode (10) einen Eigenwiderstand von mindestens 300 Ω, bevorzugter mindestens 600 Ω, noch bevorzugter mindestens 1200 Ω aufweist.
Elektrodenanordnung (100, 200, 300) nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Bipolarelektrode (10) ein Goldfilm mit einer Schichtdicke im Bereich von 10 nm bis 30 nm, vorzugsweise im Bereich von 20 nm ± 2 nm ist.
Elektrodenanordnung (100, 200, 300) nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Bipolarelektrode (10) mindestens einen langestreckten schmalen Bereich (11) aufweist, mit einer Länge, die mindestens dem zehnfachen der Breite entspricht.
Elektrodenanordnung (100, 200, 300) nach Anspruch 6, wobei der langestreckte schmale Bereich (11) in U-Form, L-Form oder meanderförmig ausgebildet ist.
Elektrodenanordnung (100, 200, 300) nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Bipolarelektrode (10) mindestens einen flächigen Bereich (12) aufweist, mit einer Länge, die weniger als das zehnfache der Breite entspricht.
Elektrodenanordnung (100, 200, 300) nach einem der vorherigen Ansprüche, der weiterhin eine Isolierschicht (20) umfasst, der die Bipolarelektrode (10) abdeckt und der mindestens zwei Aussparungen (20A, 20B, 20C, 20D, 20E, 20F, 20G, 2H, 201, 20K) an definierten Positionen über der Bipolarelektrode (10) aufweist, um eine elektrische Verbindung zwischen den ausgesparten Elektrodenbereichen über den Elektrolyten zu ermöglichen.
Elektrodenanordnung (100, 200, 300) nach einem der vorherigen Ansprüche, der weiterhin eine Begrenzung (30) über der Bipolarelektrode (10) umfasst, mit der eine Messkammer definiert wird.
Elektrodenanordnung (100, 200, 300) nach Anspruch 10, wobei die Begrenzung (30) aus einem für Zellkulturen kompatiblen Material, vorzugsweise Glas oder Polystyrol besteht.
Elektrodenanordnung (100, 200, 300) nach einem der Ansprüche 3-11, wobei die Film Elektrode mit einem nass-chemischen Ätzverfahren photolithografisch strukturiert wurde.
Messvorrichtung, die umfasst: eine Haltevorrichtung, die angepasst ist, eine Elektrodenanordnung auf einem transparenten Trägermaterial (100, 200, 300) nach einem der Ansprüche 1-12 zu halten; einen Impedanzanalysator, der mit der Elektrodenanordnung (100, 200, 300) elektrisch verbindbar ist; und ein Mikroskop, das so angeordnet ist, dass eine Zellkultur auf der Elektrodenanordnung (100, 200, 300) von der Rückseitenrichtung des Chips mit dem Mikroskop untersucht werden kann.
Verwendung der Elektrodenanordnung (100, 200, 300) nach einem Ansprüche 1-12 zur simultanen impedimetrischen und mikroskopischen Untersuchung von lebenden Zellen.
Verwendung der Elektrodenanordnung (100, 200, 300) nach einem Ansprüche 1-12 zur Elektroporation und/oder Untersuchungen zur Zell-Wundheilung.