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Die Erfindung betrifft eine Probenaufnahmeeinrichtung für biologische Proben, insbesondere eine Probenaufnahmeeinrichtung für Zellkulturen in einem Kultivierungsmedium, z. B. zur Untersuchung, Kultivierung und/oder Differenzierung von biologischen Zellen. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung und Anwendung der Probenaufnahmeeinrichtung. Anwendungen der Erfindung sind insbesondere in der Biotechnologie, Biomedizin und Medizintechnik, insbesondere in der Diagnostik und/oder der regenerativen Medizin, gegeben.
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Es ist allgemein bekannt, dass bei der Prozessierung von biologischen Zell- oder Gewebeproben Gefäße aus Kunststoff oder Glas verwendet werden. Diese Gefäße umfassen z. B. Schalen, Bechergläser, Reagenzgläser oder Multiwellschalen. Typische Arbeitsschritte bei der Prozessierung von biologischen Zell- oder Gewebeproben sind die Kultivierung von Zellkulturen in Petri- oder Multiwellschalen, bei denen häufige Medienwechsel durchgeführt werden, die Durchführung von Differenzierungsschritten, die in regelmäßigen Abständen durch verschiedene Methoden geprüft werden (z. B. Expression von zell-spezifischen Markern durch Fluoreszenzmikroskopie, elektrophysiologische Ableitungen), oder der Transport und/oder die Lagerung von biologischem Material, wobei die relevanten Temperaturbereiche bei 37°C, Raumtemperatur, gekühlt bei +4°C oder tiefkalt zwischen -80°C und -196°C (Kryokonservierung) liegen.
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Die aus der Praxis bekannten Gefäße weisen meistens einfache, standardisierte Formate auf, die an manuell, halb-automatisch oder automatisch durchzuführende Arbeitsschritte angepasst sind. Bei der Kultivierung und/oder Differenzierung der biologischen Proben im Rahmen von Laborarbeiten ist häufig eine visuelle Kontrolle der Probe im Gefäß, z. B. durch direkte Beobachtung oder mit einem Mikroskop, vorgesehen, so dass typischerweise durchsichtige Gefäßmaterialien verwendet werden. Darüber hinaus werden die Gefäße meistens als Einwegartikel verwendet, um eine Probe nicht durch Kontaminationen des Gefäßes zu beeinträchtigen. Daher bestehen die bisher verwendeten Gefäße häufig aus kostengünstigen Kunststoffen, wie z. B. Polystyrol oder Polypropylen, was wegen deren Lichtdurchlässigkeit auch für die visuelle Kontrolle günstig ist.
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Es besteht ein stetig steigender Bedarf an Hochdurchsatzuntersuchungen, z. B. in der Diagnostik oder der regenerativen Medizin, wobei die Prozessierung der biologischen Proben parallelisiert und miniaturisiert wird. Für die Zwecke der Parallelisierbarkeit und Miniaturisierung wurden die Formen und Größen der Gefäße angepasst. Für automatisierte Hochdurchsatzverfahren werden z. B. Multiwellplatten (Substratplatten mit einer Vielzahl von Einzelgefäßen, z. B. Mikro- oder Nanotiterplatten), beispielsweise mit standardisierten Formaten von 6 Wells/Platte bis hin zu 1536 Wells/Platte, verwendet.
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Multiwellplatten weisen zwar eine hohe Leistungsfähigkeit für relativ einfache Verfahren, wie zum Beispiel für Toxizitätsassays in Studien für die In Vitro Diagnostik (IVD) auf. Bei komplexeren Verfahren, z. B. bei der Zell- und Gewebekultur, und insbesondere bei Hochdurchsatzanwendungen treten jedoch in der Praxis Limitierungen auf. Die Zahl der kommerziell verfügbaren Assays steigt, die keinen sichtbaren Zugang zur Probe erfordern, aber spezifische Messungen, wie z. B. Fluoreszenzmessungen oder elektrophysiologische Untersuchungen, erfordern und für einen Hochdurchsatz automatisierbar sein sollen. Ein Beispiel dafür ist der lumineszenzbasierte Assay mit dem Handelsnamen „CelltiterGlo“, der ATP-Inhalte in den Medien erkennt. Bei Fluoreszenzmessungen besteht Interesse an Maßnahmen, um störendes Fremdlicht aus der Umgebung abzuschirmen. Des Weiteren müssen die Zellen für elektrophysiologische Untersuchungen (Ableitungen von Zellströmen und/oder -potentialen), wie sie für Kardiomyozyten oder Neuronen verwendet werden, bisher in spezielle, für die elektrophysiologische Untersuchung angepasste Vorrichtungen umgesetzt werden. Dies erfordert enzymatische oder mechanische Dissoziationsschritte, welche die Proben schädigen können. Schließlich ist auch für die Aufbewahrung funktionaler Zellen und Gewebe mittels der Kryokonservierung eine Überführung in spezielle Gefäße, wie z. B. Kryoröhrchen, vorgesehen, die aufgrund ihrer thermischen und mechanischen Eigenschaften große Temperaturänderungen (üblicherweise von +4°C bis -196°C) tolerieren, langzeitstabil sind und in Bezug auf bei der Kryokonservierung verwendete Substanzen, wie z. B. Kochsalzlösung, chemisch beständig sind.
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Es ist bekannt, Probeaufnahmen für spezielle Aufgaben anzupassen. Beispielsweise wird in
EP 1 486 767 A1 eine Multiwellplatte beschrieben, die mit Kohlenstoff-Gittern in den einzelnen Wells ausgestattet sind. Die als Zusatzmodule in die Wells eingefügten Kohlenstoff-Gitter sind für eine Infrarot-spektroskopische Messung von Proben in der Multiwellplatte vorgesehen. In
EP 542 422 A1 ist eine Multiwellplatte beschrieben, die mit einer Heizeinrichtung ausgestattet und aus einem Kunststoff, wie z. B. Polystyrol, hergestellt ist. Um die Wirkung der Heizeinrichtung zu unterstützen, kann die Wärmeleitfähigkeit des Kunststoffs durch einen Zusatz von Aluminiumoxid, Metall oder Kohlenstofffasern erhöht sein. Zugleich wird in
EP 542 422 A1 für die Durchführung optischer Messungen gefordert, dass der Kunststoff in den Wells optisch klar ist und eine glatte Oberfläche aufweist. Derartige Spezialgefäße haben jedoch aufgrund ihrer Anpassung für besondere Messaufgaben nur einen eingeschränkten Anwendungsbereich.
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Die Aufgabe der Erfindung ist es, eine verbesserte Probenaufnahmeeinrichtung zur Aufnahme biologischer Proben bereitzustellen, mit der Nachteile herkömmlicher Techniken vermieden werden sollen. Die Probenaufnahmeeinrichtung soll insbesondere einen erweiterten Anwendungsbereich, z. B. in der Diagnostik, Therapie und bei biomedizinischen Prozessen und/oder Untersuchungen, aufweisen, einen einfachen Aufbau haben, als Einwegartikel geeignet sein, die Anwendung einer vergrößerten Zahl verschiedener Verfahren zur Prozessierung und/oder Untersuchung biologischer Zellen ermöglichen, für komplexe Assays geeignet sein, und/oder eine Kryokonservierung, z. B. nach einer Prozessierung und/oder Untersuchung der Probe, ohne einen Wechsel der Probenaufnahme ermöglichen. Die Aufgabe der Erfindung ist es auch, verbesserte Verfahren zur Anwendung einer derartigen Probenaufnahmeeinrichtung bereitzustellen, mit denen Nachteile herkömmlicher Techniken vermieden werden. Die Verfahren sollen insbesondere die Durchführung verschiedener Arten der Prozessierung und/oder Untersuchung von Proben ohne einen Wechsel der Probenaufnahme ermöglichen.
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Diese Aufgaben werden jeweils durch eine Probenaufnahmeeinrichtung und Verfahren zu deren Anwendung mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
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Gemäß einem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch eine Probenaufnahmeeinrichtung (oder: Kultivierungseinrichtung, Gefäßanordnung, Kultivierungsgefäß, Kultivierungssubstrat) zur Aufnahme mindestens einer biologischer Probe (insbesondere Zellen, Zellbestandteile, Zellaggregate, Mikroorganismen und/oder Gewebe) gelöst. Die Probenaufnahmeeinrichtung umfasst einen Grundkörper mit mindestens einer Probenaufnahme. Die mindestens eine Probenaufnahme ist konfiguriert, eine biologische Probe, ggf. mit einem flüssigen Medium, aufzunehmen. Die mindestens eine Probenaufnahme wird in mindestens einer Raumrichtung durch mindestens eine Wand begrenzt. Die mindestens eine Wand weist an einer zur Probenaufnahme weisenden Oberfläche einen flächigen, Kohlenstoff-basierten Werkstoff auf, der Flüssigkeits-undurchlässig ist. Der Grundkörper ist Gefäßkörper, dessen Wände vorzugsweise eine geringere Dicke aufweisen als die Querschnittsdimension der mindestens einen Probenaufnahme, und/oder ein kompakter Quader, insbesondere eine kompakte, ebene oder gekrümmte Platte, in dem die mindestens eine Probenaufnahme gebildet ist.
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Gemäß der Erfindung hat der Kohlenstoff-basierte Werkstoff einen derart hohen Kohlenstoffanteil, dass der Kohlenstoff-basierte Werkstoff lichtundurchlässig und elektrisch leitfähig ist. Vorteilhafterweise erfüllt der Kohlenstoff-basierte Werkstoff zusätzlich zu der reinen Begrenzung der jeweiligen Probenaufnahme weitere Funktionen, die durch herkömmliche, ursprünglich aus den Anforderungen bei Laborarbeiten entwickelte, durchsichtige Gefäß-Wandmaterialien aus Glas oder Kunststoff nicht realisierbar sind. Die Erfinder haben festgestellt, dass der Kohlenstoff in der Wand der Probenaufnahme eine elektrische Leitfähigkeit bereitstellt, die ausreichend hoch insbesondere für elektrophysiologische Messungen und/oder elektrophysiologische Stimulationen ist. Die Verwendung teurer Metallelektroden und deren Einbau in Gefäße werden vermieden. Des Weiteren bildet der Kohlenstoff eine Abschirmung von Licht, insbesondere Streulicht aus der Umgebung der Probenaufnahmeeinrichtung, z. B. Licht im sichtbaren Spektralbereich. Vorteilhafterweise bietet dies einen Schutz von lichtempfindlichen Proben (Vermeidung von so genanntem Bleaching) und die Möglichkeit, fremdlichtfrei selbst geringste Emissionen, wie z. B. Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, der Probe zu messen und ein Hintergrundrauschen zu reduzieren. Vorteilhafterweise ist der Kohlenstoff chemisch inert, so dass unerwünschte Reaktionen zwischen Proben und der Wand einer Probenaufnahme vermieden werden. Zugleich ermöglicht die Verwendung des Kohlenstoff-basierten Werkstoffs die Bereitstellung der Probenaufnahmeeinrichtung mit geringen Kosten. Weitere Vorteile des Kohlenstoff-basierten Werkstoffs ergeben sich aus dessen Sterilisierbarkeit und Biokompatibilität. Des Weiteren kann er als Wachstumsfläche für in der Praxis interessierende relevante Zelltypen dienen und sogar die unveränderte Lagerung von gebrauchsfertigem biologischem Material bei kryogenen Temperaturen ermöglichen. Der Kohlenstoff-basierte Werkstoff kann mit einer glatten (stufenfreien) Oberfläche oder einer strukturierten Oberfläche hergestellt werden. Des Weiteren kann der Kohlenstoff-basierte Werkstoff mit einer funktionellen Beschichtung ausgestattet sein, welche die biologische Probe oder deren Wechselwirkung mit der Oberfläche beeinflusst, z. B. Differenzierungstrigger oder Adhärenzsteigerung.
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Im Unterschied zu
EP 542 422 A1 ist die mindestens eine Wand der Probenaufnahme undurchsichtig. Der Verzicht auf eine direkte visuelle Kontrolle oder optische Abbildung der Probe durch eine Gefäßwand stellt jedoch für zahlreiche Anwendungen, insbesondere bei der halb-automatischen oder automatischen Prozessierung von Proben, keinen kritischen Nachteil dar. Die visuelle Kontrolle durch Bedienpersonal ist bei der halb-automatischen oder automatischen Prozessierung in der Regel nicht vorgesehen, und bei Bedarf kann eine Überprüfung einer Probe auch z. B. durch Auflichtmikroskopie automatisiert durchgeführt werden.
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Ein weiterer wichtiger Vorteil des Kohlenstoff-basierten Werkstoffs besteht darin, dass er eine hohe Formstabilität und thermische Stabilität aufweist. Der Kohlenstoff-basierte Werkstoff kann mit einer hohen Planarität hergestellt werden. Vorteilhafterweise werden Deformationen der Probenaufnahmeeinrichtung durch mechanische Kräfte oder bei Temperaturänderungen vermieden. Ein formschlüssiger Kontakt zu einer Temperierungseinrichtung bleibt auch beim Durchlauf von Temperierungszyklen mit mehreren Temperaturwechseln erhalten. Die Probenaufnahmeeinrichtung kann zur Mehrfachverwendung oder als Einwegartikel vorgesehen sein.
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Vorzugsweise ist die Probenaufnahmeeinrichtung ein einheitliches Bauteil, umfassend den Kohlenstoff-basierten Werkstoff und ggf. weitere Komponenten des Grundkörpers. Besonders bevorzugt enthält die Probenaufnahmeeinrichtung keine separate aktive Temperierungseinrichtung, z. B. Heizplatte.
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Gemäß einem zweiten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein Verfahren zur Verwendung der Probenaufnahmeeinrichtung gemäß dem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung gelöst, das eine Prozessierung einer biologischen Probe (insbesondere Kultivierung und/oder Differenzierung von Zellen), eine Messung einer Wechselwirkung de Probe mit Licht (insbesondere Fluoreszenzmessung), eine elektrophysiologische Messung (insbesondere eine Ableitung von elektrischen Potentialen und/oder Strömen), einen Transport und/oder einer Lagerung biologischer Proben (insbesondere im gefrorenen Zustand), eine Tieftemperaturbehandlung von biologischen Proben (insbesondere bei Temperaturen unterhalb von -140 °C), und/oder eine Hochdurchsatzuntersuchung (insbesondere für Aufgaben der Diagnostik oder der regenerativen Medizin) umfasst.
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Durch die erfindungsgemäße Verwendung des lichtundurchlässigen und elektrisch leitfähigen, Kohlenstoff-basierten Werkstoffs werden Limitierungen herkömmlicher Gefäße für die Prozessierung biologischer Proben vorteilhafterweise überwunden. Insbesondere bei der Kryokonservierung biologischer Proben wird das Eiskristall-freie Einfrieren (Vitrifikation) begünstigt, da der Kohlenstoff-basierte Werkstoff eine präzise Herstellung formstabiler Probenaufnahmen mit geringen Probenvolumina und einen extrem schnellen Wärmeübergang bei der Vitrifikation ermöglicht. Probenaufnahmen können ohne Stabilitätsverlust mit geringen Wandstärken aus dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff, insbesondere mit einer Dicke geringer als 0,2 mm hergestellt werden, so dass durch die Wand der Probenaufnahme eine geringe Wärmekapazität eingeführt und der schnelle Wärmeübergang gewährleistet wird. Eine Probenaufnahmeeinrichtung gemäß der Erfindung ermöglicht insbesondere Kühlraten von mindestens 20.000°C/min in der Probenaufnahme.
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Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann die mindestens eine Wand aus dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff bestehen. Der Kohlenstoff-basierte Werkstoff bildet die Wand in ihrer gesamten Flächen- und Dickenausdehnung. Diese Ausführungsform hat besondere Vorteile hinsichtlich der kostengünstigen Herstellung der Probenaufnahmeeinrichtung, insbesondere der mindestens einen Probenaufnahme, und der Stabilität bei Temperaturwechseln. Bevorzugt ist die Dicke der mindestens einen Wand aus dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff im Bereich von 150 µm bis 1 mm gewählt. Dieser Dickenbereich hat insbesondere Vorteile hinsichtlich der geringen Wärmekapazität und der schnellen Wärmeübertragung. Es kann alternativ eine größere Dicke, z. B. im Bereich bis 2 mm, 5 mm oder darüber gewählt werden. Vorteilhafterweise kann der gesamte Grundkörper der Probenaufnahmeeinrichtung aus dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff bestehen. In diesem Fall ergeben sich Vorteile für die Herstellungskosten der Probenaufnahmeeinrichtung. Der Grundkörper kann insbesondere einstückig aus dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff hergestellt sein (integrales Bauteil aus einem einheitlichen Material).
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Gemäß einer weiteren Abwandlung der Erfindung kann die mindestens eine Wand mehrlagig aufgebaut sein, wobei an der zur Probenaufnahme weisenden Oberfläche eine Beschichtung vorgesehen ist, die aus dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff besteht. Eine innere Oberfläche der Probenaufnahme wird durch den Kohlenstoff-basierten Werkstoff gebildet. Eine äußere Lage kann z. B. aus einem Kunststoff oder Glas bestehen. Diese Ausführungsform der Erfindung hat besondere Vorteile bei Anwendungen, bei denen vorrangig die Abschirmung von Umgebungslicht gewünscht ist. Des Weiteren kann eine Kohlenstoff-basierte Beschichtung für Probenaufnahmen mit einer komplexen Innenform von Vorteil sein. Bevorzugt ist die Dicke der Beschichtung aus dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff im Bereich von 2 nm bis 500 µm gewählt. Vorteilhafterweise ist die Lichtundurchlässigkeit des Kohlenstoff-basierten Werkstoffs, insbesondere wenn dieser aus reinem Kohlenstoff besteht, selbst bei geringen Dicken im nm-Bereich erreichbar.
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Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der Kohlenstoff-basierte Werkstoff auf seiner zur Probenaufnahme weisenden Oberfläche eine Oberflächenstruktur aufweisen. Die Oberflächenstruktur umfasst Erhebungen und/oder Vertiefungen in Bezug auf die Flächenausdehnung der Oberfläche. Die Form und Größe der Erhebungen und/oder Vertiefungen ist so gewählt, dass eine mechanische Wechselwirkung biologischer Proben mit dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff gefördert wird. Die Oberflächenstruktur umfasst insbesondere Kanten und Spitzen, welche Kopplungspunkte für die adhärente Kopplung biologischer Zellen bilden. Des Weiteren kann es auch für eine spätere Freigabe der adhärenten Kopplung von Vorteil sein, wenn die biologische Probe, insbesondere die biologischen Zellen, aufgrund der Oberflächenstruktur Punktkontakte mit der Oberfläche bildet.
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Besonders bevorzugt umfasst die Oberflächenstruktur eine vorbestimmte Rauigkeit des Kohlenstoff-basierten Werkstoffs und/oder eine Oberfläche mit einer Vielzahl von Vorsprüngen des Kohlenstoff-basierten Werkstoffs. Vorteilhafterweise kann die Rauigkeit in Abhängigkeit von der konkreten Anwendung, insbesondere von der Art der in der Probenaufnahmeeinrichtung aufzunehmenden Zellen gewählt werden. Die Rauigkeit des Kohlenstoff-basierten Werkstoffs bildet vorzugsweise eine Submikro- oder Nanostruktur mit typischen Dimensionen geringer als 100 nm. Zellen reagieren unterschiedlich durch adhärente Ankopplung und/oder Zellreaktionen auf Rauigkeiten. Durch eine Einstellung der Rauigkeit kann die Zahl der adsorbierten Proteinmoleküle eingestellt werden. Es können durch eine raue Oberfläche auch Differenzierungsschritte getriggert werden. Vorsprünge können z. B. in Gestalt von Säulen oder Pyramiden gebildet sein, wobei bevorzugte Dickendimensionen im Bereich von 250 nm bis 500 µm gewählt sind. Besonders bevorzugt sind die Vorsprünge des Kohlenstoff-basierten Werkstoffs so dimensioniert und angeordnet, dass im Bereich einer Kontaktfläche einer biologischen Zelle, vorzugsweise in lateraler Richtung über eine Länge von rd. 20 µm, mehrere Vorsprünge vorgesehen sind.
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Des Weiteren kann mindestens eine innere Oberfläche der Probenaufnahme, insbesondere eine glatte, unstrukturierte Oberfläche oder eine Oberfläche mit der Oberflächenstruktur, zusätzlich mit einer funktionellen Beschichtung ausgestattet sein. Die funktionelle Beschichtung kann z. B. adsorbierte Proteine umfassen, die Ankerpunkte für die adhärente Kopplung von biologischen Zellen bilden.
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Allgemein ist der Volumenanteil des Kohlenstoffs in dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff mindestens 5 %, insbesondere mindestens 25 %. Der Kohlenstoff-basierte Werkstoff ist vorzugsweise schwarz. Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass mehrere Kohlenstoff-basierte Werkstoffe verfügbar sind, welche elektrisch leitfähig und lichtundurchlässig sind. Gemäß einer ersten Variante kann der Kohlenstoff-basierte Werkstoff reinen Kohlenstoff, z. B. pyrolytischen Kohlenstoff umfassen. Alternativ kann der Kohlenstoff-basierte Werkstoff einen mit Kohlenstofffasern (Carbonfasern) verstärkten Kunststoff (carbonfaserverstärkter Kunststoff, CFK) umfassen. Des Weiteren ist als weitere Alternative ein mit Silizium versetzter Kohlenstoff, insbesondere Siliziumkarbid, mit Wärmeleitfähigkeiten von über 120 W/(m·K), insbesondere über 250 W/(m-K), verwendbar. Es ist ferner allgemein möglich, die zum Inneren der Probenaufnahme weisende Oberfläche aus einem Kohlenstoff-basierten Werkstoff zu bilden, der mehrere Komponenten, wie z. B. mindestens eine Lage reinen Kohlenstoff und mindestens eine Lage Kohlenstofffaser-verstärkten Kunststoff oder eine Zusammensetzung aus verschiedenen Kohlenstoffformen umfasst. Der Kohlenstoff im Kohlenstoff-basierten Werkstoff kann eine amorphe, kristalline oder polykristalline Struktur aufweisen, wobei jedoch ein Diamant-Werkstoff (Werkstoff mit Kohlenstoff mit Diamant-Struktur) ausgeschlossen ist.
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Die genannten Beispiele von Kohlenstoff-basierten Werkstoffen haben vorteilhafterweise eine hohe Elektronen- und Wärmeleitfähigkeit (insbesondere an die Elektronen- und Wärmeleitfähigkeit von Kupfer angepasst), eine hohe Oxidationsstabilität (die Werkstoffe sind insbesondere für biologische Proben chemisch inert), eine Biokompatibilität und Gewebeverträglichkeit, gute mechanische Eigenschaften (z. B. hohe Festigkeit (insbesondere Bruchfestigkeit) und eine hohe Planarität), eine hohe Temperaturwechselbeständigkeit, einen geringen Ausdehnungskoeffizienten und eine hohe chemische Beständigkeit.
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Die Probenaufnahmeeinrichtung kann gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung mit einem der folgenden Verfahren hergestellt werden. Das Verfahren wird in Abhängigkeit von dem konkret verwendeten Material gewählt. Gemäß einer ersten Variante kann die Probenaufnahmeeinrichtung durch ein mechanisches Abtragsverfahren, z. B. Fräsen, Sägen und/oder Bohren, aus einem Kohlenstoff-haltigen Vollmaterial, z. B. pyrolytischem Kohlenstoff oder Kohlenstofffaser-verstärktem Kunststoff, hergestellt werden. Gemäß einer weiteren Variante kann der Kohlenstoff-basierte Werkstoff zunächst durch eine Kompositbildung aus einem Bindemittel, wie z. B. Polystyren oder Polypropylen, und Kohlefasern hergestellt werden. Die Formgebung kann dann durch Auftrag einer Beschichtung aus dem Komposit auf den Innenseiten der Probenaufnahmen und/ oder durch Spritzguss erfolgen.
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Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann die Probenaufnahmeeinrichtung mit mindestens einem Kontaktabschnitt ausgestattet sein, der zur elektrischen Verbindung der mindestens einen Wand mit einer Spannungsquelle und/oder einer Messeinrichtung konfiguriert ist. Der Kontaktabschnitt kann z. B. eine elektrisch leitfähige Beschichtung, wie eine Metallschicht, auf dem Grundkörper und/oder eine Verbindungsleitung, wie einen Verbindungsdraht, umfassen. Wenn die Probenaufnahmeeinrichtung mehrere Probenaufnahmen umfasst, sind diese vorzugsweise relativ zueinander elektrisch isoliert angeordnet und jeweils mit einem Kontaktabschnitt ausgestattet. Damit werden vorteilhafterweise parallel, voneinander unabhängig mehrere elektrophysiologische Untersuchungen und/oder Stimulationen in den Probenaufnahmen ermöglicht.
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Allgemein ist die mindestens eine Probenaufnahme so gebildet, dass die biologische Probe, ggf. mit einem flüssigen Medium, an der mindestens einen Wand lokalisiert ist. Die Halterung an der mindestens einen Wand erfolgt unter der Wirkung von der Gravitationskraft (z. B. bei der Ablage von Tropfen auf einem Substrat), von zwischenmolekularen Kräften (z. B. bei der Halterung von hängenden Tropfen) und/oder von Zwangskräften, die von mehreren Wänden auf eine in der Probenaufnahme eingeschlossene Probe ausgeübt werden.
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Wenn der Grundkörper der Erfindung mehrere Wände umfasst, die ein Innenvolumen der Probenaufnahme einschließen, ist der Kohlenstoff-basierte Werkstoff der Wände gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform einstückig gebildet. Das Innenvolumen der Probenaufnahme kann einseitig oder mehrseitig von der mindestens einen Wand begrenzt sein. Die Probenaufnahme kann allseits geschlossen mit mindestens einer verschließbaren Zugriffsöffnung oder ein- oder mehrseitig offen sein. Die Wände begrenzen die Probenaufnahme beispielsweise in Gravitationsrichtung und allseits in Horizontalrichtung (oben offene Probenaufnahme) oder in allen Raumrichtungen (allseits geschlossene Probenaufnahme).
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Vorteilhafterweise ist eine Vielzahl von Formen der Probenaufnahmeeinrichtung mit einer oder mehreren Probenaufnahmen verfügbar. Die Probenaufnahmeeinrichtung kann z. B. eine Schale, optional mit einem Deckel, insbesondere eine Petrischale, ein Substrat, eine Multiwellplatte (insbesondere Mikro- oder Nanotiterplatte), einen Probenbecher, insbesondere in Gestalt eines Becherglases, ein Probenröhrchen, insbesondere in Gestalt eines Reagenzglases oder so genannten Tubes oder eines Röhrchens zur Kryokonservierung (Kryovial), und/oder eine Hohlfaser umfassen. Hohlfasern, die erfindungsgemäß aus dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff hergestellt sind, haben vorteilhafte Anwendungen in einem Hohlfaser-Bioreaktor (Kultivierungsvorrichtung mit einem Behälter, in dem Hohlfasern angeordnet sind, an deren äußeren Oberflächen Zellen adhärieren und der von einem Kultivierungsmedium durchströmt wird). Es kann auch eine Kombination der genannten Formen und/oder eine Anordnung mit einer Vielzahl von Probenaufnahmeeinrichtungen vorgesehen sein. Vorteilhafterweise werden Kohlenstoff-basierte Probenaufnahmeeinrichtungen, insbesondere Zellkulturdisposables, bereitgestellt, die in Größe und Form herkömmlichen Gefäßen gleichen und daher ohne Weiteres in bestehende Prozesse integriert werden können. Insbesondere im Fall der Multiwellplatte kann diese komplett oder ausschließlich auf der Innenseite der Wells (Einzelgefäße, Näpfe) aus dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff hergestellt sein.
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Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Es zeigen schematisch:
- 1: eine Perspektivansicht einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Probenaufnahmeeinrichtung in Gestalt einer Petrischale;
- 2A und 2B: Seitenansichten einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Probenaufnahmeeinrichtung in Gestalt eines Kryoröhrchens;
- 3 und 4: Perspektivansichten einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Probenaufnahmeeinrichtung in Gestalt einer Multiwellplatte;
- 5: eine Illustration einer elektrophysiologischen Messung unter Verwendung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Probenaufnahmeeinrichtung;
- 6: eine Illustration einer optischen Messung unter Verwendung einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Probenaufnahmeeinrichtung; und
- 7: eine Ausführungsform der Erfindung, bei der eine Vielzahl von Probenaufnahmeeinrichtungen in Gestalt von Hohlfasern in einem Bioreaktor angeordnet sind.
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Ausführungsformen der Erfindung werden im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf Ausführungsform der erfindungsgemäßen Probenaufnahmeeinrichtung in Gestalt einer Petrischale, eines Kryoröhrchens und einer Multiwellplatte beschrieben. Es wird betont, dass die Umsetzung der Erfindung nicht auf diese Varianten beschränkt ist, sondern entsprechend mit anderen Gefäßformen, wie z. B. einem Becher, einem Kolben, einem Hohlrohrreaktor o. dgl., oder einer Probenaufnahmeeinrichtung in Gestalt eines flachen Substrats anwendbar ist. Des Weiteren sind Abwandlungen der Dimensionen und/oder Formen der Probenaufnahmeeinrichtung und/oder der einzelnen Probenaufnahmen, insbesondere zur Anpassung an eine spezielle Anwendung, möglich. Einzelheiten der Prozessierung und/oder Untersuchung biologischer Proben werden hier nicht beschrieben, da sie an sich von herkömmlichen Techniken bekannt sind.
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1 zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Probenaufnahmeeinrichtung 100 in Gestalt einer Petrischale 101. Die Form und Größe der Petrischale 101 kann gewählt sein, wie es von herkömmlichen Petrischalen bekannt ist. Es können insbesondere eine Höhe von 1 cm und ein Durchmesser von 3 bis 12 cm vorgesehen sein. Die Petrischale 101 umfasst einen Grundkörper 10 in Gestalt eines Schalenteils, das die Probenaufnahme 12 für die biologische Probe 1 bildet. Die Probenaufnahme wird 12 von Wänden 11 begrenzt, die den Schalenboden und die seitlich umlaufende Schalenwand z. B. aus Glas oder Kunststoff umfassen. Auf der Innenseite der Wände 11 ist eine Beschichtung 13 aus Kohlenstofffaser-verstärktem Kunststoff vorgesehen. Auf dem Schalenboden kann ein fester, künstlicher Nährboden zur Kultur von z. B. Zellen oder Zellgewebe angeordnet sein.
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Des Weiteren ist die Petrischale 101 vorzugsweise mit einem schließenden Deckelteil 14 ausgestattet. Das Deckelteil 14 ist zur Illustration des Inneren der Petrischale 101 durchsichtig gezeigt, besteht aber wie das Schalenteil aus Kunststoff oder Glas mit einer Innenbeschichtung aus Kohlenstofffaser-verstärktem Kunststoff. Besonders bevorzugt ist das Deckelteil 14 flüssigkeitsdicht mit dem Grundkörper 10 (Schalenteil) koppelbar.
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2 zeigt zwei Varianten eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Probenaufnahmeeinrichtung 100 in Gestalt eines Kryoröhrchens 102. Gemäß 2A umfasst das Kryoröhrchen 102 außen Kunststoff oder Glas und innen eine Beschichtung 13 aus dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff, z. B. Kohlenstofffaser-verstärktem Kunststoff, während gemäß 2B das gesamte Kryoröhrchen 102 aus dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff hergestellt ist. Im Einzelnen umfasst das Kryoröhrchen 102 einen Grundkörper 10 in Gestalt eines einseitig geschlossenen Probenröhrchens mit einer zylinderförmigen, am unteren Ende (Boden) geschlossenen Wand 11. Das Innere des Probenröhrchens bildet die Probenaufnahme 12. Am oberen Ende des Probenröhrchens ist ein flüssigkeitsdicht schließendes Deckelteil 14 befestigt. Das Kryoröhrchens 102 hat z. B. einen Innendurchmesser von 11 mm und eine axiale Länge von 4.1 cm.
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Weitere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Probenaufnahmeeinrichtung 100 in Gestalt einer Multiwellplatte 103 sind schematisch in den 3 und 4 gezeigt. Im Grundkörper 10, der eine Grundplatte der Multiwellplatte 103 bildet, ist eine Anordnung von Probenaufnahmen 12 (Wells) vorgesehen. Die Zahl und Größe der Probenaufnahmen 12 ist gewählt, wie an sich von herkömmlichen Mikro- oder Nanotiterplatten bekannt ist. Die Multiwellplatte 103 weist ferner ein Deckelteil 14 auf, mit dem die Probenaufnahmen 12 abgedeckt und ggf. flüssigkeitsdicht verschlossen werden. Gemäß 3 ist die gesamte Multiwellplatte 103 aus dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff, z. B. aus pyrolytischem Kohlenstoff oder Siliziumkarbid, hergestellt. Gemäß 4 sind nur die Probenaufnahmen 12 der Multiwellplatte 103 und die zu den Probenaufnahmen 12 weisende Seite des Deckelteils mit dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff, z. B. einer Schicht aus Kohlenstofffaser-verstärktem Kunststoff versehen, während die übrige Grundplatte und das übrige Deckelteil aus Kunststoff oder Glas hergestellt sind. Um die Probenaufnahmen 12 auch bei Anwendung der Multiwellplatte 103 mit geschlossenem Deckelteil 14 voneinander elektrisch zu isolieren, kann das Deckelteil 14 mit einer strukturierten, auf die Öffnungen der Probenaufnahmen 12 beschränkten Beschichtung aus dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff versehen sein.
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4 illustriert des Weiteren Kontaktabschnitte 30, welche metallische Leiterstreifen auf der Oberfläche des Haltekörpers 10 umfassen. Die Leiterstreifen sind voneinander getrennt jeweils mit einer der Probenaufnahmen 12 elektrisch verbunden. Obwohl in 4 aus Übersichtlichkeitsgründen nur für die erste Reihe von Probenaufnahmen 12 gezeigt ist, kann vorzugsweise jede Probenaufnahme 12 mit einem zugehörigen Kontaktabschnitt 30 zur Verbindung mit einer Spannungsquelle und/oder einer Messeinrichtung 40 (siehe 5) ausgestattet sein. Vorteilhafterweise werden damit spezifische elektrische Messungen und/oder Stimulationen in den einzelnen Probenaufnahmen 12 ermöglicht. Alternativ können die Probenaufnahmen 12 der Multiwellplatte 103 gruppenweise oder alle gemeinsam über mehrere oder einen einzigen Kontaktabschnitt 30 mit der Spannungsquelle und/oder Messeinrichtung koppelbar sein.
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In der schematischen Schnittansicht der Probenaufnahmeeinrichtung 100 gemäß 5 sind weitere Merkmale bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung gezeigt, die einzeln oder in Kombination bei den verschiedenen Varianten der Probenaufnahmeeinrichtung 100 realisiert werden können. In der Probenaufnahme 12, von der nur die untere Wand 11 (Bodenabschnitt) gezeigt ist, befindet sich eine biologische Probe mit mindestens einer biologischen Zelle 2 in einem flüssigen Medium 3, z. B. Kultivierungsmedium und/oder Medium mit Differenzierungsfaktoren.
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Der Kohlenstoff-basierte Werkstoff der Wand 11 weist auf seiner inneren, zur Probenaufnahme 12 weisenden Oberfläche eine Oberflächenstruktur 20 mit säulenförmigen Vorsprüngen 21 des Kohlenstoff-basierten Werkstoffs auf. Die Vorsprünge 21 haben zum Beispiel eine Höhe von 2 µm, eine Querschnittsdimension, z. B. Durchmesser, von 5 µm und einen gegenseitigen Mitte-Mitte-Abstand von 20 µm. In 5 sind alle Vorsprünge 21 mit einer gleichen Höhe so dimensioniert, dass die freien Enden der Vorsprünge 21 eine ebene Trägerfläche zur adhärenten Aufnahme der biologischen Probe, wie z. B. die adhärente Zelle 2 aufspannen. Alternativ können die Vorsprünge 21 verschiedene Höhen aufweisen, wodurch eine Adhärenz von Zellen an der Oberfläche gesteigert werden kann. Die biologische Zelle 2 berührt die Vorsprünge 21 in lateraler Richtung entlang der Oberfläche über eine Kontaktfläche mit einer typischen Ausdehnung von z. B. 40 µm und wird dadurch von mehreren Vorsprünge 21 getragen.
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Die freien Enden der Vorsprünge 21 oder deren Spitzen oder Kanten bilden geometrische Oberflächenmerkmale (Kopplungspunkte), an denen die adhärente Kopplung biologischer Zellen gefördert ist. Die Adhärenz kann noch gesteigert werden, indem die Vorsprünge 21 mit einer funktionellen Beschichtung zur Adhärenzsteigerung, z. B. aus Fibronektin, Laminin oder synthetischen RGD-Peptidsequenzen versehen sind.
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5 zeigt des Weiteren schematisch eine Messeinrichtung 40 für elektrische Messungen, die über Verbindungsleitungen 41 einerseits mit dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff der Wand 11 und andererseits mit dem Innenraum der Probenaufnahme 12, z. B. direkt mit der biologischen Zelle 2 oder mit dem flüssigen Medium 3, verbunden sind. Der Kontakt mit dem Kohlenstoff-basierten Werkstoff kann über einen Kontaktabschnitt (nicht dargestellt, siehe 4) realisiert sein. Die Messeinrichtung 40 umfasst z. B. eine Spannungsmesseinrichtung zur Ableitung von Membranpotentialen oder- strömen von der Zelle 2. Abweichend von 5 können andere Anordnungen von einer oder mehreren Messeinrichtungen und einer oder mehreren Verbindungsleitungen vorgesehen sein.
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6 illustriert schematisch eine Messeinrichtung 40 für optische Messung an der biologischen Probe in Gestalt einer Zellkultur 4 in der Probenaufnahme 12 gemäß einer weiteren Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Probenaufnahmeeinrichtung 100. Die Messeinrichtung 40 umfasst eine oder mehrere Anregungslichtquellen 42, wie z. B. Laserdioden, und eine oder mehrere Sensoreinrichtungen 43, wie z. B. Photodioden, spektral auflösende Detektoren und/oder Sensorkameras. Die Anregungslichtquellen 42 und die Sensoreinrichtungen 43 sind über Lichtleiter mit dem Innenraum der Probenaufnahmen 12 optisch gekoppelt. Störendes Fremdlicht wird im Innenraum der Probenaufnahmen 12 durch die Bildung der Wand 11 und des Deckels 14 mit dem lichtundurchlässigen Kohlenstoff-basierten Werkstoff ausgeschlossen. Die Anregungslichtquellen 42 und die Sensoreinrichtungen 43 sind des Weiteren mit einer Steuereinrichtung (nicht dargestellt) verbunden, die zur Ansteuerung der Anregungslichtquellen 42 und zur Aufnahme und Auswertung von Sensorsignalen konfiguriert ist. Mit der Messeinrichtung 40 für optische Messung können z. B. Fluoreszenzmessungen in der Probenaufnahme durchgeführt werden.
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Gemäß der schematischen Teilansicht in 7 umfasst eine weitere Ausführungsform der Erfindung eine Vielzahl von Hohlfasern 104, die in einem Bioreaktor 200 angeordnet sind. Die Hohlfasern 104 sind zumindest an ihren Oberflächen z. B. aus mit Kohlenstofffasern verstärktem Kunststoff hergestellt und/oder mit Kohlenstoff beschichtet, und sie haben einen Innendurchmesser im Bereich von z. B. 0.1 mm bis 5 mm. Der Bioreaktor 200 umfasst in an sich bekannter Weise einen Behälter, z. B. in Form eines Hohlzylinders, mit einer allseits geschlossenen Behälterwand (hier offen gezeigt). Die Behälterwand ist mit Fluidik- und Sensoranschlüssen und optional mit Fenstern und/oder weiteren Zugriffsöffnungen ausgestattet. Die Hohlfasern 104 erstrecken sich in axialer Richtung des Bioreaktors 200. Im Bioreaktor sind zum Beispiel 10000 Hohlfasern 104 angeordnet, und er ist mit einem Kultivierungsmedium gefüllt, welches die Hohlfasern 104 umspült. Vorzugsweise ist eine Durchströmung des Bioreaktors 200 mit dem Kultivierungsmedium vorgesehen.
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Anwendungen der erfindungsgemäßen Probenaufnahmeeinrichtung wurden bei der Vitrifikation von biologischen Proben getestet. Bei der Vitrifikation z. B. von Drosophila Melanogaster-Embryonen (DM-Embryonen, humanen Stammzellen (embryonal, adult, induziert), differenzierten Zellen, insbesondere solche, die elektrophysiologisch untersucht werden können (Kardiomyozyten, neuronale Zellen), Eizellen, Spermienzellen und Gewebe (z.B. Biopsieproben) hat sich insbesondere ein SiC-Substrat wegen des schnellen Wärmeaustauschs mit einer mit der Probenaufnahmeeinrichtung gekoppelten Kühleinrichtung als vorteilhaft erwiesen.
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Weitere Anwendungen der erfindungsgemäßen Probenaufnahmeeinrichtung bei elektrophysiologischen Messungen waren ebenfalls erfolgreich. Elektrophysiologischen Messungen gehen oft langwierige Kultivierungs- und Differenzierungsprotokolle mit einer Dauer im Bereich von Wochen bis Monaten voraus, bis die Zellen den nötigen Reifegrad haben, der sich durch das Ausbilden besonderer Kanäle oder Kontakte auszeichnet. Die Probenaufnahmeeinrichtung bietet verschiedene Möglichkeiten, elektrophysiologische Signale über eine größere Fläche abzuleiten, als das beim gegenwärtigen Stand der Technik möglich ist. Z. B. werden bisher bei Ableitungen gemäß der Patch-Clamp-Methode typischerweise elektrophysiologische Signale nur einer Zelle gemessen. Die erfindungsgemäße Technik erlaubt die parallele Messung an mehreren Zellen. Darüber hinaus können Zellen, die adhärent in der Probenaufnahmeeinrichtung wachsen, über elektrische Signale manipuliert werden, und dadurch können Differenzierungsschritte beeinflusst werden. Durch die Lichtundurchlässigkeit der Probenaufnahmeeinrichtung können fluoreszenzbasierte Messungen des Kalzium-Efflux ohne Hintergrundrauschen aufgenommen werden. Insbesondere für die Patch-Clamp-Methode werden Zellen im gleichen Kultivierungsgefäß, wie z. B. einer Petrischale mit 35 mm Durchmesser, zunächst kultiviert und dann vermessen. Für elektrophysiologische Messungen haben sich insbesondere Wände der Probenaufnahmen aus pyrolytischem Kohlenstoff als vorteilhaft erwiesen.
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Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination oder Unterkombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
