JP2002357604A - 反応容器及びこれを用いる生物学的に活性な物質の分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 一度に複数の検体それぞれについて複数の生
物学的活性を測定することができる反応容器及びこれを
用いる生物学的に活性な物質の分析方法を提供する。 【解決手段】 生物学的に活性な物質を固定化すること
ができる担体である底板と、この底板に着脱自在に密着
させることのできる蓋部とを有し、この蓋部は、底板と
ともに容器の壁面を構成する筒孔を複数有し、底板と蓋
部との密着により複数の容器を形成することができる反
応容器を構成し、この反応容器を用いて、担体に固定化
された生物学的に活性な第１の物質と、この第１の物質
に特異的に結合し得る第２の物質とを反応させ、第１の
物質と第２の物質との結合を介して担体に間接的に結合
した第２の物質又は結合しない第２の物質を検出するこ
とにより、試料中の第１の物質又は第２の物質を分析す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、多種類の生物学的
に活性な物質を用い多数の検体を効率的に測定すること
のできる反応容器及び測定方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】生物学的な研究開発、医療検査分野など
においては、有底のくぼみ（以下「ウェル」ともいう）
を複数有するマイクロタイタープレートが汎用されてい
る。上記のような分野では、抗体、タンパク質、核酸な
ど生物学的に活性な物質を、マイクロタイタープレート
の各ウェルに注入し、ウェルの内面に前記物質を固定化
し、各ウェルに前記物質に特異的に結合する抗原、抗
体、核酸などを含む検体溶液を注入して反応させること
により、特異的な反応を起こさせ、測定対象の物質存在
の有無又は存在量を測定することが通常行われている。

【０００３】しかしながら、汎用マイクロタイタープレ
ートの形状では筒部が妨げとなり、１つのウェルの底面
に複数種類の生物学的活性物質を固定する事ができない
ため、１ウェルに対して一種類の生物学的に活性な物質
についてしか調べることができず、複数の生物学的に活
性な物質について調べるためには複数のウェルが必要と
なる。このため、必要となる検体の量も増加するため、
微量しか採取できないサンプルに対しては測定できる種
類が限定されるという欠点がある。

【０００４】一方、複数の遺伝子情報を一度に解析する
方法としてはＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイを用
いる方法がある。

【０００５】ＤＮＡチップはＵ．Ｓ．Ｐａｔ６０２２９
６３に開示された方法であり、ＤＮＡマイクロアレイは
Patrick O. Brownらによって行われている方法（http:/
/cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/index.html）であ
る。これらは共に、ガラスなどの基板平板上に高密度に
ＤＮＡを固定したものであり、ハイブリダイゼーション
を多数の遺伝子又はＤＮＡマーカーに対して一度に行う
ことを可能にした技術である。

【０００６】ハイブリダイゼーション技術とは、一重鎖
のＤＮＡ又はＲＮＡが二重鎖を形成する際に、相補的な
配列同士が特異的に二重鎖形成を行う性質を利用し(ア
デニン−チミン、シトシン−グアニン)塩基配列を決定
する技術である。上記のＤＮＡチップやＤＮＡマイクロ
アレイには１枚当たり多数のＤＮＡが固定されているた
め、上記の方法によれば一度のハイブリダイゼーション
実験によって多数の情報が得られる。

【０００７】しかしながら、従来のＤＮＡチップやＤＮ
Ａマイクロアレイ技術では、ＤＮＡチップやＤＮＡマイ
クロアレイが平板であり、複数種類の検体を上記チップ
やマイクロアレイ上に供給した場合に、検体溶液の混合
を防ぐことができないことから、複数種類の検体を同時
に１枚のチップやアレイで測定できない欠点を持つ。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、一度に複数
の検体それぞれについて複数の生物学的活性を測定する
ことができる反応容器及びこれを用いる生物学的に活性
な物質の分析方法を提供することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決するため検討を行った結果、マイクロタイタープレ
ートのウェル底部を取り外せるようにし、ウェルの底部
に複数の生物学的活性物質を固定すると、一度に複数の
検体について複数の生物学的活性を測定することもでき
ることを見出し、本発明の完成に至った。

【００１０】すなわち本発明は、担体に固定化された生
物学的に活性な第１の物質と、この第１の物質に特異的
に結合し得る第２の物質とを反応させ、第１の物質と第
２の物質との結合を介して担体に間接的に結合した第２
の物質又は結合しない第２の物質を検出することによ
り、試料中の第１の物質又は第２の物質を分析するため
に用いる反応容器であって、この反応容器は、生物学的
に活性な物質を固定化することができる担体である底板
と、この底板に着脱自在に密着させることのできる蓋部
とを有し、この蓋部は、底板とともに容器の壁面を構成
する筒孔を複数有し、底板と蓋部との密着により複数の
容器を形成することができる反応容器である。

【００１１】上記の構成によれば、底板と蓋部とが着脱
自在であることから、生物学的に活性な物質を底板に任
意に固定化することが可能となる。また、この底板に上
記蓋部を密着させることにより試料溶液が注入される容
器を形成し、それぞれの容器に試料溶液を注入した場合
に底板上での試料溶液の混合が防止されることから、一
度に複数の検体それぞれについて複数の生物学的活性を
測定することが可能となる。

【００１２】また上記の構成によれば、前記生物学的に
活性な物質の固定後で検体の容器への注入前や、生物学
的に活性な物質と検体との結合後等、任意の時点で底板
のみを洗浄することが可能であることから、余剰分の検
体や非特異反応による影響を分析前に取り除くことがで
き、より精度の高い分析を行うことが可能となる。

【００１３】また本発明は、生物学的に活性な第１の物
質、及び生物学的に活性な第２の物質が核酸又はタンパ
ク質であることが好ましい。また底板は、蓋部の筒孔の
それぞれに対応する複数の容器底部を有し、各々の容器
底部には複数種の生物学的に活性な物質、より具体的に
は核酸又はタンパク質、が区画して固定されることが、
生物学的に活性な物質の分析においてより好ましい。

【００１４】また本発明は、担体に固定化された生物学
的に活性な第１の物質と、この第１の物質に特異的に結
合し得る第２の物質とを反応させ、第１の物質と第２の
物質との結合を介して担体に間接的に結合した第２の物
質又は結合しない第２の物質を検出することにより、試
料中の第１の物質又は第２の物質を分析するために用い
る反応用器具であって、この反応用器具は、生物学的に
活性な物質を固定化することができる担体に着脱自在に
密着させることができ、担体とともに容器の壁面を構成
する筒孔を複数有し、担体と反応用器具との密着により
複数の容器を形成することができる反応用器具を提供す
る。

【００１５】また本発明は、担体に固定化された生物学
的に活性な第１の物質と、この第１の物質に特異的に結
合し得る第２の物質とを反応させ、第１の物質と第２の
物質との結合を介して担体に間接的に結合した第２の物
質又は結合しない第２の物質を検出することにより、試
料中の第１の物質又は第２の物質を分析する方法であっ
て、前述した反応容器を構成する底板の、蓋部の筒孔の
それぞれに対応する位置に複数種の生物学的に活性な物
質を区画して固定するステップと、底板に蓋部を密着さ
せ、各々の筒孔毎に異なる生物学的に活性な物質を含む
溶液を注入して反応させるステップとを、少なくとも含
む分析方法を提供する。以下、本発明を詳細に説明す
る。

【００１６】

【発明の実施の形態】＜反応容器＞本発明の反応容器は
底板を取り外すことができる。すなわち本発明の反応容
器は、生物学的活性物質を固定化することができる底板
と、この底板との密着により複数の容器を形成する蓋部
とからなる。底板は、生物学的活性物質を固定化するこ
とができる担体のみから構成され、生物学的活性物質を
直接固定化するものであっても良いし、担体とこの担体
を担持して支持する基材とから構成され、担体を介して
生物学的活性物質を基材に固定化するものであっても良
い。

【００１７】上記底板の材質は、基本的に溶剤不溶であ
りかつ常温若しくはその付近の温度範囲内（０〜１００
℃）で固体又はゲル状であるものであれば特に制限され
ない。尚、底板が溶剤不溶であるとは、担体への生物学
的活性物質の固定化や、その後の生物学的活性の分析等
の反応容器の使用に伴い各過程で用いられる水溶性溶
剤、有機溶剤等の各種溶剤に実質的に不溶性であること
を言う。

【００１８】また、基材に担体を担持させる場合の「担
持」とは、担体に生物学的活性物質を固定化する際や、
生物学的活性物質の分析等に用いられる水溶性溶剤、有
機溶剤等の各種溶剤中で、基材から担体が実質的に脱離
しないことを意味する。

【００１９】担体としては、担体自体が生物学的活性物
質に結合性を有しても良いし、生物学的活性物質に結合
性を有するリガンドを介して生物学的活性物質を固定化
できるものであっても良い。

【００２０】また上記担体は、上記基材上に担持される
限り、単に物理的な接着性を利用して担持されていても
良いし、また化学的に共有結合等を介して担持されてい
ても良い。また上記担体は、必要に応じ基材上の全面に
おいて担持されていても良いし、その一部において担持
されていても良い。

【００２１】上記担体の材質としては、有機低分子、プ
ラスチック、無機高分子、金属、天然高分子及びセラミ
ック等が挙げられる。

【００２２】上記有機低分子として具体的には、リガン
ドとして機能する化学構造を有する化合物、例えばカル
ボジイミド基含有化合物、イソシアネート基含有化合
物、窒素イペリット基含有化合物、アルデヒド基含有化
合物及びアミノ基含有化合物等が挙げられる。

【００２３】また、上記プラスチックとして具体的に
は、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、
ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキ
シ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポ
リフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド
及びアクリル樹脂等が挙げられる。

【００２４】また、上記無機高分子として具体的には、
ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト
等が挙げられる。

【００２５】また、上記金属として具体的には、金、白
金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石及びパラマグネッ
ト等が挙げられる。

【００２６】また、上記天然高分子として具体的には、
ポリアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギ
ン酸及びそれらの誘導体等が挙げられる。

【００２７】また、上記セラミックとして具体的には、
アパタイト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ
素及び炭化ホウ素等が挙げられる。

【００２８】前述した基材の材質として具体的にはプラ
スチック、無機高分子、金属、天然高分子及びセラミッ
ク等が挙げられる。

【００２９】上記プラスチックとして具体的には、ポリ
エチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロ
ピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、
ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化
ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアク
リル樹脂等が挙げられる。

【００３０】また、上記無機高分子として具体的には、
ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト
等が挙げられる。

【００３１】また、上記金属として具体的には、金、白
金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石及びパラマグネッ
ト等が挙げられる。

【００３２】また、上記天然高分子として具体的にはポ
リアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン
酸及びそれらの誘導体等が挙げられる。

【００３３】また、セラミックとして具体的にはアパタ
イト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素及び
炭化ホウ素等が挙げられる。

【００３４】なお底板の選定には、上記担体の使用の有
無や生物学的活性物質の固定化等の他にも、検体の検出
や分析に好適な材質のものを用いることが好ましい。例
えば生物学的活性の分析において透過光測定を行う場合
では、ガラスやプラスチック、及び担体としてプラスチ
ック層を表面に有するガラス等、光透過性を有する底板
を用いることが好ましい。

【００３５】本発明に用いられる蓋部は、前述した底板
に着脱自在に密着させることができ、底板とともに容器
の壁面を構成する筒孔を複数有し、底板との密着により
複数の容器を形成するものであり、生物学的活性物質の
特異的反応時や、生物学的活性を分析する際、試料溶液
を保持する役割を果たすものであって、基本的に溶剤不
溶でありかつ常温若しくはその付近の温度範囲内（０〜
１００℃）で固体又はゲル状であるものであれば特に制
限されない。尚、蓋部が溶剤不溶であるとは、底板に固
定される生物学的活性物質と容器に注入される分析対象
物質との特異的反応時や、分析対象物質の生物学的活性
を測定する際の各過程で用いられる水溶性溶剤、有機溶
剤等の各種溶剤に実質的に不溶性であることを言う。

【００３６】このような蓋部の材質として具体的にはプ
ラスチック、無機高分子、金属、天然高分子及びセラミ
ック等が挙げられる。

【００３７】上記プラスチックとして具体的には、ポリ
エチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロ
ピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、
ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化
ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド及びアク
リル樹脂等が挙げられる。

【００３８】また、上記無機高分子として具体的には、
ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト
等が挙げられる。

【００３９】また、上記金属として具体的には、金、白
金、銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石及びパラマグネッ
ト等が挙げられる。

【００４０】また、上記天然高分子として具体的にはポ
リアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン
酸及びそれらの誘導体等が挙げられる。

【００４１】また、上記セラミックとして具体的にはア
パタイト、アルミナ、シリカ、炭化ケイ素、窒化ケイ素
及び炭化ホウ素等が挙げられる。

【００４２】蓋部に設けられる筒孔は、底板に固定され
る生物学的活性物質と分析対象物質との反応、及び分析
対象物質の生物学的活性の分析に必要な操作が行える範
囲の容器を形成するものであればその形状やサイズに特
に制限はない。このような筒孔の具体例には、平らな壁
面を有する筒孔や、凹凸をつけた壁面を有する筒孔等が
挙げられる。

【００４３】また筒孔の数量は複数であれば特に限定さ
れないが、前記底板と蓋部との密着により筒孔が壁面を
構成する容器の容器密度（単位面積当たりの容器数）は
通常０．１容器/ｃｍ²〜１０００容器/ｃｍ²程度であ
り、好ましくは０．５容器/ｃｍ²〜５００容器/ｃｍ²程
度である。０．１容器/ｃｍ²より低密度であると１回の
測定に必要とされる試料検体量が増え、また１０００容
器/ｃｍ²より高密度となると容器中に試料溶液等を分注
する際の操作性が悪くなる傾向にある。

【００４４】上記のような筒孔を有する蓋部としてより
具体的には、プラスチックチューブの束、筒孔を穿けた
アクリル板、市販のマイクロタイタープレートの底部を
切断したもの等を用いることができる。

【００４５】なお前記底板の形状及び大きさは、上記蓋
部と密着して容器を形成することができ、固定された生
物学的活性物質と分析対象物質との反応、及びその分析
に必要な操作が行える範囲で上記のような所望の容器を
形成することができる範囲であれば特に制限されない。

【００４６】また底板及び蓋部の密着により形成される
容器には、容器の容積、容器底部の面積、及び必要に応
じて電極等をつけることも可能である。このような電極
は、蒸着やメッキによって所望の形状に形成された金属
層や、所望の形状に塗布、固定された有機系導電性物質
層等により構成することができる。

【００４７】本発明の反応容器は、底板と蓋部とを密着
させることにより容器を形成するが、底板と蓋部とは着
脱自在である。底板と蓋部との密着については、蓋部に
十分な重量がある場合では蓋部の自重により底板と密着
させることができるし、容器底部に当たる部分が突出又
は陥没した形状の底板とこの突起（又は窪み）部分に筒
孔が嵌合する構造や、底板と蓋部とが接触部分に塗布さ
れた粘着剤により密着する構造や、底板と蓋部とが固定
具によって密着して固定される構造等によって密着させ
ることもできる。なお容器底部は平面に限定されず、例
えば容器底部中心部が突出又は陥没する形状に形成され
ていても良い。

【００４８】上記粘着剤の材質は粘着性があれば特に制
限されないが、生物学的に活性を有さない物質や、前記
特異的反応に影響を及ぼさない物質であることが好まし
い。具体的にはエポキシ系樹脂、ポリビニルアルコール
及びデンプン糊等が挙げられる。また粘着剤は一種を用
いても良く、二種以上を用いても良い。

【００４９】上記固定具は底板と蓋部とを密着した状態
で固定できれば特に制限はないが、底板と蓋部とが互い
に接近する方向へ付勢しつつ両者を固定するものである
ことが好ましい。このような固定具として具体的にはゴ
ムバンド等のように伸縮自在な材質で構成される固定具
や、クリップ及びねじ等のように定形性のある材質で構
成される固定具が挙げられる。また、固定具は一種を用
いても良く、二種以上を用いても良い。

【００５０】上記ゴムのように伸縮自在な材質の固定具
としては、その材質は伸縮性のあるものであれば特に制
限はない。具体的には天然ゴム、シリコーンゴム及びフ
ッ素ゴム等が挙げられる。

【００５１】また、クリップやねじ等のように定形性の
ある材質の固定具としては、底板と蓋部とを固定するの
に十分な強度を有するものであればその材質は特に制限
はない。具体的には金属、プラスチック、無機高分子及
び天然高分子が挙げられる。

【００５２】上記金属として具体的には、金、白金、
銀、銅、鉄、アルミニウム、磁石及びパラマグネット等
が挙げられる。

【００５３】また、上記プラスチックとして具体的に
は、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、
ポリプロピレン、ポリアミド、フェノール樹脂、エポキ
シ樹脂、ポリカルボジイミド樹脂、ポリ塩化ビニル、ポ
リフッ化ビニリデン、ポリフッ化エチレン、ポリイミド
及びアクリル樹脂等が挙げられる。

【００５４】また、上記無機高分子として具体的には、
ガラス、水晶、カーボン、シリカゲル及びグラファイト
等が挙げられる。

【００５５】また、上記天然高分子として具体的にはポ
リアミノ酸、セルロース、キチン、キトサン、アルギン
酸及びそれらの誘導体等が挙げられる

【００５６】分析対象となり得る第１の物質及び第２の
物質は、ともに生物学的に活性な物質であり、かつ互い
に特異的に結合し得る物質であれば特に限定されない。
また第１の物質及び第２の物質は直接的に結合するもの
であっても良いし、他の適当な生物学的活性物質（例え
ば抗原抗体反応における第１抗体等）を介して間接的に
結合するものであっても良い。

【００５７】上記第１の物質及び第２の物質は、上記の
ような物質であれば特に限定されない。第１の物質及び
第２の物質としては、具体的には核酸、タンパク質、
糖、アミノ酸、脂質等が挙げられる。本発明では第１の
物質及び第２の物質が核酸、又はタンパク質であること
がより好ましい。

【００５８】上記核酸には天然又は合成のＤＮＡ（オリ
ゴヌクレオチドを含む）若しくはＲＮＡ（オリゴヌクレ
オチドを含む）が特に制限なく挙げられる。本発明の反
応容器に固定化される核酸は既知の配列を有するもので
あっても、未知の配列を有するものであってもよく、ま
た、一種であっても二種以上であってもよい。二種以上
の核酸を固定化する場合、各核酸は互いに分離された状
態で固定化されていることが望ましい。また、二種以上
の核酸を用いる場合の各核酸の配置等については底板の
使用形態、用途等により適宜選択されうる。

【００５９】上記タンパク質として具体的にはアルブミ
ン、糖タンパク質、ケラチン等が挙げられる。本発明の
反応容器に固定化されるタンパク質は既知の配列を有す
るものであっても、未知の配列を有するものであっても
よく、また、一種であっても二種以上であってもよい。
二種以上のタンパク質を固定化する場合、各タンパク質
は互いに分離された状態で固定化されていることが望ま
しい。また、二種以上の核酸を用いる場合の各タンパク
質の配置等については底板の使用形態、用途等により適
宜選択されうる。

【００６０】また、糖として具体的にはグルコース、ガ
ラクトース、フルクトース等が挙げられる。本発明の反
応容器に固定化される糖は既知のものであっても、未知
のものであってもよく、また、一種であっても二種以上
であってもよい。二種以上の糖を固定化する場合、各糖
は互いに分離された状態で固定化されていることが望ま
しい。また、二種以上の糖を用いる場合の各糖の配置等
については底板の使用形態、用途等により適宜選択され
うる。

【００６１】また、アミノ酸として具体的にはグリシ
ン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、アス
パラギン酸等が挙げられる。本発明の反応容器に固定化
されるアミノ酸は一種であっても二種以上であってもよ
い。二種以上のアミノ酸を固定化する場合、各アミノ酸
は互いに分離された状態で固定化されていることが望ま
しい。また、二種以上のアミノ酸を用いる場合の各アミ
ノ酸の配置等については底板の使用形態、用途等により
適宜選択されうる。

【００６２】また、脂質として具体的にはリポ多糖、リ
ポタンパク質等が挙げられる。本発明の反応容器に固定
化される脂質は既知のものであっても、未知のものであ
ってもよく、また、一種であっても二種以上であっても
よい。二種以上の脂質を固定化する場合、各脂質は互い
に分離された状態で固定化されていることが望ましい。
また、二種以上の脂質を用いる場合の各脂質の配置等に
ついては底板の使用形態、用途等により適宜選択されう
る。

【００６３】上記反応容器の底板に前記第１の物質を固
定化する方法としては公知の方法が用いられる。例えば
（i）物理吸着によって第１の物質を底板に直接固定化
する方法、（ii）アミノ基やアルデヒド基等の各基と共
有結合する基が予め底板に固定されており、この基と前
記各基との共有結合により第１の物質を底板に固定化す
る方法、また（iii）底板と第１の物質との両方と結合
可能な化合物を介して第１の物質を底板に固定する方
法、（iv）底板上で第１の物質を合成する方法等が挙げ
られる。

【００６４】（i）の方法は例えば、核酸を含む溶液を
上記底板上にスポッター又はマイクロピペット等でスポ
ット（滴下）し、これを乾燥させることにより行うこと
ができる。

【００６５】また、（ii）の方法において、アミノ基や
アルデヒド基及びイミノ基と共有結合可能な基として例
えば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、イソシアネ
ート基、イソチオシアネート基、カルボジイミド基等の
官能基が挙げられる。このような官能基を有する底板と
しては、あらかじめ上記官能基を有する材料からなる底
板を用いてもよいし、底板に上記官能基を導入したもの
を用いてもよい。また、このような底板に第１の物質を
固定化する方法は従来公知の方法を用いることができ、
底板が有する官能基に応じて適宜選択される。

【００６６】また、（iii）の方法として核酸の固定を
例に挙げると、ポリ−Ｌ−リジンを用いたPatrick O. B
rownらの方法（http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mgui
de/index.html）や、カルボジイミド基を有する化合物
を用いた方法（特許公開２０００−１４６９７８号公
報）などが挙げられる。このように底板に第１の物質を
固定化する方法は従来公知の方法を用いることができ、
底板が有する官能基に応じて適宜選択される。

【００６７】また、（iv）の方法として核酸を例にとる
とＵ．Ｓ．Ｐａｔ６０２２９６３に開示されている方法
等によって製造できる。このように底板上で第１の物質
を合成する方法には公知の方法を用いることができる。

【００６８】前記底板は、前記蓋部の筒孔のそれぞれに
対応する複数の容器底部を有しており、第１の物質は、
全ての容器において同じ物質であっても良いし、容器毎
に異なる物質であっても良い。また個々の容器底部に一
種のみの第１の物質が固定されても良いし、容器底部に
複数種の第１の物質が固定されても良く、容器底部に複
数種第１の物質が区画して固定されることがより好まし
い。またこのように区画して固定される複数種の第１の
物質としては核酸又はタンパク質がより好ましい。

【００６９】なお容器底部には、例えば核酸とタンパク
質等、異種の物質を第１の物質として同一容器底部に区
画して固定しても良い。このような形態によれば、生物
学的活性が未知の分析対象物質を分析する場合に有効で
ある。

【００７０】＜反応用器具＞本発明の反応用器具は、本
発明の反応容器において前述した蓋部と同じものであ
る。またこの反応用器具と着脱自在に密着させることが
できる担体には、例えば前述したＤＮＡチップや通常Ｄ
ＮＡマイクロアレイ等、担体として用いられるものを用
いることができる。本発明の反応用器具は用いられる担
体に適合するものであれば良い。このように本発明で
は、底板と蓋部の両方ともを製造しなくても、蓋部のみ
を製造するだけでも良い。

【００７１】＜生物学的に活性な物質の分析方法＞本発
明における生物学的に活性な物質の分析方法の一実施形
態を図１に示す。本発明の分析方法では、前述した第１
の物質及び第２の物質を分析するにあたり、前述した反
応容器を構成する底板の、蓋部の筒孔のそれぞれに対応
する位置に複数種の生物学的に活性な物質を区画して固
定するステップと、底板に蓋部を密着させ、各々の筒孔
毎に異なる生物学的に活性な物質を含む溶液（以下、
「試料検体混合液」ともいう）を注入して反応させるス
テップとを少なくとも含む。

【００７２】上記の分析方法によれば、一枚の底板に複
数種の生物学的に活性な物質を区画して固定でき、固定
された物質のそれぞれに試料検体混合液を適用するにあ
たり、それぞれの試料検体混合液が混じり合わないよう
にそれぞれの区画に適用できることから、特定できる生
物学的活性物質が区画毎に決まり、多種類の生物学的活
性物質を効率よく特定することができる。なお上記の分
析方法は、前述したステップの他にも必要に応じて反応
後の反応容器を洗浄するステップ等を含むことができ
る。

【００７３】上記分析方法では、生物学的に活性な物質
として具体的に核酸又はタンパク質が好ましく、さらに
核酸がより好ましい。上記生物学的に活性な物質として
核酸を上記分析方法に適用すると、特定できる塩基配列
が区画毎に決まり、多種類の核酸の塩基配列を効率よく
特定することができる。

【００７４】上記試料検体混合液とは、生物学的活性が
維持されるように通常水又は緩衝液中に検体として前記
第２の物質が含まれている溶液をさす。この緩衝液は公
知の緩衝液を用いることができる。具体的には、核酸を
例にとるとＴＥ緩衝液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．
０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ］等が挙げられる。

【００７５】また、試料検体混合液として核酸、タンパ
ク質、糖、アミノ酸、脂質等の生物学的活性物質を含有
する溶液を特に際限なく挙げることができる。上記試料
検体混合液中に含まれる物質は一種類であっても二種以
上であってもよい。

【００７６】試料検体混合液を本発明の反応容器の各容
器へ供給する方法としては公知の手段を用いることがで
き、自動分注機を用いる方法、ディスペンサを用いる方
法、バブルジェット（登録商標）を用いる方法等がある
が、本発明がこれらに限定されるものではない。

【００７７】本発明の反応容器へ加える試料検体混合液
の量は容器底部を覆い被さる量であれば特に制限されな
いが、通常１ｎＬ〜１０ｍＬ、好ましくは１μＬ〜１ｍ
Ｌである。液量が１μＬ〜１ｍＬであると、第１の物質
と第２の物質との反応が効率的に進む。

【００７８】第１の物質と第２の物質との反応は公知の
各種方法及び、反応条件を採用することができる。核酸
を例にとるとハイブリダイゼーション等であり、タンパ
ク質を例にとると抗原抗体反応等が挙げられる。

【００７９】第１の物質及び第２の物質の分析には、公
知の各種方法及び反応条件を採用することができる。例
えば試料検体混合液に含まれる第２の物質をあらかじめ
蛍光標識しておき、反応後、蛍光スキャナーを用いて蛍
光の有無を測定する方法、免疫染色を用いて発色の有無
を調べる方法等が挙げられる。また標識化合物には従来
より知られている種々の化合物、例えばＣｙ５、ＦＩＴ
Ｃ（フルオロセインイソチオシアネート）を用いること
ができる。

【００８０】上記の反応や分析等の各ステップにおいて
は、容器中の試料溶液が他の試料と混合しても問題ない
操作は、蓋部を底板に密着させた状態でも、蓋部を底板
から取り外した状態でも行うことができる。このような
操作としては、例えば単一の試料混合液を用いる場合
に、底板を単一の容器に浸漬する操作等を挙げることが
できる。

【００８１】また分析の際には蓋部をはずし底板のみを
検出器にセットすることができ、反応容器用検出器を用
意する必要がなく、汎用の検出器によって測定結果を調
べることができる。

【００８２】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００８３】（１）反応容器の作製 図２に示すように、１．２ウェル/ｃｍ²のポリスチレン
製９６ウェルマイクロタイタープレート（Greiner社
製、ウェル直径：７ｍｍ、ウェル深さ：１０ｍｍ）を底
より５ｍｍの位置でウェル上縁に対して水平に切り、反
応容器とした。切断したマイクロタイタープレートの下
部を底板、上部を蓋部とした。

【００８４】（２）底板への第１の物質の固定 底板をカルボジイミド樹脂でコートし、一方では配列番
号１、配列番号２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドを１００ｎｇ／μＬになるように２ＭＮａＣｌに
溶解しＤＮＡ溶液とした。次にスポッター（Pixsys:Car
tesian社製）を用い、各ウェルの底部であった部分のそ
れぞれ２点ずつ各ＤＮＡ溶液をスポットした。スポッタ
ーを用いてＤＮＡ溶液をスポットした際のスポット直径
は２００μｍであった。

【００８５】これを乾燥機に入れ、３７℃にて１５分間
乾燥した。次いで３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を
含む緩衝液Ａ（０．２Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリ
ス塩酸（ｐH７．５）、０．０５％トライトンＸ−１０
０）に上記の底板を浸し、３７℃にて１５分間乾燥し
た。次に、この底板をＴＥ緩衝液で洗浄後、３７℃にて
１５分間乾燥した。

【００８６】（３）ハイブリダイゼーション ポリビニルアルコールを用いて上記の底板と蓋部とを密
着させた。同一のＤＮＡ溶液をスポットした二つの容器
の一方にはハイブリダイゼーション溶液Ａ［３×ＳＳＣ
（ＳＳＣ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍクエン
酸ナトリウム）、１０％デキストラン］を、隣り合うも
う一方の容器にはハイブリダイゼーション溶液Ｂ［３×
ＳＳＣ（ＳＳＣ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．１５Ｍ
クエン酸ナトリウム）、１０％デキストラン、１ｐｍｏ
ｌ Ｃｙ５標識プローブ］をそれぞれ３０μＬずつ（全
部で４箇所）のせ、４２℃のウォーターバスで１晩加熱
した。なおＣｙ５標識プローブには、Ｃｙ５（インドジ
カルボシアニン色素）で標識したプローブを用いてＲＮ
Ａポリメラーゼβサブユニット遺伝子をＰＣＲ（ポリメ
ラーゼ連鎖反応）により増幅し、得られた増幅産物（約
１１０ｂ）を用いた。

【００８７】（４）ポストハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションの後、以下の条件でポストハイ
ブリダイゼーションを行い、非特異的に吸着したプロー
ブを除去した。 （i）２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；室温、５分間、２
回 （ii）０．３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ；４０℃、５分
間、２回 （iii）２×ＳＳＣ；室温、５分間

【００８８】（５）ハイブリダイゼーションシグナルの
検出 反応容器の蓋部をはずし、底板を２６ｍｍ×７６ｍｍの
大きさに切り、SCAN ARRAY（GSI Lumonics社製）を用い
て切断した底板について蛍光測定した。その結果を表１
に示す。表１中の溶液Ａはハイブリダイゼーション溶液
Ａを、溶液Ｂはハイブリダイゼーション溶液Ｂをさす。

【００８９】

【表１】 ○：シグナルが観察された。 ×：シグナルが観察されなかった。

【００９０】以上の結果から本発明の反応容器は容器の
溶液の漏れがなく、かつ特異的なハイブリダイゼーショ
ンを行えることがわかる。

【００９１】

【発明の効果】本発明によれば、一度に複数の検体につ
いて複数の生物学的活性を調べることができ、短時間で
多数の生物学的活性を調べることが可能となる。また、
反応容器の底板と蓋部を取り外せるため反応容器用の測
定機器を使用する必要がなくなる。

【００９２】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 tttttttttt aattcatggt ccagaaca 28

【００９３】配列番号：２ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 tttttttttt aatcatgga ccagaaca 27

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の分析方法における一実施態様を示す図
である。

【図２】本発明の反応容器における一実施例を示す斜視
図である。

【符号の説明】

１ 底板 ２ 蓋部

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鈴木 収 千葉県千葉市緑区大野台１−２−３ 日清 紡績株式会社研究開発センター内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 HA12 4B029 AA07 AA23 BB15 BB20 CC03 CC08 FA15

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 担体に固定化された生物学的に活性な第
   １の物質と、この第１の物質に特異的に結合し得る第２
   の物質とを反応させ、前記第１の物質と第２の物質との
   結合を介して担体に間接的に結合した第２の物質又は結
   合しない第２の物質を検出することにより、試料中の第
   １の物質又は第２の物質を分析するために用いる反応容
   器であって、 前記反応容器は、生物学的に活性な物質を固定化するこ
   とができる担体である底板と、この底板に着脱自在に密
   着させることのできる蓋部とを有し、 前記蓋部は、底板とともに容器の壁面を構成する筒孔を
   複数有し、底板と蓋部との密着により複数の容器を形成
   することができることを特徴とする反応容器。
2. 【請求項２】 生物学的に活性な第１の物質、及び生物
   学的に活性な第２の物質が核酸である請求項１記載の反
   応容器。
3. 【請求項３】 生物学的に活性な第１の物質、及び生物
   学的に活性な第２の物質がタンパク質である請求項１記
   載の反応容器。
4. 【請求項４】 前記底板は、蓋部の筒孔のそれぞれに対
   応する複数の容器底部を有し、各々の容器底部には複数
   種の生物学的に活性な物質が区画して固定される請求項
   ２記載の反応容器。
5. 【請求項５】 前記生物学的に活性な物質が核酸である
   請求項４記載の反応容器。
6. 【請求項６】 前記生物学的に活性な物質がタンパク質
   である請求項４記載の反応容器。
7. 【請求項７】 担体に固定化された生物学的に活性な第
   １の物質と、この第１の物質に特異的に結合し得る第２
   の物質とを反応させ、前記第１の物質と第２の物質との
   結合を介して担体に間接的に結合した第２の物質又は結
   合しない第２の物質を検出することにより、試料中の第
   １の物質又は第２の物質を分析するために用いる反応用
   器具であって、 前記反応用器具は、生物学的に活性な物質を固定化する
   ことができる担体に着脱自在に密着させることができ、
   担体とともに容器の壁面を構成する筒孔を複数有し、担
   体と反応用器具との密着により複数の容器を形成するこ
   とができることを特徴とする反応用器具。
8. 【請求項８】 担体に固定化された生物学的に活性な第
   １の物質と、この第１の物質に特異的に結合し得る第２
   の物質とを反応させ、前記第１の物質と第２の物質との
   結合を介して担体に間接的に結合した第２の物質又は結
   合しない第２の物質を検出することにより、試料中の第
   １の物質又は第２の物質を分析する方法であって、 請求項１記載の反応容器を構成する底板の、蓋部の筒孔
   のそれぞれに対応する位置に複数種の生物学的に活性な
   物質を区画して固定するステップと、 前記底板に蓋部を密着させ、各々の筒孔毎に異なる生物
   学的に活性な物質を含む溶液を注入して反応させるステ
   ップとを、少なくとも含む分析方法。