WO2006103826A1 - プローブアレイ及びプローブアレイの製造方法 - Google Patents

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WO2006103826A1
WO2006103826A1 PCT/JP2006/301565 JP2006301565W WO2006103826A1 WO 2006103826 A1 WO2006103826 A1 WO 2006103826A1 JP 2006301565 W JP2006301565 W JP 2006301565W WO 2006103826 A1 WO2006103826 A1 WO 2006103826A1
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array
probe
separator
region
partition wall
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PCT/JP2006/301565
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English (en)
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Yasuko Yoshida
Kazunari Yamada
Tomokazu Takase
Akinobu Oribe
Original Assignee
Ngk Insulators, Ltd.
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Publication date
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Priority to JP2007509364A priority patent/JP4856057B2/ja
Priority to KR1020077022207A priority patent/KR20070122465A/ko
Priority to US11/886,676 priority patent/US20090042734A1/en
Priority to CN2006800095344A priority patent/CN101147062B/zh
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    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
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    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0819—Microarrays; Biochips

Definitions

  • the present invention relates to a probe array holding probes in an array and a method for manufacturing the same.
  • the present invention relates to a probe array having a plurality of array regions, a separator therefor, a probe array manufacturing method, a nucleic acid hybridization method, and the like.
  • each array region is a probe fixing region in which a large number of probes are fixed
  • Hybridization is performed by placing a single cover glass on a glass substrate having a plurality of array regions.
  • This method has a problem in that the reaction solution (solution containing the target) in the adjacent array region mixes with each other. It might be. For this reason, for example, in JP-A-2002-65274, while imparting hydrophobicity to the partition wall that partitions the array region, the reaction solution is held and mixed in the array region by making the array region hydrophilic. It is disclosed to avoid this.
  • the surface treatment is usually performed to fix the probes to the substrate surface, and various methods such as an inkjet method are performed. Using this method, the probe is supplied to the substrate surface, and then the fixing process is performed to fix the probe to the substrate surface.
  • the formation of hydrophobic regions for partitioning multiple array regions requires the use of printing or chemical treatment. To fix these hydrophobic regions to the substrate, several hundreds of degrees It is necessary to immerse the sample in a liquid, which may degrade biological materials such as nucleic acids and proteins, and surface treatment. For this reason, conventionally, as shown in FIG. 18, the hydrophobic region forming process is performed prior to the surface treatment or spotting, and the hydrophobic region of the substrate on which the hydrophobic region is previously formed is not formed. Surface treatment is performed, followed by spotting. Disclosure of the invention
  • Another object of the present invention is to provide a probe array manufacturing technique capable of forming the above array region in an arbitrary region on a substrate.
  • the present inventors have found that the hydrophobic region forming process for partitioning the array region performed prior to the substrate surface treatment or the surface of the array region is present.
  • the surface treatment becomes non-uniform, and the shape and size of the probe spot, and hence the amount of fixed spots become non-uniform.
  • interaction reactions such as hybridization are performed. It has been found that the variation in the number increases. In particular, this non-uniformity is also observed at the edge of the array area close to the hydrophobic area. I put it out.
  • the present inventors have eliminated the step of forming the hydrophobic region by printing on the substrate surface or by chemical treatment, and partition walls that can partition the array region with respect to the substrate subjected to surface treatment or the like.
  • the present invention has been completed by obtaining the knowledge that the conventional problems can be solved by mounting a separator having the above. Therefore, according to the present invention, the following means are provided.
  • a probe array including one or more array regions on a substrate that are partitioned and have a large number of probes immobilized thereon.
  • a probe array provided with a separator having partition walls that divide an area on the substrate.
  • the probe is preferably a nucleic acid probe.
  • the probe is also preferably a protein probe.
  • the array region has a plurality.
  • the separator may be attached to the surface of the probe fixing layer on which the probe is fixed on the substrate.
  • the separator is disposed after the probe fixing step. It is preferable to be attached to the surface of the probe fixing layer.
  • the separator is preferably in the form of a sheet, and is fixed to the substrate via an adhesive layer. Furthermore, it is preferable that the separator is detachably fixed to the substrate.
  • the separator may have a hydrophobic region.
  • the hydrophobic region is provided on the top surface of the partition wall of the separator.
  • the contact angle of water in such a hydrophobic region is preferably 60 ° or more. More preferably, it is 70 ° or more.
  • the hydrophobic region may contain a material selected from the group consisting of polycarbonate, polyolefin, polyamide, polyimide and acrylic resin, and their fluoride and halogenated materials.
  • an area surrounded by a partition wall that partitions the array area of the separator can constitute an open-type cavity for interaction between the probe and the test sample on the array area.
  • the design area of the array region defined by the partition wall is 0.3 mm.
  • it can be 3 mm2 or more and 90 mm2 or less.
  • it is possible to provide one or more and 400 or less of the array regions, and preferably one or more and 144 or less.
  • the design area (Sd) of the array region defined by the partition walls is 90 mm2 or less, and the probing effective area ratio represented by the following formula (1) is 70%. This can be done.
  • Probing effective area ratio (%) Se [mm2] / Sd [mm2] X 100 (1)
  • Se is a variation coefficient of signal intensity based on the interaction between the probe and the target. Represents the area.
  • Probing refers to exploration, detection, confirmation, etc. of an object by using the probe capable of selective or specific interaction with the object and causing the interaction with the object. It means to do.
  • the variation coefficient of signal intensity is the variation coefficient of signal based on the interaction obtained by supplying the object to be interacted with the probes on the probe array (signal intensity detected in the micro area force of the array area).
  • the standard deviation of the Z-array region is the microregion force (average value of the detected signal intensity).
  • the coefficient of variation in signal intensity forms an appropriate number of microscopic areas of a single type of probe (for example, a spot) in the array area, and supplies an object that interacts with the probe to provide a hybridizer.
  • the area where the variation coefficient of signal intensity is 20% or less is the area where there is a minute area where the variation coefficient of signal intensity is 20% or less among the appropriate number of minute areas in the array area. Means. Note that the contour of the region where the variation coefficient of the signal intensity is 20% or less can be defined by the minute region on the outermost side of the minute region group that satisfies the variation coefficient. In addition, it is preferable that the number of minute regions to be subjected to calculation of the variation coefficient of the signal intensity is 3 or more, more preferably 20 or more.
  • the array area to be partitioned has a variation coefficient of signal intensity obtained by probing in an area excluding the area within the partition force within 0.8 mm within the array area of 20% or less. It is also preferable that Also, the array area to be partitioned has a depth of 1 It is preferably 0 ⁇ m or more and 240 ⁇ m or less! / ⁇ .
  • the ratio [R] represented by the following formula (2) is 0.02 or less.
  • d represents the depth of the array region
  • Sd represents the design area of the array region
  • the separator can be capable of forming a plurality of partition walls having different heights. Further, the separator may be capable of reducing the height of the partition wall by removing at least a part of the partition wall.
  • the cell Pareta may be possible to form a partition wall of a plurality of different heights in the range of 10 mu m or more 1000 mu m.
  • the partition wall of the separator has a height of 60 m or more at the time of reaction in which a test sample is supplied to the probe for reaction, and less than 60 m at the time of signal detection of the reaction product after the reaction. It can also have a height.
  • the area of the array region can be 0.3 mm 2 or more.
  • the separator may have a laminate structure. Further, the separator can include a fragile portion capable of removing at least a part of the partition wall, the separator is a laminate, and the fragile portion can be an interface portion of the laminated layers.
  • the separator may have an overhang portion that projects toward the upper side of the array region at least at a part of the upper side of the partition wall. Furthermore, the overhang portion may be provided over the entire periphery of the array region. Furthermore, at least the region of the portion overhanging the partition wall above the overhang portion that can contact with the test solution can have a hydrophobic region.
  • the height of the bottom end of the overhang portion (the height of the substrate surface force) may be 40 ⁇ m or more and 990 ⁇ m or less, and the overhang portion is fixed to the array region. Further, it may be overhanging as long as it does not reach the probe. Further, it is defined by the inner peripheral surface of the overhang portion.
  • the region to be fixed may be a region to which the probe in the array region is fixed. Furthermore, at least a part of the overhanging portion extends integrally with the remaining portion of the partition wall. Z or removable, and the entire overhang may be integral and z or removable with respect to the remainder of the septum.
  • the separator can constitute at least a part of the height of the partition wall that partitions the array region, and the substrate has at least a height of the partition wall that partitions the array region. You can make up part of it.
  • a partition for partitioning the array region on the substrate on which a plurality of probes form one or more array regions and are fixed is provided.
  • a separator is provided.
  • the separator has a hydrophobic region on the upper surface of the partition wall.
  • the separator may be capable of forming a plurality of partition walls having different heights.
  • the separator may have an overhanging portion that projects toward the upper side of the array region at least at a part of the upper side of the partition wall.
  • the separator may have a laminate structure.
  • the separator is preferably for the probe array described in any of the above.
  • a probe array in which a large number of probes are fixed in a form of one or more array regions, and one probe is formed by the separator.
  • a probe array in which the above array region is partitioned.
  • the probe array of this aspect is a probe array provided with the array area
  • a method for manufacturing a probe array comprising a step of fixing a plurality of probes to a substrate by forming one or more array regions. Attaching a separator provided with a partition wall capable of partitioning the surface to the surface of the substrate on which the probe is fixed, and partitioning a plurality of the probes into one or more array regions; A manufacturing method is provided.
  • the array region may be plural.
  • a nucleic acid hybridization method wherein a test solution containing a nucleic acid test sample is supplied to the array region of a probe array of nucleic acid probes.
  • a hybridization method comprising a step of performing hybridization with the probe.
  • the probe array has an open-type cavity for hybridization on the array region, and the hybridization step is performed under humidified conditions by supplying a test solution to the open-type cavity. be able to.
  • a reaction method using a probe array wherein a test solution is supplied to the array region of any one of the probe arrays described above including a protein probe. And a reaction method comprising the step of performing a reaction with the probe.
  • a step of forming the first height partition wall on the substrate after fixing the probe to the substrate can be provided prior to the reaction step.
  • the partition wall having the first height in the reaction step has an overhang portion that projects toward the upper part of the array region at least at a part above the partition wall, and the overhang portion is removed in the post-process.
  • the height of the partition wall can be reduced to the second height.
  • the partition may be formed by applying a separator capable of partitioning the array region to the substrate surface.
  • the separator may be a laminate.
  • FIG. 1 shows an example of a probe array.
  • FIG. 2 is a diagram showing details of an example of a probe array.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a partition form in a separator sheet.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of a partition form in a separator sheet.
  • FIG. 5 is a conceptual diagram of a probing effective area ratio.
  • FIG. 6 is a diagram showing an example of a probe array manufacturing process.
  • FIG. 7 is a diagram showing a state where probe array regions (partitioned! /,! /) Are formed on a substrate in a probe array manufacturing process.
  • FIG. 8 is a diagram showing a pattern of an array region of a nucleic acid probe array of an example.
  • FIG. 9 is a view showing a structure of a separator sheet of an example.
  • FIG. 10 is a graph showing the relationship between the distance of bulkhead force and the CV of fluorescence intensity.
  • FIG. 11 is a graph showing the difference in hybridized effective area ratio between an example and a comparative example.
  • FIG. 12 is a graph showing the relationship between array region depth and fluorescence intensity.
  • FIG. 13 is a graph showing the relationship between water repellency and fluorescence intensity.
  • FIG. 14 is a graph showing the relationship between the ratio R of the array region depth to the design area of the array region and the fluorescence intensity (in the case of an array region depth of 0.25 mm).
  • FIG. 15 is a graph showing the relationship between the ratio R of the array region depth to the design area of the array region and the fluorescence intensity (when the array region depth is 0.1 mm).
  • FIG. 16 is a view showing a laminated structure of the separator sheet produced in Example 5.
  • FIG. 17 is a view showing a laminated structure of the separator sheet produced in Example 5.
  • FIG. 18 is a diagram showing an example of a conventional probe array manufacturing process.
  • the probe array according to the present invention includes an array region on which a plurality of probes are fixed on a substrate.
  • the probe array includes a separator having a partition partitioning the array region and its periphery.
  • a separator having partition walls that divide the array region and its periphery is mounted on the substrate. That is, the array region is partitioned without forming a hydrophobic region by dipping the water repellent material on the substrate. For this reason, non-uniform surface treatment chemistry and non-uniform surface treatment due to such treatment being performed before surface treatment and the presence of hydrophobic or water-repellent regions on the substrate in the probe array preparation stage.
  • Non-uniformity in various operations such as non-uniformization, shape and size of the probe, and non-uniformity in the amount of fixed weight.
  • the separator of the present invention is characterized by having a partition for partitioning the array region on the substrate on which a plurality of probes form one or more array regions and are fixed. . Therefore, a probe array having the partitioned array region of the present invention can be formed by attaching this separator to a probe array in which a large number of probes form one or more array regions and are immobilized. As a result, various advantages similar to those described above can be obtained.
  • the method for manufacturing a probe array of the present invention includes a step of fixing a large number of probes to a substrate in a pattern capable of forming one or more array regions, and the substrate on which probes are fixed. Attaching a separator having a partition wall capable of partitioning the surface into one or more, and partitioning a large number of the probes into the one or more array regions in the pattern. It is a feature.
  • the probes are fixed in a pattern that assumes the partitioning of the array region, and then a plurality of probes are partitioned into a plurality of array regions by the separator. For this reason, the array region is partitioned without forming the hydrophobic region by dipping the water repellent material on the substrate.
  • a hydrophobic region forming process can be omitted, and various types of non-uniformity due to the presence of such a hydrophobic region can be eliminated, and a probe array can be preferably manufactured.
  • the array area is preferably plural.
  • the nucleic acid hybridization method of the present invention is characterized by comprising a step of supplying a test solution containing a test sample to the array region of the probe array and performing hybridization with the probe. According to this method, since various inconveniences caused by the conventional partitioning method are eliminated in the array region of the probe array, it is possible to implement good noise and hybridization.
  • the probe array of the present invention can form a plurality of partition walls having different heights as a separator. In this way, a good reaction can be realized between the probe and the test solution.
  • the array region can be partitioned at the required height according to probe array manufacturing, reaction process, etc., such as probe immobilization, blocking, reaction, washing, signal detection, etc. it can.
  • the height of the partition wall is not disturbed during the surface treatment, and it is set to a height or zero (without the partition wall). It is possible to set the height to avoid or suppress this contamination and to make the partition wall low or zero during washing and signal detection.
  • the separator may be formed so as to be separable from the substrate.
  • the degree of freedom in supplying the test solution to the cavity including the array region is improved, and it is easy to use the appropriate amount of test solution depending on the type of test solution and the type of reaction. Can be reacted.
  • the height of the partition wall may be maintained or increased. Otherwise, the partition wall may be removed or the height may be reduced. .
  • the probe array of the present invention can also have an overhanging portion projecting toward the array region at least at a part above the partition wall.
  • an overhanging portion projecting toward the array region at least at a part above the partition wall.
  • the protruding portion can be integrated with or removed from the remaining portion of the partition wall, so that the probe array can be manufactured and various operations and processes can be performed. It is possible to exert a contamination suppression effect without obstructing.
  • the probe and the test solution are reacted in a state where the array region is partitioned by the first height partition walls, and the array region is the first height.
  • various post-processes such as washing and detection after the reaction are performed in a state of being divided at a second height or having no partition wall.
  • a good reaction can be realized between the probe and the test solution. That is, as already explained, the characteristics (height, etc.) required for the partition walls that divide the array region differ depending on the manufacturing and reaction process of the array. If the height of the partition wall is required, that is, it is increased in the subsequent process which is high during the reaction, the reaction can be preferably performed on the probe array.
  • the probe array 2 includes a substrate 4, the substrate 4, and a separator 12. On the substrate 4, spot-like minute regions 8 to which a large number of probes 6 are fixed are provided. These minute regions 8 are aligned to form one array region 10, for example.
  • the probe 6 is not particularly limited, but directly or indirectly as a result of interaction with various test samples in the test solution such as nucleic acid, protein, synthetic or natural compound in the array region 10. It only needs to be able to detect signals based on interactions.
  • nucleic acids utilize various interactions such as hybridization based on base pairing, specific binding between protein and nucleic acid, protein and low molecular weight compound, and nucleic acid and low molecular weight compound. it can.
  • a nucleic acid can be used as a probe of the probe array of the present invention.
  • a nucleic acid at least a part of it is hybridized with another nucleic acid by base pairing of the nucleic acid.
  • the concept includes both natural and synthetic nucleotide oligomers and polymers, as well as DNA such as genomic DNA and cDNA, PCR products, RNA such as RNA, and peptide nucleic acids. Nucleic acids can detect signals by base pairing, interactions by hybridization reactions, and interactions by specific binding to proteins and low-molecular compounds.
  • an enzyme, an antibody, an antigen, a receptor, or the like can be used. These react specifically with the substrate, antigen, antibody, and nucleic acid, respectively, so that signals can be detected.
  • other synthetic or natural compounds include various drug candidate compounds synthesized by combinatorial chemistry. The present invention However, the present invention is not limited to these examples, and any probe can be used as long as it can detect the target compound.
  • the probe 6 is present on the substrate 4 as a minute region 8 having a diameter of about 50 ⁇ m to 500 ⁇ m, for example.
  • the fixing method and fixing form of the probe 6 to the substrate 4 are not particularly limited, and include all forms known at the time of this application. Therefore, a probe fixing method using a contact-type pin and a probe fixing method using a non-contact ink-jet method, as well as a method of synthesizing the probe 6 on the substrate 4 are included.
  • the shape and material of the substrate 4 are not particularly limited! However, various materials can be used in addition to various materials used in conventional DNA chips and DNA microarrays.
  • ceramics including silicon ceramics such as glass, silicon dioxide and silicon nitride, silicone such as silicone, polymethyl methacrylate, poly (meth) acrylate, metals such as gold, silver, copper, etc.
  • An appropriate coat may be applied to impart desired surface properties.
  • a glass substrate, silicone, and acrylic resin can be used.
  • the substrate 4 is provided with a probe fixing layer 5 that is processed according to the type of the probe 6 in order to fix various probes 6 such as nucleic acids to the substrate 4. It is preferable.
  • the type of probe immobilization layer 5 is not particularly limited.
  • a positively charged polymer layer such as polylysine, a functional group in nucleic acid, or a reaction added to nucleic acid
  • a polymer layer having an aldehyde group or a carboxyl group capable of bonding a functional group can be provided as the probe fixing layer 5.
  • the region on the substrate 4 where the probe 6 is to be fixed is substantially flat, including the case where it has a minute three-dimensional shape such as a porous shape.
  • An array region 10 is provided on the substrate 4.
  • the array region 10 is a region in which the minute region 8 is formed.
  • the array region 10 is formed as an aggregate of a large number of micro regions 8.
  • On the substrate 4, one or more, preferably a plurality of array regions 10 are provided. Different groups of probes 6 may be immobilized on different array regions 10.
  • the array region 10 in the probe array 2 of the present invention is at least partitioned from the surroundings, or other The array area 10 is partitioned.
  • the test solution is supplied onto the array region 10, a certain amount of the test solution is retained in the array region 10, and the surrounding array region 10 is in the adjacent array region 10. I like to be spilled and not spilled.
  • Such partitioning is preferably made to form a cavity 7 in the array region 10.
  • the cavity 7 is, for example, an open-type cavity in which at least a part of the array area 10 is opened. Typically, it is a concave cavity that is open at the top. Also, the cavity 7 may be a closed-type cavity that can open and close the injection port of the test liquid. Such cavity 7 is formed by a separator 12 described later. This cavity 7 is a space for the interaction between the probe 6 and the test sample. When the probe array 2 is a nucleic acid probe array, it becomes a space for the hybrid reaction.
  • the cavity 7 may have a part of its depth formed by a concave portion or a convex portion provided in the substrate 4 itself.
  • the substrate 4 itself may have a shallow well corresponding to the array region 10, and conversely, a partition wall having a height corresponding to a part of the height of the partition wall 14 that partitions the flat array region 10. Have it, have it.
  • the depth of the cavity 7 (which is synonymous with the height of the partition wall 14 described later) is preferably 10 ⁇ m or more and 240 ⁇ m or less. Within this range, the thickness of the test liquid retained in the cavity 7 can suppress the influence of the partition walls that make up the cavity 7 to ensure the convection of the test liquid and the diffusion of the test sample, resulting in highly sensitive detection. Is possible. More preferably, it is 150 ⁇ m or less, and further preferably 100 ⁇ m or less.
  • the depth of the array region 10 can be the height from the surface of the substrate 4 on which the probe is fixed to the top surface of the partition wall 14 as will be described later. Such a distance can be easily measured by, for example, various digital length measuring devices. Such a structure of cavity 7 is preferable when probing in an aqueous medium such as nucleic acid hybridization.
  • the ratio [R] represented by the following equation (2) is 0.02 or less.
  • the ratio R is in this range.
  • Such a structure of cavity 7 is also preferable when probing in an aqueous medium such as nucleic acid hybridization.
  • d represents the depth of the array region
  • Sd represents the design area of the array region
  • the size of the array region 10, that is, the designed area (hybridized area) of the array region is preferably 0.3 mm2 or more and 2000 mm2 or less. This is because within this range, the variation coefficient of the signal intensity based on the interaction between the probe and the test sample is well suppressed. 0 If it is 3 mm2 or less, the convection of the test solution and the diffusion of the test sample are likely to be hindered by the effect of the septum 14, and if it is 2000 mm2 or more, the signal intensity varies only with the convection of the test solution and the diffusion of the test sample It becomes ⁇ to suppress a coefficient. More preferably, it is 3 mm2 or more and 90 mm2 or less.
  • the designed area of the array region is an area inside the array region defined by the partition walls 14 of the separator 12 described later.
  • the number of array regions 10 on the substrate 4 is not particularly limited, but preferably 1 or more and 400 or less, and more preferably 1 or more and 144 or less. From the standpoint of adapting to existing infrastructure, it is preferable to use 400 or less for a 96-well plate size and 144 or less for a slide glass size.
  • a separator 12 that partitions the array region 10 is provided on the substrate 4.
  • the separator 12 includes a partition wall 14 that partitions the array region 10.
  • the partition wall 14 in the separator 12 is for partitioning the array region 10 from the periphery, and corresponds to the size and shape of the array region 10 to be partitioned.
  • the partition walls 14 intersect in a grid shape, and the adjacent array regions 10 can be partitioned.
  • the array regions 10 can be partitioned in a staggered manner. Has a bulkhead of 14
  • the partitioned array area 10 is not limited to the form shown in FIGS. 3 and 4, and one or more array areas 10 may be partitioned in any form. It may be a thing to do.
  • the partition walls of the separator 12 are preferably the partition walls 10 that surround the entire individual array regions 10.
  • the form of the partition wall 14 of the separator 12 varies depending on the size, number, and shape of the array region 10 to be partitioned.
  • the separator 12 itself is preferably a sheet-like body. In the sheet state, it is easy to mount the substrate 4 on the flat surface.
  • the sheet-like body means the whole shape, and even if the partition wall 14 has a skeleton shape, it may be a sheet shape from the thickness and outer shape (width, length, etc.) of the semiconductor 12.
  • the separator 12 only needs to be attached to the substrate 4 so as to partition the array region 10. Therefore, it is possible to place the separator 12 on the substrate 4 and fix them with a jig or the like, but the separator 12 is fixed to the substrate 4 via the adhesive layer 16 as shown in FIG. It is preferable that By fixing with the adhesive layer 16, the separator 12 can be easily attached to the substrate 4 after the probe 6 is fixed.
  • the adhesive layer 16 may use a so-called strong and long-time adhesive, or a pressure-sensitive adhesive that can be easily separated. Mounting using the adhesive layer 16 is a particularly preferable form when the separator 12 is a sheet-like body.
  • the height of the separator 12 that is, the height of the partition wall 14 can be changed as necessary.
  • the separator 12 has a laminated structure in which the constituent layers can be integrated and Z or removed. That is, different heights can be realized by making the separator 12 a laminate having two or more layers and making it possible to remove the constituent layers at at least one interface.
  • a stackable structure having a stackable constituent layer may be used. Furthermore, it is good also as a laminated body in which both separation and integration are possible.
  • the interface portion is a fragile portion, and this portion is configured so as to be integral and Z or removable.
  • this portion may be formed so as to be integrated or removable by a layer such as an adhesive or a pressure-sensitive adhesive, or may be configured so as to be integrated or removable depending on the adhesiveness or adhesion of the constituent layer itself. Good.
  • the adhesive or the like the adhesive strength between the constituent layers can be easily adjusted, and the operability during height adjustment can be easily ensured.
  • the constituent layers are configured to be integrated or separable by mechanical fitting or the like. You can do it.
  • One or two or more interfacial portions that make the constituent layers integral and Z or removable can be provided as necessary.
  • a structure having a fragile portion at a predetermined height can be provided. Even if it does not depend on the laminated structure, it has a structurally or materially weak part, so that a part of the separator 12 can be removed and the height of the part can be reduced.
  • the height of the separator 12 having the partition wall 14 having a variable height can be adjusted, for example, in the range of 10 ⁇ m or more and 100 00 ⁇ m or less. Within this range, the height of the partition wall 14 can be configured so that contamination of the test solution can be avoided or suppressed during the reaction, while the partition wall can be high enough not to interfere with washing and signal detection after the reaction. . More specifically, it is preferably 60 m or more during the reaction. When the thickness is 60 ⁇ m or more, it is possible to sufficiently suppress contamination between array areas during array transfer while ensuring a sufficient supply amount of the test solution. More preferably, it is 200 ⁇ m or more.
  • the height of the test liquid supplied to the cavity 7 including the array region 10 does not exceed the partition wall 14, and it becomes easy to react with the cavity 7 in a state.
  • it is preferably less than 60 m for subsequent washing and signal detection. 60 ⁇ m not yet
  • the height of the partition wall 14 is 40 / z m or more in the subsequent process. When it is 40 / z m or more, even when the height of the partition 14 is reduced by removing the upper part of the partition 14, the contamination between the array regions 10 of the test solution after the reaction can be suppressed.
  • the separator 12 can be provided with an overhanging portion that projects toward the array region 10 at least at a part above the partition wall 14.
  • This overhang portion may be formed over the entire periphery of the partition wall 14 surrounding the array region 10 or may be formed only in part. As a form that is formed only partially, for example, it may be formed on each of a pair of partition walls facing each other in the periphery, or may be appropriate over the entire periphery. A large number of overhangs may be formed discontinuously at intervals.
  • the shape of the overhanging portion is not particularly limited.
  • the overhanging portion may be overhanging parallel to the surface of the substrate 4 or may be overhanging obliquely downward. Further, the overhang portion may have a notch shape such that the inner peripheral surface thereof is tapered upward with respect to the surface of the substrate 4 such as a dome shape.
  • the overhang amount of the overhang portion is preferably within a range that is not reached by the probe fixed to the array region 10. This is because if the overhanging portion reaches the probe, problems such as bubbles remaining on the probe may occur when supplying the test solution including the test sample.
  • the region defined by the most protruding tip side of the overhanging portion is the region where the probe is immobilized by the array region 10. Therefore, it is preferable that the tip of the overhang portion is within 0.8 mm of the partition wall 14 force.
  • the position of the lowest end of the overhang portion is 40 ⁇ m or more and 990 ⁇ m or less. This is because, when the length is 40 m or more, even when the overhanging portion is bent and removed, contact and damage between the overhanging portion and the array region can be prevented. More preferably, it is not less than 500 ⁇ m.
  • the portion of the overhanging portion that can come into contact with the test solution has a hydrophobic region 18 described later.
  • the portion that can be contacted with the test solution include a lower surface or an inner peripheral surface facing the surface of the substrate 4 of the overhang portion.
  • the top surface When the top surface is exposed, it is preferable that the top surface also includes a hydrophobic region 18.
  • the hydrophobic region 18 When the hydrophobic region 18 is added to the overhang portion, it is typically preferable to form the overhang portion itself with a hydrophobic material described later.
  • the overhanging portion may be provided to the partition wall 14 and the separator 12 in any form. Only the overhanging portion can be attached to or removed from the uppermost portion of the partition wall 14 or can be provided in a part of the uppermost portion of the partition wall 14 in advance. In addition, such an overhang portion is an opening of the cavity 7 including the array region 10 surrounded by the partition wall 14. It may be a patch-like body that partially blocks the periphery of the mouth (configured by the upper edge of the partition wall 14).
  • the separator 12 is preferably attached to the surface of the probe fixing layer 5 of the substrate 4 as shown in FIG. After the probe immobilization layer 5 is formed, the separator 12 is attached.
  • the probe immobilization layer 5 is uniformly formed on the surface of the substrate 4 regardless of the presence of the conventional hydrophobic region partitioning the array region 10 and the influence of the treatment. Furthermore, for this reason, the surface treatment layer such as the probe fixing layer 5 is uniformly formed and provided in the edge region of the array region 10 adjacent to the partition wall of the separator 12 similarly to the other portions. Become. In the case where the substrate 4 includes a partition wall having a height corresponding to a part of the height of the partition wall 14, the separator 12 may be mounted so as to correspond to such a partition wall.
  • the surface treatment is applied to the entire surface on which the array region 10 including the partition wall is formed on the substrate 4 including the partition wall as well as the flat substrate 4. It is preferable that the separator 12 is attached after the probe fixing layer 5 is formed.
  • the material of the separator 12 is not particularly limited.
  • acrylic resin, thermoplastic elastomer, natural or synthetic rubber, silicone, polyolefin, polyamide, polyimide, halogenated bur, polycarbonate, or the like can be used.
  • the separator 112 preferably has flexibility and may have transparency.
  • a hydrophobic region 18 is provided in at least a part of the separator 12.
  • the hydrophobic region means a region having at least surface properties exhibiting water repellency, and preferably a region having higher water repellency than general sodium silicate glass not subjected to hydrophilic treatment or the like. Means.
  • the hydrophobic region 18 is also exposed to the cavity 7, and thus acts as a driving force that promotes natural convection of the test solution in the cavity 7, for example, a substance such as a hybrid Can be expressed well.
  • the hydrophobic region 18 is provided on the top or top surface of the partition wall of the separator 12 from the viewpoint of suppressing contamination of the test solution and enhancing the ability of the test solution to be retained in the cavity 7 of the test solution. It is preferable.
  • the top portion or the top surface is a portion or a surface of the partition wall 14 on the side opposite to the substrate 4. From the viewpoint of promoting substance interaction in the cavity 7, it is preferable that the hydrophobic region 18 is formed in the region of the separator 12 exposed in the cavity 7. Area 10 side).
  • the water repellency of the hydrophobic region 18 can be expressed by the contact angle of water on a generally flat surface.
  • the water contact angle of the hydrophobic region is preferably 30 ° or more, more preferably 60 ° or more, and further preferably 70 ° or more. Most preferably, it is 90 ° or more.
  • the contact angle means the angle of the portion where the droplet contacts the solid when the droplet is placed on a horizontal solid plate.
  • the droplet method for measuring the static contact angle includes (1) tangent method, (2) ⁇ Z2 method, and (3) three-point click method.
  • the tangent method in (1) is a method for directly obtaining the contact angle by aligning the cursor with the tangent of the droplet using a reading microscope or the like, and the 0Z2 method in (2) is used for one end and the top of the droplet. The angle between the straight line connecting the two and the solid surface is doubled to obtain the contact angle.
  • the three-point click method in (3) uses two points of contact between the droplet and the solid surface and the vertices on the computer image, etc. This is a method to obtain by image processing by clicking. In these droplet methods, it is preferable to obtain the contact angle by the methods (2) and (3) above.
  • the hydrophobic region 18 is configured by using a hydrophobic material as the material of the separator 12 itself.
  • the hydrophobic material and Z can be formed by providing a surface form or layer exhibiting hydrophobicity (water repellency).
  • hydrophobicity water repellency
  • examples of the hydrophobic material constituting the hydrophobic region 18 include polyolefins such as polycarbonate, polyethylene, and polypropylene, halogenated bulls, polyamides, polyimides and acrylic resins, and fluorides or salts of these resins. Can do.
  • examples of the surface form exhibiting water repellency include a form in which the surface of various materials is roughened so that the contact angle becomes 60 ° or more by chemical modification or mechanical treatment. .
  • Such a separator 12 is mounted on the substrate 4 on which the probes 6 are fixed to constitute the probe array 2.
  • the separator 12 before being mounted on the substrate 4 itself independently constitutes one aspect of the present invention.
  • the separator 12 before being attached to the substrate 4 can be provided with an adhesive layer 16 on the surface to which the substrate 4 is attached, and the adhesive layer 16 is preferably protected by a release layer until use.
  • the hydrophobic region forming process conventionally performed on the surface of the substrate 4 is not performed, and there is no hydrophobic region on the substrate 4.
  • the surface treatment of the probe immobilization layer 5 and the like is performed uniformly.
  • the probe fixing layer 5 is uniformly applied to the entire array region 10, and the formation form of the micro region 8 of the probe 6 in the array region 10 and the probe fixing layer 5 are formed.
  • the cocoon rate is uniform. In other words, as in the conventional case, the shape of the micro area 8 of the probe 6 is distorted in the edge area of the array area 10, or the fixing efficiency varies or is low! .
  • the probe array 2 of the present invention has an improved probing effective area ratio (%) of the array region 10 as compared with the conventional array.
  • the probing effective area ratio is the ratio of the probing effective area (Se) to the designed array area (Sd) (see the following formula (1)).
  • Probing effective area ratio (%) Se [mm2] / Sd [mm2] X 100 (1)
  • the design area (Sd) of the array area is the area within the array area 10 surrounded by the partition 14
  • the effective probing area (Se) is an area in which the interaction between the probe and the object can be detected within a certain accuracy within the array region 10, and The area of the area where the coefficient of variation of the signal intensity is 20% or less.
  • the variation coefficient of the signal intensity such as fluorescence due to hybridization is 20% or less.
  • Figure 5 shows a conceptual diagram of the probing effective area ratio.
  • the probing effective area ratio varies depending on the design area (Sd) of the partitioned array area 10. For example, when Sd is 90 mm2 or less, the probing effective area ratio Is a preferred embodiment of 70% or more. In the case of this Sd, the probing effective area ratio does not reach 70% in the conventional array (see Example 1). Preferably, in this Sd, the probing effective area ratio is 80% or more, more preferably 85% or more.
  • the partitioned array region 10 of the probe array 2 of the present invention has an interaction between the probe 6 and the test sample in a region excluding the range within 0.8 mm from the partition wall 14 force.
  • the coefficient of variation of signal intensity based on this can be reduced to 20% or less. In the conventional array, such uniformity cannot be secured unless about 1 mm is excluded from the hydrophobic region corresponding to the partition wall 14.
  • the coefficient of variation is 20% or less in a region excluding the range of 0.6 mm or less, more preferably 0.4 mm or less, and most preferably 0.3 mm or less. In these various array areas, the coefficient of variation is more preferably 15% or less.
  • such a determination can be made by measuring the signal intensity of the micro area 8 on the line that is a predetermined distance away from the partition wall 14 force and calculating the coefficient of variation.
  • the probe array 2 shown in FIGS. 1 and 2 is illustrated as an example of the probe array, and the manufacturing method of the present invention will be described with reference to FIG.
  • the probe array manufacturing method of the present invention includes a step of fixing a plurality of probes 6 to the substrate 4 in a pattern capable of forming a plurality of arrayed regions 10 partitioned, and the probes 6 are fixed.
  • a partition wall 14 capable of partitioning the surface into a plurality of surfaces. And attaching a separator 12 to partition the plurality of probes 6 into a plurality of array regions 10 in the pattern.
  • the probe 6 is supplied to the substrate 4 provided with the probe fixing layer 5 by various methods.
  • the probe 6 is preferably supplied so as to form the microregion 8.
  • the method for supplying the probe 6 is not particularly limited as described above, and the method for synthesizing the probe 6 on the surface of the substrate 4 is not excluded.
  • the probe 6 is supplied in a pattern capable of forming a plurality of array regions 10 at a later stage. For example, as shown in FIG. 7, several array regions 10 in which a large number of minute regions 8 are aligned are formed on the substrate 4. This pattern corresponds to the partition form of the array region 10 defined by the partition walls 14 of the separator 12 mounted in the subsequent stage.
  • the substrate 4 may be provided with a concave portion corresponding to the array region 10 and a convex portion corresponding to at least a part of the height of the partition wall 14. In this case, the probe fixing layer is similarly applied to these. 5 is preferred.
  • the substrate 4 on which the pattern of the micro area 8 of the probe 6 is formed is treated according to the type of the probe 6 and the probe immobilization layer 5, such as heat treatment, immersion in a liquid, and dehydration 'washing. To fix probe 6.
  • the hydrophobic region for the partition is not formed, and as a result, the hydrophobic region is not present on the substrate 4.
  • the probe fixing layer 5 is uniformly provided on the substrate 4, and as a result, the probe 6 is reliably fixed in a better form by the fixing layer 5. It will be.
  • a probe array in which a large number of probes 6 are fixed to the substrate 4 in a pattern capable of forming a plurality of partitioned array regions 10 is obtained.
  • Such a probe array becomes a probe array having an array region 10 partitioned by attaching a separator 12 when used. Therefore, the probe array including the array region 10 that is not mounted with the separator 12 and can be stored as it is and can be distributed.
  • a separator 12 is mounted on the surface of the substrate 4 on which the probe 6 is fixed.
  • the unit 12 is attached to the probe fixing layer 5.
  • the separator 12 includes a partition wall 14 that can partition the surface of the substrate 4 into a plurality of parts. By mounting the separator 12 on the surface of the substrate 4, the array region 10 can be partitioned.
  • the mounting method and mounting mode of the separator 12 are not particularly limited, and the adhesive layer 16 may be interposed, and the substrate 4 and the separator 12 may be sandwiched by a jig or the like.
  • the probe array 6 thus obtained can have the configuration as described above. Therefore, the probe array manufacturing method of the present invention includes various forms of the probe array 6 already described.
  • the nucleic acid hybridization method includes a step of supplying a test solution containing a nucleic acid test sample to the partitioned array region 10 of the probe array 2 and performing hybridization with the nucleic acid probe 6.
  • a test solution is supplied to the open cavity 7 and the hybridization is performed under humidified conditions. Preferably it is done. By doing this, contamination of the test sample solution can be avoided and a large number of nucleic acid test solutions can be accessed simultaneously.
  • the reaction method using the probe array of the present invention is a probe array comprising one or more array regions on which a plurality of probes are immobilized and partitioned, and a partition wall having a first height.
  • the test solution is supplied and reacted in one or more of the partitioned array regions, and there is no partition wall or the height of the partition wall is reduced to a second height lower than the first height. It is preferable to perform washing after the reaction step or detection of a reaction product.
  • the first height is preferably 10 ⁇ m or more, for example, and preferably 1000 ⁇ m or less.
  • the second height is preferably less than 60 / zm, more preferably 50 ⁇ m or less.
  • the second height is preferably 40 ⁇ m or more.
  • the partition wall 14 may be removed, but when the partition wall 14 having the above height is left, when removing the upper part of the separator 12 to reduce the height of the partition wall 14, the contamination between the array regions 10 is reduced. It can be effectively suppressed.
  • the partition wall 14 is formed each time.
  • the separator 12 of the present invention capable of changing the height. According to such a separator 12, it is possible to easily construct the partition wall 14 having a height corresponding to various steps from reaction to detection, and supply a sufficient amount of the test solution while effectively suppressing the contamination of the test solution. Can be easily washed, and can be made to have a thickness suitable for signal detection.
  • the separator 12 has an overhang portion, it is possible to effectively suppress contamination of the test solution. Therefore, it is possible to reduce the height of the partition wall 14.
  • the uniformity of the surface treatment coat of the substrate is compared between the case where the surface is coated after chemical operation (water repellency imparted by printing) and the case where a separator sheet is pasted after the surface coat.
  • the comparison method is to calculate the coefficient of variation (CV: (standard deviation Z average value) X 100 (%)) of fluorescence intensity obtained by hybridization between three substrates for each column along the partition wall.
  • CV standard deviation Z average value
  • X 100 (%) the uniformity of the coat was evaluated from the size of the hybridized effective area ratio.
  • the hybridized effective area ratio is defined as (area of array region where stable CV was obtained Z area of designed array region) X 100 (%).
  • rat-derived cDNA were spotted on a glass substrate coated with poly L-lysine as shown in FIG.
  • the glass substrate was heated at 80 ° C. for 1 hour, immersed in a blocking solution (15 minutes), and immersed in boiled sterilized water (3 minutes), and dehydrated with ethanol. Thereafter, the mixture was centrifuged to prepare a nucleic acid probe array (before partitioning).
  • the blocking solution was 70 mM succinic anhydride, 0.1 M sodium borate (pH 8.0), 1-methyl-2-pyrrolidinone.
  • This separator sheet was affixed to the nucleic acid probe array before compartmentalization to produce the nucleic acid probe array of the example.
  • the nucleic acid probe array of the comparative example was prepared as follows. That is, based on the pattern shown in FIG. 8, a glass substrate coated with poly-L-lysine is prepared after the water-repellent material is printed on the glass substrate in advance and the water-repellent material is heated and solidified. After spotting the cDNA, heat treatment, blocking, washing and drying were performed, and a nucleic acid probe array of a comparative example was prepared without attaching a separator sheet. .
  • Cy 3 labeled cDNA was prepared using 1 g of rat-derived mRNA per substrate according to the procedure described in Cell Engineering Vol. 18 No. 7 1999. This test solution was dropped by 81 to each array region of the DNA array, and hybridization was performed at a final concentration (5 ⁇ SSC, 0.5% SDS). This probe array was placed in a tight box containing 3 ml of sterilized water and allowed to stand for hybridization. The hybridization conditions were 42 ° C, humidity 10Q% RH, and 16 temples.
  • the probe array is placed in the following three solutions ((2 X SSC, 0.1% SDS) solution, (1 X SSC) solution, (0.1 X SSC) solution) in this order. Each was washed with shaking for 5 minutes. After washing, the probe array was dried with a centrifuge (lOOOrpm, 3 minutes), and fluorescence was measured with a scanner (Scan Array4000 manufactured by Packard BioChip Technologies). The measured fluorescence intensity is digitized using numerical analysis software (Axon Gene Pix. Pro), and the CV between the three substrates for each of the Example and Comparative Example is calculated using Excel. The distance from the wall of the CV stable spot was determined and the effective area ratio of the hybrid was calculated from the distance.
  • the probe array of the example (array to which water repellency was imparted by applying a sheet after the surface coating) was applied to the probe array of comparative example (surface coating was applied after water repellency was imparted).
  • CV was stable at a short distance from the bulkhead compared to the array.
  • the hybridized effective area ratio based on the calculation result of the distance was as follows.
  • Example probe array The distance from the stable partition wall of the CV is 0.21 mm.
  • the hybridized effective area ratio of the example was expanded to about 2.1 times the hybridized effective area ratio of the comparative example. From the above, according to the probe array of the present invention, the coating unevenness around the partition wall can be suppressed, and a highly uniform array region can be formed.
  • the nucleic acid probe was effectively fixed.
  • This example confirms the influence of the water repellency of the hydrophobic region on the upper surface of the partition wall of the separator sheet on the fluorescence intensity resulting from the hybridization.
  • various water repellency (water contact angles) separator sheets were prepared by adjusting the type of surface treatment of the acrylic sheet. Except for the use of separator sheets with different water repellency, the same procedure as in Example 1 was followed to We made a probe array, performed noblerization, measured fluorescence intensity and digitized it
  • the fluorescence intensity greatly changed when the contact angle of water was around 60 ° to 70 °. From this result, it was found that the water repellency of the separator sheet is preferably a contact angle force of water of 0 ° or more, more preferably 70 ° or more.
  • the water repellency of the separator sheet is preferably a contact angle force of water of 0 ° or more, more preferably 70 ° or more.
  • Figure 14 shows the relationship between the design area of the array area and the fluorescence intensity when the array area depth (separator sheet thickness) is 0.25 mm.
  • the fluorescence intensity changed much more than when the design area of the array region was 15 mm2 or more and less than that, and the value was almost constant.
  • the ratio R of the array area depth (mm) to the design area (mm2) of the array area is 0.02. Yes, the ratio R decreases as the design area of the array region increases.
  • Figure 15 also shows the relationship between the design area of the array area and the fluorescence intensity when the array area depth is 0.1 mm.
  • the design area of the array area is 5 mm2 or more.
  • the ratio R at this time is 0.02 (refer to the right vertical axis in FIG. 15), and the ratio R becomes smaller as the design area of the array region increases.
  • This example is an example in which a separator sheet that can constitute a partition wall having a variable height and a separator sheet that further includes an overhang portion are prepared.
  • the hybridizing reaction and the washing process were performed in the same manner as in Example 1 except that the separator sheet was prepared as follows.
  • the separator sheet produced in this example is shown in FIGS.
  • the separator sheet 90 shown in FIG. 16 is a polyethylene terephthalate film having a thickness of 38 m and a silicon-coated double-sided adhesive sheet 100 made of polyethylene (PE) with an acrylic double-sided adhesive layer on the upper and lower surfaces.
  • PET polyethylene
  • PET polyethylene
  • a polyethylene sheet 102 having a thickness of 90 m with a silicon adhesive layer on the lower surface a polyethylene double-sided adhesive sheet 101 and a PET sheet 103 having a film thickness of 145 m
  • the upper PE sheet 102, the double-sided adhesive sheet 101, and the PET sheet 103 have a total film thickness of 300 m.
  • the interface between the PET sheet 101 and the PE sheet 102 is made of a silicon-based material, it becomes the most fragile interface part in the entire layer thickness of the sheet.
  • Separator sheet 110 shown in Fig. 17 is made of polycarbonate sheet 104 (film thickness: 145 ⁇ m) instead of PET sheet 103, and this polycarbonate sheet 104 is projected in parallel inside the array area. Except for the above, it has the same configuration as the separator sheet 90 shown in FIG.
  • the separator sheet shown in FIG. 17 is formed by punching PE double-sided adhesive sheet 100, PET sheet 101, PE sheet 102, PE double-sided adhesive sheet 100 and PC sheet 104 separately. Combined and manufactured together.
  • each of these separator sheets was affixed to a glass substrate having an array area prepared, and the test solution 81 was dropped on the cavity corresponding to each formed array area. Contamination of the test solution could be avoided by placing the sealed box in a sealed box or by installing the sealed box in an oven.
  • Figure 17 shows a substrate with a separator sheet with a PC overhang. As a result, the liquid was held in the cavity more stably.
  • the upper layer 300 m thick laminate could be easily removed at the interface between the PET sheet 101 and the PE sheet 102. . Further, preferable reactivity was obtained by removing the upper layer portion and washing in a state where the height of the partition wall was reduced.
  • the present invention can be used in the manufacture of detection devices for nucleic acids, proteins, synthetic or natural compounds in a sample, and industries that use the detection results.

Landscapes

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Abstract

　本発明は、表面の化学的性状が均一化され区画化されたアレイ領域を備えるプローブアレイを提供することを目的とする。本発明は、区画化され、多数個のプローブが固定化され複数個のアレイ領域を基板上に備えるプローブアレイにおいて、複数個の前記アレイ領域間を区画する隔壁を有するセパレーターを前記基板に装着して備えるようにする。基板表面への印刷や化学的処理による疎水性領域の形成に替えて、区画を可能な隔壁を有するセパレーターを装着することで実現することにより上記課題を解決できる。  

Description

プローブアレイ及びプローブアレイの製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、アレイ状にプローブを保持したプローブアレイ及びその製造方法に関し
、詳しくは、複数個のアレイ領域を有するプローブアレイ、そのためのセパレーター、 プローブアレイの製造方法及び核酸ハイブリダィズ方法等に関する。
背景技術
[0002] ガラス基板を用いた一般的な DNAマイクロアレイにおいて、一つの基板上に複数 のアレイ領域 (個々のアレイ領域は、多数個のプローブが固定されたプローブ固定領 域である）を形成して多検体を同時に処理することが試みられている。ハイブリダィズ は、複数のアレイ領域を有するガラス基板に一枚のカバーガラスを載せて実施される 力 こうした方法では、近接するアレイ領域の反応液 (ターゲットを含む溶液）が互い に混合するという問題が生じかねない。このため、例えば、特開 2002— 65274には 、アレイ領域を区画する区画壁に疎水性を付与する一方、アレイ領域内を親水性と することで、反応液をアレイ領域内に保持して混合を回避することが開示されている。
[0003] 図 18に示すように、 DNAマイクロアレイなど多数のプローブを基板上に保持するァ レイにおいては、通常、プローブを基板表面に固定ィ匕するための表面処理をしたうえ 、インクジェット法等各種の方式によりプローブを基板表面に供給し、その後プローブ を基板表面に固定するための固定ィ匕処理を行っている。複数のアレイ領域を区画す るための疎水性領域の形成には、印刷あるいは化学処理が用いられている力 こうし た疎水性領域を基板に固定するには、数百度の高温や基板の所定の液体への浸漬 を必要とし、プローブとなる核酸やタンパク質などの生体物質や表面処理を劣化させ る可能性がある。このため、従来は、図 18に示すように、疎水性領域の形成工程を表 面処理やスポッティングに先だって行 ヽ、予め疎水性領域を形成した基板の疎水性 領域が形成されていない領域に対し、表面処理を行い、その後スポッティングを行つ ている。 発明の開示
[0004] し力しながら、本発明者らの検討によれば、予め疎水性領域が形成された基板に 表面処理を行い、プローブをスポットし、固定化すると、疎水性領域によって区画され たアレイ領域内のハイブリダィズ反応の均一性が従来に比して低下する傾向があるこ とがわかった。また、印刷やコーティング等による疎水性領域で区画されたアレイ領 域内でのハイブリダィズ反応は効率が低下する傾向もあった。さらに検討を進めたと ころ、こうしたハイブリダィズにおける不具合は、アレイ領域表面の化学的性質の不均 一性に一因があることがわ力つた。
[0005] また、こうした複数のアレイ領域を有するアレイにぉ 、ては、被験液のアレイ領域間 における被験液のコンタミネーシヨンが大きな問題となる。例えば、被験液をアレイ領 域に滴下した後、アレイを所定の反応室に収容したり、さらに所定条件のインキュべ 一ター等にセットするなどアレイの移送に伴ってコンタミネーシヨンが生じやすくなつ ている。
[0006] そこで、本発明は、表面の化学的性状が均一化され区画化されたアレイ領域を備 えるプローブアレイを提供することを目的の一つとする。また、本発明は、ハイブリダィ ズ等プローブと被験液との良好な反応を実現できる区画ィ匕されたアレイ領域を備える プローブアレイを提供することを他の一つの目的とする。さら〖こ、本発明はアレイ領域 間のコンタミネーシヨンを抑制又は回避できるプローブアレイを提供することを他の一 つの目的とする
。また、本発明は、基板上の任意の領域に上記のようなアレイ領域を形成できるプロ ーブアレイ作製技術を提供することを、さらに他の一つの目的とする。
[0007] 本発明者らは、上記した課題について検討した結果、基板の表面処理に先立って 施されるアレイ領域の区画のための疎水性領域の形成処理またはその存在力 ァレ ィ領域の表面の化学的性状が不均一化され、この結果、表面処理が不均一化し、ま た、プローブのスポットの形状や大きさ、ひいては固定ィ匕量が不均一化し、この結果 ハイブリダィズ等の相互作用反応のバラツキも増大することを見出した。また、特に、 こうした不均一化は疎水領域に近接したアレイ領域の辺縁部分に発生することも見 出した。こうしたことから、本発明者らは、基板表面への印刷やィ匕学的処理による疎 水性領域の形成工程を排除するとともに、表面処理等を施した基板に対してアレイ 領域を区画可能な隔壁を有するセパレーターを装着することで従来の課題を解決で きることという知見を得て本発明を完成した。したがって、本発明によれば、以下の手 段が提供される。
[0008] 本発明の一つの態様によれば、区画化され、多数個のプローブが固定化された 1 個以上のアレイ領域を基板上に備えるプローブアレイであって、 1個以上の前記ァレ ィ領域を区画する隔壁を有するセパレーターを前記基板に装着して備える、プロ一 ブアレイが提供される。本発明においては、プローブは核酸プローブであることが好 ましい。また、プローブは、タンパク質プローブであることも好ましい。また、前記アレイ 領域は複数個であることが好まし 、。
[0009] この態様においては、前記セパレーターは、前記基板上の前記プローブが固定さ れるプローブ固定ィヒ層の表面に装着されていてもよぐこの場合、前記セパレーター は、前記プローブ固定ィヒ後に前記プローブ固定ィヒ層表面に装着されることが好まし い。
[0010] また、前記セパレーターはシート状であって、接着層を介して基板に対して固定さ れていることが好ましい。さらに、前記セパレーターは、前記基板に対して分離可能 に固定されて 、ることも好まし 、。
[0011] さらにまた、前記セパレーターの少なくとも一部に疎水性領域を有することもできる
。この態様においては、前記セパレーターの前記隔壁の頂面に前記疎水性領域を 有していることが好ましい。こうした疎水性領域の水の接触角は 60° 以上であること が好ましい。より好ましくは 70° 以上である。なお、前記疎水性領域は、ポリカーボネ ート、ポリオレフイン、ポリアミド、ポリイミド及びアクリル榭脂並びにこれらのフッ化物及 びハロゲンィ匕物からなる群力も選択される材料を含有することができる。
[0012] また、前記セパレーターの前記アレイ領域を区画する隔壁で囲まれた領域は前記 アレイ領域上に前記プローブと被験試料との相互作用のための開放系キヤビティを 構成することができる。
[0013] さらに、前記隔壁によって規定される前記アレイ領域の設計上の面積は、 0. 3mm 2以上 2000mm2以下とすること力 Sできる。好ましくは、 3mm2以上 90mm2以下とす ることもできる。さらに、前記アレイ領域を 1個以上 400個以下備えることもでき、好ま しくは 1個以上 144個以下備えることができる。
[0014] さらにまた、前記隔壁によって規定される前記アレイ領域の設計上の面積 (Sd)が 9 0mm2以下であって、以下の式（1)で表されるプロ一ビング有効面積率が 70%以上 とすることができる。
プロ一ビング有効面積率（％) = Se [mm2] /Sd [mm2] X 100 (1) ただし、 Seは、プローブと対象物との相互作用に基づくシグナル強度の変動係数 力 20%以下の領域の面積を表す。
なお、プロ一ビングとは、対象物と選択的又は特異的な相互作用が可能なプロ一 ブを用いて対象物との間で当該相互作用を生じさせて対象物を探査、検出、確認等 することを意味するものとする。なお、シグナル強度の変動係数とは、プローブアレイ 上のプローブに対して相互作用すべき対象物を供給して得られる相互作用に基づく シグナルの変動係数 (アレイ領域の微小領域力 検出されるシグナル強度の標準偏 差 Zアレイ領域の微小領域力 検出されるシグナル強度の平均値)である。シグナル 強度の変動係数は、アレイ領域内に単一種類のプローブの微小領域 (例えばスポッ トなどが挙げられる。）を適数個形成し、このプローブに相互作用する対象物を供給 してハイブリダィゼーシヨンを行って、各微小領域力 検出されるシグナルを測定し、 これらのシグナル強度の標準偏差と平均値とを求めることによって得られる。また、シ グナル強度の変動係数が 20%以下の領域とは、アレイ領域内の適数個の微小領域 のうち、上記シグナル強度の変動係数が 20%以下となるような微小領域が存在する 領域を意味するものとする。なお、シグナル強度の変動係数が 20%以下の領域の輪 郭は、当該変動係数を充足する微小領域群の最も外側にある微小領域によって規 定することができる。また、シグナル強度の変動係数の算出の対象となる微小領域は 、 3個以上とすることが好ましぐより好ましくは 20個以上である。
[0015] また、区画ィ匕される前記アレイ領域は、当該アレイ領域内の前記隔壁力 0. 8mm 以内の範囲を除外した領域でプロ一ビングによって得られるシグナル強度の変動係 数が 20%以下となることも好ましい。また、区画ィ匕される前記アレイ領域は、深さが 1 0 μ m以上 240 μ m以下であることが好まし!/ヽ。
[0016] また、区画ィ匕される前記アレイ領域は、以下の式（2)で表される比〔R〕が 0. 02以下 とすることちでさる。
R=d〔mm〕/Sd〔mm2〕 (2)
ただし、 dはアレイ領域の深さ、 Sdはアレイ領域の設計上の面積を表す。
[0017] また、本態様においては、前記セパレーターは、複数の異なる高さの隔壁を形成可 能とすることができる。さらに、前記セパレーターは、前記隔壁の少なくとも一部が除 去されて前記隔壁の高さを減殺可能とすることもできる。この態様において、前記セ パレーターは、 10 μ m以上 1000 μ m以下の範囲で複数の異なる高さの隔壁を形成 可能とすることができる。また、前記セパレーターの隔壁は、前記プローブに対して被 験試料を供給して反応させる反応時には、 60 m以上の高さを有し、前記反応後の 反応生成物のシグナル検出時には 60 m未満の高さを有するようにすることもできる 。この態様においては、前記アレイ領域の面積は、 0. 3mm2以上とすることができる 。さらに、前記セパレーターは積層体構造を有することができる。また、前記セパレー ターは、前記隔壁の少なくとも一部を除去可能な脆弱部を備えることができ、前記セ パレーターは積層体であり、前記脆弱部は積層された層の界面部とすることもできる
[0018] また、本態様においては、前記セパレーターは、前記隔壁の上方の少なくとも一部 にアレイ領域上方を指向して張り出す張出し部を有することができる。さらに、前記張 出し部は、前記アレイ領域を周囲全体にわたって備えられていてもよい。さらにまた、 前記張出し部のアレイ領域上方に隔壁力 張り出した部分の少なくとも被験液と接触 可能な領域は疎水性領域を有することもできる。
[0019] また、前記張出し部の最下端の高さ（基板表面力もの高さ）は、 40 μ m以上 990 μ m以下であってもよぐ前記張出し部は、前記アレイ領域に固定化された前記プロ一 ブには到達しない範囲で張出していてもよい。さらに、前記張出し部の内周面によつ て規定さ
れる領域が、前記アレイ領域の前記プローブが固定ィ匕される領域としてもよい。さら にまた、前記張出し部の少なくとも一部が前記隔壁の残余の部分に対して一体ィ匕及 び z又は除去可能としてもょ 、し、前記張出し部の全体が前記隔壁の残余の部分に 対して一体ィ匕及び z又は除去可能としてもょ 、。
[0020] また、本態様においては、前記セパレーターは、前記アレイ領域を区画する隔壁の 高さの少なくとも一部を構成することができ、前記基板が前記アレイ領域を区画する 隔壁の高さの少なくとも一部を構成して 、てもよ 、。
[0021] また、本発明の他の一つの態様によれば、多数個のプローブが 1個以上のアレイ領 域を形成して固定化された基板上の前記アレイ領域を区画するための隔壁を有する セパレーターが提供される。この態様においては、前記セパレーターの前記隔壁の 上面に疎水性領域を有することが好ましい。なお、アレイ領域は複数個とすることが できる。また、前記セパレーターは複数の異なる高さの隔壁を形成可能とすることが できる。また、前記セパレーターは、前記隔壁の上方の少なくとも一部にアレイ領域 上方を指向して張り出す張出し部を有することができる。さらに、前記セパレーターは 積層体構造を有していてもよい。さらに、前記セパレーターは、上記のいずれかに記 載のプローブアレイ用とすることが好まし 、。
[0022] また、本発明の他の一つの態様によれば、プローブアレイであって、多数個のプロ ーブが 1個以上のアレイ領域を形成して固定ィ匕され、上記セパレーターによって 1個 以上の前記アレイ領域が区画化されるプローブアレイも提供される。なお、この態様 のプローブアレイは、区画化されていないアレイ領域を備えるプローブアレイであり、 この態様のプローブアレイに上記のセパレーターが装着されることで、区画化された アレイ領域を有するプローブアレイが得られる。
[0023] 本発明のさらに他の一つの態様によれば、プローブアレイの製造方法であって、多 数個のプローブを、 1個以上のアレイ領域を形成して基板に固定ィ匕する工程と、プロ ーブが固定化された前記基板の表面に、該表面を区画可能な隔壁を備えるセパレ 一ターを装着して、多数個の前記プローブを 1個以上の前記アレイ領域に区画する 工程と、を備える、製造方法が提供される。この態様においては、前記アレイ領域は 複数個とすることができる。
[0024] 本発明のさらに他の一つの態様によれば、核酸ハイブリダィズ方法であって、核酸 プローブのプローブアレイの前記アレイ領域に核酸被験試料を含んだ被験液を供給 して前記プローブとのハイブリダィズを実施する工程を備える、ハイブリダィズ方法も 提供される。この方法においては、前記プローブアレイは、前記アレイ領域上にハイ ブリダィズのための開放系キヤビティを有しており、前記ハイブリダィズ工程は、前記 開放系キヤビティに被験液を供給し、加湿条件下で行うことができる。
[0025] また、本発明の他の一つの形態によれば、プローブアレイを用いた反応方法であつ て、タンパク質プローブを備える上記いずれかに記載のプローブアレイの前記アレイ 領域に被験液を供給して前記プローブとの反応を実施する工程を備える、反応方法 が提供される。
[0026] 本発明のさらに他の一つの形態によれば、プローブアレイを用いた反応方法であつ て、
区画化され、多数個のプローブが固定化された 1個以上のアレイ領域を基板上に 備えるプローブアレイの第 1の高さの隔壁で区画された 1個以上の前記アレイ領域に 被験液を供給して反応させる反応工程と、前記隔壁がな 、か又は前記隔壁の高さを 前記第 1の高さよりも低い第 2の高さに減じた状態で前記反応工程後の洗浄又は反 応生成物の検出を行う後工程と、を備える、反応方法が提供される。
[0027] この態様においては、前記反応工程に先だって、前記プローブを前記基板に固定 化した後前記第 1の高さの隔壁を前記基板上に形成する工程を備えることができる。 また、前記反応工程の前記第 1の高さの隔壁は、その上方の少なくとも一部にアレイ 領域上方を指向して張り出す張出し部を有し、前記後工程においては、前記張出し 部を除去して前記隔壁高さを前記第 2の高さに減じた状態とすることができる。さらに 、前記隔壁は、前記アレイ領域を区画可能なセパレーターを前記基板表面に付与し て形成してもよぐ前記セパレーターは積層体を用いてもょ 、。
図面の簡単な説明
[0028] [図 1]プローブアレイの一例を示す図である。
[図 2]プローブアレイの一例の詳細を示す図である。
[図 3]セパレーターシートにおける隔壁形態の一例を示す図である。
[図 4]セパレーターシートにおける隔壁形態の一例を示す図である。
[図 5]プロ一ビング有効面積率の概念図である。 [図 6]プローブアレイの作製工程の一例を示す図である。
[図 7]プローブアレイの作製工程において、基板上にプローブのアレイ領域（区画ィ匕 されて!/、な!/、）が形成された状態を示す図である。
[図 8]実施例の核酸プローブアレイのアレイ領域のパターンを示す図である。
[図 9]実施例のセパレーターシートの構成を示す図である。
[図 10]隔壁力もの距離と蛍光強度の CVとの関係を示すグラフである。
[図 11]実施例と比較例のハイブリダィズ有効面積率の相違を示すグラフである。
[図 12]アレイ領域の深さと蛍光強度との関係を示すグラフである。
[図 13]撥水性と蛍光強度との関係を示すグラフである。
[図 14]アレイ領域の設計上の面積に対するアレイ領域の深さの比 Rと蛍光強度との 関係を示すグラフである（アレイ領域深さ 0. 25mmの場合)。
[図 15]アレイ領域の設計上の面積に対するアレイ領域の深さの比 Rと蛍光強度との 関係を示すグラフである（アレイ領域深さ 0. 1mmの場合)。
[図 16]実施例 5で作製したセパレーターシートの積層構造を示す図である。
[図 17]実施例 5で作製したセパレーターシートの積層構造を示す図である。
[図 18]従来のプローブアレイの作製工程の一例を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の区画化され多数個のプローブが固定されたアレイ領域を基板上に備える プローブアレイは、前記アレイ領域とその周囲とを区画する隔壁を有するセパレータ 一を備えることを特徴としている。本発明のプローブアレイによれば、アレイ領域は、 アレイ領域とその周囲とを区画する隔壁を有するセパレーターが前記基板に装着さ れている。すなわち、基板に対して撥水性材料の印刷ゃ浸漬などによる疎水性領域 を形成することなくアレイ領域が区画ィ匕されている。このため、こうした処理を表面処 理前に行うことや疎水性ないし撥水性領域がプローブアレイ調製段階で基板上に存 在することによる基板表面の化学的性質の不均一化、表面処理の不均一化、プロ一 ブの形状、大きさ、固定ィ匕量の不均一化など、各種操作における不均一化を排除で きる。この結果、アレイ領域内の化学的性質が均一化された区画ィ匕アレイ領域を形 成できるし、プローブの固定ィ匕形態や固定量等が均一化されて良好なプロ一ビング を実施できる区画ィ匕アレイ領域を形成できる。この結果、多検体、多項目のプロービ ングであっても効率的に行うことができる。
[0030] また、本発明のセパレーターは、多数個のプローブが 1個以上のアレイ領域を形成 して固定化された基板上の前記アレイ領域を区画するための隔壁を有することを特 徴としている。このため、このセパレーターを、多数個のプローブが 1個以上のアレイ 領域を形成して固定化されたプローブアレイに装着することで、本発明の区画化され たアレイ領域を有するプローブアレイを形成でき、この結果、上記と同様の各種の利 点、を得ることができる。
[0031] さらに、本発明のプローブアレイの製造方法は、多数個のプローブを 1個以上のァ レイ領域を形成可能なパターンで基板に固定ィ匕する工程と、プローブが固定化され た前記基板の表面に、該表面を 1個以上に区画可能な隔壁を備えるセパレーターを 装着して、多数個の前記プローブを前記パターンで 1個以上の前記アレイ領域に区 画する工程と、を備えることを特徴としている。この方法によれば、アレイ領域の区画 化を想定したパターンでプローブを固定し、その後に、セパレーターによって多数個 のプローブを複数個のアレイ領域に区画する。このため、基板に対して撥水性材料 の印刷ゃ浸漬などによる疎水性領域を形成することなくアレイ領域が区画化されるこ とになる。このため、こうした疎水性領域形成処理を省略できるとともに、こうした疎水 性領域の存在による各種の上記した不均一化を排除して、好まし 、プローブアレイを 製造できる。なお、前記アレイ領域は複数個とすることが好ましい。
[0032] また、本発明の核酸ノヽイブリダィズ方法は、プローブアレイのアレイ領域に被験試 料を含んだ被験液を供給して前記プローブとのハイブリダィズを実施する工程を備え ることを特徴としている。この方法によれば、プローブアレイのアレイ領域において従 来の区画ィ匕法に起因する各種の不都合が排除されているため、良好なノ、イブリダイ ズを実施できる。
[0033] また、本発明のプローブアレイは、セパレーターとして複数の異なる高さの隔壁を形 成することができる。こうすることで、プローブと被験液との間で良好な反応を実現で きる。すなわち、プローブの固定化、ブロッキング、反応、洗浄、シグナル検出等、プ ローブアレイの製造や反応工程等に応じて必要な高さでアレイ領域を区画することが できる。例
えば、プローブの固定ィ匕ゃ表面処理時においては隔壁高さがこうした処理の妨げに ならな 、程度の高さ又はゼロ（隔壁がな 、状態）とし、反応時等にぉ 、ては被験液の コンタミネーシヨンを回避又は抑制可能な高さに設定し、洗浄やシグナル検出時にお いては、隔壁を低くあるいはゼロにすることが可能である。なお、隔壁高さをゼロにす るには、セパレーターを基板から分離可能に形成すればよい。また、隔壁の高さを調 整することにより、アレイ領域を含むキヤビティに対する被験液の供給量の自由度も 向上し、被験液の種類や反応の種類に応じて適切な被験液量で容易に反応させる ことができる。さらに、反応後においてアレイ領域毎に発色反応等させる場合におい ては隔壁の高さを維持又は高くすればよいし、そうでない場合には、隔壁を除去する か又は高さを減じればょ 、。
[0034] また、本発明のプローブアレイは、また、隔壁の上方の少なくとも一部にアレイ領域 を指向して張り出す張出し部を有することができる。こうすることで、隔壁で区画され たアレイ領域を含むキヤビティに被験液が供給されるとき、他のアレイ領域との被験 液のコンタミネーシヨンを効果的に回避又は抑制でき、この結果、プローブと被験液と の良好な反応を実現できる。さらに、こうした張出し部の被験液に接触する部位が疎 水性領域を有する場合には、親水性の被験液についてより効果的にコンタミネーショ ンを回避又は抑制できる。また、こうした張出し部によれば、隔壁 14の高さを抑制し つつ十分なコンタミネーシヨン抑制効果を得ることができる。なお、こうした張出し部を 有する隔壁に対しても、張出し部の少なくとも一部が隔壁の残余の部分に対して一 体ィ匕又は除去可能とすることで、プローブアレイの製造や各種操作や処理に妨げに ならないでかつコンタミネーシヨン抑制効果を発揮させることができる。
[0035] さらに、本発明のプローブアレイを用いた反応方法は、アレイ領域が第 1の高さの 隔壁で区画された状態でプローブと被験液とを反応させ、アレイ領域が前記第 1の高 さより低 、第 2の高さで区画されたあるいは隔壁がな 、状態で前記反応後の洗浄や 検出等の各種後工程を実施するものである。こうすることで、プローブと被験液との間 で良好な反応を実現できる。すなわち、既に説明したように、アレイ領域を区画する 隔壁に求められる特性 (高さ等）はアレイの製造、反応工程により異なっているため、 隔壁高さを必要に応じ、すなわち、反応時には高ぐその後の工程ではより低くする ことで、プローブアレイ上で好まし 、反応を実現できる。
[0036] 以下、本発明のプローブアレイ、セパレーター、プローブアレイの製造方法及び 核酸ハイブリダィズ方法について順に説明する。
[0037] (プローブアレイ）
本発明のプローブアレイ 2の一実施形態を図 1に示し、その詳細図を図 2に示す。 プローブアレイ 2は、基板 4とこの基板 4とセパレーター 12とを備えている。基板 4上に は、多数個のプローブ 6が固定されたスポット状の微小な領域 8を備えており、これら の微小領域 8は、例えば、整列されて一つのアレイ領域 10を形成している。
[0038] (プローブ）
本発明においてプローブ 6とは、特に限定しないで、核酸、タンパク質、合成あるい は天然の化合物など、アレイ領域 10上で被験液中の各種被験試料と相互作用の結 果、直接あるいは間接的に相互作用に基づくシグナルを検出できるものであればよ い。例えば、核酸同士は塩基対合に基づくハイブリダィゼーシヨンという相互作用、タ ンパク質と核酸、タンパク質と低分子化合物、核酸と低分子化合物との特異的結合な ど、各種の相互作用を利用できる。
[0039] 本発明のプローブアレイのプローブとしては最も典型的には核酸を用いることがで きる。核酸としては、少なくとも一部に核酸の塩基対合によって他の核酸とハイブリダ ィズす
るものであればよぐ天然あるいは合成のヌクレオチドのオリゴマーおよびポリマーの 双方を含み、さらにゲノム DNA、 cDNAなどの DNA、 PCR産物、 mRNAなどの RN A、ペプチド核酸を含む概念である。核酸は、塩基対合によるノ、イブリダィズ反応に よる相互作用、タンパク質や低分子化合物との特異的結合による相互作用によりシグ ナルを検出することができる。
[0040] タンパク質としては、酵素、抗体、抗原やレセプター等を用いることができる。これら はそれぞれ基質、抗原及び抗体、核酸と特異的に反応するために、シグナルを検出 することが可能となる。さらに、他の合成あるいは天然の化合物としては、コンビナトリ アルケミストリ一により合成した各種の薬剤候補ィ匕合物が挙げられる。なお、本発明 においては、これらの例示に限定されないで、標的化合物を検出できるものであれば プローブ 6として用いることができる。
[0041] プローブ 6は、例えば、直径 50 μ m〜500 μ m程度の微小領域 8として基板 4上に 存在する。本発明においては、基板 4に対するプローブ 6の固定方法や固定形態は 特に限定することなぐ本出願時において公知の全ての形態を包含するものである。 したがって、接触型のピンによるプローブ固定方法や非接触型のインクジェット法に よるプローブ固定方法のほか、基板 4上でプローブ 6を合成する方法も含まれる。
[0042] (基板）
基板 4の形状や材質は特に限定しな!、が、従来の DNAチップや DNAマイクロアレ ィ等に用いられている各種の材料の他各種の材料を使用できる。例えば、ガラス、二 酸化ケィ素、窒化ケィ素などのシリコン系セラミックスを含むセラミックス、シリコーン、 ポリメチルメタタリレート、ポリ（メタ)アタリレートなどの榭脂、金、銀、銅等の金属などを 用いることができる。所望の表面特性を付与するために適当なコートが施されていて もよい。なかでも、ガラス基板、シリコーン、アクリル榭脂を使用することができる。
[0043] 図 2に示すように、基板 4には、核酸など各種のプローブ 6を基板 4に固定するため に、プローブ 6の種類に応じた処理がなされてプローブ固定ィ匕層 5を備えていること が好ましい。プローブ固定ィ匕層 5の種類は特に限定しないが、例えば、核酸をプロ一 ブ 6として固定する場合には、ポリリシンなどの陽電荷ポリマー層、核酸中の官能基あ るいは核酸に付加した反応性基を結合可能なアルデヒド基やカルボキシル基を備え るポリマー層などをプローブ固定ィ匕層 5として備えることができる。なお、基板 4におい てプローブ 6を固定するべき領域は、多孔質であるなど微小な三次元形状を有して V、る場合も含め実質的に平坦であることが好ま 、。
[0044] (アレイ領域）
基板 4上には、アレイ領域 10を有している。アレイ領域 10は、微小領域 8が形成さ れた領域である。アレイ領域 10は、多数個の微小領域 8の集合体として形成されて いる。基板 4上には、 1個以上、好ましくは複数のアレイ領域 10を有している。異なる アレイ領域 10に異なるプローブ 6のグループが固定化されていてもよい。本発明のプ ローブアレイ 2におけるアレイ領域 10は少なくとも周囲と区画されているかあるいは他 のアレイ領域 10と区画ィ匕されている。区画ィ匕されたアレイ領域 10は、このアレイ領域 10上に被験液が供給されたとき、この被験液の一定量がアレイ領域 10内に保持さ れ、周囲ある 、は隣接するアレイ領域 10に流出しな 、ように区画ィ匕されて 、ることが 好ま 、。これらのアレイ領域 10に異なる被験試料を含む被験液を供給することで、 多検体の（または異なる種類の)被験液を同時にアツセィできることになる。
[0045] こうした区画化は、好ましくは、アレイ領域 10にキヤビティ 7を形成するようになされ ている。キヤビティ 7とは、例えばアレイ領域 10の少なくとも一部が開放された開放 系キヤビティが挙げられる。典型的には、上方が開放された凹状キヤビティである。ま た、キヤビティ 7としては、被験液の注入口を開閉可能に備える閉鎖系キヤビティであ つてもよい。こうしたキヤビティ 7は、後述するセパレーター 12によって形成される。こう したキヤビティ 7は、プローブ 6と被験試料との相互作用のための空間であり、プロ一 ブアレイ 2が核酸プローブアレイの場合には、ノ、イブリダィズ反応のための空間となる
[0046] キヤビティ 7は、基板 4自体の備える凹部ゃ凸部によってその深さの一部が形成さ れていてもよい。例えば、基板 4自体がアレイ領域 10に対応する浅いゥエルを有して いてもよいし、逆に、平坦なアレイ領域 10を区画する隔壁 14の高さの一部に相当す る高さの隔壁を有して 、てもよ 、。
[0047] キヤビティ 7の深さ（後述する隔壁 14の高さと同義である。 )は、 10 μ m以上 240 μ m以下であることが好ましい。この範囲であれば、キヤビティ 7に保持された被験液の 厚みにより、キヤビティ 7を構成する隔壁の影響を抑制して被験液の対流並びに被験 試料の拡散を確保でき、その結果として高感度な検出が可能となる。より好ましくは、 150 μ m以下であり、さらに好ましくは 100 μ m以下である。なお、アレイ領域 10の深 さは、後述するように、基板 4のプローブが固定された表面から隔壁 14の頂面までの 高さとすることができる。こうした距離は、例えば、各種のデジタル測長機などにより容 易に測定できる。このようなキヤビティ 7の構造は、核酸ノヽイブリダィゼーシヨンなど、 水性媒体下でのプロ一ビングを行う場合に好ましい。
[0048] さらに、キヤビティ 7の深さとアレイ領域 10の設計上の面積との関係については、以 下の式（2)で表される比〔R〕が 0. 02以下であることが好ましい。比 Rがこの範囲であ ると、キヤビティ 7の隔壁 14の影響を抑制して被験液の対流並びに被験試料の拡散 を確保でき、その結果として高感度な検出が可能となる。このようなキヤビティ 7の構 造も、核酸ハイブリダィゼーシヨンなど、水性媒体下でのプロ一ビングを行う場合に好 ましい。
R=d〔mm〕/Sd〔mm2〕 (2)
ただし、 dはアレイ領域の深さ、 Sdはアレイ領域の設計上の面積を表す。
[0049] また、アレイ領域 10の大きさ、すなわち、設計上のアレイ領域の面積 (ハイブリダィ ズ面積）は、 0. 3mm2以上 2000mm2以下であることが好ましい。この範囲であると 、プローブと被験試料との相互作用に基づくシグナル強度の変動係数がよく抑制さ れるからである。 0. 3mm2以下であると、隔壁 14の影響により被験液の対流並びに 被験試料の拡散が阻害されやすくなり、 2000mm2以上であると、被験液の対流並 びに被験試料の拡散のみではシグナル強度の変動係数を抑制しに《なる。より好ま しくは 3mm2以上 90mm2以下である。なお、設計上のアレイ領域の面積とは、後述 するセパレーター 12の隔壁 14によって規定される前記アレイ領域の内側の面積で ある。また、基板 4上におけるアレイ領域 10の個数は特に限定しないが、好ましくは、 1個以上 400個以下備えることができ、更に好ましくは 1個以上 144個以下備えること ができる。既存インフラへの対応の観点から、 96穴プレート程度のサイズでは 400個 以下、スライドガラスサイズであれば 144個以下が好まし 、。
[0050] (セパレーター）
基板 4上には、アレイ領域 10を区画ィ匕するセパレーター 12を備えている。セパレー ター 12は、図 1〜図 4に示すように、アレイ領域 10を区画ィ匕する隔壁 14を備えている 。セパレーター 12における隔壁 14は、アレイ領域 10を周囲と区画するためのもので あり、区画しょうとするアレイ領域 10の大きさや形状に対応されている。図 3に示す形 態では、隔壁 14がグリッド状に交差し、隣接するアレイ領域 10を区画可能となってお り、図 4に示す形態では、千鳥状にアレイ領域 10を区画可能に千鳥状の隔壁 14を 有
している。なお、こうした区画ィ匕されたアレイ領域 10は、図 3及び図 4に示す形態に限 定するものではなぐ一つあるいは 2個以上のアレイ領域 10をどのような形態で区画 ィ匕するものであってもよい。なお、セパレーター 12の隔壁は、個々のアレイ領域 10の 全体を取り囲むような形態の隔壁 10となっていることが好ましい。
[0051] セパレーター 12の隔壁 14の形態は、区画化しようとするアレイ領域 10の大きさ、数 、形状によって異なる力 セパレーター 12自体は、シート状体であることが好ましい。 シート状態であれば、その平坦面を利用して基板 4に対して装着するのが容易である 。シート状体とは、全体形状を意味し、隔壁 14の部分がスケルトン状であっても、セ ノル一ター 12の厚みと外形形態 (幅や長さ等)からシート状であればよい。
[0052] セパレーター 12は、アレイ領域 10を区画可能に基板 4に対して装着されていれば よい。したがって、基板 4にセパレーター 12を載置して治具等でこれらを挟んで固定 することもできるが、図 2に示すように、セパレーター 12は、接着層 16を介して基板 4 に対して固定されていることが好ましい。接着層 16により固定されることで、プローブ 6の固定化後にお 、て容易にセパレーター 12を基板 4に対して装着できる。接着層 16は、具体的にはいわゆる強力でかつ長時間の接着性を発揮する接着剤を用いて もよいし、分離が容易な粘着剤を用いることもできる。接着層 16を用いる装着は、セ パレーター 12がシート状体の場合に特に好ましい形態である。
[0053] セパレーター 12は、その高さ、すなわち、隔壁 14の高さが必要に応じて変更可能 であることが好ましい。高さを増減可能に構成するには、セパレーター 12が構成層の 一体ィ匕及び Z又は除去が可能な積層体構造を有することが好ましい。すなわち、セ パレーター 12を 2層以上の層を有する積層体とし、少なくとも一つの界面において構 成層を除去可能とすることで異なる高さを実現できる。一方、積層可能な構成層を有 する積層可能な構造体としてもよい。さらには、分離及び一体化の双方が可能な積 層体としてもよい。
[0054] 積層体にお 、てはその界面部が脆弱部でありこの部分で一体ィ匕及び Z又は除去 可能に構成されることが好ましい。例えば、接着剤や粘着剤などの層により一体化又 は除去可能に形成されていてもよいし、構成層自体の粘着性や密着性等によって一 体ィ匕又は除去可能に構成されていてもよい。接着剤等によれば、構成層と構成層と の間の接着強度を容易に調整でき、高さ調整時の操作性などを容易に確保すること ができる。さらに、構成層は機械的な嵌合等によって一体化又は分離可能に構成さ れて 、てもよ 、。構成層を一体化及び Z又は除去可能とする界面部分は必要に応じ て 1箇所又は 2箇所以上設けることができる。
[0055] また、セパレーター 12の高さを変更可能とするには、所定の高さ部位に脆弱部を 有する構造体とすることができる。積層構造によらなくても構造的にあるいは材質的 に脆弱な部位を有することで当該部位においてセパレーター 12の一部を除去してそ の高さを減ずることができる。
[0056] このような高さ可変の隔壁 14を有するセパレーター 12は、例えば、 10 μ m以上 10 00 μ m以下の範囲で高さ調整が可能となっていることが好ましい。この範囲であると 、反応時には、被験液のコンタミネーシヨンを回避又は抑制できる隔壁 14高さを構成 できる一方、反応後においては洗浄やシグナル検出を妨げない程度の高さの隔壁と することできる。より具体的には、反応時には、 60 m以上であることが好ましい。 60 μ m以上であると、被検液の供給量を十分に確保しつつ、アレイ移送時のアレイ領 域間のコンタミネーシヨンを良く抑制できる力もである。より好ましくは 200 μ m以上で ある。 200 m以上であると、アレイ領域 10を含むキヤビティ 7に供給した被験液の液 面の高さが隔壁 14を越えな 、状態でキヤビティ 7にお 、て反応させるのが容易にな る。一方、その後の洗浄やシグナル検出等においては 60 m未満であることが好ま し ヽ。 60 μ m未
満であると洗浄時のアレイ領域に対する洗浄液の液廻りが良ぐかつシグナル検出 にお 、ては、一般的な既存装置 (インフラ)への適用に支障をきたさな 、からである。 より好ましくは 50 m以下である。なお、隔壁 14の高さは、後工程においても 40 /z m 以上であることが好ましい。 40 /z m以上であると、隔壁 14の上部を除去して隔壁 14 の高さを減じたときにおいても、反応後の被験液のアレイ領域 10間のコンタミネーシ ヨンを抑制できる力 である。
[0057] また、セパレーター 12は、隔壁 14の上方の少なくとも一部にアレイ領域 10を指向し て張出す張出し部を備えることができる。この張出し部は、アレイ領域 10を包囲する 隔壁 14の周囲全体にわたって形成されて 、てもよ 、し、一部にのみ形成されて 、て もよい。一部にのみ形成されている形態としては、例えば、前記周囲において対向す る一対の隔壁にそれぞれ形成されていてもよいし、前記周囲全体にわたって適当な 間隔をお 、て不連続に多数個の張出し部が形成されて 、てもよ 、。
[0058] また、張出し部の形状も特に限定しない。張出し部は基板 4の表面に平行に張出し ていてもよいし、斜め下方を指向して張出していてもよい。さらに張出し部は、その内 周面が基板 4の表面に対してドーム状等上方にテーパ状となるように切欠き状となつ ていてもよい。張出し部の張出し量は、好ましくはアレイ領域 10に固定ィ匕されたプロ 一ブには到達されな 、範囲であることが好まし 、。張出し部がプローブに到達されて いると、被検試料を含む被検液を供給する際に、プローブ上に気泡を残留させてし まう等の不具合を生じることがあるからである。なお、換言すれば、張出し部を有する 場合には、張出し部の最も張出した先端側によって規定される領域がアレイ領域 10 によってプローブが固定化される領域である。したがって、張出し部の先端は、隔壁 1 4力ら 0. 8mm以内にあることが好ましい。
[0059] また、張出し部の最も下端の位置は、 40 μ m以上 990 μ m以下であることが好まし い。 40 m以上であると張り出し部を撓ませて除去する場合でも、張り出し部とアレイ 領域との接触、損傷を防ぐことができるからである。より好ましくは 以上であり、 また、 500 μ m以下である。
[0060] 張出し部の被験液と接触可能な部位は後述する疎水性領域 18を備えて 、ることが 好ましい。疎水性領域 18を備えることにより、より効果的に被験液のコンタミネーショ ンを回避又は抑制できる。被験液と接触可能な部位は、張出し部の基板 4の表面と 対向する下面又は内周面等が挙げられる。隔壁 14の、張出し部の形成位置が比較 的低い場合、例えば、張出し部の最上端の高さが 60 m未満であって、張出し部が 隔壁 14の最上部に形成されているなど、張出し部の頂面が露出されている場合には 、その頂面も疎水性領域 18を備えていることが好ましい。張出し部に疎水性領域 18 を付与する場合、典型的には張出し部自体を後述する疎水材料で形成することが好 ましい。
[0061] 張出し部はどのような形態で隔壁 14に対してまたセパレーター 12に対して備えら れていてもよい。隔壁 14の最上部に対して張出し部のみを装着し又は除去可能に 設けることもできるし、予め隔壁 14の最上部等の一部に備える形態であってもよい。 また、こうした張出し部は、隔壁 14で包囲されたアレイ領域 10を含むキヤビティ 7の開 口部（隔壁 14の上端縁で構成される）の周縁を一部遮断するようなパッチ状体であつ てもよい。
[0062] なお、張出し部を備えることで隔壁 14の高さを抑制しつつ被験液等のコンタミネー シヨンを抑制できる。
[0063] セパレーター 12は、図 2に示すように、基板 4のプローブ固定ィ匕層 5の表面に装着 されていることが好ましい。プローブ固定化層 5の形成後にセパレーター 12が装着さ れて
いることにより、プローブ固定化層 5は、アレイ領域 10を区画する従来の疎水性領域 の存在やその処理の影響に関わらず、均一に基板 4の表面に形成されることになる。 さらに、このことから、セパレーター 12の隔壁に隣接するアレイ領域 10の辺縁領域に も、他の部分と同様に均一にプローブ固定ィ匕層 5等の表面処理層が形成され備えら れることになる。なお、基板 4が隔壁 14の高さの一部に相当する高さの隔壁を備える 場合には、こうした隔壁に対応するようにセパレーター 12を装着すればよい。なお、 基板 4が隔壁 14の一部を備える場合には、平坦な基板 4と同様、こうした隔壁を備え る基板 4に対しても隔壁を含むそのアレイ領域 10を形成する表面全体に表面処理を 施してプローブ固定ィ匕層 5を形成した後、セパレーター 12が装着されることが好まし い。
セパレーター 12の材料は特に限定しないが、例えば、アクリル榭脂、熱可塑性エラ ストマー、天然あるいは合成ゴム、シリコーン、ポリオレフイン、ポリアミド、ポリイミド、ハ ロゲン化ビュル、ポリカーボネートなどの榭脂を用いることができる。また、セパレータ 一 12は、可撓性を有していることが好ましぐまた、透明性を有していてもよい。
[0064] セパレーター 12の少なくとも一部に疎水性領域 18を備えていることが好ましい。セ パレーター 12に疎水性領域 18を備えさせることにより、水性の被験液に対する撥水 性を発揮させ、被験液のアレイ領域 10間におけるコンタミネーシヨンを抑制できるとと もに、結果としてキヤビティ 7の本来の容量を越えて多くの量の被験液をアレイ領域 1 0内に保持させることができる。なお、本発明における疎水性領域は、少なくとも撥水 性を示す表面特性を有する領域を意味し、好ましくは、親水処理など施されていない 一般的なケィ酸ソーダガラスよりも高い撥水性を有する領域を意味する。 [0065] 疎水性領域 18は、また、キヤビティ 7に露出されていることにより、例えば、キヤビテ ィ 7内での被験液の自然対流を促進する駆動力として作用し、例えば、ハイブリダィ ズなどの物質間相互作用を良好に発現させることができる。
[0066] 疎水性領域 18は、被験液の流出ゃコンタミネーシヨン抑制、被験液のキヤビティ 7 への被験液の保持能力を高める観点からは、セパレーター 12の隔壁の頂部又は頂 面に備えていることが好ましい。ここで、頂部又は頂面とは、いずれも、隔壁 14の基 板 4と反対側の部分あるいは面である。また、キヤビティ 7内における物質相互作用を 促進する観点からは、疎水性領域 18はキヤビティ 7内に露出されるセパレーター 12 の領域に形成されていることが好ましぐ例えば、隔壁 14の内側（アレイ領域 10側） である。
[0067] このような疎水性領域 18の備える撥水性は、一般に平坦な表面における水の接触 角で表現することができる。本発明における疎水性領域の水の接触角は、 30° 以上 であることが好ましぐより好ましくは 60° 以上であり、さらに好ましくは 70° 以上であ る。最も好ましくは、 90° 以上である。なお、接触角とは、液滴を水平な固体板状に 置いたときに液滴が固体と接している部分の角度をいうものとする。接触角は、静的 接触角や臨界値としての前進接触角あるいは後退接触角、さらには動的接触角など をも用いることができる力 液滴法によって測定した静的接触角を用いることが好まし い。
[0068] なお、静的接触角を測定する液滴法は、（1)接線法、 (2) θ Z2法および (3) 3点ク リック法がある。（1)の接線法は、読み取り顕微鏡等を利用してカーソルを液滴の接 線に合わせて接触角を直接求める方法であり、（2)の 0 Z2法は、液滴の片端と頂 点とを結ぶ直線と固体面との角度を 2倍して接触角として求める方法であり、（3)の 3 点クリック法は、液滴と固体面との接点 2ケ所と頂点をコンピュータ画像上等でクリック して画像処理により求める方法である。これらの液滴法においては、上記（2)および（ 3)の方法にて接触角を求めることが好ま 、。
[0069] 疎水性領域 18は、セパレーター 12自体の材質を疎水性材料とすることで構成する
_
ともできるし、疎水性領域 18を形成しょうとする領域に対して疎水性材料および Zま たは疎水性 (撥水性)を呈する表面形態や層を付与することによつても形成すること ができる。疎水性領域 18を構成する疎水性材料としては、ポリカーボネート、ポリエ チレン、ポリプロピレンなどのポリオレフイン、ハロゲン化ビュル、ポリアミド、ポリイミド 及びアクリル榭脂並びにこれらの榭脂のフッ化又は塩ィ匕物を挙げることができる。ま た、撥水性を呈する表面形態としては、例えば、各種材料表面に化学的な修飾や機 械的処理により接触角が 60° 以上になるように粗面化された形態を挙げることがで きる。
[0070] こうしたセパレーター 12は、プローブ 6が固定化された基板 4に装着されてプローブ アレイ 2を構成する。基板 4に装着される前のセパレーター 12は、それ自体独立して 本発明の一態様を構成する。基板 4に装着される前のセパレーター 12は、接着層 16 をその基板 4への装着面に備えることができ、接着層 16は使用時まで剥離層により 保護されて ヽることが好ま ヽ。
[0071] このようなプローブアレイ 2においては、基板 4の表面に対して従来なされていた疎 水性領域の形成処理などがなされておらず、基板 4上に疎水性領域が存在しな ヽた め、プローブ固定化層 5などの表面処理が均一に施されている。さらに、このために、 アレイ領域 10内の全体に均一にプローブ固定ィ匕層 5が付与されていることになり、ァ レイ領域 10内におけるプローブ 6の微小領域 8の形成形態やプローブの固定ィ匕率な どが均一化されている。すなわち、従来のようにアレイ領域 10の辺縁領域において プローブ 6の微小領域 8の形状が歪んだり、あるいは固定ィ匕効率がばらつく若しくは 低!、などと!/、う不具合が解消されて 、る。
[0072] 以上のことから、本発明のプローブアレイ 2は、従来のアレイに比較してアレイ領域 10のプロ一ビング有効面積率（％)が向上されている。プロ一ビング有効面積率とは 、設計上のアレイ領域の面積 (Sd)に対するプロ一ビング有効面積 (Se)の割合であ る（以下の式（1)参照)。
プロ一ビング有効面積率（％) = Se [mm2] /Sd [mm2] X 100 (1) ただし、設計上のアレイ領域の面積 (Sd)は、隔壁 14で囲まれたアレイ領域 10内の 面積であり、プロ一ビング有効面積（Se)とは、当該アレイ領域 10内においてプロ一 ブと対象物との相互作用を一定の精度以上で検出できる面積であって、相互作用に 基づくシグナル強度の変動係数が 20%以下の領域の面積とする。例えば、核酸プロ ーブを用いたノヽイブリダィズ反応の場合には、ハイブリダィズによる蛍光などのシグナ ル強度の変動係数が 20%以下の領域となる。プロ一ビング有効面積率の概念図を 図 5に示す。
[0073] プロ一ビング有効面積率は、区画ィ匕されたアレイ領域 10の設計上のアレイ領域の 面積（Sd)によって異なるが、例えば、 Sdが 90mm2以下のときには、プロ一ビング有 効面積率は 70%以上であることが好ましい態様である。この Sdの場合、従来アレイ では、プロ一ビング有効面積率は 70%に到達していない（実施例 1参照)。好ましく は、この Sdにおいて、プロ一ビング有効面積率が 80%以上であり、より好ましくは 85 %以上である。
[0074] また、本発明のプローブアレイ 2の区画化されたアレイ領域 10は、隔壁 14力ら 0. 8 mm以内の範囲を除外した領域にお 、て、プローブ 6と被験試料との相互作用に基 づくシグナル強度の変動係数が 20%以下とすることができる。従来のアレイでは、隔 壁 14に対応する疎水性領域から lmm程度を除外しないとこのような均一性を確保 できていない。好ましくは、 0. 6mm以内、さらに好ましくは、 0. 4mm以内、最も好ま しくは 0. 3mm以内の範囲を除外した領域において前記変動係数が 20%以下となる 。なお、これらの各種アレイ領域において、変動係数は 15%以下であることがより好 ましく、さ
らに好ましくは 10%以下である。なお、隔壁 14力も所定距離離れたライン上にある微 小領域 8のシグナル強度を測定し、その変動係数を算出することにより、こうした判定 を行うことができる。
[0075] (プローブアレイの製造方法）
次に、本発明のプローブアレイの製造方法について説明する。プローブアレイとし て図 1及び 2に示すプローブアレイ 2を例示して、図 6を参照しながら本発明の製造方 法について説明する。
[0076] 本発明のプローブアレイの製造方法は、多数個のプローブ 6を区画ィ匕された複数 個のアレイ領域 10を形成可能なパターンで基板 4に固定ィ匕する工程と、プローブ 6 が固定化された前記基板 4の表面に、該表面を複数個に区画可能な隔壁 14を備え るセパレーター 12を装着して、多数個の前記プローブ 6を前記パターンで複数個の アレイ領域 10に区画する工程と、を備えている。
[0077] プローブ 6の固定化工程では、プローブ固定ィ匕層 5を備える基板 4に対してプロ一 ブ 6を各種の方法で供給する。プローブ 6は、微小領域 8を形成するように供給される ことが好ましい。プローブ 6の供給方法等は、既に述べたように特に限定しないし、ま た、プローブ 6を基板 4表面において合成する方法も排除されない。プローブ 6は、後 段で複数個のアレイ領域 10を形成可能なパターンで供給される。例えば、図 7に示 すように、多数個の微小領域 8が整列してなるアレイ領域 10が基板 4上にいくつか形 成される。このパターンは、後段で装着されるセパレーター 12の隔壁 14によって規 定されるアレイ領域 10の区画形態に対応している。なお、基板 4がアレイ領域 10に 対応する凹部や隔壁 14の高さの少なくとも一部に対応する凸部を備えていてもよぐ この場合にはこれらに対しても同様にプローブ固定ィ匕層 5が付与されていることが好 ましい。
[0078] プローブ 6の微小領域 8のパターンが形成された基板 4に対して、加熱処理、液中 への浸漬、脱水'洗浄等、プローブ 6とプローブ固定化層 5との種類に応じた処理を 行ってプローブ 6を固定する。
[0079] 本方法では、プローブ 6の固定化に先立って、区画のための疎水性領域の形成処 理も行われておらず、その結果、疎水性領域も基板 4上に存在していない。このため 、基板 4上には均一にプローブ固定ィヒ層 5が付与された状態となっており、この結果 、プローブ 6は固定化層 5により確実に、より良好な形態で固定ィ匕されることになる。
[0080] こうして多数個のプローブ 6が、複数個の区画化されたアレイ領域 10を形成可能な パターンで基板 4に固定化されたプローブアレイが得られる。こうしたプローブアレイ は、使用時にセパレーター 12を装着することで区画ィ匕されたアレイ領域 10を備える プローブアレイとなる。したがって、セパレーター 12が装着されず区画化されていな いアレイ領域 10を備えるプローブアレイは、このままの状態で保存可能であり、また、 流通可能である。
[0081] 次いで、プローブ 6が固定化された基板 4の表面に、セパレーター 12を装着する。
基板 4の最表層はプローブ 6が固定化されたプローブ固定化層 5であるので、セパレ 一ター 12はプローブ固定ィ匕層 5に装着されることになる。セパレーター 12は基板 4の 表面を複数個に区画可能な隔壁 14を備えており、セパレーター 12を基板 4の表面 に装着することにより、アレイ領域 10を区画ィ匕できる。セパレーター 12の装着方法及 び装着形態には特に限定されず、接着層 16を介してもよいし、治具等により基板 4と セパレーター 12とを挟持するようにしてもよい。
[0082] このようにして得られるプローブアレイ 6は、上記のとおりの構成を有することができ る。したがって、本発明のプローブアレイの製造方法においては、既に説明したプロ ーブアレイ 6の各種形態を包含する。
[0083] (核酸のハイブリダィズ方法）
本発明のプローブアレイにおいて、プローブとして核酸プローブを用いることで、核 酸被験試料を含む多数の又は異種の被験液を同時にハイブリダィズアツセィできる 核酸ハイブリダィズ方法が提供される。すなわち、核酸ハイブリダィズ方法は、プロ一 ブアレイ 2の区画化されたアレイ領域 10に核酸被験試料を含んだ被験液を供給して 核酸プローブ 6とのハイブリダィズを実施する工程を備えて ヽる。このハイブリダィズ 方法においては、アレイ領域 10上にハイブリダィズのための開放系キヤビティ 7を有 していることが好ましぐハイブリダィズ工程では、開放系キヤビティ 7に被験液を供給 し、加湿条件下でハイブリダィズを行うことが好ましい。こうすることで、被験試料液の コンタミネーシヨンを回避して多数個の核酸被験液を同時にアツセィすることができる
[0084] (プローブアレイを用いた反応方法）
本発明のプローブアレイを用いた反応方法は、多数個のプローブが固定化され区 画化された 1個以上のアレイ領域を基板上に備えるプローブアレイであって第 1の高 さを有する隔壁で区画された 1個以上の前記アレイ領域に被験液を供給して反応さ せ、隔壁がないか又は隔壁の高さを前記第 1の高さよりも低い第 2の高さに減じた状 態で前記反応工程後の洗浄又は反応生成物の検出を行うことが好ましい。ここで第 1の高さは、例えば、 10 μ m以上であることが好ましぐまた 1000 μ m以下であること が好ましい。また、例えば、第 2の高さは、 60 /z m未満であることが好ましぐより好ま しくは 50 μ m以下である。また、第 2の高さは 40 μ m以上であることが好ましい。なお 、隔壁 14を除去してもよいが、上記高さ以上の隔壁 14を残すことにより、セパレータ 一 12の上部を除去して隔壁 14の高さを減ずる際において、アレイ領域 10間のコンタ ミネーシヨンを効果的に抑制できる。
[0085] このように区画ィ匕されたアレイ領域 10を有するプローブアレイを用いる反応にぉ ヽ て、必要に応じて隔壁 14の高さを変更するには、その都度、隔壁 14を形成するよう なセパレーターを装着してもよいが、高さの変更が可能な本発明のセパレーター 12 を用いることが好ましい。こうしたセパレーター 12によれば、反応から検出までの各種 ステップに応じた高さの隔壁 14を容易に構築でき、被験液のコンタミネーシヨンを効 果的に抑制しつつ、十分な被験液量の供給が可能であり、洗浄も容易であり、さらに シグナル検出にも適した厚みとすることができる。また、セパレーター 12が張出し部を 有する場合には、効果的に被験液のコンタミネーシヨンを抑制できるため、隔壁 14の 高さを低くすることちでさる。
実施例 1
[0086] 以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明する。本実施例は、基板の表面処 理コートの均一性を、化学操作 (印刷による撥水性附与)後に表面コートした場合と 表面コート後にセパレーターシートを貼付した場合とで比較するものである。比較方 法は、 3基板間のハイブリダィゼーシヨンによって得られた蛍光強度の変動係数 (CV ： (標準偏差 Z平均値） X 100 (%) )を隔壁に沿った列毎に算出して、 CVが安定す る距離を確定するとともに、ハイブリダィズ有効面積率の大小からコートの均一性を評 価した。ハイブリダィズ有効面積率は、（安定した CVを得られたアレイ領域の面積 Z 設計上のアレイ領域の面積） X 100 (%)と定義する。
[0087] まず、ポリ L—リジンでコートされたガラス基板上に、図 8に示すように、複数区画に 分けてラット由来の cDNAを 99種スポットした。次いで、このガラス基板に対し、 8 0°Cで 1時間加熱処理、ブロッキング溶液への浸漬処理（15分間）、及び沸騰した滅 菌水中への浸漬処理 (3分間）を施し、エタノールで脱水した後、遠心乾燥して、核酸 プローブアレイ（区画化前）を作製した。なお、ブロッキング溶液は、 70mM無水コハ ク酸、 0. 1Mホウ酸ナトリウム（pH8. 0)、 1— methyl— 2— pyrrolidinoneとした。
[0088] 複数のアレイ領域に区画ィ匕するセパレーターシートは、図 9に示す構成を有してお り、次のようにして作製した。すなわち、片面にシリコーン系撥水処理 (水の接触角 11 0° )を施したアクリルシート（t=0. 037mm)の撥水処理面の反対面に両面接着シ —卜と片面接着シートとを積層し、この積層体を図 8に示す複数区画に対応するバタ —ンで打ち抜いた。
[0089] このセパレーターシートを、区画化前の核酸プローブアレイに貼付し、実施例の核 酸プローブアレイを作製した。
[009Q] 比較例の核酸プローブアレイは以下のようにして作製レた。すなわち、図 8に示す パターンに基づレ、て予め撥水材料をガラス基板に印刷し撥水材料を加熱凝固させた 後にポリ L—リジンでコートされたガラス基板を用意し、上記と同様に cDNAをスポット 後、加熱処理、ブロッキング、洗浄及び乾燥を行い、セパレーターシートを貼付するこ となく比較例の核酸プローブアレイを作製した。.
[0091] 次に、ラット由来の mRNAを基板あたり 1 g使用して、細胞工学 Vol. 18 No. 7 1999記載の手順に従い Cy 3標識 cDNAを調製した。この被験液を、 DNAアレイの 各アレイ領域に 8 1ずつ滴下し、ノ、イブリダィゼーシヨンを終濃度（5 X SSC, 0. 5 %SDS)で行うこととした。このプローブアレイを、滅菌水を 3ml封入したタイトボックス に設置し、静置してハイブリダィゼーシヨンを実施した。ハイブリダィゼーシヨン条件は 、 42°C、湿度 10Q%RH、 16寺間とした。
[0092] 所定時間経過後、プローブアレイを以下の 3種溶液 ( (2 X SSC, 0. 1%SDS)溶液 、（1 X SSC)溶液、 (0. 1 X SSC)溶液）中でこの順でそれぞれ 5分振とうして洗浄し た。洗浄後、遠心機 (lOOOrpm, 3分間）にてプローブアレイを乾燥させ、スキャナー (Packard BioChip Technologies社製 Scan Array4000)にて蛍光を測定した 。蛍光強度の測定値を、数値解析ソフト (Axon社製 Gene Pix. Pro)を用レ、て数値 化し、さらに、 Excelを用いて実施例及び比較例それぞれ 3枚の基板間の CVを算出 し、 CVの安定するスポットの壁面からの距離を確定するとともに、該距離からハイプリ ダイズ有効面積率を算出した。
[0093] 図 10に示すように、実施例のプローブアレイ (表面コート後にシートを貼付して撥水 性を附与したアレイ）は、比較例のプローブアレイ (撥水性附与後に表面コートを施し たアレイ）に比べて、隔壁から短い距離で CVが安定していた。実施例のプローブァ
訂正されあ,用羝 (規 91) レイは隔壁から 0. 21mm,比較例のプローブアレイは 0. 88mmであった。
[0094] この距離の算出結果に基づくハイブリダィズ有効面積率は、以下のとおりとなった。
実施例のプローブアレイ： CVの安定する区画壁からの距離が 0. 21mm ノヽイブリ有効面積率 ίま、 { (4-0. 21 X 2) X (6-0. 21 Χ 2) }/24 = 83. 2% 比較例のプローブアレイ： CVの安定する区画壁からの距離が 0. 88mm ノヽイブリ有効面積率 ίま、 { (4-0. 88 X 2) X (6-0. 88 X 2) }/24 = 39. 5% [0095] 図 11にも示すように、実施例のハイブリダィズ有効面積率は比較例のハイブリダィ ズ有効面積率の約 2. 1倍に拡大していた。以上のことから、本発明プローブアレイに よれば、隔壁周辺のコートムラを抑えることができ、均一性の高いアレイ領域を形成し
、核酸プローブが有効に固定されていることがわ力つた。
実施例 2
[0096] 本実施例は、アレイ領域の深さ力 ハイブリダィゼーシヨンの結果である蛍光強度に 及ぼす影響を確認するものである。実施例 1で作製したセパレーターシートにお 、て
、表面の撥水処理剤の種類と両面接着シート及び Ζ又は片面接着シートの厚みとを 調整して、 2種類の撥水性 (水の接触角として 70° と 110° )で各種の厚みのセパレ 一ターシートを作製した。こうしたセパレーターシートを用いる以外は、実施例 1と同 様に操作して、実施例の核酸プローブアレイを作製し、ハイブリダィゼーシヨンを行い 、蛍光強度を測定し、数値化した。結果を図 12に示す。
[0097] 図 12に示すように、アレイ領域の深さ（セパレーターシートの厚みでもある）が 250 m近傍で蛍光強度が大きく変化することがわ力つた。この結果から、アレイ領域の 深さは 250 m以下であることが好ましいことがわかった。なお、撥水性の相違 (ここ では、 70° と 110° )による蛍光強度の差は認められな力つた。
実施例 3
[0098] 本実施例は、セパレーターシートの隔壁の上面の疎水性領域の撥水性がハイブリ ダイゼーシヨンの結果である蛍光強度に及ぼす影響を確認するものである。実施例 で作製したセパレーターシートにおいて、アクリルシートの表面処理の種類等を調整 して各種の撥水性 (水の接触角）のセパレーターシートを作製した。撥水性の異なる セパレーターシートを用いる以外は、実施例 1と同様に操作して、実施例の核酸プロ ーブアレイを作製し、ノ、イブリダィゼーシヨンを行い、蛍光強度を測定し、数値化した
。結果を図 13に示す。
[0099] 図 13に示すように、水の接触角は 60° 〜70° 近傍において蛍光強度が大きく変 化することがわ力つた。この結果から、セパレーターシートの撥水性は、水の接触角 力 0° 以上であることが好ましぐより好ましくは 70° 以上であることがわ力つた。 実施例 4
[0100] 本実施例は、設計上のアレイ領域の面積とアレイ領域の深さが、ハイブリダィゼー シヨンの結果である蛍光強度に及ぼす影響を確認するものである。実施例 1で作製し たセパレーターシートにおいて、両面接着シート及び Z又は片面接着シートの厚み を調整して 2種類の厚み（0. 25mm及び 0. 1mm (アレイ領域の深さ））のセパレータ 一シートを作製するとともに、金型によるうち抜きパターンを 1, 4, 9, 16, 25, 36及 び 49mm2の合計 7種類のシートを作製した。なお、表面処理による撥水性は実施例 1と同様とした。これらのセパレーターシートを用いる以外は、実施例 1と同様に操作 して、実施例のプローブアレイを作製し、ハイブリダィゼーシヨンを行い、蛍光強度を 測定し、数値化した。結果を図 14及び図 15に示す。
[0101] 図 14には、アレイ領域の深さ（セパレーターシートの厚み）が 0. 25mmのときのァ レイ領域の設計上の面積と蛍光強度との関係を示しているが、この図から明らかなよ うに、アレイ領域の設計上の面積が 15mm2以上においてそれ未満のときよりも蛍光 強度が大きく変化するとともに、ほぼ一定値となった。アレイ領域の設計上の面積が 1 5mm2のとき、アレイ領域の設計上の面積（mm2)に対するアレイ領域の深さ（mm) の比 R (図 14の右縦軸参照）は、 0. 02であり、アレイ領域の設計上の面積が増大し ていくと比 Rはより小さくなる。
[0102] また、図 15には、アレイ領域の深さが 0. 1mmのときのアレイ領域の設計上の面積 と蛍光強度との関係を示している力 アレイ領域の設計上の面積が 5mm2以上にお いてそれ未満のときと比較して蛍光強度が大きく変化するとともにほぼ一定値となつ た。このときの上記比 Rは、 0. 02 (図 15の右縦軸参照）であり、アレイ領域の設計上 の面積が増大していくと比 Rはより小さくなる。
[0103] 以上のことから、アレイ領域の設計上の面積 (mm2)に対するアレイ領域の深さ (m m)の比は、 0. 02以下であることが好ましいことがわかった。
実施例 5
[0104] 本実施例は、高さ可変の隔壁を構成できるセパレーターシート及びさらに張出し部 を備えるセパレーターシートを調製した例である。本実施例では、セパレーターシー トを以下のように作製した以外は、実施例 1と同様にして操作し、ハイブリダィズ反応 、洗净工程を実施した。
[0105] 本実施例で作製したセパレーターシートを図 16及び図 17に示す。図 16に示すセ パレーターシート 90は、基板側から、上下面にアクリル系両面接着剤層を備えるポリ エチレン (PE)製両面接着シート 100、上面にシリコンコーティングされた膜厚 38 mのポリエチレンテレフタレート（PET)製シート 101、下面にシリコン系接着剤層を有 する膜厚 90 mのポリエチレン製シート 102、上記ポリエチレン製両面接着シート 10 1及び膜厚 145 mの PET製シート 103を重ね合わせて、必要なパターンで打ち抜 いて作製した。ここで、上層側の PE製シート 102、両面接着シート 101及び PET製 シート 103は全体で膜厚 300 mとなっている。また、このセパレーターシートにおい ては、 PETシート 101と PE製シート 102との界面がシリコン系材料で構成されている ため、シートの層厚全体で最も脆弱な界面部となって 、る。
[0106] 図 17に示すセパレーターシート 110は、 PET製シート 103に替えてポリカーボネー ト製のシート 104 (膜厚 145 μ m)を重ね、このポリカーボネート製シート 104をアレイ 領域内側に平行に張出し状になっている以外は、図 16に示すセパレーターシート 9 0と同様の構成を有している。なお、図 17に示すこのセパレーターシートは、 PE製両 面接着シート 100、 PET製シート 101、 PE製シート 102及び PE製両面接着シート 1 00と PC製シート 104はそれぞれ別個に打ち抜いた上で位置合わせして一体ィ匕して 作製した。
[0107] これらのセパレーターシートをそれぞれアレイ領域が準備されたガラス製基板に貼 り付けて、形成された各アレイ領域に対応するキヤビティに被験液 8 1を滴下したとこ ろ、ハイブリダィズのためにアレイを密閉ボックスに収容したり、さらにこの密閉ボック スをオーブンに設置する操作などにぉ 、て、被験液のコンタミネーシヨンを回避でき た。図 17に示す PC製の張出し部を備えるセパレーターシートを貼付した基板におい ては、液体は一層安定してキヤビティ内に保持された。また、いずれのセパレーター シートを貼付した基板においても、ハイブリダィズ反応後、 PET製シート 101と PE製 シート 102との界面で上部層の膜厚 300 mの積層体部分を容易に除去することが できた。また、上層部分を除去して隔壁高さを低減させた状態で洗浄したことにより好 ましい反応性が得られた。
[0108] 本発明は、 2005年 3月 25日に出願された日本国特許出願第 2005— 089403、 および 2005年 10月 28日に出願された日本国特許出願第 2005— 315262号を優 先権主張の基礎としており、引用によりその内容のすべてが編入される。
産業上の利用可能性
[0109] 本発明は、試料中の核酸、タンパク質、合成あるいは天然の化合物などの検出装 置の製造及びその検出結果を利用する産業に利用できる。

Claims

請求の範囲
[I] 区画化され、多数個のプローブが固定化された 1個以上のアレイ領域を基板上に 備えるプローブアレイであって、
1個以上の前記アレイ領域を区画する隔壁を有するセパレーターを前記基板に装 着して備える、プローブアレイ。
[2] 前記アレイ領域は複数個である、請求項 1に記載のプローブアレイ。
[3] 前記セパレーターは、前記基板上の前記プローブが固定されるプローブ固定化層 の表面に装着される、請求項 1又は 2に記載のプローブアレイ。
[4] 前記セパレーターは、前記プローブ固定ィ匕後に前記プローブ固定ィ匕層表面に装 着されている、請求項 3に記載のプローブアレイ。
[5] 前記セパレーターはシート状であって、接着層を介して基板に対して固定されてい る、請求項 1〜4のいずれかに記載のプローブアレイ。
[6] 前記セパレーターは、前記基板に対して分離可能に固定されている、請求項 1〜5 の！、ずれかに記載のプローブアレイ。
[7] 前記セパレーターの少なくとも一部に疎水性領域を有する、請求項 1〜6のいずれ かに記載のプローブアレイ。
[8] 前記セパレーターの前記隔壁の頂面に前記疎水性領域を有している、請求項 7に 記載のプローブアレイ。
[9] 前記疎水性領域の水の接触角は 60° 以上である、請求項 7又は 8に記載のプロ一 ブアレイ。
[10] 前記疎水性領域は、ポリカーボネート、ポリオレフイン、ポリアミド、ポリイミド及びァク リル榭脂並びにこれらのフッ化物及びハロゲンィ匕物力もなる群力も選択される材料を 含有する、請求項 7〜9のいずれかに記載のプローブアレイ。
[II] 前記セパレーターの前記アレイ領域を区画する隔壁で囲まれた領域は前記アレイ 領域上に前記プローブと被験試料との相互作用のための開放系キヤビティを構成す る、請求項 1〜10のいずれかに記載のプローブアレイ。
[12] 前記隔壁によって規定される前記アレイ領域の設計上の面積は、 0. 3mm2以上 2 000mm2以下である請求項 1〜： L 1のいずれかに記載のプローブアレイ。
[13] 前記アレイ領域を 1個以上 400個以下備える、請求項 1〜12のいずれかに記載の プローブアレイ。
[14] 前記隔壁によって規定される前記アレイ領域の設計上の面積 (Sd)が 90mm2以下 であって、以下の式（1)で表されるプロ一ビング有効面積率が 70%以上である、請 求項 1〜13のいずれかに記載のプローブアレイ。
プロ一ビング有効面積率（％) = Se [mm2] /Sd [mm2] X 100 (1) ただし、 Seは、プローブと被験試料との相互作用に基づくシグナル強度の変動係 数が
20%以下の領域の面積を表す。
[15] 区画化される前記アレイ領域は、当該アレイ領域内の前記隔壁力 0. 8mm以内 の範囲を除外した領域でプロ一ビングによって得られるシグナル強度の変動係数が
20%以下となる、請求項 1〜14のいずれかに記載のプローブアレイ。
[16] 区画化される前記アレイ領域は、深さ（d)が 10 m以上 240 m以下である、請求 項 1〜15のいずれかに記載のプローブアレイ。
[17] 区画化される前記アレイ領域は、以下の式（2)で表される比〔R〕が 0. 02以下であ る、請求項 1〜16のいずれかに記載のプローブアレイ。
R=d〔mm〕/Sd〔mm2〕 (2)
ただし、 dはアレイ領域の深さ、 Sdはアレイ領域の設計上の面積を表す。
[18] 前記セパレーターは、複数の異なる高さの隔壁を形成可能である、請求項 1〜17 の！、ずれかに記載のプローブアレイ。
[19] 前記セパレーターは、 10 μ m以上 1000 μ m以下の範囲で複数の異なる高さの隔 壁を形成可能である、請求項 18に記載のプローブアレイ。
[20] 前記セパレーターは、前記隔壁の少なくとも一部が除去されて前記隔壁の高さを減 殺可能である、請求項 1〜19のいずれかに記載のプローブアレイ。
[21] 前記セパレーターの隔壁は、前記プローブに対して被験試料を供給して反応させ る反応時には、 60 m以上の高さを有し、前記反応後の反応生成物のシグナル検 出時には 60 μ m未満の高さを有する、請求項 18〜20のいずれかに記載のプローブ アレイ。
[22] 前記アレイ領域の面積は、 0. 3mm2以上である、請求項 18〜21のいずれかに記 載のプローブアレイ。
[23] 前記セパレーターは積層体構造を有する、請求項 18〜22のいずれかに記載のプ ローブアレイ。
[24] 前記セパレーターは、前記隔壁の少なくとも一部を除去可能な脆弱部を備える、請 求項 18〜23のいずれかに記載のプローブアレイ。
[25] 前記セパレーターは積層体であり、前記脆弱部は積層された層の界面部である、 請求項 24に記載のプローブアレイ。
[26] 前記セパレーターは、前記隔壁の上方の少なくとも一部にアレイ領域上方を指向し て張り出す張出し部を有する、請求項 1〜25に記載のプローブアレイ。
[27] 前記張出し部は、前記アレイ領域を周囲全体にわたって備える、請求項 26に記載 のプローブアレイ。
[28] 前記張出し部のアレイ領域上方に隔壁から張り出した部分の少なくとも被験液と接 触可能な領域は疎水性領域を有して!/、る、請求項 26又は 27に記載のプローブァレ ィ。
[29] 前記張出し部の最下端の高さは、 40 m以上 990 m以下である、請求項 26〜2
8の!、ずれかに記載のプローブアレイ。
[30] 前記張出し部は、前記アレイ領域に固定ィヒされた前記プローブには到達しない範 囲で張出している、請求項 26〜29のいずれかに記載のプローブアレイ。
[31] 前記張出し部の内周面によって規定される領域力 前記アレイ領域の前記プロ一 ブが固定化される領域である、請求項 26〜30のいずれかに記載のプローブアレイ。
[32] 前記張出し部を含む部分が前記隔壁の残余の部分に対して一体化及び Z又は除 去可能である、請求項 26〜31いずれかに記載のプローブアレイ。
[33] 前記張出し部全体が前記隔壁の残余の部分に対して一体化及び Z又は除去可能 である、請求項 32に記載のプローブアレイ。
[34] 前記セパレーターは、前記アレイ領域を区画する隔壁の高さの少なくとも一部を構 成する、請求項 1〜33のいずれかに記載のプローブアレイ。
[35] 前記基板は、前記アレイ領域を区画する隔壁の高さの少なくとも一部を構成する、 請求項 1〜34のいずれかに記載のプローブアレイ。
[36] 前記プローブは核酸プローブである、請求項 1〜35のいずれかに記載のプローブ アレイ。
[37] 前記プローブはタンパク質プローブである、請求項 1〜35のいずれかに記載のプロ ーブアレイ。
[38] 多数個のプローブが 1個以上のアレイ領域を形成して固定化された基板上の前記 アレイ領域を区画するための隔壁を有するセパレーター。
[39] 前記アレイ領域は複数個である、請求項 38に記載のセパレーター。
[40] 前記セパレーターの前記隔壁の頂面に疎水性領域を有する、請求項 38又は 39に 記載のセパレーター。
[41] 前記セパレーターは複数の異なる高さの隔壁を形成可能である、請求項 38〜40 の！、ずれかに記載のセパレーター。
[42] 前記セパレーターは、前記隔壁の上方の少なくとも一部にアレイ領域上方を指向し て張り出す張出し部を有する、請求項 38〜41のいずれかに記載のセパレーター。
[43] 前記セパレーターは積層体構造を有する、請求項 38〜42のいずれかに記載のセ ノ レーター-
[44] 請求項 1〜37のいずれかに記載のプローブアレイ用である、請求項 38〜43のい ずれかに記載のセパレーター。
[45] プローブアレイであって、
多数個のプローブが 1個以上のアレイ領域を形成して固定ィ匕され、請求項 38〜44 のいずれかに記載のセパレーターによって 1個以上の前記アレイ領域が区画ィ匕され るプローブアレイ。
[46] 前記アレイ領域は複数個である、請求項 45に記載のプローブアレイ。
[47] プローブアレイの製造方法であって、
多数個のプローブを、 1個以上のアレイ領域を形成して基板に固定ィ匕する工程と、 プローブが固定ィ匕された前記基板の表面に、該表面を区画可能な隔壁を備えるセ パレーターを装着して、多数個の前記プローブを 1個以上の前記アレイ領域に区画 する工程と、を備える、製造方法。
[48] 前記アレイ領域は複数個である、請求項 47に記載の製造方法。
[49] 核酸ハイブリダィズ方法であって、
請求項 36に記載のプローブアレイの前記アレイ領域に核酸被験試料を含んだ被 験液を供給して前記プローブとのノ、イブリダィズを実施する工程を備える、ハイブリダ ィズ方法。
[50] 前記プローブアレイは、前記アレイ領域上にノ、イブリダィズのための開放系キヤビ ティを有しており、
前記ハイブリダィズ工程は、前記開放系キヤビティに被験液を供給し、加湿条件下 で行う、請求項 49に記載のハイブリダィズ方法。
[51] プローブアレイを用いた反応方法であって、
請求項 37に記載のプローブアレイの前記アレイ領域に被験液を供給して前記プロ ーブとの反応を実施する工程を備える、反応方法。
[52] プローブアレイを用いた反応方法であって、
多数個のプローブが固定化され区画化された 1個以上のアレイ領域を基板上に備 えるプローブアレイの第 1の高さを有する隔壁で区画された 1個以上の前記アレイ領 域に被験液を供給して反応させる反応工程と、
前記隔壁がないか又は前記隔壁の高さを前記第 1の高さよりも低い第 2の高さに減 じた状態で前記反応工程後の洗浄又は反応生成物の検出を行う後工程と、 を備える、反応方法。
[53] 前記反応工程に先だって、前記プローブを前記基板に固定化した後前記第 1の高 さの隔壁を前記基板上に形成する工程を備える、請求項 52に記載の反応方法。
[54] 前記反応工程の前記第 1の高さの隔壁は、その上方の少なくとも一部にアレイ領域 上方を指向して張り出す張出し部を有し、
前記後工程においては、前記張出し部を除去して前記隔壁高さを前記第 2の高さ に減じた状態とする、請求項 52又は 53に記載の反応方法。
[55] 前記隔壁は、前記アレイ領域を区画可能なセパレーターを前記基板表面に付与して 形成する、請求項 52〜54のいずれかに記載の反応方法。
[56] 前記セパレーターは積層体である、請求項 55に記載の反応方法。
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