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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Systemen, die
elektrisch leitfähige
Polymere für
die Herstellung von Geräten,
wie etwa Inkubatoren für
die Verwendung bei der Kultur von biologischem Material, umfassen,
sowie Geräte
und Verfahren zur Inkubation von biologischem Material.
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Die
Kultur von biologischem Material, wie etwa Pflanzen- oder Tierzellen,
Bakterien, Viren oder Hybridomen oder anderen unsterblichen Zelllinien wird
für eine
große
Vielfalt von Zwecken benötigt. Beispielsweise
können
die Zelllinien zur Verwendung für
experimentelle Zwecke kultiviert werden. Des weiteren können Bakterien
und insbesondere rekombinante Bakterien dafür kultiviert werden, um für die Herstellung
von Materialien, wie etwa Antibiotika oder anderen Pharmazeutika,
verwendet zu werden. Antikörper,
die für
die Diagnose und Therapie in einem weiten Bereich von Gebieten nützlich sind,
werden z.B. über
die Kultur von Hybridomen oder anderen unsterblichen Zelllinien
hergestellt.
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Für diagnostische
Zwecke, z.B. auf dem Gebiet der Lebensmittelhygiene-Überwachung,
kann es notwendig sein, jeden isolierten Bakterien- oder Virenstamm
zu kultivieren, um signifikante Mengen für die Detektion und/oder Identifizierung
zu erhalten.
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Pflanzenzellen
können
kultiviert werden, um Kalli für
die Verwendung bei der Transformation herzustellen, um rekombinante
Pflanzen zu erzeugen.
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Das
kontrollierte Erhitzen von Schüttelkolben oder
anderen Gefäßen, die
bei der Kultur von biologischem Material verwendet werden, erfolgt
oft unter Verwendung großer
Heizeinrichtungen oder Inkubato-293-62.379EPDE-Sn ren.
Zahlreiche Schüttelkolben,
die jeweils das zu testende biologische Material und Kulturmedium
enthalten, werden in diesen Einrichtungen gehalten. Die Temperatur
im Inneren des Inkubators wird auf einer Temperatur gehalten, bei der
das biologische Material gezüchtet
werden kann. Allgemein wird diese im Bereich von 37°C liegen, was
eine akzeptable Temperatur für
die Kultur vieler Arten von biologischem Material darstellt. Jedoch wird
dies nicht für
jedes in dem Behälter
kultivierte biologische Material die optimale Kulturtemperatur sein,
insbesondere, wenn eine breite Palette verschiedener biologischer
Materialien in den verschiedenen einzelnen Schüttelkolben enthalten ist.
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Weiterhin
ist es möglich,
dass dies kein ökonomisches
Verfahren des Erhitzens darstellt, wenn nur eine kleine Anzahl an
Proben benötigt
wird, es jedoch erforderlich ist, die gesamte Vorrichtung auf die gewünschte Temperatur
aufzuheizen und diese zu halten, auch wenn sich nur einige wenige
Proben darin befinden.
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Schließlich benötigt die
Inkubation bestimmter Stämme,
insbesondere rekombinanter Bakterienstämme etc., spezifische Temperaturbedingungen und
Temperaturübergänge, um
gewünschte
Gene zu induzieren oder „anzuschalten". Bestimmte Stämme erfordern
eine Kultivierung für
eine vorab festgelegte Zeitspanne bei einer Temperatur, gefolgt
von der Einstellung der Temperatur auf ein anderes Niveau, um die
Expression eines bestimmten Gens zu erhalten. Gegenwärtig muss
eine so komplexe Operation manuell ausgeführt werden, was bedeutet, dass
eine bedienende Person zu dem bestimmten Zeitpunkt anwesend sein
muss, wenn der Temperaturwechsel erforderlich ist, um das Inkubationsgefäß aus der
konstanten Temperaturumgebung zu entfernen und es – so wie
es passend ist – zu
erwärmen
oder abzukühlen.
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Es
besteht ein Bedarf für
ein besser kontrollierbares Verfahren der Erhitzung von Inkubationsgefäßen, die
bei der Kultur von biologischem Material verwendet werden. Die WO
98/24548, die zum Zeitpunkt der vorliegenden Anmeldung unveröffentlicht war
(und somit ein Referenzdokument nach Art. 54 (3) EPC darstellt,
das somit keine Beeinträchtigung für den erfinderischen
Schritt der vorliegenden Anmeldung mit sich bringt) beschreibt Reaktionsgefäße, die
elektrisch leitfähige
Polymere als Heizelemente verwenden. Die
DE 3132926 beschreibt Küvetten und
insbesondere Fließzellen,
die einen Polymerblock als Widerstandsheizer verwenden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird die Verwendung eines Inkubationssystemsfür das kontrollierte
Erhitzen biologischer Materialien gemäß der Definition im angefügten Anspruch
1 angegeben.
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Elektrisch
leitfähige
Polymere sind in der Technik bekannt und können von Caliente Systems Inc.
aus Newark, USA, bezogen werden. Andere Beispiele für solche
Polymere werden beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5,106,540
und 5,106,538 offenbart. Viele Polymere, z.B. Polytetrafluorethylen (PTFE)
oder Polyethylen (PE), können
durch Einschluss von Graphit in das Polymermaterial zu elektrisch
leitfähigen
Polymeren gemacht werden.
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Geeignete
leitfähige
Polymere können
Temperaturen von bis zu 300°C
bereitstellen und sind so gut in der Lage, bei Inkubationsprozessen
verwendet zu werden, wo der Temperaturbereich zwischen 15°C und 50°C liegt.
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Inkubationsgefäße, die
im Zusammenhang der Erfindung verwendet werden können, sind in der Technik wohlbekannt.
Sie können
Schüttelkolben, Petrischalen,
Teströhrchen,
Chemostaten, Fermenter oder Objektträger, einschließlich mikroskopischer Objektträger, umfassen.
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Ein
Vorteil der Erfindung gegenüber
bekannten Inkubatoren oder Öfen
besteht darin, dass die Temperaturen innerhalb einzelner Inkubationsgefäße unabhängig voneinander
kontrolliert werden können.
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Die
erreichbare Heizgeschwindigkeit hängt von der genauen Natur des
Polymers, den Dimensionen des verwendeten Polymers und der applizierten Strommenge
ab. Vorzugsweise besitzt das Polymer einen hohen spezifischen Widerstand,
z.B. oberhalb von 1000 Ohm·cm.
Die Temperatur des Polymers kann problemlos kontrolliert werden,
indem man die Menge an elektrischem Strom kontrolliert, die durch das
Polymer fließt,
was es erlaubt, dieses für
eine gewünschte
Zeitspanne auf einer gewünschten
Temperatur zu halten. Weiterhin kann die Übergangsgeschwindigkeit zwischen
Temperaturen nach der Kalibrierung problemlos kontrolliert werden,
indem ein geeigneter elektrischer Strom zugeführt wird, z.B. unter der Kontrolle
eines Computerprogramms.
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Geeigneter
Weise kann die Temperatur innerhalb eines jeweiligen Gefäßes jedoch
dadurch eingestellt werden, indem man z.B. eine einfache Thermostatvorrichtung
verwendet, die die Stromzufuhr zu dem Polymer abstellt, wenn die
Temperatur innerhalb des Kolbens die gewünschte Temperatur überschreitet.
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Die
thermischen Eigenschaften eines elektrisch leitfähigen Polymers und insbesondere
seine geringe thermische Masse werden sicherstellen, dass Temperaturanpassungen
rasch stattfinden. Wenn es jedoch gewünscht ist, kann das Inkubationsgefäß einer
künstlichen
Kühlung
unterzogen werden, um die Geschwindigkeit der Abkühlung weiter zu
erhöhen.
Geeignete Kühlverfahren
beinhalten eine Kühlung
durch angetriebene Luft, z.B. unter Verwendung von Ventilatoren
bzw. Gebläsen,
das Eintauchen in Eis oder Wasserbäder, etc.
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Weiterhin
wird die Verwendung des Polymers in Form eines Films oder einer
Beschichtung als Heizelement in einem Inkubationsgefäß der Vorrichtung
im allgemeinen erlauben, eine kompaktere Form anzunehmen als bestehende
Inkubatoren. Dies kann nützlich
sein, wenn Kulturprozesse unter Feldbedingungen, wie etwa an der
freien Luft, an einem Fluss, auf einem Fabrikboden oder sogar in
einem kleinen Geschäft,
durchgeführt
werden.
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Das
Inkubationsgefäß kann die
Form eines Reagenzbehälters
annehmen, wie etwa eines Glas-, Plastik- oder Silikonbehälters, wobei
das elektrisch leitfähige
Polymer in Form eines Films in enger Nachbarschaft zu dem Behälter angeordnet
ist. Bei einer Ausführungsform
des Gefäßes wird
das Polymer als Umhüllung
bereitgestellt, die um das Inkubationsgefäß passt und in thermischem
Kontakt mit dem Gefäß steht.
Die Umhüllung
kann entweder als ausgeformte Umkleidung bereitgestellt werden,
die so gestaltet ist, dass sie sich passgenau um ein Inkubationsgefäß schmiegt,
oder sie kann als Filmstreifen bereitgestellt werden, der um das
Inkubationsgefäß herumgewickelt
und befestigt werden kann.
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Diese
Anordnung der Polymer-Umhüllung bedeutet,
dass ein enger thermischer Kontakt zwischen der Umhüllung und
dem Inkubationsgefäß erreichbar
ist. Dies stellt sicher, dass das Gefäß rasch die gewünschte Temperatur
erreicht, ohne dass es zu der üblichen
Verzögerungszeit
kommt, die aus dem isolierenden Effekt der Luftschicht zwischen
dem Inkubationsgefäß und dem
Heizelement resultiert. Weiterhin kann eine Polymer-Umhüllung verwendet
werden, um eine Vorrichtung an die Verwendung bestehender Inkubationsgefäße anzupassen.
Insbesondere kann ein Streifen aus flexiblem Polymerfilm um ein Inkubationsgefäß diverser
verschiedener Größen und
Formen herum gewickelt werden.
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Wo
eine Umhüllung
verwendet wird, kann es vorteilhaft für diese sein, perforiert oder
in gewisser Weise netzartig zu sein. Dies kann die Flexibilität des Polymers
verstärken
und kann einen noch schnelleren Zugang für ein Kühlmedium erlauben, wenn das Polymer
nicht selber dazu verwendet wird, die Kühlung zu bewirken.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird der Polymerfilm oder die Polymerbeschichtung
als integraler Bestandteil des Inkubationsgefäßes bereitgestellt. Das Inkubationsgefäß kann unter
Verwendung einer zusammengesetzten Konstruktion hergestellt werden,
bei der eine Schicht des leitfähigen
Polymers zwischen Schichten desjenigen Materials zwischengeschaltet
ist, aus dem das Gefäß hergestellt
ist, oder bei der die inneren oder äußeren Oberflächen des
Inkubationsgefäßes mit dem
Polymer beschichtet sind. Solche Gefäße können unter Verwendung von Schichtung
und/oder Ablagerung, wie etwa chemischen oder elektrochemischen
Ablagerungstechniken, wie in der Technik gebräuchlich, hergestellt werden.
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Gefäße, die
den Polymerfilm oder die Polymerbeschichtung als integralen Bestandteil
enthalten, können
besonders kompakte Strukturen bereitstellen.
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Wenn
mehrere Inkubationsgefäße für eine bestimmte
Reaktion benötigt
werden, kann jeder elektrische Verbindungspunkt so positioniert
werden, dass eine einzige Versorgungseinheit mit allen Inkubationsgefäßen oder
-Röhrchen
verbunden werden kann. Die Inkubationsgefäße können in Form eines Array bereitgestellt
werden.
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Alternativ
kann jedes oder jede Gruppe von Inkubationsgefäßen sein/ihr eigenes Heizprofil
aufweisen, das dadurch eingestellt wird, indem man den applizierten
Strom bei diesem Gefäß oder dieser Gruppe
von Gefäßen anpasst.
Dies bietet einen weiteren und beson ders wichtigen Vorteil der erfindungsgemäßen Inkubationsgefäße mit Polymer
gegenüber
konventionellen Inkubatoren, und zwar in der Weise, als die Temperatur
der einzelnen Gefäße unabhängig voneinander
kontrolliert werden kann. Dies bedeutet, dass jedes Inkubationsgefäß mit seinem
eigenen thermischen Profil versehen werden kann, das für die Kultur
des darin enthaltenen bestimmten biologischen Stammes optimiert
werden kann.
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Das
Polymer kann geeigneter Weise in Form eines Blattmaterials oder
Films bereitgestellt werden, z.B. mit einer Dicke von 0,01 mm bis
10 mm, so etwa von 1 bis 10 mm, und, bevorzugt, mit einer Dicke
von 0,1 bis 0,3 mm. Durch die Verwendung dünner Filme wird das Volumen
des Polymers minimiert, das benötigt
wird, um ein bestimmtes Inkubationsgefäß oder eine Oberfläche zu bedecken.
Dies verringert die Zeit, die das Polymer zum Aufheizen auf die
erforderliche Temperatur benötigt,
da die Wärme,
die durch das Durchleiten des Stroms durch das Polymer erzeugt wird,
nicht über
ein großes
Volumen an Polymermaterial verteilt werden muss.
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Bei
der Benutzung ist der Polymer-Bestandteil des Inkubationsgefäßes so angeordnet,
dass ein elektrischer Strom innerhalb des Polymers erzeugt werden
kann. Dies kann entweder dadurch erreicht werden, dass man das Polymer
mit Verbindungspunkten zur Verbindung mit einer elektrischen Versorgungseinheit
versieht, oder durch Induzieren eines elektrischen Stroms im Polymer,
z.B. indem man das Polymer geeigneten elektrischen oder magnetischen
Feldern aussetzt.
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Ein
enger thermischer Kontakt zwischen dem Polymer und dem Inkubationsgefäß ist insofern ökonomisch,
als dadurch nicht die Erwärmung
des gesamten Raums innerhalb des Inkubators benötigt wird.
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Ein
besonders geeignetes Inkubationsgefäß zur Verwendung im Zusammenhang
mit der Erfindung ist ein konischer Kolben. Der Kolben kann z.B. von
einer Umhüllung
aus dem leitfähigen
Polymer umgeben sein. Die Umhüllung
kann durch Haltemittel, wie etwa Federklemmen, in Position gehalten werden.
Die Klemmen bestehen geeigneter Weise aus Metall oder einem anderen
leitfähigen
Material, da dieses dann als Verbindung mit der Stromquelle dienen
kann.
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Alternativ
kann das Polymer integraler Bestandteil des Kolbens sein. Beispielsweise
kann der Kolben eine geschichtete Form des Polymers auf Glas oder
Silizium enthalten.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
kann das Gefäß eine flache
Trägerplatte
umfassen, wie etwa einen zweidimensionalen Array, insbesondere einen
Chip, wie etwa einen Silizium-Waffelchip; oder einen Objektträger, insbesondere
einen mikroskopischen Objektträger,
auf dem biologisches Material und Kulturmedium getragen werden können. Die Platte
kann aus dem Polymer hergestellt sein, oder das Polymer kann als
integraler Bestandteil der Platte bereitgestellt werden, entweder
als Beschichtung auf einer Seite der Platte oder als Polymerschicht
innerhalb einer zusammengesetzten Konstruktion, wie zuvor beschrieben.
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Andere
geeignete Inkubationsgefäße sind Röhrchen und
Küvetten,
die in der Technik bekannt sind.
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Neue
Formen von Inkubationsmitteln zur Verwendung bei der Erfindung sowie
als Inkubationsgefäße schließen derartige
Mittel aus einem weiteren Aspekt der Erfindung ein.
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Die
Erfindung stellt weiterhin eine Inkubationsvorrichtung für die Kultur
von biologischem Material gemäß der Definition
in dem angefügten
Anspruch 9 bereit.
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Die
Kontrolleinrichtung ist geeigneter Weise eine automatische Kontrolleinrichtung,
wie etwa eine Thermostat-Vorrichtung, wie diese in der Technik wohlbekannt
sind, oder eine Computer-gesteuerte Interface-Anordnung. Die letztere
kann eine Vorrichtung zur Temperaturüberwachung beinhalten, wie etwa
ein Thermoelement, das die Temperatur des Inkubationsgefäßes überwacht
und diese Information in ein Kontrollsystem einspeist, sodass der
gewünschte
Ablaufplan von Heizen und/oder Abkühlen eingehalten wird.
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Alternativ
kann die Temperatur des Polymers auf direktem Weg überwacht
werden, indem man dessen spezifischen Widerstand misst, beispielsweise
durch Einsetzen des Polymer-Heizelements als Widerstand in die Anordnung
eines Wheatstonebrücken-Schaltkreises.
Dies erspart die Anwendung anderer Temperaturmessvorrichtungen,
wie etwa von Thermoelementen.
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Optional
kann die Vorrichtung weiterhin künstliche
Kühlmittel
wie etwa ein oder mehrere Gebläse
bzw. Ventilatoren umfassen.
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Die
Vorrichtung kann eine Vielzahl von Inkubationsgefäßen beinhalten.
Das Polymer kann als integraler Bestandteil jedes Behälters bereitgestellt werden,
als Umhüllung
um den jeweiligen Behälter, oder
es ist so angeordnet, dass eine Schicht des Polymers zwischen aneinander
grenzenden Behältern zwischengeschaltet
ist. Sämtliche
elektrischen Verbindungspunkte an dem Polymer können mit einer einzigen elektrischen
Versorgungseinheit verbunden sein, wenn eine Anzahl von Reaktionen
durchgeführt wird,
die dieselben Temperaturstufen erfordern.
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Jedoch
ist die Vorrichtung bei einer bevorzugten Ausführungsform so angeordnet, dass
das Polymer, das mit einem Gefäß oder einer
Gruppe von Gefäßen in Kontakt
steht (oder diese bildet) mit einer individuellen Versorgungseinheit
verbunden ist, wobei verschiedene Gefäße oder Gruppen von Gefäßen mit
verschiedenen, unabhängig
kontrollierten elektrischen Versorgungseinheiten verbunden sind. Mit
dieser Anordnung kann eine Anzahl verschiedener Kulturen, die unterschiedliche
Temperaturen oder Temperaturstufen benötigen, zur selben Zeit durchgeführt werden,
da jeder Behälter
oder jede Gruppe von Behältern
sein/ihr eigenes Heizelement besitzt. Diese Anordnung erlaubt es
den Benutzern, eine Anzahl von Kulturen mit kleinen Chargen unter ökonomischer
Verwendung einzelner Gefäße durchzuführen.
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Da,
wo das Inkubationsgefäß einen
Objektträger
oder Chip beinhaltet, kann die Vorrichtung den Objektträger oder
Chip; eine elektrische Versorgungseinheit, Mittel zur Verbindung
der elektrischen Versorgungseinheit mit dem Objektträger oder
Chip oder Mittel zum Induzieren eines elektrischen Stroms in dem
Polymer, sowie ein Mittel zum Kontrollieren des durch die Polymerschicht
in den Objektträger oder
Chip fließenden
Stroms umfassen.
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Die
Inkubationsgefäße und die
Vorrichtung der Erfindung können
bei einer Vielzahl von Situationen verwendet werden, bei denen es
notwendig ist, biologisches Material zu kultivieren. Somit stellt
die Erfindung weiterhin ein Verfahren zur Kultivierung eines biologischen
Materials bereit, wobei dieses Verfahren das Einsetzen des biologischen
Materials und eines Kulturmediums in eine Inkubationsvorrichtung gemäß obiger
Beschreibung umfasst, sowie das Zuführen von Strom zu der Inkubationseinrichtung,
um so zu bewirken, dass das Inkubationsgefäß eine vorab festgelegte Temperatur
erreicht.
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Es
werden nun beispielhaft Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung beschrieben, wobei auf die zugehörige Zeichnung
Bezug genommen wird, die eine Schemadarstellung ist, welche eine Ausführungsform
einer Inkubationsvorrichtung der Erfindung zeigt.
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In
der Zeichnung ist ein konischer Kolben 1 von einer Ummantelung
des elektrisch leitfähigen Polymers 2 umgeben.
Die Polymerummantelung 2 wird mittels einer federnden Metallklemme 3 in
Position gehalten. Eine elektrische Energiezufuhr (nicht dargestellt)
ist mit der Klemme 3 verbunden.
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Bei
Benutzung wird das biologische Material in dem Kulturmedium 4 in
das Inkubationsgefäß 1 gegeben,
das mittels eines Stöpsels 5 verschlossen wird.
Die Ummantelung 2 steht in engem thermischem Kontakt mit
dem Inkubationsgefäß 1.
Der Klemme 3 wird elektrische Energie zugeführt, sodass Strom
durch die Polymerummantelung 2 geleitet wird, wodurch diese
und das biologische Material im Inneren des Inkubationsgefäßes 1 erhitzt
werden.
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Die
elektrische Energiezufuhr steht unter der Kontrolle einer Thermostat-Vorrichtung
(nicht dargestellt), die eingestellt wurde, um sicherzustellen,
dass die Temperatur im Inneren des Inkubationsgefäßes für die bestimmte
Bedingung bzw. die Bedingungen, unter denen das biologische Material
wächst,
optimal bleibt.
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Das
Gefäß 1 kann
im Verlauf der Reaktion bewegt oder geschüttelt werden, z.B. in einer
Schüttelvorrichtung,
wie sie in der Technik wohlbekannt ist. Alternativ oder zusätzlich kann
das Gefäß anderweitig
belüftet
werden, z.B. mittels Einspritzung. In Abhängigkeit von der Natur des
kultivierten biologischen Materials kann es notwendig oder wünschenswert
sein, den Prozess unter nicht-aeroben Bedingungen durchzuführen, z.B.
unter Stickstoff-Atmosphäre.
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Obwohl
das in der Figur dargestellte Gefäß einen konischen Kolben umfasst,
wird es erkenntlich sein, dass andere Formen des Gefäßes, einschließlich Röhrchen,
Objektträgern
und Schalen verwendet werden können.
Die Ausbildung bzw. Anordnung des Polymers wird dementsprechend
angepasst werden.