DE7004220U

DE7004220U - Objekttraeger.

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Publication number: DE7004220U
Application number: DE7004220U
Authority: DE
Original assignee: Richardson Merrell Inc
Current assignee: Richardson Vicks Inc
Priority date: 1969-02-10
Filing date: 1970-02-06
Publication date: 1971-09-02
Also published as: BE745667A; NL7001767A; US3572892A; FR2033318A1; DE2005543A1; BR6915183D0; ES376407A1; FR2033318B1; GB1248193A

Description

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DR. ING. B. HOFFriÄN77 · DIPL. ING. W. JQlTLB · DR. RBR. NAT. K. HOFFMANN

FATB NTAJJ W ALTK O.taOO MÖNCHEN Π · AtABELLASTKASSS 4 · TELEFON «Mil) 911017 Riehardaon-Merell Inc., Mew York, X.Y. (ITBA) Objektträger

Die Neuerung betrifft einen Objektträger aus einer rechteckigen, planparallelen Platte tranepareateü Materials mit mehreren Vertiefungen für

Die Entdeckung und Identlf l2Sierung von V1M& uart Bakterien mittels der fluoreszierenden Antikörperteolialk 1st zwar äusserst zuverlässig^ erfordert aber b#t#K«fetliehe Zelt und Mühen, um die ttür den Test benJStlgye» Reagenzien und Gewebe vorzubereiten. Solche Test» werden In etwa wie folgt durchgeführt: Zellen von Gewebekultur ren der erforderlichen Art und Spezies werden auf

Kulturfläche oder -gefäss, wie z.B. eine Petrischale, einen Objektträger oder ein Deckglas aufgebracht. Naoh einer ausreichenden Inkubationsperiode, in weloher die Zellen auf der KuIturflache anwachsen, werden die Zellen mit einem bestimmten Virus träger infiziert. Naoh einer zweiten Inkubationsperiode, in der sich der Virusträger vervielfacht, wird das KulturgefHss aus dem Inkubator entnommen, die Zellen werden mit einem geeigneten Fixatlv fixiert und dann getrocknet. Diese Zellen dienen dann als Unterlage für den Test mittels der fluoreszierenden AntlkSrperteohnlk, wie er naoh dem «Stand der Technik allgemein durchgeführt wird. Die OefMsse mit fixierten» Infizierten Oewebekulturen werden In einer Vielzahl vorbereitet. Wenn SerumverdUnnungen angewendet werden sollen» muss für Jede Verdünnung Je eine Kultur in einer Petrischale, einem Objektträger oder einem Deokglas vorbereitet werden. Wenn mehr als eine Serumprobe verwendet werden soll, erfordert dies eine Vielzahl von Kulturen. Jede Kultur wird dann mit einer Verdünnung des Serums de« Patienten oder des Tieres behandelt. Das Serum muss dann 15 bis JJo Minuten in Kontakt mit der Kultur verbleiben. Diese wird dann In einem geeigneten Verdünnungsmittel gespült, um das überflüssige Serum zu entfernen. Die Kultur wird dann 15 bis >> Minuten mit einem nit Fluoresoln konjugierten homolen Antlsertue behandelt. Dieses Anticerum 1st gewöhnlich Oanmaglobulin.. Jede Kultur wird gespült, um den überflüssigen, mit Fluorescein konjugierten Stoff zu entfernen, und wird dann getrocknet.

Nach dem Trocknen wird die Kultur mikroskopisch untersucht, und zwar mit einem Fluoreszenz-Mikroskop. Eine positive Diagnose wird durch das Auftreten einer bestimmten Fluoreszenz in der behandelten Kultur angezeigt.

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Die Anwendung der oben beschriebenen Fluoreszenztechnik ist gut bekannt. Sie ist beschrieben durch (a) Coona, A.H., International Rev. Cytoi, 5:1-23» 1956; (b) Coons, A.H., in Oeneral Cytological Methods, New York Aoademlo Press, 1958, Volume-I; (o) Liu, C, Ergebn, Mlkrob. Immunforsoh. J>3/2k2, i960; und(d) Fluoresoent Antibody Techniques, Public Health Service Publication No. 729 (1966) U.S. Ooν. Printing Office.

Obwohl die fluoreszierenden Antikörper verwendende Technik viele Vorteile hat, kann sie eine zeitraubende und mUhsame Arbeit sein. So erfordert ein Test, bei dem 6 Serumverdünnungen nOtig sind, eine Gesamtzahl von 12 verschiedenen Kulturen in Petrisohalen, Deckgläsern oder Objektträgern. Jede einzelne muss vorbereitet, behandelt, gespült, getrocknet und geprüft werden.

Demgegenüber ist der neuerungsgemässe Objektträger durch eine Vielzahl voneinander getrennter Vertiefungen in der Oberfläche der Platte, wobei die Vertiefungen an einer Seite einer Längekante der Platte eine Öffnung haben, die sich von der oberen Seite bis zum Boden der Vertiefung erstreckt, gekennzeichnet.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Neuerung sind die Böden der Vertiefungen eben und verlaufen parallel zur Unter-/Oberseite des Objektträgers.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Neuerung sind Rippen vorgesehen, die auf der Oberfläche der Platte nach oben vorspringen und ein-tellig mit der Platte ausgebildet sind.

Sohliesslich sind nach einer weiteren bevorzugten

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Aueftihrungsform der Neuerung getrennte Reihen von Vertiefungen in der Oberfläche der Platte entlang der Längskanten vorgesehen.

Durch Anwendung der Neuerung sind auf einen einzigen Objektträger alle grundlegenden Materialien, die benötigt werden« um die fluoreszierende Antlkurper-Teohnlk durchzuführen, vorhanden. Duron dies· Neuerung kann die zur Durchführung soloher diagnostischer Versuche benötigte Gesamtzeit, lnkbsive Vorbereltungszolt, voll 7 bis 14 Tagen auf höchstens 2 Stunden reduziert werden. Mit den vorliegenden Objektträger für Qewebekulturen mit mehreren Vertiefungen, kann ein vollständiger Test, der 6 öder auoh mehr Verdünnungen erfordert, auf einen einzigen Träger durchgeführt werden. Dadurch entfällt das Bearbeiten von einer Vielzahl von Kulturen und die Notwendigkeit einer individuellen mikroskopischen Untersuchung vieler Kulturen. Dar Objektträger mit vielen Vertiefungen kann in einen mikroskopischen Arbeltegang geprüft werden.

Jeder In einer Gewebekultur züohtbare Virusträger kann mit dieser Weiterung vfwendet werden. Durch Vorbereitung eines Gestelle, auf din sitfh Objektträger mit eiüter Reihe fixierter, alt einem Vino» oder einer Gruppe von Vire% infizierter Zellen befinden, steht den Arzt, den Laboratorium oder Institut ein rasches uad spezielles »t* tu zur iftcwendung für die Diagnose von^r Virus-Krankheiten zur Verfügung.

Weitere Einzelheiten der Neuerung sollen anhand eines Beispiels näher erläutert «nd beschrieben werden, wobei auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen ist.

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Fig. 1 ist eine perspektisohe Ansicht dee Objektträgers von oben und von den Selten;

Fig· 2 ist eine perspektivische Ansicht des Objektträgers der Flg. 1 von oben und von den Seiten, mit einer zusammenhängenden Schicht virusinfizierter Oewebekulturzellen In Jeder Vertiefung; und

Flg. 3 ist eine perspektivische Ansicht des Bodens und der Seiten des Objektträgers von Flg. 1·

Der Objektträger Io ist eine rechteckige Platte, die aus einem flachen Stück Glas oder anderem transparenten Material, wie z.B. Kunstharz, z.B. Polystyrol, besteht. Der Objektträger Io hat zwei lange, paraJlel zueinander laufende Selten oder Kanten 12 - 12 und im rechten Winkel zu den langen Seiten 12-12 stehende kurze Selten oder Kanten 14-14. Jede Seite 12 1st 9o mm lang. Jade kurze Salti 14 hat eine Breite von 25 mm. Eine Längsrippe 16 mit einer Breite von 5 mm und Querrippen 18 mit einer Breite van 2 mm begrenzen im Verein mit Erhebungen längs der kurzem Selten 14-14 dazwischenliegende quadratische Vertiefung** 2o. Die Oberflächen der Rippen 16 und 18 und d$t gen an den kurzen Seiten 14-14 liegen alle In d»r Ebene und parallel zur Unterseite des 0bJelc1rbrä&ep#,26· Dicke des Objektträgers, gerechnet von den Oberflächen Rippen bis zur ObJektträgeFuntarseite 26, beträgt f mm; Wände umschliessen drei Seiten Jeder Vertiefung 2o. Diese Vertiefungen sind o,5 mm tief, und Jede Wand 24 elnaar Vertiefung hat eine Länge von Io mm· Dl« Vertiefungen sind in der Nähe der Kante 12 von oben bis zum Boden dar Vertiefungen durchgehend offen. Die Unterseite 26 das Objektträgers Io ist eben und erstreckt sich parallel zum Boden 22 der Vertiefungen 2o. In Fig. 2 enthält Jede der Vertiefungen 2o eine fixierte, zusammenhängende vlrt»lnfl-

zierte Gewebekultur S8₃ Λίβ i.sx der Bodenfläche 22 der Vertiefungen angewachsen Ut-, Die kurzen Seiten 14-14 bilden an Jedem Ende des Objektträgers Wände von Io mm Breite für eine Seite der Vertiefungen. Auf dem Objektträger sind für Jede Reihe von Vertiefungen die Bezeichnungen A und B und zusätzlich auf den Rippen 16 zwischen den sich gegenüberliegenden Vertiefungen die Nummern 1 bis 5 angebracht« so dass durch Angabe eines Buchstabens und einer Stammer Jede Vertiefung bezeichnet werden kann·

Im folgenden soll die Anwendung des Objektträgers mit mehreren Vertiefunge» für Gewebekulturen gemäss Fig_e I erläutert werden.

Ein einziger Objektträger mit mehreren Vertiefungen, wie er In Pig. 1 gezeigt ist, wird für das zu untersuchende Serum des Patienten vorbereitet. Der Objektträger wird in ein Kulturgefäss, das eine Nährlösung für die zu verwendenden Zellen enthält, vollständig eingetaucht. In diesem Pail wurden menschliche dlploide Wi-38-Zellen verwendet. Wi-28-Zellen werden der Nährlösung xugesetzt, die den Objektträger bedeckt. Nach einer stationären Inkubationszeit von 4 bis 5 Tagen bei

bis 37⁰C wird die Kultur durch Einimpfunis des Adenovirus Typ 3 in den Kulturträger infiziert.

Der mit einem Virus infizierte Objektträger mit mehreren Vertiefungen wird aus der Nährlösung entnommen, Io Minuten lang mit Aceton fixiert und dann getrocknet. Die Kultur befindet sioh auf allen Flächen der Platte. Die Kultur wird von der Platte gewischt, aber nicht vom Boden der Vertiefungen 22, wie bei 28 In Flg. 2 gezeigt. Jetzt

enthält jede Vertiefung eine zusammenhängende Schicht fixierter Wi-38-Zellen, die mit Adenovirus Typ 3 infiziert ist.

(C) Dem Patienten« bei dem der Adenovirus Typ 3 als Krankheitsursache vermutet wird, wird Serum entnommen. Es werden Verdünnungen des Serums des Patienten vorbereitet» und jede Vertiefung wird mit ungefähr O₄I ml einer der Verdünnungen bedeckt· Eine Reihe von Vertiefungen, z.B. Reihe A der Flg. 2, die Verdünnungen des Kontrollserums (des normalen Serums) enthält, und eine andere Reihe, z.B. die Reihe B der Fig, 2, die Vertiefungen mit dem Serum des Patienten enthält, werden vorbereitet, verdoppelte Verdünnungen im Verhältnis von 1:2, 4,

8, 16 und 32 werden vorbereitet.

(D) Pie In mehreren Vertiefungen befindliche^ Kultur wird dann für 15 bis Jo Minuten bei 35 bis 37⁰C In eine Befeuchtungskammer eingeführt, und dann bei pH 7»2 mit einer mit o,o2 molaren phosphatgepufferten Salzlösung gespült, um das überschüssige Serum zu entfernen.

(E) Dann wird jede Vertiefung mit einem mit Fluorescein markierten konjugierten Antiserum TUr das im Serum des Patienten enthaltene Oammaglobulln überschichtet. Dieses markierte konjugierte Antiserum 1st im Handel erhältlich. Es wird auf der zusammenhängenden Schicht in einer Befeuchtungskammer 3o Minuten lang bei 35 bis j>7°C adsorbiert und wie oben mit dem Phosphatpuffer gespült.

(F) Die In mehreren Vertisfungen befindliche Kultur wird dann in einem Fluoreszenzmikroskop auf das

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Vorhandensein einer bestimmten Fluoreszenz mikroskopisch untersucht. Im positiven Falle fluoresziert das Präparat grün, im negativen Falle tritt keine Fluoreszenz auf, wie im Falle normalen Serums.

Der obige Test wird mit einem einzigen Objektträger durchgeführt und In einem einzigem Vorgang mikroskopisch beobachtet. Das normale Serum und das verdächtige Serum befinden sich Seite an Seite und gestatten eine gleichzeitige Beobachtung.

Ia folgenden soll ein weiterer Tost, nämlich zur Bestliunung des Vorhandenseins des Adenovlros-Antlkörpers im Serum eines Patienten besohriebon werden.

Ein Gestell mit 8 Objektträgern, wie sie in Fig. gezeigt sind, wird dem Arzt oder Laboratorium übergeben. Auf jedem Objektträger befindet sich eine Gewebekultur zusammenhängender Zellen, die mit einem anderen Adenovirus-Typ infiziert ist, welcher, wie im Beispiel 1 Absatz (A) und (B) beschrieben, fixiert ist. In diesem Falle jedoch handelt es sich um den Adenovirus der Tippen 1, 2, 5, 5, 4, 7, 14 und 21. Der Arzt behandelt jeden Objektträger mit dem verdächtigen menschlichen Serum und mit normalen Serum, wie In Abschnitt (C) des Beispiele 1 beschrieben. Durch Wiederholung des übrigen Verfahrens des Beispiels 1 kam» Innerhalb von ungefähr 2 Stunden bestimmt werden, ob einer der unter das Mikroskop gebrachten !Sdenovirus-Typen bei der Krankheit des Patienten eine Ro(LIe spielt.

Der neuerungsgemäese, neuartige Objektträger kann anstalt für eine Diagnose von Virus-Antikörpern auch für

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andere diagnostische Tests mit einem Fluores^ens-Mikroskop Verwendung finden« z.B. zur Diagnose von Bakterienkrankheiten·

Claims

ι t< ti j I 3 - Io - Schutzansprüche

1. Objektträger aus einer rechteckigen, planparallelen Platte transparenten Materials mit mehreren Vertiefungen für Gewebekulturen» gekennzeichnet durch eine Vielzahl von-einander getrennter Vertiefungen (2o) In der Oberfläche der Platte« wobei die Vertiefungen an einer Seite einer Längskante (12) der Platte eine Öffnung haben, die eich von der oberen Seite bis zum Boden (22) der Vertiefung erstreckt,

2. Objektträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Böden (22) der Vertiefungen (2o) eben sind und parallel zur lMter-/Oberseite des Objektträgers verlaufen»

3· Objektträger naoh Anspruoh 1 oder 2, gekennzeichnet durch Rippen (16), die auf der Oberfläche der Platte naoh oben vorspringen und einteilig mit der Platte ausgebildet sind.

4. Objektträger naoh Anspruch 1,2 oder 3* gekennzeichnet durch getrennt· Reihen von Vertiefungen in der Oberfläche der Platte entlang der Längskanten (12).