DE19709019C2 - Verfahren zur Bestimmung der Verträglichkeit, insbesondere auch der Toxizität von gasförmigen, flüssigen und/oder viskosen Stoffen für den menschlichen oder tierischen Organismus - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung der Verträglichkeit, insbesondere auch der Toxizität von gasförmigen, flüssigen und/oder viskosen Stoffen für den menschlichen oder tierischen OrganismusInfo
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Description
Insbesondere im medizinischen und pharmazeutischen Bereich, aber auch in anderen
Bereichen, beispielsweise Ernährung usw., ist es vielfach notwendig, bestimmte Stoffe,
auch gasförmige, flüssige und/oder viskose Stoffe auf ihre Toxizität hin zu bestimmen.
Die heute hierfür üblichen Verfahren sehen zunächst Zellkulturversuche vor, die durch
anschließende Tierversuche ergänzt werden müssen, und zwar insbesondere dann,
wenn bei den Zellkulturversuchen keine Toxizität festgestellt wird. Anschließend sind
eventuell klinische Studien am Menschen erforderlich. Im einzelnen läßt sich der Stand
der Technik wie folgt darstellen:
Bisher eingesetzte Modellsysteme zur Bestimmung der akuten Toxizität von flüssigen
oder partikulären Stoffen basieren auf der Verwendung von Zellkulturen. Adhärent
wachsende Zellen sowie nicht-adhärent wachsende Zellen werden für unterschiedliche
lange Zeiträume der zu testenden Substanz ausgesetzt, die entweder mit der Nährlösung
angeboten wird, oder als Kultursubstrat von den Zellen besiedelt werden soll.
Die Applikation gasförmiger oder flüssiger Testsubstanzen erfolgt in diesem System
gemeinsam mit der Testsubstanz. Eine gezielte polare Applikation der Testsubstanz am
basalen bzw. apikalen Aspekt epithelialer Zellmonolayer erfolgt nicht. Die Zellen
werden entweder vollständig von Medium und Testsubstanz umspült oder sind beiden
Komponenten gemeinsam im Bereich der apikalen Zellmembran ausgesetzt.
Charakteristisch für diese Systeme ist, daß sie mit nur jeweils einem Zelltyp arbeiten.
Häufig handelt es sich dabei um unbegrenzt teilungsfähige Zellen, also Zellen mit
Tumorcharakteristik.
Sowohl epitheliale Zellinien als auch Zellinien mit Bindegewebscharakteristik werden
für diese Versuche eingesetzt. Sie unterscheiden sich in ihren Eigenschaften jedoch
deutlich von differenzierten Epithel- oder Bindegewebszellen in menschlichen oder
tierischen Organen, da Tumorzellen dedifferenziert sind und nur noch in begrenztem
Umfang die typischen zellulären Funktionen differenzierter Zellen ausführen können.
Dies ist nach einer der Erfindung zugrunde liegenden Erkenntnis einer der Gründe für
die mangelende Übertragbarkeit der in Zellkulturexperimenten gewonnenen Ergebnisse
auf die Situation im Organismus. Chronisch toxische Wirkungen können in
Zellkultursystemen ohnehin nur ungenügend untersucht werden.
Haben sich Testsubstanzen in den Zellkultursystemen als nicht toxisch erwiesen, so
müssen sie daher auf verschiedene Weise im tierischen Organismus auf ihre Wirkung
hin untersucht werden. Doch sind auch Ergebnisse aus Tierexperimenten nur begrenzt
übertragbar auf den Menschen. Zwischen dem menschlichen und dem tierischen
Organismus gibt es entscheidende Unterschiede im Stoffwechsel geschehen. Einerseits
werden Stoffe, die für bestimmte Spezies toxisch sind, vom Menschen ohne
weitreichende negative Nebenwirkungen vertragen (Beispiel: Aspirin). Andererseits gibt
es eine erhebliche Zahl von Testsubstanzen, die erst in klinischen Studien als für den
Menschen toxisch erkannt werden.
Der Nachteil von Tierversuchen besteht somit u. a. darin, daß sie zeitaufwendig sind
und ihr Aussagegehalt in Bezug auf den menschlichen Organismus oftmals gering ist.
Klinische Versuche am Menschen sind ebenfalls aufwendig und teuer und vielfach nicht
durchführbar.
Bekannt ist speziell ein Verfahren zur In-Vitro-Prüfung von Einwirkungen auf
biologische Strukturen (DE 42 29 013 A1), insbesondere als Analytik, Verträglichkeits-,
Toxizitäts-, Nebenwirkungs- und Wirksamkeits-Prüfung. Bei diesem Verfahren wird die
jeweilige Probe in einer Kammer angeordnet, in der sie dann vollständig von einer
Testsubstanz umspült ist, so daß sich hier diejenigen Nachteile ergeben, die vorstehend
bereits zu den "Zellkulturversuchen" genannt wurden.
Bekannt ist weiterhin ein System bzw. ein Verfahren zum Messen transepithelialer
Widerstände an Gewebeproben mit kleinem Durchmesser (DE 40 20 013 A1), und zwar
unter Verwendung einer Perfusionskammer zur Aufnahme der jeweiligen
Gewebeprobe. Mit diesem bekannten System werden kleine Organismen oder Organe
hinsichtlich ihrer Transporteigenschaften (Transportsysteme der Membran für Ionen)
untersucht, und zwar mit speziellen Anwendungsgebieten der Ökotoxikologie,
Pharmakologie und der Transportphysiologie in der Biologie und Medizin. Die
Anwendung dieses bekannten Verfahrens ist ausschließlich auf Epithelzellverbände
beschränkt. Ermittelt wird der transepitheliale Widerstand.
Bekannt ist weiterhin eine Vorrichtung zur Behandlung von auf Objektträgern
aufgezogenen und in vitro gehaltenen Gewebeproben (DE 36 35 013 C2). Die
Vorrichtung umfaßt eine Kammer zur Aufnahme des Präparates. Diese Kammer ist mit
dem jeweiligen Behandlungsreagenz füllbar, mit einem Deckel dicht verschließbar und
weiterhin mit Zuführ- und Ablaßöffnungen für die Reagenzien versehen. Es handelt sich
hierbei grundsätzlich um ein Einkammersystem. Die jeweilige Probe selbst befindet sich
auf dem impermeablen Objektträger und wird nur einseitig von der jeweiligen
Testflüssigkeit benetzt. Auch bei diesem bekannten System können somit die Zellen der
Probe nicht oder nur in sehr begrenztem Umfange die typischen zellulären Funktionen
differenzierter Zellen ausführen, so daß eine Übertragbarkeit der gewonnenen
Ergebnisse auf die tatsächliche Situation im Organismus nicht oder nur sehr bedingt
möglich ist.
Bekannt ist weiterhin eine Vorrichtung zur Bestimmung und Messung membran
permeabler Substanzen (US 5 525 475). Es geht bei dieser bekannten Vorrichtung nicht
um die Bestimmung der Verträglichkeit, z. B. der Toxizität von gasförmigen, flüssigen
oder viskosen Stoffen für den menschlichen oder tierischen Organismus.
Die bekannte Vorrichtung sieht zwei Kammern vor, die durch eine semipermeable
Membran voneinander getrennt sind. Die zu testende Substanz wird in eine der
Kammern eingefüllt. Die Diffusion der Substanz wird in der zweiten Kammer gemessen.
Die Kultivierung von Zellen oder Geweben ist in keiner dieser Kammern vorgesehen.
Sinn und Zweck dieses bekannten Systems ist die Bestimmung der Diffusibilität einer
Testsubstanz, nicht die Bestimmung ihrer biologischen Wirkung, insbesondere auch
nicht die Bestimmung der Verträglichkeit für den menschlichen oder tierischen
Organismus.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren aufzuzeigen, welches diese Nachteile
vermeidet und es ermöglicht, die Verträglichkeit oder Toxizität von gasförmigen,
flüssigen und viskosen Stoffen im Labor aktuell für den tierischen oder menschlichen
Organismus zu bestimmen.
Zur Lösung dieser Aufgabe sieht das erfindungsgemäße Verfahren vor, daß Organe oder
Organteile, die ohne proteolytische Desintegration aus einem menschlichen oder
tierischen Körper gewonnen wurden, in einer gradienten Perfusionskammer in
Gegenwart
einer zu testenden Substanz kultiviert werden, wobei die Gradientenkammer ein oberes
und ein unteres Kompartiment bildet, die durch die Organ- oder Gewebeprobe
voneinander getrennt sind, und daß das eine Kompartiment der
Gradientenperfusionskammer mit einer Nährlösung durchspült wird, während die Organ- oder
Gewebeprobe mit der zu testenden Substanz beaufschlagt wird, und zwar bevorzugt
über das andere Kompartiment.
Die Auswertung der Testergebnisse erfolgt bei der Erfindung beispielsweise unter
Verwendung von Antikörpern oder Antigenen zum Nachweis dafür, ob bestimmte Zellen
in der getesteten Organ- oder Gewebeprobe nach dem Test (Kultivieren) noch vorhanden
oder während der Behandlung abgestorben sind, und/oder durch mikroskopische
Untersuchungen usw.
Bei den Organ- oder Gewebeproben handelt es sich nicht um einfach aufgebaute
Zellkulturen, sondern um interaktive Gewebekultursysteme mit den nachfolgend
angegebenen Vorteilen:
- 1. Interaktive Gewebekultursysteme setzen sich aus Zellen in organtypischen Differenzierungszustand zusammen. Je nach Gewebetyp besteht für einen Teil der Zellen Kontaktinhibition. Diese Zellen proliferieren nicht. Sie sind eingebettet in eine spezifische extrazelluläre Matrix und bilden strukturierte Zellverbände mit organtypischer Funktion.
- 2. Interaktive Gewebekultursysteme bestehend aus Zellverbänden, die sich aus gleich- und verschiedenartigen Zellen in organspezifischer Matrix zusammensetzen. Damit können interzelluläre Wechselbeziehungen bei der Wirkung toxischer Substanzen zwischen den verschiedenen Zellkomponenten erfaßt werden.
- 3. Teste von toxischen Substanzen in interaktiven Gewebekultursysteme können zur
Reduktion der Versuchszahlen beitragen. Zwei wesentliche Vorteile der Erfindung
kommen dabei zum Tragen, nämlich:
Substanzen, die im Zellkultursystem keine toxische Wirkung zeigten, da diese erst durch interzelluläre Wechselwirkungen evident werden, können durch den Einsatz von Gewebekultursystemen frühzeitig von weiteren Tests ausgeschlossen werden. Das interaktive Gewebekulturmodell gemäß der Erfindung ermöglicht die Verwendung humanen Gewebematerials. Damit ist das erfindungsgemäße Verfahren besser als bisherige Verfahren geeignet, Daten, die im Kulturexperiment gewonnen wurden, auf die Situation im menschlichen Organismus zu übertragen. Dadurch wird ebenfalls zu einer Reduktion der Zahl der Experimente beigetragen.
Das interaktive Gewebekultursystem gemäß der Erfindung erfüllt auch folgende
Forderungen:
- - Vermeidung von Nekrosebildung in kultiviertem Gewebe
- - Verzicht auf undefinierte Mediumzusätze
- - Erhaltung eines organspezifischen Differenzierungsgrades der Zellen
- - Erhalt der organtypischen Gewebezusammensetzung
- - Möglichkeit zur gezielten basalen bzw. apikalen Applikation von Testsubstanz.
Die Gewinnung der Organ- oder Gewebeteile erfolgt bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren ohne proteolytische Präparation unter Erhalt der organtypischen
Gewebezusammensetzung und unter Erhalt eines organspezifischen
Differenzierungsgrades der Zellen. Die Gewinnung der Gewebe- oder Organproben
erfolgt beispielsweise als Gewebeschnitte, z. B. Vibratomschnitte, die grundsätzlich von
allen Organen gewonnen werden können, als Zupfpräparate, z. B. Gewebeexplantate aus
der Niere, Mucosa-Explantate des Magens. Weiterhin können als Gewebeproben auch
ausreichend dünne Gewebeteile, z. B. Retina, Cornea, Haut usw. verwendet werden.
Erst durch die Verwendung der Gradientenperfusionskammer ist eine Aufrechterhaltung
der Organstruktur und der Funktion, die an ein funktionierendes Gefäßsystem geknüpft
sind, möglich, d. h. eine Desintegration des Gewebes wird vermieden. In einer normalen
Kulturschale mit Nährlösung ließe sich das erfindungsgemäße Verfahren nicht durchführen,
da eine ausreichende Versorgung mit Nährstoffen und insbesondere Sauerstoff nicht
gewährleistet ist. Erst durch die Verwendung der Gradientenperfusionskammer wird
vermieden, daß sich im Gewebe Metabolite anreichern, die natürlicherweise durch das
das Organ versorgende Gefäßsystem abgeführt werden. Die Kultivierung einer
Gewebeprobe in einer herkömmlichen Kulturschale hat somit Gewebenekrosen zur
Folge, wodurch die ursprüngliche Gewebestruktur zerstört wird. Eine Beurteilung, ob dies
dann die Folge der Einwirkung einer toxischen Substanz oder die Folge der
Kulturbedingungen ist, ist nicht mehr möglich. Diese Nachteile werden bei der Erfindung
vermieden.
Von entscheidender Bedeutung für die Wirkung einer zu testenden Substanz kann bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren auch der Ort der Applikation sein.
Epithelzellverbände sind beispielsweise polar organisiert. Die Zellen grenzen mit der
apikalen Membran an ein Lumen an, welches je nach Organ sehr unterschiedliche
Substanzen enthalten kann (z. B. Harnblase - Urin, Darm - Nahrungsbrei usw.). Die basale
Membran der Zellen steht dagegen mit der blutähnlichen Gewebsflüssigkeit in Kontakt. In
Abhängigkeit vom Ort der Applikation (basal oder apikal) können Testsubstanzen sehr
unterschiedliche Wirkungen auf die Zellen haben, zumal Stoffgradienten in Gewebeteilen
die interzellulären Wechselwirkungen wesentlich beeinflussen können.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß toxische Wirkungen nicht nur über den
unmittelbaren Kontakt der Testsubstanz mit einem bestimmten Zelltyp ausgelöst werden,
sondern vor allem auch über Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zellen
eines Organs vermittelt werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden also
diese Wechselwirkungen durch die Verwendung von Organ- oder Gewebeproben, die
ein interaktives Gewebesystem darstellen, voll berücksichtigt.
Organe sind komplex aufgebaut, sie setzen sich aus mehr als einem Zelltyp zusammen.
Die Zellen liegen außerdem in unterschiedlichen Differenzierungsstadien vor. Neben
sogenannten Reservezellen, die für den Ersatz abgestorbenen Gewebes benötigt werden,
kommen terminal differenzierte Zellen vor, die nicht mehr profilieren, sondern
spezifische Funktion erfüllen. In bezug auf die Proliferationsfähigkeit der differenzierten
Zellen spricht man von einer Kontaktinhibition. Solange der Gewebeverband unverletzt
ist, die spezifische extrazelluläre Matrix intakt ist und die Zellen untereinander in
Verbindung stehen, verbleiben sie in ihrem hohen Differenzierungszustand. Nur zum
Verschluß von Wunden oder zur Regeneration werden die Reservezellen aktiviert. Der
Anteil der zur Proliferation befähigten Reservezellen und die Lebensdauer der terminal
differenzierten Zellen ist organspezifisch. Während die Epithelzellen der Haut innerhalb
kurzer Zeit ersetzt werden, wird für die Epithelzellen der Niere eine mehrjährige
Lebens- und Funktionsdauer angenommen. Werden Gewebe in Gegenwart mitogener
Nährmedien kultiviert, wirkt dies stimulierend auf die Reservezellen. Die Proliferation der
Zellen wird angeregt, nicht jedoch ihre Differenzierung. Dadurch verändert sich das
organtypische Verhältnis von proliferierenden zu differenzierten Zellen, und die typische
Organfunktion wird eingeschränkt. Um organtypische Bedingungen in der Gewebekultur
möglichst nahe zu kommen, muß nach der Erkenntnis der Erfindung Gewebematerial und
Nährmedium verwendet werden, dessen zelluläre Zusammensetzung in bezug auf den
Differenzierungsgrad den Verhältnissen im Organ entspricht.
Die Funktion des Organs wird sowohl durch dessen Einzelkomponenten als auch durch
die Wechselbeziehung zwischen den verschiedenen Zelltypen bestimmt. Nicht nur
Zellen gleichen Typs stehen miteinander in Kontakt, sondern auch die Zellen der
verschiedenartigen Gewebekomponenten treten miteinander in Wechselwirkung. Von
entscheidender Bedeutung für die organtypischen Wechselbeziehungen sind darüber
hinaus nicht nur die zellulären Komponenten, sondern auch die organspezifische
extrazelluläre Matrix. Erst durch Zusammenwirken der verschiedenen
Gewebekomponenten wird Organfunktion möglich. Diese Komplexität, die für die
Bestimmung der Substanzwirkung von entscheidender Bedeutung sein kann, wird weder
von einfachen Zellkultursystemen noch von Ko-Kultursystemen erreicht.
Die Erfindung trägt also dem Umstand Rechnung, daß im Organismus ein Stoff nicht nur
auf einen einzelnen Zelltyp einwirkt, sondern prinzipiell alle Zellen des Körpers mit der
Substanz oder mit deren Stoffwechselprodukten in Kontakt kommen können. Für die
Toxizität eines Stoffes ist also nicht nur dessen akute Wirkung auf eine einzelne Zelle
entscheidend. Vielmehr sind es die interzellulären Wechselwirkungen zwischen den
verschiedenen Zelltypen, die beeinflußt von der Testsubstanz, für deren Wirkung im
Organismus verantwortlich sind.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können durch Verwendung von Proben eines
tierischen Gewebes oder von Proben eines menschlichen Gewebes Testbedingungen
geschaffen werden, die eine unmittelbare Übertragbarkeit der Kultur- bzw. Testergebnisse
auf die Verhältnisse im tierischen und menschlichen Organismus ermöglichen.
Die Erfindung wird nachstehend im Zusammenhang mit der Figur, die in vereinfachter
Darstellung einen Schnitt durch eine Gradientenperfusionskammer 1 wiedergibt, näher
erläutert.
Die in der Fig. 1 dargestellte Perfusionskammer 1 besteht im wesentlichen aus zwei
Gehäuseteilen 2 und 3, die bei geschlossenem Gehäuse einen nach außen hin
geschlossenen Gehäuseinnenraum bilden. Zwischen den beiden Gehäuseteilen 2 und 3
ist eine beispielsweise von einem Haltering 4 gebildete Halterung vorgesehen, an der die
Gewebe- oder Organprobe 5 eingelegt und fixiert wird, insbesondere auch in der Form,
daß ein Abkugeln der Organprobe 5 verhindert wird. Durch den Halter 4 und die Organ- oder
Gewebeprobe 5 wird der Innenraum der Kammer 1 in zwei Teilräume 6 und 7
unterteilt, die jeweils einen Einlaß 8 zum Zuführen der Nährlösung oder der Testsubstanz
(zu testenden Substanz) sowie einen Auslaß 9 zum Abführen der Nährlösung mit den
Stoffwechselprodukten bzw. der Testsubstanz aufweisen. Für die Figur wurde
angenommen, daß der obere Teilraum 6 mit der Testsubstanz beaufschlagt wird. Hierfür
ist der Einlaß 8 dieses Teilraumes über eine Schlauchleitung 10 mit einer nicht
dargestellten Aufgabe für die Testsubstanz verbunden. Der untere Teilraum 7 wird von
der Nährlösung durchströmt. Der dortige Einlaß 8 ist daher über eine Schlauchleitung 11,
eine Mehrfach-Schlauchpumpe 12 mit einem Vorrat 13 für die Nährlösung verbunden.
Der Auslaß 9 des unteren Teilraumes 7 ist über eine nicht dargestellte Schlauchleitung an
einem Auffangbehälter zum Auffangen von verbrauchter Nährlösung angeschlossen. Bei
jedem Test werden bevorzugt mehrere Gewebeproben 5 gleichzeitig kultiviert und
teilweise mit der Testsubstanz beaufschlagt, teilweise zur Kontrolle aber auch mit einem
neutralen Medium aus einem Vorratsbehälter. Die Schlauchleitungen 11 sämtlicher
Kammern 1 sind dann beispielsweise über die gemeinsame Schlauchpumpe 12 geführt.
Dadurch, daß insbesondere der untere Teilraum 7 ständig von einem Mediumstrom
durchströmt wird, werden Metabolite und parakrine Faktoren ständig entfernt. Weiterhin
ist eine optimale Sauerstoffversorgung der jeweiligen Gewebeprobe 5 gewährleistet. Bei
dem Kulturmedium (Nährstofflösung) ist auf das Testergebnis beeinflussende Zusätze,
insbesondere auf fötale Seren (fötales Kälberserum), Gewebeextrakte usw. verzichtet, die
bei Nährlösungen für Kulturen in Kulturschalen benötigt werden und die aus einer
Vielzahl von Proteinen, Wachstumsfaktoren und anderen nicht genau definierten
Komponenten bestehen, welche das Testergebnis beeinträchtigen oder aber zu nicht
kontrollierbaren Interferenzen mit der jeweiligen Testsubstanz führen könnten. Durch die
Verwendung der Perfusionskulturtechnik werden auch Nekrosen minimiert.
Die Verwendung der Perfusionskammer gestattet es weiterhin auf einfache Weise auch,
die jeweilige Testsubstanz wahlweise basal oder apikal auf die Gewebeprobe 5 einwirken
zu lassen. Als Testsubstanz sind gasförmige, flüssige oder viskose Substanzen möglich.
Als Beispiel wird nachfolgend für das erfindungsgemäße Verfahren der Nachweis der
toxischen Wirkung von Glaskörperersatzstoffen in der renalen Explantatkultur
wiedergegeben.
Glaskörperersatzstoffe werden, wie der Name sagt, zum Ersatz des verletzten oder
geschädigten Glaskörpers in der Augenheilkunde eingesetzt. In dem vorliegenden
Beispiel wurden zwei dieser Ersatzstoffe (Stoff Perfluorphenantren und Perfluordecalin)
untersucht. Die Stoffe waren in einem Zellkultursystem getestet worden. Dieser Test gab
keine Hinweise auf toxische Wirkungen der Glaskörperersatzstoffe. Ein Test des Stoffes
Perfluorphenantren im Kaninchenauge resultierte jedoch in weitreichenden
Veränderungen des Blutgefäßsystems im Bereich der Retina, sowie einer erheblichen
Schädigung des Auges. Der Stoff Perfluordecalin zeigte eine gute Verträglichkeit im
Tierversuch. Schädigungen der Retina oder anderer Teile des Auges wurden nicht
beobachtet.
Zur Toxizitätstestung dieser Substanzen wurde ein interaktives Gewebekultursystem
etabliert. Das Kultursystem sollte Auskunft darüber geben, ob die gefäßverändernde
Wirkung des Stoffes Perfluorphenantren bereits in vitro feststellbar ist. Als Testgewebe
wurden Explantate von neonatalen Kaninchennieren gewählt. Antikörper zum Nachweis
von Gefäßen in Kaninchengeweben stehen in unserem Labor zur Verfügung. Außerdem
weist das Gefäßsystem in diesem Gewebe einen außerordentlich hohen räumlichen
Ordnungsgrad auf. Der Strukturerhalt des Gefäßsystems nach Applikation der
Testsubstanz war ein Parameter zur Beurteilung der toxischen Wirkung in diesem Test.
Präparation des Gewebes: Ein bis drei Tage alte Kaninchen wurden durch zervikaler
Dislokation getötet. Die Präparation von Organexplantaten erfolgte unmittelbar nach der
Entnahme der Nieren.
Die Niere neonataler Kaninchen ist noch nicht vollständig ausgereift. Im äußersten
Bereich des Organs unmittelbar unter der Organkapsel gelegen, werden neben
embryonalem Gewebe alle Nephron-Entwicklungsstadien vorgefunden. Aus diesem
Bereich wurden mikrochirurgisch Organexplantate präpariert. Dazu wurden die Nieren
der Länge nach halbiert. Mit einer feinen Pinzette konnte nun die dünne Organkapsel
abgezogen werden. Mit der Organkapsel trennte man auch das noch in der Entwicklung
befindliche Nierengewebe ab. Proteasen wurden bei dieser Präparationsmethode nicht
eingesetzt, d. h. die organtypische extrazelluläre Matrix sowie die interzellulären
Verbindungen blieben intakt. Die Organexplantate wurden dann auf ein Halteringsystem
aufgespannt.
Kultur der Nierenexplantate: Durch die Verwendung eines Halteringsystems war es
möglich Gewebexplantate für die Versuche zu verwenden, die nicht durch
proteolytische Desintegration gewonnen worden waren. Das Gewebestück wurde in der
entsprechenden Größe präpariert und im Haltering fixiert. Eine proteolytische
Desintegration des Gewebes, wie sie für die Kultur in herkömmlichen
Kulturschaleneinsätzen notwendig sein kann, wurde nicht durchgeführt. Das im Haltering
aufgespannte Gewebestück konnte mit der Gewebeoberseite oder der Gewebeunterseite
mit der Testsubstanz in Kontakt gebracht werden. Als Gewebeoberseite wurde die Seite
definiert, die von Organkapsel bedeckt war. Die Gewebeunterseite war die durch die
Präparation freigelegte Seite des Gewebes. Die so vorbereiteten Gewebeexplantate
wurden unter ständigem Mediumdurchstrom kultiviert. Die Verwendung der
Perfusionskulturtechnik ermöglichte in diesem Fall den vollständigen Verzicht auf Zusätze
von fötalem Kälberserum, adultem Serum oder Gewebeextrakten. Das Medium besteht
aus einem kommerziell erhältlichen Grundmedium (Iscove's Modified Dulbecco's
Medium, IMDM), dem die Hormone Aldosteron (10⁻7 M) und 1.25-Dihydroxyvitamin D3
(10⁻9 M) zugegeben worden waren. In Gegenwart dieser Hormone bleibt die Struktur des
renalen Gewebes vollständig erhalten. Nekrosen wurden auch nach Kulturzeiten von
mehr als 10 Tagen nicht beobachtet.
Zur Perfusionskultur wurden die aufgespannten Explantate 5 (Organproben) in die
Gradientenkammer eingesetzt, so daß ein oberes und ein unteres Kompartiment 6 bzw. 7
gebildet sind, die durch das Gewebe 5 voneinander getrennt sind. Das obere
Kompartiment 6 wurde mit der jeweiligen Testsubstanz gefüllt und in diesem Experiment
nicht durchströmt, da die Testsubstanz von viskoser Konsistenz war. Eine Durchströmung
mit Testsubstanz wäre aber bei der Applikation von flüssigen oder gasförmigen Stoffen
möglich.
Das untere Kompartiment 7 war mit Nährlösung gefüllt, die kontinuierlich durch dieses
Kammerkompartiment gepumpt wurde. Die Mediumvorratsflasche 13 wurde über die
Schlauchverbindung 11 mit dem Einlaß 8 der unteren Kammer 7 verbunden. Der
Kammerausfluß 9 wurde an die Abfallflasche angeschlossen. Die Vorratsflasche 13 wurde
während der gesamten Kulturzeit bei 4°C gelagert. Der zuführende Schlauch 11 wurde in
die 12 eingelegt, die eine konstante Mediumdurchspülung der Kammer mit 1 ml/h
gewährleistete. Diese Perfusionsrate hat sich für die Kultur renalen Gewebes als gut
geeignet erwiesen. Es sind prinzipiell auch andere Flußraten möglich.
In das obere Kammerkompartiment 6 wurde die Testsubstanz (Stoff Perfluorphenantren,
Stoff Perfluordecalin) gefüllt, so daß das Gewebestück 5 einseitig von der Nährlösung
erreicht wurde, während die gegenüberliegende Gewebeseite mit der Testsubstanz in
unmittelbarem Kontakt stand. Der Kontrollansatz bestand darin, daß dort das obere
Kammerkompartiment 6 nicht mit der Testsubstanz, sondern mit Grundmedium gefüllt
wurde.
Ein weiterer Experimentansatz wurde so ausgelegt, daß bei der dortigen
Perfusionskammer 1 die Testsubstanz im unteren Kammerkompartiment 7 plaziert wurde,
während die Nährlösung durch das obere Kompartiment 6 gepumpt wurde.
Die Perfusionskammern 1 wurden dann auf einer 37°C warmen Heizplatte plaziert und
das Gewebe für 24 Stunden unter kontinuierlichem Mediumdurchstrom kultiviert.
Nach der Kultur wurden die Explantate kurz in Pufferlösung gespült und in flüssigem
Stickstoff eingefroren.
Lichtmikroskopisches Auswertungsverfahren: Als Kriterien zur Beurteilung der toxischen
Wirkung der jeweiligen Testsubstanz wurden zwei Parameter herangezogen:
- 1. Die verschiedenen Zelltypen eines Organs sind gekennzeichnet durch die
Expression typischer Moleküle, die mit Hilfe spezifischer Antikörper nachgewiesen
werden können. Endothelzellen in der Kaninchenniere tragen ebenfalls solche
Moleküle.
Zum Nachweis von Endothelzellen wurde in unseren Experimenten der Antikörper EC1 eingesetzt. Das EC1-Antigen wird ausschließlich von Endothelzellen exprimiert. Sterben die Endothelzellen ab, kann das EC1-Antigen im Gewebe nicht mehr nachgewiesen werden. - 2. Das sich entwickelnde Gefäßnetz der Niere ist von einem außergewöhnlich hohen räumlichen Ordnungsgrad gekennzeichnet. Diese charakteristische Struktur wird nur in einem distinkten Differenzierungszustand des Gewebes beobachtet. Sie ist Ausdruck der koordinierten Entwicklung der verschiedenen Organkomponenten der Niere. Der Erhalt der dreidimensionalen Struktur des Gefäßnetzes im Explantat nach Applikation der Testsubstanz war ein weiteres Kriterium zur Beurteilung der Toxizität der Substanz.
Zum Nachweis endothelialer Antigene im histologischen Präparat wurde die indirekte
Immunperoxidäse-Markierung eingesetzt. Bei diesem Verfahren wurde der murine,
monoklonale Antikörper EC1 als Primärantikörper zum Nachweis von Endothelzellen
verwendet. Die Antikörperbindung wurde dann in einem zweiten Schritt durch markierte
spezies-spezifische Sekundärantikörper nachgewiesen.
Die Spezifität der Antikörperreaktion wurde durch verschiedene Kontrollansätze
abgesichert. Zum einen wurden Kontrollschnitte mitgeführt, die nicht mit dem
Primärantikörper, aber mit allen anderen verwendeten Fixantien, Puffern und
Antikörperkonjugaten behandelt worden waren. Außerdem wurden in den Experimenten
auch Schnitte mit irrelevanten Primärantikörpern der gleichen Klasse bzw. Subklasse des
spezifischen Antikörpers inkubiert. Auch murine Präimmunseren wurden zur Kontrolle
verwendet.
Beispielhaft werden hier die Ergebnisse für die Applikation der Testsubstanzen im unteren
Kammerkompartiment wiedergegeben. Renale Explantate, die mit dem Stoff
Perfluordecalin für 24 Stunden kultiviert worden waren, zeigten ebenso wie die
Kontrollexplantate einen optimalen Erhalt der räumlichen Organisation des
Gefäßnetzwerkes. Im Gegensatz dazu war das Gefäßnetzwerk, das für 24 Stunden dem
Stoff Perfluorphenantren ausgesetzt war, weitgehend aufgelöst. Einzelne Endothelzellen
waren jedoch nachweisbar, d. h. die Expression des EC1-Antigens wurde durch die
Inkubation des Gewebes mit dem Stoff Perfluorphenantren nicht beeinflußt. Die
destruktive Wirkung des Stoffes Perfluorphenantren auf den Strukturerhalt des
Gefäßnetzwerkes war jedoch eindeutig. Darüber hinaus zeigte das gesamte Gewebestück
strukturelle Veränderungen. Die Ergebnisse der Versuche sind in der folgenden Tabelle
zusammengefaßt.
Der Test der Glaskörperersatzstoffe Perfluorphenantren und Perfluordecalin an renalen Explantaten in vitro bestätigte überzeugend die Ergebnisse, die nach Applikation dieser
Substanzen in das Kaninchenauge gewonnen wurden. Während Perfluordecalin keine
Schädigung der Retina und des Auges hervorrief, zeigte das Gefäßsystem der Retina nach
Applikation von Perfluorphenantren wesentliche Veränderungen. Auch das Gefäßsystem
in den renalen Explantaten war bereits nach 24stündiger Inkubation mit
Perfluorphenantren in Auflösung begriffen. Sowohl die Kontrollexplantate als auch
Explantate, die mit Perfluordecalin inkubiert wurden, wiesen nach 24 Stunden Kultur
einen exzellenten Erhalt des Gefäßsystems auf. Dieses Ergebnis zeigt deutlich, daß
interaktive Gewebekultursysteme erfolgreich zum Nachweis toxischer Wirkungen
eingesetzt werden können.
Bei der Testung des Stoffes Perfluorphenantren an Tumorzellen waren keine toxischen
Wirkungen der Substanz aufgefallen. Die Bedeutung der zellulären Interaktion für die
Ausprägung der toxischen Wirkung einer Substanz wird durch diese Diskrepanz
eindrucksvoll unterstrichen. Zellkultursysteme sind zum Nachweis akuter toxischer
Wirkungen hervorragend geeignet. Sie erlauben eine schnelle Überprüfung der direkten
toxischen Wirkung. Beruht die Toxizität eines Stoffes jedoch auf zellulären
Wechselwirkungen müssen andere Systeme zur Analyse genutzt werden.
Die hier exemplarisch beschriebenen Kulturbedingungen können nach Bedarf variiert
werden. Variation der Mediumflußraten, unterschiedliche ausgedehnte Kulturzeiträume,
sowie eine andere Mediumzusammensetzung je nach Erfordernis des Gewebes sind
möglich und auf einfache Weise anpaßbar. Neben den hier beschriebenen
Zupfpräparaten können auch Gewebeschnitte oder Organteile in Kultur genommen
werden.
Ebenso können andere Methoden zur Auswertung herangezogen werden. Neben
transmissions- und rasterelektronenmikroskopischen Techniken sind auch in situ-
Hybridisierung, sowie biochemische und histochemische Nachweise denkbar. Eine
wesentliche Vereinfachung der Auswertung kann durch Messung von Molekülen im
Kulturüberstand erreicht werden. Beispielsweise könnte der Nachweis der Zunahme
apoptotischer Zellen nach Applikation einer Testsubstanz über die Untersuchung des
Kulturüberstandes mit Hilfe von Apoptosemarkern und geeigneten Analysesystemen
durchgeführt werden.
Für die hier beschriebenen Versuche wurden Explantate der neonatalen Kaninchenniere
verwenden. Prinzipiell kann mit diesem System jedes Gewebe kultiviert werden. In
unserem Labor zeigten erste Experimente mit Gewebe aus dem Kaninchenmagen, daß
auch dieses Gewebe mit gutem Erfolg über lange Zeiträume kultiviert werden kann. Die
hier beschriebene Verwendung einer Gradientenperfusionskammer zur gezielten apikalen
bzw. basalen Applikation von toxischen Substanzen ist auch für andere Gewebe (z. B.
Magen, Haut, Cornea, Retina) möglich.
Für die hier beschriebenen Experimente wurde eine Kulturdauer von 24 Stunden gewählt.
Es sind auch kürzere oder längere Kulturzeiträume mit diesem System möglich.
Vorstehend wurde davon ausgegangen, daß die Gewebeprobe vor der Auswertung zur
Verbesserung der Lagerung eingefroren wird. Grundsätzlich ist es auch möglich, die
Gewebeprobe nach ihrer Kultivierung sofort auszuwerten.
Für das Auswertverfahren sind auch andere Techniken geeignet, beispielsweise
automatisierbare Testsysteme, z. B. ein dem Fachmann unter ELISA bekanntes Testsystem.
Anstelle des oben genannten EC1-Antigen können zur Auswertung auch andere Marker
verwendet werden, und zwar zum Nachweis proliferierender und/oder apoptotischer
Zellen.
1
Perfusionskammer
2
,
3
Gehäuseteil
4
Halterung
5
Gewebe- oder Organprobe
6
,
7
Teilraum
8
Einlaß
9
Auslaß
10
,
11
Schlauchleitung
12
Schlauchpumpe
13
,
14
Vorratsbehälter
Claims (9)
1. Verfahren zur Bestimmung der Verträglichkeit, insbesondere auch der Toxizität von
gasförmigen, flüssigen und/oder viskosen Stoffen für den menschlichen oder tierischen
Organismus, dadurch gekennzeichnet, daß eine ohne proteolytische Desintegration
gewonnene Organ- oder Gewebeprobe in eine Gradienten-Perfusionskammer (1) derart
eingebracht wird, daß im Inneren der Kammer wenigstens zwei Teilräume (6, 7)
gebildet sind, die durch die Gewebeprobe voneinander getrennt sind, daß die
Gewebeprobe (5) über eine Kammer (7) mit einer Nährlösung versorgt wird, und daß
die Gewebeprobe (5) über wenigstens eine der beiden Kammern (6, 7) mit dem zu
testenden Stoff beaufschlagt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebeprobe (5) über
die eine Kammer (7) mit einer Nährlösung versorgt und über die andere Kammer (6)
mit dem zu testenden Stoff beaufschlagt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewebeprobe (5) als
Gewebeschnitt oder als Zupfpräparat aus einem lebenden tierischen oder
menschlichen Gewebe gewonnen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Gewebeprobe (5) ein
dünnes Gewebeteil, z. B. Retina, Cornea, Haut verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
die Auswertung der Gewebeprobe nach dem Kultivieren unter Verwendung von
Antigenen erfolgt, die jeweils ausschließlich von einem organtypischen, differenzierten
Zelltyp exprimiert werden.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
nach dem Kultivieren ein mikroskopisches, vorzugsweise lichtmikroskopisches Aus- oder
Bewerten der Organprobe erfolgt.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
die Gewebeprobe (5) nach einer Kultivier- oder Behandlungsdauer in einer
Pufferlösung gespült und anschließend schockgefroren, vorzugsweise in flüssigem
Stickstoff eingefroren wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
zur Auswertung Marker zum Nachweis proliferierender und/oder apoprotischer Zellen
verwendet werden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
zur Auswertung ein EC1-Antigen verwendet wird, welches ausschließlich von
Endothelzellen exprimiert wird.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19709019A DE19709019C2 (de) | 1997-02-25 | 1997-03-06 | Verfahren zur Bestimmung der Verträglichkeit, insbesondere auch der Toxizität von gasförmigen, flüssigen und/oder viskosen Stoffen für den menschlichen oder tierischen Organismus |
US09/028,467 US5928860A (en) | 1997-02-25 | 1998-02-24 | Process for determining the tolerance, or toxicity of gaseous, liquid and/or viscous substances for the human or animal organism |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE19707539 | 1997-02-25 | ||
DE19709019A DE19709019C2 (de) | 1997-02-25 | 1997-03-06 | Verfahren zur Bestimmung der Verträglichkeit, insbesondere auch der Toxizität von gasförmigen, flüssigen und/oder viskosen Stoffen für den menschlichen oder tierischen Organismus |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19709019A1 DE19709019A1 (de) | 1998-08-27 |
DE19709019C2 true DE19709019C2 (de) | 1999-03-18 |
Family
ID=7821437
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE19709019A Expired - Fee Related DE19709019C2 (de) | 1997-02-25 | 1997-03-06 | Verfahren zur Bestimmung der Verträglichkeit, insbesondere auch der Toxizität von gasförmigen, flüssigen und/oder viskosen Stoffen für den menschlichen oder tierischen Organismus |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19709019C2 (de) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10224518A1 (de) * | 2002-05-31 | 2003-12-11 | Gruenenthal Gmbh | Zweikanal-Durchflussmesszelle |
DE102005020776A1 (de) * | 2005-05-02 | 2006-11-09 | Forschungsinstitut Hohenstein Prof. Dr. Jürgen Mecheels GmbH & Co. KG | Testsystem zur Prüfung von Textilien |
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DE4020013A1 (de) * | 1990-06-21 | 1992-03-19 | Schwarz Hans Joachim Dipl Betr | Vorrichtung einer vertikalen transportkammer |
DE3635013C2 (de) * | 1986-10-15 | 1992-05-27 | Karl-Rainer 4630 Bochum De Greskoetter | |
DE4229013A1 (de) * | 1992-09-02 | 1994-03-03 | Effem Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur in-vitro-Prüfung von Einwirkungen auf biologische Strukturen |
US5525475A (en) * | 1992-08-12 | 1996-06-11 | Ladouceur; Cynthia A. | Diffusion through a membrane assaying apparatus and method |
-
1997
- 1997-03-06 DE DE19709019A patent/DE19709019C2/de not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE19709019A1 (de) | 1998-08-27 |
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